Summary
La metodologia assiste nell'analisi della variazione nelle dinamiche di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle. Diverse metodologie possono essere adottate in base al livello di citotossicità del materiale di interesse. Inoltre, viene fornita una descrizione dell'analisi delle immagini per aiutare nell'analisi delle fibre del DNA.
Abstract
L'esposizione ai nanomateriali può causare stress da replicazione e instabilità genomica nelle cellule. Il grado di instabilità dipende dalla chimica, dalle dimensioni e dalla concentrazione dei nanomateriali, dal tempo di esposizione e dal tipo di cellula esposta. Diversi metodi consolidati sono stati utilizzati per chiarire come gli agenti endogeni / esogeni influenzano la replicazione globale. Tuttavia, i saggi a livello di replica, come il test delle fibre di DNA, sono indispensabili per capire come questi agenti influenzano l'inizio della replicazione, le terminazioni e la progressione della forcella di replicazione. Sapere questo permette di capire meglio come i nanomateriali aumentino le possibilità di fissazione delle mutazioni e di instabilità genomica. Abbiamo usato macrofagi RAW 264.7 come cellule modello per studiare le dinamiche di replicazione sotto l'esposizione alle nanoparticelle di ossido di grafene. Qui, dimostriamo il protocollo di base per il test delle fibre di DNA, che include l'etichettatura degli impulsi con analoghi nucleotidici, la lisi cellulare, la diffusione delle fibre di DNA marcate con impulso su vetrini, l'immunocolorazione fluorescente degli analoghi nucleotidici all'interno delle fibre di DNA, l'imaging degli intermedi di replicazione all'interno delle fibre del DNA utilizzando la microscopia confocale e l'analisi intermedia della replica utilizzando un software di punteggio e analisi assistita da computer (CASA).
Introduction
Durante ogni ciclo cellulare, la replicazione del DNA garantisce un'accurata duplicazione del genoma1. La replicazione cromosomica eucariotica dipende essenzialmente da tre fattori: la tempistica dell'attivazione di più origini di replicazione, la velocità delle forcelle che emergono dalle origini sparate e la cessazione del processo di replicazione quando due forcelle di replicazione da origini adiacenti si incontrano2. Per la trasmissione ad alta fedeltà delle informazioni genetiche alle cellule figlie, nonché per la conservazione dell'integrità genetica, è fondamentale un'accurata replicazione del DNA. Gli agenti che si sviluppano dal metabolismo regolare o sono dovuti a materiali ambientali artificiali o naturali attaccano costantemente il genoma. Questi agenti endogeni ed esogeni causano il rallentamento o l'arresto delle forcelle di replicazione a causa del danno al DNA causato da questi agenti e le forcelle che rallentano temporaneamente o si fermano in risposta a queste difficoltà sono chiamate stress di replicazione3. In risposta allo stress di replicazione, le cellule hanno sviluppato diversi percorsi molecolari che mantengono la stabilità delle forcelle di replicazione disturbate e consentono loro di ricominciare4. In termini di stabilità genetica, sopravvivenza cellulare e malattie umane, questi meccanismi di risposta allo stress di replicazione sono emersi come fattori chiave per mantenere un genoma sano, garantire la sopravvivenza cellulare e ridurre la probabilità di formazione di malattie5.
Uno degli agenti esogeni in grado di produrre stress di replicazione sono le nanoparticelle. Le nanoparticelle sono particelle di dimensioni variabili da 1 nm a 100 nm6. Grazie alle loro elevate aree superficiali, alle forme distintive e alle proprietà chimiche uniche, le nanoparticelle sono utilizzate in varie applicazioni mediche, farmaceutiche, ambientali e industriali 7,8. Mentre le nanoparticelle hanno molti potenziali benefici, alcune di esse (a causa della loro natura ereditaria o longevità) possono diventare tossiche. Le nanoparticelle possono anche formarsi a causa dell'usura naturale degli impianti medici ed essere rilasciate nella regione peri-protesica 9,10.
A causa dell'esposizione degli esseri umani a una miriade di nanoparticelle prodotte per varie applicazioni, la ricerca nel campo della tossicità delle nanoparticelle è aumentata enormemente negli ultimi 10 anni11. Mentre questi sforzi di ricerca hanno rivelato informazioni in abbondanza sulla potenziale minaccia che le nanoparticelle rappresentano per la salute umana, la conoscenza del potenziale delle nanoparticelle di causare genotossicità è ancora limitata. Ciò che è stato scoperto finora è che queste nanoparticelle possono interagire fisicamente con il DNA, promuovere danni al DNA e danneggiare o interferire con le proteine responsabili della riparazione o della replicazione del DNA12. Per rilevare come interferiscono con la replicazione del DNA, la pettinatura delle fibre del DNA, la sintesi del DNA radioresistente (RDS) e l'analisi delle fibre del DNA vengono in genere utilizzate13,14,15,16.
Il metodo di pettinatura delle fibre di DNA è flessibile e fornisce informazioni sulla dinamica della forcella di replicazione a livello di singola molecola17. In sostanza, un coprislip salinizzato viene delicatamente prelevato dalla soluzione di DNA una volta che le estremità del DNA si legano ad esso. Le molecole di DNA sono raddrizzate e allineate dal menisco della soluzione. L'omogeneità, la spaziatura e l'allineamento delle fibre di DNA supportano misurazioni accurate e affidabili della lunghezza del tratto di fibre. Regolando la lunghezza e la sequenza dei trattamenti e dei farmaci utilizzati per causare stress o danni, molti aspetti dell'avanzamento della forcella possono essere monitorati utilizzando questa applicazione. In questo metodo, viene utilizzato un doppio sistema di etichettatura, attraverso il quale vengono valutate la velocità e la progressione della forcella di replica17,18. D'altra parte, l'elettroforesi su gel 2D sfrutta il fatto che, nell'elettroforesi su gel di agarosio, le strutture di DNA ramificate viaggiano più lentamente delle molecole di DNA lineari della stessa massa, consentendo la separazione pulita dei due in una corsa 2D. Infatti, questo metodo è studiato per segregare le molecole di DNA in base alla loro massa nella prima corsa e in base alla loro forma nella seconda corsa ortogonale. Dopo la frammentazione del DNA genomico, gli intermedi di replicazione e ricombinazione non comuni sviluppano una forma ramificata e possono essere distinti dalle molecole lineari più comuni nel gel 2D19.
Il metodo RDS viene utilizzato per determinare come viene influenzata la sintesi globale del DNA. In questo metodo, il grado di inibizione della replicazione globale è determinato confrontando la quantità di nucleotidi marcati radioattivamente incorporati, come [14C] timidina, in cellule non trattate rispetto a quelle trattate14,20. La differenza percentuale nella radiomarcatura tra le cellule non trattate e trattate rappresenta il grado in cui l'agente dannoso per il DNA influisce sulla sintesi del DNA. Analogamente a questo, un altro metodo utilizza la capacità delle cellule di integrare analoghi nucleotidici come BrdU (5-bromo-2′-deossiuridina) per la citometria a flusso per misurare i tassi complessivi di sintesi del DNA21,22. Mentre questi metodi dimostrano come gli agenti dannosi del DNA influenzano la sintesi globale del DNA, non mostrano come i singoli replicons sono influenzati. In effetti, i saggi a livello di replicon sono indispensabili per comprendere meglio l'inizio e l'entità dell'instabilità genomica in caso di esposizione a particelle tossiche (nanomateriali). L'autoradiografia delle fibre del DNA e la microscopia elettronica sono alcuni metodi utilizzati per determinare questo23,24,25,26.
I concetti di bolle di replicazione e replicazione bidirezionale da sorgenti distanti in modo non uniforme sono stati inizialmente sviluppati utilizzando test a singola molecola come la microscopia elettronica e l'autoradiografia delle fibre di DNA27,28. L'osservazione diretta di intermedi di replicazione ramificati su molecole specifiche disperse attraverso una griglia rivestita di carbonio è notevolmente facilitata dalla microscopia elettronica. Questo metodo, che è ancora in uso oggi per tracciare i cambiamenti patologici alle forche di replicazione, è stato utilizzato per localizzare la prima origine eucariotica della replicazione del DNA28. L'autoradiografia a fibra è incentrata sul concetto di identificazione autoradiografica di aree di nuova replicazione e sulla marcatura del polso dei cromosomi con timidina triziata. La prima valutazione quantitativa delle densità di origine e dei tassi di forcella di replicazione nelle sequenze genomiche dei metazoi è stata resa possibile dall'autoradiografia delle fibre di DNA29.
Attualmente, i metodi di fluorografia delle fibre hanno preso il posto dell'autoradiografia, principalmente perché la fluorografia delle fibre è molto più veloce dell'autoradiografia. Nella fluorografia delle fibre, due derivati nucleotidici alogenati, come bromo- (Br), cloro- (Cl) o iododeossiuridina (IdU), sono incorporati sequenzialmente nel DNA appena replicato e quindi identificati mediante immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi30. La visione microscopica del DNA nascente che ha incorporato uno o entrambi gli analoghi è resa possibile dall'immunocolorazione di uno degli analoghi in un colore e dell'altro analogo in un colore diverso (ad esempio, immunocolorazione del DNA nascente con rosso IdU incorporato e verde CldU incorporato) (Figura 1)21. Molti diversi tipi di intermedi di replicazione possono essere identificati dall'analisi delle fibre del DNA. I più comunemente studiati sono le singole forcelle allunganti, iniziazioni e terminazioni. Le singole forcelle allunganti hanno un modello di replicazione di rosso seguito da verde (rosso-verde; Figura 2A). 13 Le lunghezze di questi intermedi sono frequentemente utilizzate per misurare la velocità della forcella (cioè la lunghezza della forcella/tempo dell'impulso) o la degradazione esonucleolitica del DNA nascente attraverso l'accorciamento della traccia (Figura 2E)30,31,32. In uno studio di Mimitou et al., è stato scoperto che dopo l'esposizione a lungo termine all'idrossiurea, un veleno di replicazione che causa rotture a doppio filamento nel DNA, RE11 è stato reclutato33. MRE11 è un'esonucleasi nota per la sua attività di esonucleasi 3'-5' ed è in grado di tagliare le estremità del DNA per la riparazione. Pertanto, quando esposti ad agenti tossici, si può osservare la degradazione esonucleolitica del DNA nascente, che è l'accorciamento del filamento di DNA dovuto all'esposizione a un agente dannoso per il DNA34.
Le rotture della forcella di replicazione causate da ostruzioni fisiche (complessi DNA-proteina o lesioni del DNA), impedimenti chimici o mutazioni possono arrestare la replicazione e richiedere una ricombinazione omologa per riavviarla. Questo è noto come progressione della forcella compromessa. Numerose indagini in vitro e in vivo hanno indicato che la trascrizione può, occasionalmente, impedire l'avanzamento della forcella di replicazione in questo modo35.
Le iniziazioni sono origini di replica che iniziano e si attivano durante il primo o il secondo impulso. Le origini che si attivano durante il primo impulso e hanno forcelle di replica che continuano ad essere attive hanno un pattern verde-rosso-verde (Figura 2B, in basso). Le origini che iniziano durante il secondo impulso hanno un modello solo verde (Figura 2B, in alto) e sono talvolta chiamate origini appena iniziate, quindi quelle origini possono essere differenziate da quelle che iniziano durante il primo impulso. Il confronto delle percentuali relative di origini appena cotte tra due condizioni sperimentali permette di capire come una cellula risponde a un agente dannoso per il DNA o la presenza o l'assenza di una proteina. Le terminazioni vengono create quando due fork di replica da replicons adiacenti si uniscono e hanno un pattern rosso-verde-rosso (Figura 2D)30.
Sulla base dei fatti sopra descritti, l'analisi delle fibre di DNA è attualmente considerata un metodo preferito per studiare la variazione delle dinamiche di replicazione del DNA causata da agenti tossici come i nanomateriali. I ricercatori hanno ora una buona comprensione e conoscenza delle dinamiche della replicazione del DNA a livello di genoma negli eucarioti, sia quantitativamente che qualitativamente, grazie alla scoperta di questa tecnologia36. Sulla base delle variabili di risultato, possono essere adottate diverse metodologie. Alcuni esempi di metodi per studiare le variazioni del danno al DNA indotto da agenti esterni/nanoparticelle sono mostrati nella Figura 3. L'obiettivo generale del metodo di analisi delle fibre di DNA descritto in questo studio è determinare come le nanoparticelle influenzano il processo di replicazione in vitro e come influenzano in modo differenziale i vari tessuti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di anticorpi e tampone
- Preparare la soluzione anticorpale primaria, l'anti-BrdU del topo ad una diluizione di 1:300 in BSA al 5% e l'anti-BrdU di ratto ad una diluizione di 1:500 in BSA al 5%.
- Preparare la soluzione anticorpale secondaria, alexafluor 594 coniglio anti-topo ad una diluizione 1:300 in 5% BSA e alexafluor 488 pollo anti-ratto ad una diluizione 1:500 in 5% BSA.
- Preparare la soluzione anticorpale terziaria, alexafluor 594 capra anti-coniglio ad una diluizione 1:1.000 in 5% BSA e alexafluor 488 capra anti-pollo ad una diluizione 1:1.000 in 5% BSA.
- Preparare 10 mL di tampone di lisi in ddH 2 O con2mL di 1M Tris (pH 7,4), 1 mL di 0,5 M EDTA e 0,5 mL di 10% SDS.
2. Preparazione per il dosaggio delle fibre
- Giorno 1: Coltura cellulare e trattamento con nanomateriali per il saggio delle fibre
- Piastra RAW 264,5 cellule macrofagiche o le cellule di interesse, in modo che le cellule siano nella fase logaritmica della loro crescita il giorno dell'esperimento. Per le celle RAW, aggiungere 5 x 104 celle / pozzetto a piastre da 24 pozzetti per ogni condizione. Mantenere le celle in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e il 98% di umidità. La tabella 1 descrive i componenti dei mezzi utilizzati. Lasciare che le cellule crescano fino al 75%-80% di confluenza17,37.
- Dopo che le celle raggiungono il livello di confluenza del 75%-80%, rimuovere il mezzo dalle piastre, prendere metà del mezzo e riservarlo per l'impulso CldU (riserva CldU) e aggiungere 5 μL di IdU all'altra metà ad una concentrazione finale di 50 μM. Mescolare e aggiungere nuovamente il mezzo contenente IdU alle piastre. Posizionare le celle con IdU nell'incubatore per 20 minuti.
- Posizionare il mezzo di riserva CldU a 37 °C per mantenerlo preriscaldato. Aggiungi CldU a questo mezzo appena prima dell'impulso CldU.
- Dopo 20 minuti, aspirare la miscela IdU-medium e lavare delicatamente le cellule con 500 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4) ruotando delicatamente la piastra. Scartare il PBS.
- Trattare le cellule con varie concentrazioni di nanoparticelle in 500 μL del mezzo e incubare per altri 30 minuti. Per questo studio, utilizzare nanoparticelle di ossido di grafene trattate a una concentrazione di 25 μg / ml.
- Aspirare la miscela del mezzo di trattamento e lavare delicatamente le celle con 500 μL di PBS ruotando delicatamente la piastra. Scartare il PBS. Aggiungere 5 μL di CldU (100 μM finale
- concentrazione) al mezzo di riserva CldU e coprire le cellule con il mezzo di riserva CldU. Posizionare le celle nell'incubatore per la durata dell'impulso CldU per 20 minuti.
- Lavare le cellule con PBS, raschiare via o tripsinizzare per 3-4 minuti, quindi aggiungere 5 ml di terreno alla piastra e raccogliere le cellule.
- Girare a 264 x g per 4 min. Rimuovere il mezzo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS ghiacciato. Determinare il numero di cellule utilizzando un test di tripano blu (conteggio emocitometrico), quindi diluire le cellule a ~ 200-400 cellule / μL. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio durante il conteggio delle cellule.
NOTA: Se possibile, limitare il tempo in cui le celle rimangono sul ghiaccio. Questo può aiutare a ottenere una soluzione cellulare lungo la parte superiore del vetrino. Se sono tenuti sul ghiaccio, tenerli in posa per meno di 30 minuti.
- Giorno 1: Preparazione delle fibre del DNA
- Utilizzando una matita, etichettare i vetrini (vetrino, 75 mm x 25 mm) con la condizione sperimentale e la data.
- Prelevare 2 μL di celle in una pipetta, tenere la pipetta con un angolo di ~45°, posizionare la pipetta circa 1 cm sotto l'etichetta del vetrino e spostare la pipetta orizzontalmente sull'etichetta del vetrino. Mentre la pipetta si sposta sul vetrino, rilasciare un po' della soluzione cellulare alla volta. Creare più righe di celle in ogni diapositiva (passaggio critico).
NOTA: dovrebbe esserci una linea orizzontale di sospensione cellulare attraverso la diapositiva. Se la sospensione cellulare si gonfia, aggiungere 5-10 μL di mezzo cellulare al contenitore che ha la sospensione cellulare, poiché ciò potrebbe aiutare la soluzione ad aderire al vetrino quando viene nuovamente applicata. - Lasciare che la soluzione con le cellule evapori fino a quando la soluzione appare appiccicosa e appiccicosa. A questo punto, un po 'di liquido è associato alle cellule, ma non molto. Questo passaggio richiede 8-20 minuti e varia a seconda di quanta umidità c'è nell'aria.
NOTA: Assicurarsi che tutta la soluzione non sia evaporata, poiché ciò rende molto difficile ottenere fibre di DNA dritte e allineate poiché la maggior parte, se non tutto, del DNA sarà incollato insieme e non sarà in grado di separarsi. - Quando la soluzione è appiccicosa, sovrapporre le cellule con 15 μL di tampone di diffusione (lisi) per ogni linea di cellule, facendo attenzione a non lasciare che la punta della pipetta tocchi il vetrino. Attendere 10 min. Inclinare la diapositiva con un angolo di 25° e posizionare l'etichetta della diapositiva orizzontalmente contro il bordo di un rack portatubi (la parte inferiore dell'etichetta deve allinearsi con il bordo del rack tubiero).
- Lasciare asciugare il DNA all'aria per un minimo di 4 ore dal momento in cui sono state fatte le ultime diapositive.
NOTA: Un periodo da 4 h a 12 h è buono per l'asciugatura. Tuttavia, non lasciarli asciugare durante la notte. Se lasciato asciugare durante la notte, ci sarà molto DNA rilassato ma pochissime fibre di DNA dritte e allineate.
- Giorno 1: Fissaggio delle fibre del DNA e congelamento
- Una volta asciugati i vetrini, fissare i vetrini con metanolo:acido acetico (3:1) immergendo i vetrini per 2 min. Esegui questo passaggio sotto un cappuccio e lascia asciugare i vetrini durante la notte in un'area con esposizione alla luce limitata o copri i vetrini con una tenda di stagnola.
- Giorno 2
- Posizionare le diapositive in un portavetri. Posizionare i vetrini a -20 °C per un minimo di 24 ore. Questo passaggio migliora la risoluzione o la nitidezza dell'immagine.
3. Esecuzione del test delle fibre del DNA
- Denaturazione del DNA
- Preparare una camera umidificata utilizzando piccole scatole di punta per pipette con coperchi. Riempire a metà i contenitori con acqua e metterli a bagnomaria a 37 °C per almeno 1 ora.
- Estrarre i vetrini da -20 °C e scongelarli per alcuni secondi. Posizionare con cura i vetrini in un barattolo Coplin contenente acqua deionizzata (DI) in modo che le superfici rivestite non tocchino le pareti del barattolo. Incubare il vetrino per 20 secondi, quindi versare con cura l'acqua.
- Aggiungere 2,5 M HCL al barattolo Coplin in modo che copra tutti i vetrini. Attendere 80 min. Questo è un passaggio fondamentale nel protocollo. Un cambiamento nel tempo può cambiare il risultato dell'immagine.
- Lavare i vetrini 1x con PBS più Tween (PBS + 0,1% Tween [concentrazione finale]) e poi 2x con PBS per 3 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT).
- Immunocolorazione
- Conservare le diapositive nella camera umidificata per i passaggi successivi. Blocca le diapositive in BSA al 5% in PBS per 30 minuti su RT e coprile con copertine, copertine fatte da un sacchetto Western blot o fogli di plastica trasparente.
- Dopo il blocco, rimuovere con attenzione il vetrino, rimuovere la soluzione bloccante e asciugare il vetrino su un tovagliolo di carta (toccare il vetrino sull'asciugamano) per rimuovere la soluzione bloccante in eccesso.
- Aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale primaria lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi un nuovo copricopertina di plastica e attendi 2 ore. Quando si aggiunge il foglietto, assicurarsi che non si formino bolle.
- Dopo 2 ore, eliminare la soluzione anticorpale e sciacquare i vetrini in un barattolo Coplin riempito di PBS 2 volte a RT. Utilizzare PBS fresco ogni volta per lavare i vetrini.
- Bloccare nuovamente i vetrini aggiungendo 200 μL (da tre a quattro gocce) di BSA al 5% lungo ogni vetrino e aggiungere un vetrino di plastica. Attendere 15 min.
- Togliere il vetrino, eliminare il BSA in eccesso su un tovagliolo di carta e aggiungere 100 μL della soluzione anticorpale secondaria lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi una nuova copertina di plastica e attendi 1 ora.
- Togliere il coprifoglio, buttare via il BSA in eccesso su un tovagliolo di carta e lavare le diapositive 2 volte in PBS a RT.
- Bloccare nuovamente i vetrini aggiungendo 200 μL (da tre a quattro gocce) di BSA al 5% lungo ogni vetrino e aggiungere un vetrino di plastica. Attendere 15 min.
- Se necessario, rimuovere il foglietto, rimuovere l'eccesso di BSA su un tovagliolo di carta e aggiungere 100 μL di soluzione terziaria di anticorpi lungo la lunghezza del vetrino. Aggiungi nuovi coprivetrini di plastica e attendi 30 minuti.
- Lavare i vetrini con PBS 3x. Rimuovere il PBS in eccesso e lasciarli asciugare completamente.
- Una volta asciutto, aggiungere il supporto di montaggio e posizionare con cura i vetrini di vetro (24 mm x 60 mm) sul supporto di montaggio in modo da evitare bolle. Ri-etichettare le diapositive e lasciarle al buio durante la notte.
4. Acquisizione di immagini
- Visualizza le fibre di DNA immunocolorate utilizzando un microscopio immunofluorescente dotato di una fotocamera, un obiettivo 60x e set di filtri appropriati per rilevare i coloranti Alexafluor 488 e 594.
- Scatta immagini per l'analisi in regioni in cui le fibre sono ben separate e non impigliate. È importante acquisire immagini in aree diverse lungo la diapositiva, poiché l'acquisizione di immagini in una sola parte della diapositiva potrebbe non fornire dati rappresentativi relativi a tutti gli intermedi di replica trovati nella diapositiva.
- Se possibile, ottenere immagini in fibra da 20 regioni diverse su una diapositiva. Utilizzare un solo canale per selezionare le aree per scattare immagini per evitare distorsioni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dopo aver ottenuto un numero sufficiente di immagini (da 20 a 100 immagini per condizione), gli intermedi di replica devono essere identificati, misurati e contati. Sia che si analizzino le fibre manualmente o automaticamente tramite un programma38, è necessario definire chiaramente quali caratteristiche deve avere una fibra per poter essere contata o segnata (o non contata o misurata)39. Ad esempio, è possibile prendere in considerazione le seguenti domande. (1) Si dovrebbero misurare e contare solo le fibre con immunofluorescenza al 100% in tutta la fibra, o possono contenere alcune regioni senza immunofluorescenza (ad esempio, tutti gli intermedi nella Figura 4Ai,ii,iii dovrebbero essere analizzati o solo un sottoinsieme di essi?)? Se si analizzano le fibre con perdita di segnale, qual è la perdita massima di segnale accettabile all'interno di una fibra e qual è il numero massimo di pixel continui nella fibra che possono essere privi di qualsiasi segnale (ad esempio, la Figura 3Aiv sarebbe considerata un intermedio rosso-verde o rosso-solo?)? (2) Quali dovrebbero essere le larghezze/lunghezze minime e massime delle fibre? (3) Quale dovrebbe essere il rapporto segnale-rumore (S:N) quando si decide se misurare o meno una fibra (ad esempio, quante fibre dovrebbero essere scelte nella Figura 4B per analizzare?)? (4) Quanto deve essere vicina al bordo dell'immagine una fibra prima che non venga contata o misurata? (5) Se un segnale fluorescente è giallo, lo si conta come rosso o verde (ad esempio, la porzione gialla dell'intermedio di replicazione nella figura 4C dovrebbe essere contata come rossa o verde?)? (6) Quanto deve essere lungo un segmento di colore per essere considerato un segnale vero (ad esempio, l'intermedio di replica nella Figura 4D è una traccia solo verde, una traccia verde-rosso-verde o una traccia verde-rossa?)? (7) Se si utilizza un programma automatizzato di analisi delle fibre, quanto è sicuro il programma nella misurazione / conteggio che ha appena eseguito? (8) Se le fibre vengono analizzate manualmente, quanto dovrebbe essere coerente l'analisi nel tempo e tra gli individui?
Tipicamente, i parametri utilizzati per l'analisi delle fibre di DNA sono i seguenti:
Rapporto segnale-rumore: 3 (l'intensità della fibra è tre volte maggiore dell'intensità di fondo)
Spessore della fibra: ≤8 pixel di larghezza
Dimensioni minime: solo rosso o verde e 10 pixel; tracce rosso-verdi con ogni segmento ≥10 pixel; tracce rosso-verde-rosso o verde-rosso-verde con ogni segmento ≥10 pixel.
Continuità del segnale fluorescente: almeno l'80% e nessuna lacuna nel segnale superiore a 6 pixel.
Fiducia nella valutazione: i valori di confidenza devono essere simili tra loro in un'immagine e tra le immagini.
Oltre ai parametri sopra menzionati, un altro criterio importante è la selezione di una fibra trasparente che non si sovrapponga ad altre fibre durante l'imaging e l'analisi.
La Figura 5A mostra immagini rappresentative del controllo (Figura 5Ai) e del DNA macrofagico trattato con nanoparticelle di ossido di grafene (Figura 5Aii,iii). L'immagine mostra un aumento delle tracce di sola lettura (terminazioni) e una diminuzione delle origini appena cotte nelle celle trattate con ossido di grafene rispetto al controllo (Figura 5C). È anche importante considerare il numero di immagini e la posizione della diapositiva da cui vengono prese le immagini. Come mostrato nella Figura 5Aiii,C, una variazione nel modello degli intermedi di replicazione (un aumento delle nuove origini rispetto al controllo) è stata osservata su una regione diversa della stessa condizione. Anche se alcune di queste osservazioni potrebbero non influenzare il risultato complessivo, è necessario prestare attenzione a visualizzare la diapositiva includendo tutte le aree rappresentative. Sarebbe ideale dividere l'area totale della diapositiva in cinque o sei regioni e acquisire più immagini da ciascuna regione (ad esempio: 10 immagini) per trovare dati in fibra conclusivi per ogni diapositiva. È ideale selezionare circa 500 intermedi (Figura 5B) da più vetrini/condizioni. Con queste variazioni nella replicazione, la quantificazione intermedia dall'analisi delle fibre di DNA può essere utilizzata per studiare la variazione nelle dinamiche di replicazione del DNA causata dalle nanoparticelle di ossido di grafene o la genotossicità di altri nanomateriali. Quindi, sia una comprensione qualitativa che quantitativa delle dinamiche della replicazione del DNA a livello di genoma può essere ottenuta attraverso questa nuova metodologia rispetto ad altre analisi menzionate nell'introduzione.
Figura 1: Saggio delle fibre di DNA. Rappresentazione schematica del saggio con una panoramica dei principali passaggi nell'analisi delle fibre di DNA. Scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immunocolorazione degli intermedi di replicazione del DNA. Rappresentazione schematica di diversi intermedi di replicazione identificati mediante marcatura sequenziale a impulsi con IdU (rosso) e CldU (verde). Scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Esposizione alle nanoparticelle. Diverse metodologie per studiare le variazioni nel danno al DNA indotto da nanoparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Caratteristiche delle fibre di DNA da valutare. Esempi di intermedi di replica in un'immagine. (A) lacune nell'immunofluorescenza; (i) perdita di segnale di immunofluorescenza dello 0% attraverso l'intermedio di replicazione; (ii) ~ 7% di perdita di segnale; iii) perdita di segnale del 50%; e (iv) perdita di segnale del >90%. (B) Una regione con molti intermedi di replicazione sovrapposti (la freccia indica la regione con chiara sovrapposizione di fibre). (C) Una fibra di DNA con una regione gialla. (D) Un intermedio di replica aperto all'interpretazione (la freccia indica gli spazi vuoti nella fibra). Scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi e interpretazione delle fibre del DNA. (A) Immagini rappresentative di fibre di DNA provenienti da (i) cellule macrofagiche di controllo e (ii,iii) cellule macrofagiche trattate con nanoparticelle per 20 minuti ad una concentrazione di 25 μg/ml. Le immagini ii e iii sono state prese da diverse regioni della diapositiva. (B) Analisi software automatizzata rappresentativa delle condizioni di controllo e trattate con nanoparticelle. Per questa analisi, abbiamo utilizzato il programma automatizzato di tracciamento e misurazione delle fibre del DNA sviluppato da Wang et al.38. I numeri nella figura mostrano il numero di tracce di DNA analizzate. (C) Rappresentazione grafica dell'analisi software delle condizioni di controllo e trattate con nanoparticelle. NP rappresenta nanoparticelle. La percentuale relativa della popolazione intermedia (ad esempio, solo per il rosso) viene calcolata dal totale degli intermedi analizzati. Confrontando l'immagine 1 trattata con NP con l'immagine 2, ci sono grandi differenze tra le due immagini. Pertanto, è importante ottenere molte immagini in tutta la diapositiva per comprendere in che modo una condizione sperimentale influisce sul processo di replica. Abbreviazioni: R = rosso; G = verde. Scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composizione dei media |
| 10% siero bovino fetale |
| Soluzione di penicillina-streptomicina all'1% (10000 unità/ml) |
| 1% L Glutammina (200 mM) |
| Glucosio medio-alto dell'aquila modificata di Dulbecco |
Tabella 1: Composizione dei mezzi utilizzati per la coltura cellulare di macrofagi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Discutiamo qui un metodo per aiutare nell'analisi della variazione nella dinamica di replicazione del DNA in presenza di nanoparticelle attraverso il saggio delle fibre di DNA. I principali passaggi critici coinvolti nel test standard sono descritti nel protocollo (fase 2.2.2 e fase 3.1.3). Si consiglia sempre di utilizzare un'area con un'esposizione limitata alla luce dall'alto e un flusso d'aria costante per prevenire rotture del DNA indotte dalla luce nei vetrini e per migliorare la riproducibilità. È necessaria un'attenta attenzione alla durata temporale per l'essiccazione del lisato cellulare sui vetrini. L'eccessiva essiccazione avrà un impatto negativo sulla diffusione della fibra. Il secondo passo critico è la denaturazione delle fibre utilizzando una soluzione acida. La durata del lavaggio acido deve essere mantenuta uguale per tutti i vetrini dello stesso esperimento. La risoluzione dei problemi per questi due passaggi per trovare condizioni ottimali (tempo di lisi, volume di lisato sul vetrino, tempo di asciugatura e tempo di lavaggio acido) è consigliata per diversi tipi di cellule e ambienti di laboratorio.
Come discusso nella Figura 3, la durata dell'esposizione delle nanoparticelle può essere variata per la determinazione quantitativa dell'alterazione delle dinamiche di replicazione del DNA indotte dalle nanoparticelle. Per determinare l'impatto iniziale delle dinamiche di replicazione, sarebbe appropriata un'esposizione a breve termine come 1 min, 20 min o 30 min con dosaggi diversi. La differenza nei modelli di replicazione (come mostrato nella Figura 2) dopo l'esposizione a lungo termine delle cellule ai nanomateriali può essere determinata confrontando i modelli di esposizione a IdU e CIdU (20 minuti ciascuno) prima e dopo il trattamento con nanoparticelle. Questo approccio può essere utilizzato per determinare lo stallo della forcella, il rallentamento della forcella e la differenza di origine di accensione in diversi momenti di esposizione, che possono essere interpretati come gli effetti dell'esposizione acuta e cronica ai nanomateriali39,40.
Esistono diverse tecniche promettenti disponibili per rilevare la variazione nella replicazione del DNA, come la pettinatura del DNA e il metodo RDS; tuttavia, rispetto a tali metodi, il saggio delle fibre di DNA è conveniente ed economico senza la necessità di costosi strumenti di analisi41. I limiti di questo metodo sono la durata sperimentale, il tempo necessario per scattare immagini sufficienti per la quantificazione, nonché l'analisi del software. Tuttavia, certamente, questo approccio supporterà la ricerca nanotossicologica nel determinare l'instabilità genomica causata dalle particelle nelle linee cellulari, così come in diversi campioni di tessuto e tra specie diverse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della fondazione Blazer, del Medical Biotechnology Program di Biomedical Sciences, UIC Rockford e del Department of Health Science Education, UIC Rockford. Gli autori ringraziano Ananya Sangineni e James Bradley per il loro contributo al progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1--75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A.
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R.
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
