Summary
Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.
Abstract
Nanomalzeme maruziyeti, hücrelerde replikasyon stresine ve genomik kararsızlığa neden olabilir. Kararsızlık derecesi, nanomalzemelerin kimyasına, boyutuna ve konsantrasyonuna, maruz kalma süresine ve maruz kalan hücre tipine bağlıdır. Endojen / eksojen ajanların küresel replikasyonu nasıl etkilediğini aydınlatmak için çeşitli yerleşik yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, DNA lifi testi gibi replikon seviyesi tahliller, bu ajanların replikasyon başlangıcını, sonlandırmalarını ve replikasyon çatalı ilerlemesini nasıl etkilediğini anlamak için zorunludur. Bunu bilmek, nanomalzemelerin mutasyon fiksasyonu ve genomik kararsızlık şansını nasıl artırdığını daha iyi anlamamızı sağlar. Grafen oksit nanopartikül maruziyeti altındaki replikasyon dinamiklerini incelemek için model hücreler olarak RAW 264.7 makrofajlarını kullandık. Burada, nükleotid analogları ile nabız etiketleme, hücre lizisi, nabız etiketli DNA liflerinin slaytlara yayılması, DNA lifleri içindeki nükleotid analoglarının floresan immünoboyanması, konfokal mikroskopi kullanılarak DNA lifleri içindeki replikasyon ara ürünlerinin görüntülenmesi ve bilgisayar destekli bir puanlama ve analiz (CASA) yazılımı kullanılarak replikasyon ara analizini içeren DNA lifi testi için temel protokolü gösteriyoruz.
Introduction
Her hücre döngüsü sırasında, DNA replikasyonu doğru genom duplikasyonu sağlar1. Ökaryotik kromozomal replikasyon esas olarak üç faktöre bağlıdır: çoklu replikasyon orijinlerinin ateşlenmesinin zamanlaması, ateşlenen orijinlerden çıkan çatalların hızı ve bitişik orijinlerden iki replikasyon çatalı2 ile buluştuğunda replikasyon işleminin sona ermesi. Genetik bilginin yavru hücrelere yüksek doğrulukta aktarılması ve genetik bütünlüğün korunması için, doğru DNA replikasyonu çok önemlidir. Düzenli metabolizmadan gelişen veya yapay veya doğal çevresel materyallerden kaynaklanan ajanlar sürekli olarak genoma saldırmaktadır. Bu endojen ve eksojen ajanlar, bu ajanların neden olduğu DNA hasarı ile karşılaşmaları nedeniyle replikasyon çatallarının yavaşlamasına veya durmasına neden olur ve bu zorluklara yanıt olarak geçici olarak yavaşlayan veya duran çatallara replikasyon stresi3 denir. Replikasyon stresine yanıt olarak, hücreler rahatsız edici replikasyon çatallarının stabilitesini koruyan ve yeniden başlatmalarına izin veren birkaç moleküler yol geliştirmiştir4. Genetik stabilite, hücre sağkalımı ve insan hastalığı açısından, bu replikasyon stres yanıt mekanizmaları, sağlıklı bir genomun korunması, hücre sağkalımının sağlanması ve hastalık oluşum olasılığının azaltılması için anahtar faktörler olarak ortaya çıkmıştır5.
Replikasyon stresi üretebilen eksojen ajanlardan biri nanopartiküllerdir. Nanopartiküller, boyutları 1 nm ila 100 nm6 arasında değişen parçacıklardır. Yüksek yüzey alanları, ayırt edici şekilleri ve benzersiz kimyasal özellikleri nedeniyle, nanopartiküller çeşitli tıbbi, farmasötik, çevresel ve endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadır 7,8. Nanopartiküllerin birçok potansiyel faydası olsa da, bazıları (kalıtsal doğaları veya uzun ömürlülükleri nedeniyle) toksik hale gelebilir. Nanopartiküller ayrıca tıbbi implantların doğal aşınması ve yıpranması nedeniyle oluşabilir ve peri-protez bölgesine salınabilir 9,10.
İnsanların çeşitli uygulamalar için üretilen sayısız nanopartiküle maruz kalması nedeniyle, nanopartikül toksisitesi alanındaki araştırmalar son 10 yılda muazzam bir şekilde artmıştır11. Bu araştırma çabaları, nanopartiküllerin insan sağlığına oluşturduğu potansiyel tehdit hakkında bol miktarda bilgi ortaya çıkarmış olsa da, nanopartiküllerin genotoksisiteye neden olma potansiyeli hakkındaki bilgiler hala sınırlıdır. Şimdiye kadar keşfedilen şey, bu nanopartiküllerin DNA ile fiziksel olarak etkileşime girebileceği, DNA hasarını teşvik edebileceği ve DNA12'nin onarılmasından veya çoğaltılmasından sorumlu proteinlere zarar verebileceği veya müdahale edebileceğidir. DNA replikasyonuna nasıl müdahale ettiklerini tespit etmek için, DNA lifi taraması, radyorezistanslı DNA sentezi (RDS) ve DNA lifi analizi tipik olarak 13,14,15,16 kullanılır.
DNA lifi tarama yöntemi esnektir ve tek molekül seviyesi17'de replikasyon çatal dinamikleri hakkında bilgi verir. Özünde, tuzlanmış bir örtü kayması, DNA sona erdiğinde DNA çözeltisinden yavaşça çekilir. DNA molekülleri, çözeltinin menisküsü tarafından düzleştirilir ve hizalanır. DNA liflerinin homojenliği, aralığı ve hizalaması, doğru ve güvenilir lif yolu uzunluğu ölçümlerini destekler. Tedavilerin uzunluğunu ve sırasını ve stres veya hasara neden olmak için kullanılan ilaçları ayarlayarak, çatal ilerlemesinin birçok yönü bu uygulama kullanılarak izlenebilir. Bu yöntemde, replikasyon çatalının hızının ve ilerlemesinin değerlendirildiği bir çift etiketleme sistemi kullanılır17,18. Öte yandan, 2D jel elektroforezi, agaroz jel elektroforezinde, dallanan DNA yapılarının aynı kütlenin doğrusal DNA moleküllerinden daha yavaş hareket etmesi ve ikisinin 2D bir çalışmada temiz bir şekilde ayrılmasına izin vermesi gerçeğinden yararlanır. Aslında, bu yöntem, DNA moleküllerini ilk çalışmada kütlelerine göre ve ikinci ortogonal çalışmada şekillerine göre ayırmak için araştırılmıştır. Genomik DNA parçalanmasından sonra, nadir replikasyon ve rekombinasyon ara ürünleri dallanma formu geliştirir ve 2D jel19'daki daha yaygın doğrusal moleküllerden ayırt edilebilirler.
RDS yöntemi, küresel DNA sentezinin nasıl etkilendiğini belirlemek için kullanılır. Bu yöntemde, küresel replikasyonun inhibisyon derecesi, [14C] timidin gibi radyoaktif olarak etiketlenmiş nükleotidlerin miktarının, tedavi edilmemiş hücrelere karşı14,20 ile karşılaştırılmasıyla belirlenir. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilmiş hücreler arasındaki radyoetiketlemedeki yüzde farkı, DNA'ya zarar veren ajanın DNA sentezini etkileme derecesini temsil eder. Buna benzer şekilde, başka bir yöntem, hücrelerin DNA sentezi21,22'nin genel oranlarını ölçmek için akış sitometrisi için BrdU (5-bromo-2′-deoksiüridin) gibi nükleotid analoglarını entegre etme yeteneğini kullanır. Bu yöntemler, DNA'ya zarar veren ajanların küresel DNA sentezini nasıl etkilediğini gösterirken, bireysel replikonların nasıl etkilendiğini göstermez. Gerçekten de, replikon seviyesi tahlilleri, toksik parçacık (nanomalzeme) maruziyeti durumunda genomik instabilitenin başlangıcını ve kapsamını daha iyi anlamak için zorunludur. DNA fiber otoradyografisi ve elektron mikroskobu bu 23,24,25,26'yı belirlemek için kullanılan bazı yöntemlerdir.
Eşit aralıklı olmayan kaynaklardan replikasyon kabarcıkları ve çift yönlü replikasyon kavramları ilk olarak elektron mikroskobu ve DNA fiber otoradyografi27,28 gibi tek moleküllü testler kullanılarak geliştirilmiştir. Dallanma replikasyon ara ürünlerinin karbon kaplı bir ızgaraya dağılmış spesifik moleküller üzerinde doğrudan gözlemlenmesi, elektron mikroskobu ile büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Replikasyon çatallarındaki patolojik kaymaları izlemek için bugün hala kullanılmakta olan bu yöntem, DNA replikasyonu28'in ilk ökaryotik kökenini bulmak için kullanılmıştır. Fiber otoradyografi, yeni çoğalan alanların otoradyografik olarak tanımlanması ve tritiye timidin ile kromozomların nabız etiketlemesi kavramı etrafında toplanmıştır. Metazoan genomik sekanslarda orijin yoğunluklarının ve replikasyon çatal oranlarının ilk kantitatif değerlendirmesi DNA fiber otoradyografisi29 ile mümkün olmuştur.
Şu anda, fiber florografi yöntemleri otoradyografinin yerini almıştır, çünkü fiber florografi otoradyografiden çok daha hızlıdır. Fiber florografide, bromo- (Br), kloro- (Cl) veya iyododeoksiüridin (IdU) gibi iki halojenli nükleotid türevi, yeni çoğaltılmış DNA'ya sırayla dahil edilir ve daha sonra antikorlar30 kullanılarak dolaylı immünofloresan ile tanımlanır. Bir veya her iki analogu da içeren yeni ortaya çıkan DNA'nın mikroskobik görünümü, analoglardan birinin bir renkte, diğer analogun farklı bir renkte immünoboyanmasıyla mümkün olur (örneğin, yeni ortaya çıkan DNA'nın IdU kırmızısı ve CldU yeşili ile immünoboyaması ile boyanır) (Şekil 1)21. DNA lifi analizi ile birçok farklı replikasyon ara ürünü türü tanımlanabilir. En yaygın olarak çalışılan bireysel uzatılmış çatallar, inisiyasyonlar ve sonlandırmalardır. Tek tek uzatılmış çatallar, kırmızı ve ardından yeşil (kırmızı-yeşil; Şekil 2A). 13 Bu ara ürünlerin uzunlukları, çatal hızını (yani, çatal uzunluğu / darbe süresi) veya yeni ortaya çıkan DNA'nın ekzonkleolitik bozulmasını iz kısaltması yoluyla ölçmek için sıklıkla kullanılır (Şekil 2E)30,31,32. Mimitou ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, DNA'da çift iplikçik kırılmalarına neden olan bir replikasyon zehiri olan hidroksiüreye uzun süreli maruz kaldıktan sonra, RE11'in33 işe alındığı bulunmuştur. MRE11, 3'-5' ekzonükleaz aktivitesi ile bilinen bir ekzonükleazdır ve onarım için DNA'nın uçlarını kesebilir. Bu nedenle, toksik ajanlara maruz kaldığında, DNA'ya zarar veren bir ajana maruz kalma nedeniyle DNA ipliğinin kısalması olan yeni ortaya çıkan DNA'nın ekzonkleolitik bozulması gözlemlenebilir34.
Fiziksel engellerin (DNA-protein kompleksleri veya DNA lezyonları), kimyasal engellerin veya mutasyonların neden olduğu replikasyon çatalı kırılmaları, replikasyonu durdurabilir ve yeniden başlatmak için homolog rekombinasyon gerektirebilir. Bu, bozulmuş çatal ilerlemesi olarak bilinir. Çok sayıda in vitro ve in vivo araştırma, transkripsiyonun zaman zaman replikasyon çatalının bu şekilde ilerlemesini önleyebileceğini göstermiştir35.
İnisiyasyonlar, birinci veya ikinci darbe sırasında başlayan ve ateşlenen replikasyon kökenleridir. İlk darbe sırasında ateşlenen ve aktif olmaya devam eden replikasyon çatallarına sahip orijinler yeşil-kırmızı-yeşil bir desene sahiptir (Şekil 2B, daha düşük). İkinci nabız sırasında başlayan orijinler sadece yeşil bir kalıba sahiptir (Şekil 2B, üstte) ve bazen yeni başlatılan orijinler olarak adlandırılır, bu nedenle bu orijinler ilk nabız sırasında başlayanlardan ayırt edilebilir. İki deneysel koşul arasında yeni ateşlenen kökenlerin göreceli yüzdelerinin karşılaştırılması, bir hücrenin DNA'ya zarar veren bir ajana veya bir proteinin varlığına veya yokluğuna nasıl tepki verdiğini anlamayı sağlar. Sonlandırmalar, bitişik replikonlardan iki çoğaltma çatalı birleştiğinde oluşturulur ve kırmızı-yeşil-kırmızı bir desene sahiptirler (Şekil 2D)30.
Yukarıda açıklanan gerçeklere dayanarak, DNA lifi analizi şu anda nanomalzemeler gibi toksik ajanların neden olduğu DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonu incelemek için tercih edilen bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Araştırmacılar artık bu teknolojinin keşfi sayesinde ökaryotlarda genom çapında DNA replikasyonunun dinamikleri hakkında hem nicel hem de nitel olarak iyi bir anlayışa ve bilgiye sahipler36. Sonuç değişkenlerine dayanarak, çeşitli metodolojiler benimsenebilir. Dış ajanlar / nanopartiküller tarafından indüklenen DNA hasarındaki varyasyonları incelemek için bazı yöntem örnekleri Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan DNA lifi analiz yönteminin genel amacı, nanopartiküllerin in vitro replikasyon sürecini nasıl etkilediğini ve çeşitli dokuları farklı şekilde nasıl etkilediklerini belirlemektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antikorların ve tamponun hazırlanması
- Birincil antikor çözeltisini, fare anti-BrdU'sunu %5 BSA'da 1:300 seyreltmede ve sıçan anti-BrdU'yu %5 BSA'da 1:500 seyreltmede hazırlayın.
- İkincil antikor çözeltisi olan alexafluor 594 tavşan anti-faresini %5 BSA'da 1:300 seyreltmede ve alexafluor 488 tavuk anti-faresini %5 BSA'da 1:500 seyreltmede hazırlayın.
- Üçüncül antikor çözeltisini, alexafluor 594 keçi anti-tavşanını %5 BSA'da 1:1.000 seyreltmede ve alexafluor 488 keçi anti-tavuğunu %5 BSA'da 1:1.000 seyreltmede hazırlayın.
- 2 mL 1M Tris (pH 7,4), 1 mL 0,5 M EDTA ve 0,5 mL %10 SDS ile ddH2O'da 10 mL lizis tamponu hazırlayın.
2. Lif tahlili için hazırlık
- 1. Gün: Lif testi için hücre kültürü ve nanomalzeme tedavisi
- Plaka RAW 264.5 makrofaj hücreleri veya ilgilenilen hücreler, böylece hücreler deney günü büyümelerinin log fazında olurlar. RAW hücreler için, her koşul için 24 delikli plakalara 5 x 104 hücre/kuyu ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 ve% 98 nem oranına sahip 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun. Tablo 1, kullanılan medyanın bileşenlerini açıklamaktadır. Hücrelerin% 75 -% 80 akıcılığa kadar büyümesine izin verin17,37.
- Hücreler% 75 -% 80 akıcılık seviyesine ulaştıktan sonra, ortamı plakalardan çıkarın, ortamın yarısını alın ve CldU darbesi (CldU rezervi) için ayırın ve diğer yarısına 50 μM'lik son konsantrasyonda 5 μL IdU ekleyin. IdU içeren hücreleri inkübatöre 20 dakika boyunca yerleştirin.
- CldU rezerv ortamını önceden ısıtılmış halde tutmak için 37 ° C'ye yerleştirin. CldU'yu bu ortama CldU darbesinden hemen önce ekleyin.
- 20 dakika sonra, IdU-orta karışımını aspire edin ve plakayı hafifçe döndürerek hücreleri 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile hafifçe yıkayın. PBS'yi atın.
- Hücreleri, ortamın 500 μL'sinde çeşitli nanopartikül konsantrasyonlarıyla tedavi edin ve 30 dakika daha inkübe edin. Bu çalışma için, 25 μg / mL konsantrasyonda işlenmiş grafen oksit nanopartikülleri kullanın.
- İşlem-ortam karışımını aspire edin ve plakayı hafifçe döndürerek hücreleri 500 μL PBS ile hafifçe yıkayın. PBS'yi atın. 5 μL CldU ekleyin (100 μM final)
- konsantrasyon) CldU rezerv ortamına yerleştirin ve hücreleri CldU rezerv ortamı ile örtün. Hücreleri 20 dakika boyunca CldU nabzı süresince inkübatöre yerleştirin.
- Hücreleri PBS ile yıkayın, 3-4 dakika kazıyın veya deneyin ve ardından plakaya 5 mL ortam ekleyin ve hücreleri toplayın.
- 4 dakika boyunca 264 x g'de döndürün. Ortamı çıkarın ve hücreleri 1 mL buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Bir tripan mavisi tahlil (hemositometre sayımı) kullanarak hücre sayılarını belirleyin ve ardından hücreleri ~ 200-400 hücre / μL'ye seyreltin.
NOT: Mümkünse, hücrelerin buzun üzerinde oturduğu süreyi sınırlayın. Bu, slaytın üst kısmı boyunca bir hücre çözeltisi boncuğu elde edilmesine yardımcı olabilir. Buz üzerinde tutulurlarsa, 30 dakikadan az bir süre açık tutun.
- 1. Gün: DNA liflerinin hazırlanması
- Bir kalem kullanarak, slaytları (cam slayt, 75 mm x 25 mm) deneysel koşul ve tarihle etiketleyin.
- Bir pipete 2 μL hücre alın, pipeti ~45° açıyla tutun, pipeti slayt etiketinin yaklaşık 1 cm altına yerleştirin ve pipeti yatay olarak slayt etiketine taşıyın. Pipet slayt boyunca hareket ederken, hücre çözeltisinin bir kısmını her seferinde serbest bırakın. Her slaytta birden çok hücre satırı oluşturun (kritik adım).
NOT: Slayt boyunca yatay bir hücre süspansiyonu çizgisi olmalıdır. Hücre süspansiyonu boncuklanırsa, hücre süspansiyonuna sahip kaba 5-10 μL hücre ortamı ekleyin, çünkü bu, çözeltinin tekrar uygulandığında slayda yapışmasına yardımcı olabilir. - Çözelti yapışkan ve yapışkan görünene kadar hücrelerle çözeltinin buharlaşmasına izin verin. Bu noktada, bazı sıvılar hücrelerle ilişkilidir, ancak fazla değildir. Bu adım 8-20 dakika sürer ve havada ne kadar nem olduğuna bağlı olarak değişir.
NOT: Tüm çözeltinin buharlaşmadığından emin olun, çünkü bu, DNA'nın hepsi olmasa da çoğu birbirine yapışıp ayrılamayacağından, düz ve hizalanmış DNA liflerinin elde edilmesini çok zorlaştırır. - Çözelti yapışkan olduğunda, pipet ucunun slayta temas etmesine izin vermemeye dikkat ederek, hücreleri her hücre satırı için 15 μL yayılma (lizis) tamponu ile kaplayın. 10 dakika bekleyin. Slaydı 25° açıyla eğin ve slaydın etiketini yatay olarak bir tüp rafının kenarına yerleştirin (etiketin alt kısmı tüp rafının kenarıyla aynı hizada olmalıdır).
- DNA'nın, son slaytların yapıldığı andan itibaren en az 4 saat boyunca hava kurumasına izin verin.
NOT: 4 saat ila 12 saatlik bir süre kurutma için iyidir. Ancak, gece boyunca kurumasına izin vermeyin. Gece boyunca kurumasına izin verilirse, çok fazla gevşemiş DNA olacaktır, ancak çok az sayıda düz ve hizalanmış DNA lifi olacaktır.
- 1. Gün: DNA liflerinin sabitlenmesi ve dondurulması
- Slaytlar kuruduktan sonra, slaytları 2 dakika batırarak slaytları metanol: asetik asit (3: 1) ile sabitleyin. Bu adımı bir davlumbazın altında gerçekleştirin ve slaytların sınırlı ışığa maruz kalan bir alanda gece boyunca kurumasını bekleyin veya slaytları bir teneke folyo çadırla örtün.
- 2. Gün
- Slaytları cam bir slayt taşıyıcısına yerleştirin. Slaytları en az 24 saat boyunca −20 ° C'ye yerleştirin. Bu adım, görüntünün çözünürlüğünü veya netliğini artırır.
3. DNA lifi testinin yapılması
- DNA'nın denatürasyonu
- Kapaklı küçük pipet ucu kutuları kullanarak nemlendirilmiş bir oda hazırlayın. Kapları yarı yarıya suyla doldurun ve en az 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
- Slaytları −20 ° C'den çıkarın ve birkaç saniye boyunca buzunu çözün. Slaytları dikkatlice deiyonize (DI) su içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin, böylece kaplanmış yüzeyler kavanozun duvarlarına temas etmez. Slaydı 20 sn boyunca inkübe edin ve ardından suyu dikkatlice dökün.
- Coplin kavanozuna tüm slaytları kaplayacak şekilde 2,5 M HCL ekleyin. 80 dakika bekleyin. Bu, protokolde kritik bir adımdır. Zamandaki bir değişiklik, görüntünün sonucunu değiştirebilir.
- Slaytları 1x PBS artı Tween (PBS +% 0.1 Tween [son konsantrasyon]) ve daha sonra oda sıcaklığında (RT) her biri 3 dakika boyunca PBS ile 2x yıkayın.
- İmmün boyama
- Aşağıdaki adımlar için slaytları nemlendirilmiş odada tutun. Slaytları PBS'de RT'de 30 dakika boyunca %5 BSA'da bloke edin ve kapak fişleri, Western leke torbasından yapılmış kapak fişleri veya şeffaf plastik tabakalarla örtün.
- Bloke ettikten sonra, fazla blokaj solüsyonunu çıkarmak için kapak kapağını dikkatlice çıkarın, blokaj solüsyonunu çıkarın ve slaytı bir kağıt havlu üzerinde lekeleyin (havlu üzerindeki slayta dokunun).
- Slaytın uzunluğu boyunca 100 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin. Yeni bir plastik kapak kapağı ekleyin ve 2 saat bekleyin. Kapak kapağını eklerken, kabarcık oluşmadığından emin olun.
- 2 saat sonra, antikor çözeltisini çıkarın ve slaytları RT'de PBS dolu bir Coplin kavanozunda 2 kez durulayın. slaytları yıkamak için her seferinde taze PBS kullanın.
- Her slayt boyunca %5 BSA 200 μL (üç ila dört damla) ekleyerek slaytları tekrar bloke edin ve plastik bir kapak parçası ekleyin. 15 dakika bekleyin.
- Kapak kapağını çıkarın, fazla BSA'yı bir kağıt havlu üzerine çıkarın ve slaytın uzunluğu boyunca 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Yeni bir plastik kapak parçası ekleyin ve 1 saat bekleyin.
- Kapak kapağını çıkarın, fazla BSA'yı bir kağıt havlu üzerinde çıkarın ve slaytları RT'de PBS'de 2 kez yıkayın.
- Her slayt boyunca %5 BSA 200 μL (üç ila dört damla) ekleyerek slaytları tekrar bloke edin ve plastik bir kapak parçası ekleyin. 15 dakika bekleyin.
- Gerekirse, kapak kapağını çıkarın, fazla BSA'yı bir kağıt havlu üzerinde çıkarın ve slaytın uzunluğu boyunca 100 μL üçüncül antikor çözeltisi ekleyin. Yeni plastik kapak fişleri ekleyin ve 30 dakika bekleyin.
- Slaytları PBS 3x ile yıkayın. Fazla PBS'yi çıkarın ve tamamen kurumasını bekleyin.
- Kuruduktan sonra, montaj ortamını ekleyin ve kabarcıkların önlenmesi için cam kapak kayışlarını (24 mm x 60 mm) montaj ortamının üzerine dikkatlice yerleştirin. Slaytları yeniden etiketleyin ve gece boyunca karanlıkta bırakın.
4. Görüntü alma
- İmmün boyalı DNA liflerini, bir kamera, 60x objektif ve alexafluor 488 ve 594 boyalarını tespit etmek için uygun filtre setleri ile donatılmış bir immünofloresan mikroskop kullanarak görselleştirin.
- Liflerin iyi ayrıldığı ve dolaşık olmadığı bölgelerde analiz için görüntü alın. Slaytın yalnızca bir bölümünde görüntü çekmek, slaytta bulunan tüm çoğaltma ara ürünleriyle ilgili temsili veriler sağlamayabileceğinden, slayt boyunca farklı alanlardaki görüntüleri yakalamak önemlidir.
- Mümkünse, bir slayt üzerinde 20 farklı bölgeden fiber görüntüler elde edin. Önyargıyı önlemek amacıyla görüntü çekme alanlarını seçmek için yalnızca bir kanal kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yeterli görüntü elde edildikten sonra (koşul başına 20-100 görüntüden), çoğaltma ara ürünlerinin tanımlanması, ölçülmesi ve sayılması gerekir. Elyafların bir program38 aracılığıyla manuel veya otomatik olarak analiz edilip edilmediğini, bir elyafın sayılması veya puanlanması (veya sayılmaması veya ölçülmemesi) için hangi özelliklere sahip olması gerektiğini açıkça tanımlamak gerekir39. Örneğin, aşağıdaki sorular düşünülebilir. (1) Lif boyunca sadece %100 immünofloresan içeren lifler ölçülmeli ve sayılmalı mıdır, yoksa immünofloresan içermeyen bazı bölgeler içerebilir mi (örneğin, Şekil 4Ai, ii,iii'deki tüm ara ürünler analiz edilmeli mi yoksa bunların sadece bir alt kümesi mi?)? Sinyal kaybı olan fiberleri analiz ediyorsanız, bir fiber içinde kabul edilebilir maksimum sinyal kaybı nedir ve fiberde herhangi bir sinyalden yoksun olabilecek maksimum sürekli piksel sayısı nedir (örneğin, Şekil 3Aiv kırmızı-yeşil veya yalnızca kırmızı-ara olarak kabul edilir mi?)? (2) Minimum ve maksimum fiber genişlikleri / uzunlukları ne olmalıdır? (3) Bir fiberin ölçülüp ölçülmeyeceğine karar verirken sinyal-gürültü (S:N) oranı ne olmalıdır (örneğin, analiz etmek için Şekil 4B'de kaç fiber seçilmelidir?)? (4) Bir fiberin sayılmaması veya ölçülmemesi için görüntü kenarına ne kadar yakın olması gerekir? (5) Bir floresan sinyali sarı ise, bunu kırmızı veya yeşil olarak mı sayabiliriz (örneğin, Şekil 4C'deki replikasyon ara maddesinin sarı kısmı kırmızı veya yeşil olarak sayılmalı mıdır?)? (6) Bir renk segmentinin gerçek bir sinyal olarak sayılması için ne kadar süre olması gerekir (örneğin; Şekil 4D'deki replikasyon ara maddesi yalnızca yeşil bir parça mı, yeşil-kırmızı-yeşil bir parça mı yoksa yeşil-kırmızı bir iz mi?)? (7) Otomatik bir fiber analiz programı kullanılıyorsa, program az önce gerçekleştirdiği ölçüm/sayımda kendine ne kadar güveniyor? (8) Lifler manuel olarak analiz ediliyorsa, analiz zaman içinde ve bireyler arasında ne kadar tutarlı olmalıdır?
Tipik olarak, DNA lifi analizi için kullanılan parametreler şunlardır:
Sinyal-gürültü oranı: 3 (fiber yoğunluğu, arka plan yoğunluğundan üç kat daha fazladır)
Lif kalınlığı: ≤8 piksel genişlik
Minimum boyut: yalnızca kırmızı veya yeşil ve 10 piksel; her segmentte kırmızı-yeşil izler ≥10 piksel; kırmızı-yeşil-kırmızı veya yeşil-kırmızı-yeşil, her segmentte ≥10 piksel uzunluğunda izler.
Floresan sinyalinin sürekliliği: en az% 80 ve sinyalde 6 pikselden büyük boşluk yok.
Değerlendirmede güven: Güven değerleri bir görüntüde ve görüntüler arasında birbirine benzer olmalıdır.
Yukarıda belirtilen parametrelere ek olarak, bir diğer önemli kriter de görüntüleme ve analiz sırasında diğer liflerle örtüşmeyen berrak bir lifin seçilmesidir.
Şekil 5A, kontrolün (Şekil 5Ai) ve grafen oksit nanopartikül ile muamele edilmiş makrofaj DNA'sının (Şekil 5Aii, iii) temsili görüntülerini göstermektedir. Görüntü, salt okunur izlerde (sonlandırmalar) bir artış ve grafen oksitle muamele edilmiş hücrelerde yeni ateşlenen kökenlerde kontrole kıyasla bir azalma göstermektedir (Şekil 5C). Görüntü sayısını ve görüntülerin çekildiği slaytın konumunu dikkate almak da önemlidir. Şekil 5Aiii,C'de gösterildiği gibi, aynı durumun farklı bir bölgesinde replikasyon ara ürünlerinin paterninde bir varyasyon (kontrole kıyasla yeni kökenlerde bir artış) gözlenmiştir. Bu tür gözlemlerden birkaçı genel sonucu etkilemese de, tüm temsili alanları dahil ederek slaytı görüntülemeye özen gösterilmelidir. Slaytın toplam alanını beş ila altı bölgeye bölmek ve her slayt için kesin fiber verileri bulmak üzere her bölgeden birden fazla görüntü (ör. 10 görüntü) almak ideal olacaktır. Birden fazla slayttan/koşuldan yaklaşık 500 ara ürün (Şekil 5B) seçmek idealdir. Replikasyondaki bu varyasyonlarla, DNA lifi analizinden elde edilen ara niceleme, grafen oksit nanopartiküllerinin neden olduğu DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonu veya diğer nanomalzemelerin genotoksisitesini araştırmak için kullanılabilir. Bu nedenle, genom çapında DNA replikasyonunun dinamiklerinin hem nitel hem de nicel bir anlayışı, girişte bahsedilen diğer analizlere kıyasla bu yeni metodoloji ile elde edilebilir.
Şekil 1: DNA lifi testi. DNA lifi analizindeki ana adımlara genel bir bakış ile tahlilin şematik gösterimi. Ölçek: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DNA replikasyon ara ürünlerinin immün boyaması. IdU (kırmızı) ve CldU (yeşil) ile sıralı darbe etiketlemesi ile tanımlanan farklı çoğaltma ara ürünlerinin şematik gösterimi. Ölçek: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nanopartikül maruziyeti. Nanopartikül kaynaklı DNA hasarındaki varyasyonları incelemek için farklı metodolojiler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Puanlanacak DNA liflerinin özellikleri. Bir görüntüdeki çoğaltma aracılarına örnekler. (A) İmmünofloresandaki boşluklar; (i) Replikasyon ara maddesi boyunca %0 immünofloresan sinyal kaybı; (ii) ~%7 sinyal kaybı; (iii) %50 sinyal kaybı; ve (iv) %>90 sinyal kaybı. (B) Çakışan birçok çoğaltma ara ürünü olan bir bölge (ok, lif örtüşmesinin açık olduğu bölgeyi gösterir). (C) Sarı bölgeli bir DNA lifi. (D) Yoruma açık bir replikasyon ara maddesi (ok, lifteki boşlukları gösterir). Ölçek: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: DNA lifi analizi ve yorumu. (A) (i) makrofaj hücrelerini kontrol eden ve (ii,iii) 25 μg / mL konsantrasyonda 20 dakika boyunca nanopartiküllerle muamele edilen makrofaj hücrelerinden gelen temsili DNA lifi görüntüleri. Slaytın farklı bölgelerinden ii ve iii görüntüleri alınmıştır. (B) Kontrol ve nanopartikül ile muamele edilmiş koşulların temsili otomatik yazılım analizi. Bu analiz için, Wang ve ark.38 tarafından geliştirilen otomatik DNA lifi izleme ve ölçüm programını kullandık. Şekildeki sayılar, analiz edilen DNA izlerinin sayısını göstermektedir. (C) Kontrol ve nanopartikül ile muamele edilmiş koşulların yazılım analizinin grafiksel gösterimi. NP nanopartikülleri temsil eder. Ara popülasyonun göreceli yüzdesi (örneğin, yalnızca kırmızı için), analiz edilen toplam ara ürünlerden hesaplanır. NP ile işlenmiş görüntü 1 ile resim 2 karşılaştırıldığında, iki görüntü arasında büyük farklılıklar vardır. Bu nedenle, deneysel bir durumun çoğaltma işlemini nasıl etkilediğini anlamak için slayt boyunca birçok görüntü elde etmek önemlidir. Kısaltmalar: R = kırmızı; G = yeşil. Ölçek: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Medya kompozisyonu |
| %10 Fetal Sığır Serumu |
| %1 Penisilin-Streptomisin solüsyonu (10000 ünite/ml) |
| %1 L Glutamin (200 mM) |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartalının Orta-Yüksek Glikozu |
Tablo 1: Makrofaj hücre kültürü için kullanılan ortam bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, DNA lifi testi yoluyla nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olacak bir yöntemi tartışıyoruz. Standart tahlilde yer alan başlıca kritik adımlar protokolde açıklanmıştır (adım 2.2.2 ve adım 3.1.3). Slaytlarda ışığa bağlı DNA kırılmalarını önlemek ve tekrarlanabilirliği artırmak için her zaman sınırlı baş üstü ışığa maruz kalma ve sürekli hava akışı olan bir alan kullanılması önerilir. Slaytlardaki hücre lizatının kuruması için gereken süreye dikkat edilmelidir. Aşırı kuruma, lif yayılımını olumsuz yönde etkileyecektir. İkinci kritik adım, bir asit çözeltisi kullanılarak lif denatürasyonudur. Asit yıkama süresi, aynı deneydeki tüm slaytlar için eşit tutulmalıdır. Farklı hücre tipleri ve laboratuvar ortamları için en uygun koşulları (lizis süresi, slayttaki lizat hacmi, kuruma süresi ve asit yıkama süresi) bulmak için bu iki adımda sorun giderme önerilir.
Şekil 3'te tartışıldığı gibi, nanopartiküllerin maruz kalma süresi, nanopartiküller tarafından indüklenen DNA replikasyon dinamiklerindeki değişimin kantitatif olarak belirlenmesi için değiştirilebilir. Replikasyon dinamiklerinin ilk etkisini belirlemek için, farklı dozajlarla 1 dakika, 20 dakika veya 30 dakika gibi kısa süreli bir maruz kalma uygun olacaktır. Hücrelerin nanomalzemelere uzun süreli maruz kalmasından sonra replikasyon modellerindeki fark (Şekil 2'de gösterildiği gibi), nanopartikül işleminden önce ve sonra IdU ve CIdU maruziyet kalıpları (her biri 20 dakika) karşılaştırılarak belirlenebilir. Bu yaklaşım, farklı maruz kalma zamanlarında çatal duruşunu, çatal yavaşlamasını ve menşe ateşlemesindeki farkı belirlemek için kullanılabilir; bu, nanomalzemelere akut ve kronik maruz kalmanın etkileri olarak yorumlanabilir39,40.
DNA replikasyonundaki varyasyonu tespit etmek için DNA taraması ve RDS yöntemi gibi birkaç umut verici teknik vardır; Bununla birlikte, bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, DNA lifi tahlili, analiz için pahalı aletlere ihtiyaç duymadan uygun ve uygun maliyetlidir41. Bu yöntemin sınırlamaları, deneysel süre, niceleme için yeterli görüntü almak için gereken süre ve yazılım analizidir. Bununla birlikte, elbette, bu yaklaşım, hücre hatlarında, farklı doku örneklerinde ve farklı türler arasında parçacıkların neden olduğu genomik kararsızlığın belirlenmesinde nanotoksikoloji araştırmalarını destekleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Blazer vakfı, Biyomedikal Bilimler Tıbbi Biyoteknoloji Programı, UIC Rockford ve UIC Rockford Sağlık Bilimleri Eğitimi Bölümü'nden finansal destek kabul etmektedir. Yazarlar, projeye katkılarından dolayı Ananya Sangineni ve James Bradley'e teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well plate | Fisher brand | FB012929 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Alexa flour 594 goat anti-rabbit | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa fluor 488 chicken anti-rat | Invitrogen | A21470 | |
| Alexa fluor 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse | Invitrogen | A11062 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2153 | |
| CldU | Sigma Aldrich | 50-90-8 | |
| Coverslips (22 x 50 mm) | Fisher brand | 12-545-EP | |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher brand | 12-550-11 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| IdU | Sigma Aldrich | 54-42-2 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Mouse Anti-BrdU | BD Biosciences | 347580 | |
| Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010072 | |
| Rat anti-BrdU | Abcam | BU1--75(ICR1) | |
| Raw 264.5 macrophage cells | ATCC | TIB-71 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Silane-Prep slides | Sigma Aldrich | S4651-72EA | |
| Superfrost gold plus slides | Fischer scientific | 22-035813 | |
| Tris pH 7.4 | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
References
- Waga, S., Stillman, B. The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 721-751 (1998).
- Gambus, A.
- Berti, M., Cortez, D., Lopes, M. The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 633-651 (2020).
- Carr, A. M., Lambert, S. Replication stress-induced genome instability: The dark side of replication maintenance by homologous recombination. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4733-4744 (2013).
- Berti, M., Vindigni, A. Replication stress: Getting back on track. Nature Structural and Molecular Biology. 23 (2), 103-109 (2016).
- Montes-Burgos, I., et al. Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies. Journal of Nanoparticle Research. 12 (1), 47-53 (2010).
- Khan, I., Saeed, K., Khan, I. Nanoparticles: Properties, applications and toxicities. Arabian Journal of Chemistry. 12 (7), 908-931 (2019).
- Ealia, S. A. M., Saravanakumar, M. P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 263 (3), 032019 (2017).
- Bijukumar, D. R., et al. Differential toxicity of processed and non-processed states of CoCrMo degradation products generated from a hip simulator on neural cells. Nanotoxicology. 12 (9), 941-956 (2018).
- Bijukumar, D., Segu, A., Chastain, P., Mathew, M. T. Implant-derived CoCrMo alloy nanoparticle disrupts DNA replication dynamics in neuronal cells. Cell Biology and Toxicology. 37 (6), 833-847 (2021).
- Shekhar, S., et al. Deciphering the pathways for evaluation of nanotoxicity: Stumbling block in nanotechnology. Cleaner Engineering and Technology. 5, 100311 (2021).
- Bhabra, G., et al. Nanoparticles can cause DNA damage across a cellular barrier. Nature Nanotechnology. 4 (12), 876-883 (2009).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Chastain, P. D., et al. DNA damage checkpoint responses in the S phase of synchronized diploid human fibroblasts. Photochemistry and Photobiology. 91 (1), 109-116 (2015).
- Frum, R. A., Deb, S., Deb, S. P. Use of the DNA fiber spreading technique to detect the effects of mutant p53 on DNA replication. p53 Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. 147-155 (2013).
- Ord, M. G., Stocken, L. A. Studies in synthesis of deoxyribonucleic acid: Radiobiochemical lesion in animal cells. Nature. 182 (4652), 1787-1788 (1958).
- Moore, G., Sainz, J. J., Jensen, R. B. DNA fiber combing protocol using in-house reagents and coverslips to analyze replication fork dynamics in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (2), 101371 (2022).
- Blin, M., et al. Transcription-dependent regulation of replication dynamics modulates genome stability. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 58-66 (2019).
- Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. 2D gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast. DNA Electrophoresis. , Humana. New York, NY. 43-59 (2020).
- Painter, R. B. Radioresistant DNA synthesis: An intrinsic feature of ataxia telangiectasia. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 84 (1), 183-190 (1981).
- Aten, J. A., Bakker, P. J. M., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. N. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. The Histochemical Journal. 24 (5), 251-259 (1992).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo-and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Huberman, J. A., Riggs, A. D. Autoradiography of chromosomal DNA fibers from Chinese hamster cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 55 (3), 599-606 (1966).
- Ockey, C. H. Differences in replicon behavior between X-irradiation-sensitive L5178Y mouse lymphoma cells and AT fibroblasts using DNA fiber autoradiography. Radiation Research. 94 (2), 427-438 (1983).
- Brayner, R.
- Mendez-Bermudez, A., et al. Genome-wide control of heterochromatin replication by the telomere capping protein TRF2. Molecular Cell. 70 (3), 449-461 (2018).
- Vindigni, A., Lopes, M. Combining electron microscopy with single molecule DNA fiber approaches to study DNA replication dynamics. Biophysical Chemistry. 225, 3-9 (2017).
- Herrick, J., Bensimon, A. Single molecule analysis of DNA replication. Biochimie. 81 (8-9), 859-871 (1999).
- Taylor, J. H., Miner, P. Units of DNA replication in mammalian chromosomes. Cancer Research. 28 (9), 1810-1814 (1968).
- Nieminuszczy, J., Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. The DNA fibre technique-tracking helicases at work. Methods. 108, 92-98 (2016).
- Lemaçon, D., et al. MRE11 and EXO1 nucleases degrade reversed forks and elicit MUS81-dependent fork rescue in BRCA2-deficient cells. Nature Communications. 8, 860 (2017).
- Vindigni Lab. Replication Fork Protection. Washington University School of Medicine. , https://vindignilab.wustl.edu/research/replication-fork-protection (2020).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. DNA end resection: Many nucleases make light work. DNA Repair. 8 (9), 983-995 (2009).
- Schlacher, K., et al. Double-strand break repair-independent role for BRCA2 in blocking stalled replication fork degradation by MRE11. Cell. 145 (4), 529-542 (2011).
- Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. The EMBO Journal. 24 (6), 1267-1276 (2005).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: Evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. The Journal of Cell Biology. 140 (6), 1285-1295 (1998).
- Halliwell, J. A., Gravells, P., Bryant, H. E. DNA fiber assay for the analysis of DNA replication progression in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 54 (1), 115 (2020).
- Wang, Y., et al. Automated DNA fiber tracking and measurement. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1349-1352 (2011).
- Quinet, A., Carvajal-Maldonado, D., Lemacon, D., Vindigni, A. DNA fiber analysis: Mind the gap. Methods in Enzymology. 591, 55-82 (2017).
- Técher, H., et al. Replication dynamics: Biases and robustness of DNA fiber analysis. Journal of Molecular Biology. 425 (23), 4845-4855 (2013).
- Martins, D. J., Tirman, S., Quinet, A., Menck, C. F. Detection of post-replicative gaps accumulation and repair in human cells using the DNA fiber assay. Journal of Visualized Experiments. (180), e63448 (2022).
