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टाइप 1 मधुमेह के चूहे के घाव मॉडल के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64914
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1
1College of Nursing, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

पुरुष एसडी चूहों में स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन-प्रेरित मधुमेह घाव मॉडल वर्तमान में टाइप 1 मधुमेह मेलेटस में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। यह प्रोटोकॉल इस मॉडल के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का वर्णन करता है। यह संभावित चुनौतियों को भी प्रस्तुत करता है और संबोधित करता है और मधुमेह के घावों की प्रगति और एंजियोजेनिक विशेषताओं की जांच करता है।

Abstract

स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन की एक उच्च खुराक के बाद चूहों के डोरसम पर पूर्ण मोटाई वाली त्वचा छांटना टाइप 1 मधुमेह के घावों के पशु मॉडल के निर्माण के लिए एक सामान्य तरीका है। हालांकि, अनुचित हेरफेर चूहों में मॉडल अस्थिरता और उच्च मृत्यु दर का कारण बन सकता है। दुर्भाग्य से, टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडलिंग पर कुछ मौजूदा दिशानिर्देश हैं, और उनमें विस्तार की कमी है और विशिष्ट संदर्भ रणनीतियों को प्रस्तुत नहीं करते हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडल के निर्माण के लिए पूरी प्रक्रिया का विवरण देता है और मधुमेह के घावों की प्रगति और एंजियोजेनिक विशेषताओं का विश्लेषण करता है। टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडलिंग में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन की तैयारी, टाइप 1 मधुमेह मेलेटस का प्रेरण, और घाव मॉडल का निर्माण। घाव के बाद 7 वें और 14 वें दिन घाव क्षेत्र को मापा गया था, और चूहों की त्वचा के ऊतकों को हिस्टोपैथोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए निकाला गया था। परिणामों से पता चला है कि टाइप 1 मधुमेह मेलेटस 55 मिलीग्राम / किग्रा स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन द्वारा प्रेरित था जो कम मृत्यु दर और उच्च सफलता दर से जुड़ा था। प्रेरण के 5 सप्ताह के बाद रक्त शर्करा का स्तर अपेक्षाकृत स्थिर था। मधुमेह के घाव भरने की दर 7 वें और 14 वें दिन (पी < 0.05) पर सामान्य घावों की तुलना में काफी कम थी, लेकिन दोनों 14 वें दिन 90% से अधिक तक पहुंच सकते थे। सामान्य समूह की तुलना में, 14 वें दिन मधुमेह के घावों की एपिडर्मल परत बंद होना अधूरा था और इससे पुन: उपकलाकरण में देरी हुई और एंजियोजेनेसिस में काफी कमी आई (पी < 0.01)। इस प्रोटोकॉल के आधार पर निर्मित टाइप 1 मधुमेह घाव मॉडल में पुरानी घाव भरने की विशेषताएं हैं, जिसमें खराब बंद होना, पुन: उपकलाकरण में देरी और सामान्य चूहे के घावों की तुलना में एंजियोजेनेसिस में कमी शामिल है।

Introduction

टाइप 1 मधुमेह मेलेटस (टी 1 डीएम) एक पुरानी चयापचय बीमारी है जो हाइपरग्लेसेमिया और अग्नाशय ीβ-कोशिकाओं के विनाश की विशेषता है। एक टी 1 डीएम घाव एक पुरानी गैर-उपचार घाव है और मनुष्यों में मधुमेह की सबसे आम और विनाशकारी जटिलता 2,3 है। पशु मॉडल घाव भरने के दौरान पैथोलॉजिकल परिवर्तनों और संभावितचिकित्सीय एजेंटों की सुरक्षा और प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोटाइप हैं। अन्य प्रकारों की तुलना में, नर स्प्राग-डॉवले (एसडी) चूहे स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन (एसटीजेड) के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं और कम संबंधित मृत्यु दर दिखाते हैं, जिससे वे मधुमेहघाव अनुसंधान 5,6 में लोकप्रिय हो जाते हैं।

टी 1 डीएम घाव मॉडल के निर्माण के लिए कई तरीकों का वर्णन किया गया है। टी 1 डीएम मॉडल के बारे में, अध्ययनों ने मुख्य रूप से मधुमेह प्रेरण 7,8 की सफलता दर पर एसटीजेड इंजेक्शन विधि के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, मॉडलिंग प्रक्रिया इस ही चरण के असंगत संचालन से ग्रस्त है। एक अध्ययन में, चूहों ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 18 घंटे तक उपवास किया; एसटीजेड इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद 16.67 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा के स्तर वाले चूहों को मधुमेह माना जाता था, और मधुमेह के घाव को 3 सप्ताह9 के बाद पेश किया गया था। इसके विपरीत, एक संबंधित अध्ययन में, झू एट अल ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 12 घंटे के लिए चूहों को उपवास किया; इंजेक्शन के बाद 72 घंटे में 16.7 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा के स्तर वाले चूहों को मधुमेह माना जाता था, और मधुमेह के घाव को 4 सप्ताह10 के बाद पेश किया गया था। कुल मिलाकर, एसटीजेड इंजेक्शन प्रोटोकॉल, मधुमेह निदान मानदंड और घाव परिचय समय में विसंगतियां हैं।

घाव मॉडलिंग के संदर्भ में, अधिकांश अध्ययनों में, पृष्ठीय त्वचा की पूरी मोटाई को सफल मधुमेह प्रेरण11,12,13 के बाद टी 1 डीएम घावों के निर्माण के लिए उत्पादित किया जाता है। यद्यपि यह मॉडल चूहों में त्वचा के संकुचन के लिए अतिसंवेदनशील है, यह घाव भरने के अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है क्योंकि यह कम श्रम-गहन है और सस्ता14,15 है। फिर भी, इस पूर्ण मोटाई वाले छांटने की तकनीक पर विधि-निर्देशित अनुसंधान की कमी है। इसके अलावा, घाव के आकार और स्थान12,16 के बारे में मौजूदा अध्ययनों में कोई समान मानक नहीं हैं। घाव का आकार और स्थान अप्रत्यक्ष रूप से प्रयोगात्मक डिजाइन की स्थिरता और परिणामों की वैज्ञानिक वैधता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, शोधकर्ताओं के लिए संदर्भ के रूप में टी 1 डीएम प्रेरण और घाव मॉडलिंग के लिए एक मानक प्रोटोकॉल की तत्काल आवश्यकता है। इस अध्ययन का लक्ष्य टी 1 डीएम घाव मॉडलिंग के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल की कल्पना करना है जिसे टी 1 डीएम घाव अध्ययन के लिए संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के बाद आयोजित किया गया था, और सभी पशु प्रयोगों को चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (रिकॉर्ड नंबर 2021-13) से प्रबंधन समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. स्ट्रेप्टोज़ोटोसिन इंजेक्शन की तैयारी

  1. 8 सप्ताह की आयु के 15 एसडी पुरुष विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) चूहों का चयन करें और 220 ग्राम ± 20 ग्राम वजन करें। सरल यादृच्छिककरण विधि का उपयोग करके, चूहों को एक मधुमेह समूह (एन = 10) और एक सामान्य समूह (एन = 5) में विभाजित करें।
  2. चूहों के प्रारंभिक वजन को मापें, और 55 मिलीग्राम / किग्रा के प्रशासन के माध्यम से एसटीजेड की खुराक निर्धारित करें।
    नोट: पूर्व प्रयोगों के आधार पर, 55 मिलीग्राम / किग्रा इष्टतम एसटीजेड खुराक है।
  3. एसटीजेड पाउडर को सटीक रूप से तौलें, और इसे एक हल्के प्रूफ कंटेनर में रखें।
  4. एसटीजेड को 1% की एकाग्रता में भंग करने के लिए 0.1 मोल / एल सोडियम साइट्रेट बफर (पीएच 4.5) की उचित मात्रा जोड़ें।
    नोट: सोडियम साइट्रेट बफर को उपयोग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में 2 घंटे के लिए प्री-ठंडा किया जाना चाहिए। एसटीजेड समाधान की तैयारी को बाँझपन सुनिश्चित करना चाहिए।
  5. ड्रग ऑसिलेटर का उपयोग करके 30 सेकंड के लिए हिलाएं। एक आइस बॉक्स में रखें, और एक तरफ रखें।
    नोट: इंजेक्शन 15 मिनट के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

2. टी 1 डीएम मॉडल का प्रेरण

  1. एसटीजेड इंजेक्शन से पहले, चूहों को 18 घंटे के लिए उपवास करें, और पानी तक मुफ्त पहुंच की अनुमति दें।
  2. 1% एसटीजेड समाधान का एक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन करें।
    1. चूहे को पकड़ें, और पेट की त्वचा और इंजेक्शन साइट (दो जांघों की जड़ों और पेट की मध्य रेखा को जोड़ने वाली रेखा का चौराहे) को उजागर करें।
    2. 75% अल्कोहल में भिगोई गई कपास की गेंद का उपयोग करके इंजेक्शन साइट को दो बार कीटाणुरहित करें (एक बार घड़ी की दिशा में और एक बार काउंटरक्लॉकवाइज)। चूहे के सिर को पेट के नीचे रखें।
    3. 45 ° के कोण पर पेट की मध्य रेखा के समानांतर सुई डालें, और त्वचा को छेदने के बाद, सुई कोण को 30 ° तक कम करें, और फिर सुई को 2-3 मिमी डालें। धीरे से सुई प्लग खींचें, यह सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई रक्त या तरल पदार्थ नहीं चूसा जाता है। एसटीजेड समाधान इंजेक्ट करें, सुई को बाहर निकालें, और कपास के फाहे से रक्तस्राव को रोकें।
      नोट: यदि एक पीले तरल पदार्थ को सिरिंज में वापस खींचा जाता है, तो सुई मूत्राशय में प्रवेश कर सकती है, और यदि एक गहरे हरे रंग का तरल पदार्थ खींचा जाता है, तो सुई बड़ी आंत या कैकम में प्रवेश कर सकती है। किसी भी मामले में, सुई को तुरंत हटा दिया जाना चाहिए। पशु का मूल्यांकन पशु चिकित्सा कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए।
  3. एसटीजेड प्रेरण के बाद दिन 3 और दिन 7 पर सुबह 09:00 बजे आकस्मिक (गैर-उपवास या उपवास) रक्त शर्करा के स्तर को मापें।
    नोट: यादृच्छिक रक्त शर्करा माप के लिए समय तय किया गया है। इस प्रोटोकॉल में इसे सुबह 09:00 बजे तय किया जाता है। हालांकि, यह उपयोग किया जाने वाला एकमात्र समय नहीं है। सुई पंचर द्वारा पुच्छल नस से एकत्र किया गया रक्त एक कटी हुई पूंछ से लिए गए रक्त की तुलना में ऊतक द्रव के लिए कम संवेदनशील होता है, इसलिए रक्त शर्करा के मूल्य अधिक सटीक होते हैं।
    1. चूहे के फिक्सेटर का उपयोग करके चूहे को गतिहीन करें (चित्रा 1)।
    2. पुच्छल शिरा का स्थान ज्ञात कीजिए। 75% अल्कोहल में भिगोई गई कपास की गेंद का उपयोग करके चूहे की पूंछ को दो बार कीटाणुरहित करें।
    3. रक्तस्राव को प्रेरित करने के लिए पुच्छल नस को पंचर करें, और ग्लूकोमीटर का उपयोग करके रक्त शर्करा को मापें। रूई के फाहे से खून बहना बंद करें।
      नोट: एसटीजेड इंजेक्शन के बाद 7 वें दिन 16.7 mmol / L से अधिक ग्लूकोज का स्तर T1DM माना जाता है।
  4. चूहों को साप्ताहिक रूप से तौलें, और आहार, पानी का सेवन और मूत्र उत्पादन सहित रक्त शर्करा के स्तर और अन्य मापदंडों को मापें।
  5. एसटीजेड प्रेरण के बाद 8 सप्ताह तक जानवरों को सामान्य रूप से खिलाएं।

3. घाव मॉडल का निर्माण

  1. घाव मॉडलिंग से 1 दिन पहले चूहों को इलेक्ट्रिक रेजर के साथ शेव करें। चूहे के डोरसम साइड पर 5 सेमी × 5 सेमी का मुंडा क्षेत्र आम तौर पर आदर्श होता है।
  2. एक गर्म सामान्य खारा कपास की गेंद के साथ मुंडा क्षेत्र को पोंछें, इसे सूखने दें, और फिर 5 मिनट के लिए डिपिलेटरी क्रीम लागू करें। धुंध के साथ क्षेत्र को साफ करें, और किसी भी अवशिष्ट डिपिलेटरी क्रीम को गर्म सामान्य खारा के साथ धो लें।
  3. चूहों का वजन करें, और 35 मिलीग्राम / किग्रा मानक के आधार पर नेम्बुटल की आवश्यक खुराक की गणना करें। सामान्य लवण का उपयोग करके नेम्बुटल को 3% की एकाग्रता तक घोलें। इस प्रक्रिया के लिए अन्य सामान्य एनेस्थेटिक्स जैसे केटामाइन / ज़ाइलेज़िन या आइसोफ्लुरेन का उपयोग किया जा सकता है। कृपया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के साथ काम करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सबसे अच्छा क्या है।
    नोट: प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए, और नेम्बुटल पाउडर और समाधान को प्रकाश से बचाया जाना चाहिए।
  4. एनेस्थेटाइजेशन से पहले चूहों को 12 घंटे तक उपवास करें। एनेस्थीसिया को इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। संज्ञाहरण प्रशासन के बाद आंखों की सूखापन को रोकने के लिए टेट्रासाइक्लिन आंख मरहम या एक सामान्य आंख स्नेहक का उपयोग करें।
    नोट: संज्ञाहरण को मध्यम माना जाता था जब चूहे की मांसपेशियों को अपेक्षाकृत आराम मिलता था, आंखों की गति गायब हो जाती थी, श्वास नियमित था, और दर्दनाक उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया छोटी थी।
  5. आयोडीन में भिगोई गई कपास की गेंदों का उपयोग करके पृष्ठीय त्वचा को दो बार कीटाणुरहित करें (एक बार घड़ी की दिशा में और एक बार काउंटरक्लॉकवाइज) और 75% अल्कोहल (वैकल्पिक राउंड)।
  6. सूखने के बाद त्वचा को 20 मिमी व्यास के सर्कुलर बायोप्सी पंच से काट लें।
  7. त्वचा को बाँझ बल के साथ तम्बू करें, और फिर पंच कट के निशान के साथ पूर्ण मोटाई वाली त्वचा को हटाने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। एक सामान्य खारा कपास की गेंद के साथ रक्तस्राव बंद करो।
    नोट: घाव की बेहतर सीमा निचले स्कैपुलर सीमा से 5-10 मिमी नीचे और चूहे की रीढ़ की रीढ़ के दाईं / बाईं ओर 5-10 मिमी होनी चाहिए (चित्रा 2)। जब दो घावों का निर्माण किया जाता है तो घाव रीढ़ की हड्डी के साथ सममित होते हैं।
  8. घावों को कवर करने के लिए वैसलीन धुंध का उपयोग करें, और उन्हें रबर टेप के साथ जगह में रखे गए धुंध और सांस लेने योग्य पट्टी के साथ लपेटें। पोस्टऑपरेटिव दर्द से छुटकारा पाने के लिए रोजाना एक बार कारप्रोफेन को चमड़े के नीचे (5 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्ट करें। दिन में एक बार घाव की पट्टी बदलें (दर्द से राहत के लिए कार्प्रोफेन का उपयोग)।
    नोट: पट्टी पूरी होने के बाद किसी भी असामान्यता के लिए चूहे की गति और श्वसन का निरीक्षण करें, और सुनिश्चित करें कि सांस लेने योग्य पट्टी उचित रूप से तंग है।
  9. घाव के नीचे एक शासक रखें, और 14 वें दिन तक एक डिजिटल कैमरे के साथ घाव की तस्वीर लें। संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों के अनुसार 14 वें दिन चूहों को इच्छामृत्यु दें। घाव के किनारे से 5 मिमी घाव त्वचा के ऊतकों को काटें। ऊतक के नमूने को दो भागों में विभाजित करें, दिखाई देने वाले रक्त के दाग को हटाने के लिए उन्हें पीबीएस से धो लें, और फिर उन्हें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के साथ ठीक करें।

4. इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ घाव क्षेत्र की गणना

  1. सॉफ़्टवेयर खोलने के बाद फ़ाइल बटन पर क्लिक करें, और फिर नीचे छोड़ दें और घाव चित्रों को खोलने के लिए खोलें पर क्लिक करें।
  2. सीधे उपकरण का चयन करें, और घाव चित्रों में शासक के साथ 1 सेमी की सीधी रेखा खींचें।
  3. विश्लेषण मेनू में स्केल सेट करें आदेश पर क्लिक करें, और ज्ञात दूरी को 1 पर सेट करें।
  4. फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें, और चित्र पर घाव की रूपरेखा स्केच करें।
  5. विश्लेषण मेनू में माप आदेश पर क्लिक करें, और परिणाम पॉप अप होने के बाद क्षेत्र मान पढ़ें।

5. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होना।

  1. फिक्सेटिव से त्वचा के ऊतकों को हटा दें, इसे फ्यूम हुड में स्केलपेल के साथ पतले वर्गों में काट लें, और इसे निर्जलीकरण कैसेट में रखें।
  2. निर्जलीकरण कैसेट को निर्जलीकरण मशीन में रखें, और निम्नलिखित चरणों में ऊतकों को निर्जलित करें: 4 घंटे के लिए 75% शराब; 2 घंटे के लिए 85% शराब; 2 घंटे के लिए 90% शराब; 1 घंटे के लिए 95% शराब; निर्जल इथेनॉल I और II प्रत्येक 30 मिनट के लिए; 5-10 मिनट के लिए शराब बेंजीन; 5-10 मिनट के लिए जाइलीन I और II; और मोम I, II और III प्रत्येक 1 घंटे के लिए।
  3. ऊतकों को मोम में एम्बेड करें। एक फ्रीजिंग टेबल पर -20 ° पर ठंडा करें, और मोम ब्लॉक को बड़े करीने से सही करें।
  4. पैराफिन सेक्शनिंग मशीन का उपयोग करके मोम ब्लॉक को अनुदैर्ध्य रूप से 3 μm मोटे वर्गों में काटें।
  5. क्रमिक रूप से खंड को जाइलीन I और II में 20 मिनट के लिए भिगोएं, निर्जल इथेनॉल I और II प्रत्येक को 5 मिनट के लिए, और नल के पानी को 5 मिनट के लिए भिगोएं।
  6. ऊतकों को 3-5 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन दाग के साथ भरें, 0.5% जलीय हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान भेदभाव, 0.5% जलीय अमोनिया घोल को वापस नीले रंग में बदलें, और पानी से कुल्ला करें।
  7. 85% और 95% अल्कोहल के साथ ऊतक वर्गों को निर्जलित करें। 5 मिनट के लिए ईओसिन धुंधला घोल के साथ ऊतकों को भर दें।
    नोट: आम तौर पर, ईओसिन धुंधला होने में 30 सेकंड से 2 मिनट लगते हैं, और समय को धुंधला परिणाम और आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  8. निम्नलिखित समाधानों के साथ अनुक्रमिक रूप से अनुभागों को निर्जलित करें: निर्जल इथेनॉल I, निर्जल इथेनॉल II, निर्जल इथेनॉल III, जाइलीन I, और जाइलीन II, प्रत्येक 5 मिनट के लिए। अंत में, तटस्थ बालसम के साथ ग्लास स्लाइड को कवर करें।
  9. 40x, 20x, और 10x पर माइक्रोस्कोप के तहत H&e-दाग वाले ऊतकों की जांच करें, और प्रत्येक स्लाइड की प्रतिनिधि छवियों को बनाए रखने के लिए चित्र लें।

6. सीडी 31 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. ऊतक खंडों को जाइलीन I और II में 15 मिनट के लिए भिगोएं, निर्जल इथेनॉल I और II प्रत्येक 5 मिनट के लिए, 85% अल्कोहल 5 मिनट के लिए, और 75% अल्कोहल 5 मिनट के लिए, और आसुत पानी से कुल्ला करें।
  2. एंटीजन की मरम्मत
    1. माइक्रोवेव ओवन कंटेनर में पीएच 6.0 का एक उपयुक्त 10 एमएम साइट्रिक एसिड बफर जोड़ें, इसे उच्च पर उबलने के लिए गर्म करें, और फिर ग्लास स्लाइड को इसमें रखें।
    2. मध्यम गर्मी पर 8 मिनट के लिए उबालें, 8 मिनट के लिए बंद करें, और फिर 7 मिनट के लिए मध्यम-कम गर्मी पर फिर से उबालें।
    3. स्लाइड्स को ठंडा होने दें, उन्हें पीबीएस (पीएच 7.4) में रखें, और उन्हें डिकलराइजेशन शेकर का उपयोग करके 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  3. सर्कल में 5% बकरी सीरम ड्रॉपवाइज जोड़ें, और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. धीरे से बंद समाधान (5% बकरी सीरम) को हिलाएं, और खरगोश एंटी-सीडी 31 एंटीबॉडी (1: 200 के अनुपात में पीबीएस का उपयोग करके पतला) को वर्गों पर ड्रॉपवाइज जोड़ें। अनुभागों को एक गीले बॉक्स में रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. स्लाइड्स को पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 5 मिनट के लिए डिकलराइजेशन शेकर पर तीन बार धोएं। उन्हें सुखाने के लिए अनुभागों को हल्के से हिलाएं, और फिर उन्हें एफआईटीसी-लेबल बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी की एक गोलाकार बूंद के साथ कवर करें। अंधेरे में 50 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. स्लाइड्स को पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 5 मिनट के लिए डिकलराइजेशन शेकर पर तीन बार धोएं। हल्के झटकों के साथ अनुभागों को हवा से सुखाएं, और DAPI धुंधला घोल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
  7. अनुभागों को सुखाने के बाद, पेपपेन (एंटीबॉडी के नुकसान को रोकने के लिए) के साथ ऊतक के चारों ओर सर्कल खींचें, 5 मिनट के लिए सर्कल में एक ऑटोफ्लोरेसेंस शमन एजेंट (0.3% सूडान ब्लैक बी) जोड़ें, और उसके बाद उन्हें 10 मिनट के लिए बहते पानी के नीचे कुल्ला करें।
  8. स्लाइड्स को पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 5 मिनट के लिए डिकलराइजेशन शेकर पर तीन बार धोएं। अनुभागों को थोड़ा हिलाएं, और उन्हें एंटीफैड माउंटिंग माध्यम से सील करें।
  9. 40x, 20x, और 10x पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत अनुभागों का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें।
    नोट: DAPI UV उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 330-380 nm है, और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 420 nm (नीली रोशनी) है। एफआईटीसी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 465-495 एनएम है, और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 515-555 एनएम (हरी रोशनी) है।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. SPSS का उपयोग करके डेटा एकत्र और विश्लेषण करें।
  2. डेटा को मानक विचलन ± औसत के रूप में रिपोर्ट करें।
  3. मधुमेह और सामान्य समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करने के लिए एक स्वतंत्र नमूने टी-टेस्ट का उपयोग करें।
  4. सांख्यिकीय महत्व *p < 0.01 और *p < 0.05 पर सेट करें।

Representative Results

टी 1 डीएम मॉडल को प्रेरित करने के लिए कुल 10 एसडी चूहों को एक एसटीजेड इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन मिला। एक चूहे की समय से पहले मृत्यु हो गई (10%), लेकिन सभी चूहों (100%) में मधुमेह को प्रेरित किया गया था। एसटीजेड इंजेक्शन के 3 दिनों के बाद, सभी चूहों के रक्त शर्करा का स्तर 16.7 mmol / L से अधिक था, और प्रेरण के 5 सप्ताह बाद रक्त शर्करा का स्तर स्थिर हो गया (चित्रा 3 ए)। एसटीजेड इंजेक्शन के बाद मधुमेह समूह का वजन धीरे-धीरे बढ़ गया लेकिन सप्ताह 3 में कम हो गया और फिर धीरे-धीरे सप्ताह 4 से फिर से बढ़ गया (चित्रा 3 बी)। इसके विपरीत, सामान्य समूह में चूहों का वजन लगातार बढ़ता गया, और मधुमेह प्रेरण के 3 दिन बाद उनका औसत वजन मधुमेह समूह की तुलना में अधिक था (चित्रा 3 बी)। मधुमेह चूहों ने प्यास, बहुमूत्रता और वजन घटाने के विशिष्ट लक्षण प्रदर्शित किए, हाओ एट अल .17 के निष्कर्षों के समान।

घायल होने के बाद दिन 7 और दिन 14 पर, मैक्रोस्कोपिक विश्लेषण से पता चला कि मधुमेह समूह की तुलना में सामान्य समूह में चूहों में पुन: उपकलाकरण अधिक स्पष्ट था (चित्रा 4 ए)। मात्रात्मक परिणामों से पता चला कि दिन 7 और दिन 14 (पी < 0.01) पर सामान्य समूह की तुलना में मधुमेह समूह में घाव भरने की दर काफी कम थी। हालांकि, 14 वें दिन, मधुमेह समूह में घाव भरने की दर 90% से ऊपर हो सकती है (पी < 0.05, चित्रा 4 बी)। इससे पता चलता है कि टी 1 डीएम घाव मॉडल खराब बंद होने की विशेषता है, लेकिन मानव मधुमेह के घावों में देखी गई पुरानी गैर-चिकित्सा की सीमा तक नहीं।

घाव भरने के 14 वें दिन एच एंड ई धुंधला होने से एक अपूर्ण घाव एपिडर्मिस, केराटिनोसाइट्स के धीमी गति से प्रसार, और सामान्य समूह की तुलना में मधुमेह समूह में पुन: उपकलाकरण में देरी का पता चला। मधुमेह के घावों ने बालों के रोम और वसामय ग्रंथियों के आंशिक नुकसान को दिखाया। कम दिखाई देने वाली केशिकाएं भी थीं (चित्रा 5)।

मधुमेह एंडोथेलियल सेल डिसफंक्शन, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के ग्लाइकोसिलेशन, और संवहनी विघटनका कारण बनता है। इन जटिलताओं के परिणामस्वरूप मधुमेह के घावों में सामान्य से कम घाव एंजियोजेनेसिसहोता है। घाव भरने के लिए एंजियोजेनेसिस आवश्यक है, और घाव एंजियोजेनेसिस का विश्लेषण अक्सर सीडी 31 इम्यूनोस्टेनिंग (चित्रा 6 ए) 19,20 द्वारा किया जाता है। सीडी 31 अभिव्यक्ति के औसत ऑप्टिकल घनत्व (एओडी) के आधार पर, घाव स्थल पर एंजियोजेनेसिस मधुमेह समूह (पी < 0.01, चित्रा 6 बी) की तुलना में सामान्य में काफी अधिक था।

Figure 1
चित्र 1: फिक्सेटर द्वारा स्थिर चूहों की तस्वीर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: चूहे के घाव के स्थान का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोगात्मक चूहों के रक्त शर्करा के स्तर और वजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रयोगात्मक चूहों की पीठ पर पूर्ण मोटाई वाले त्वचा के घाव (व्यास में 20 मिमी)। (ए) दिन 0, दिन 7 और दिन 14 पर घावों की मैक्रोस्कोपिक उपस्थिति। दिन 0, दिन 7 और दिन 14 पर घाव आकृति विज्ञान छवियों को एक डिजिटल कैमरे के साथ कैप्चर किया गया था। (बी) घाव क्षेत्र इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था और घाव भरने की दर की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था। घाव भरने की दर (%) की गणना निम्नानुसार की गई थी: (प्रारंभिक घाव क्षेत्र - संकेतित समय बिंदु पर घाव क्षेत्र)/प्रारंभिक घाव क्षेत्र 100 ×। मान एसडी (एन = 14) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। सांख्यिकीय महत्व ** p < 0.01 और * p < 0.05 पर सेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: घाव की स्थापना के बाद 14 वें दिन प्रतिनिधि हिस्टोपैथोलॉजिकल एच एंड ई छवियां। नीले तीर केशिकाओं का संकेत देते हैं। लाल तीर केराटिनोसाइट्स के प्रसार को दिखाते हैं। बाएं पैमाने: एक बार = 200 μm; दाएँ पैमाने: एक पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सीडी 31 की अभिव्यक्ति के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला विश्लेषण। एंजियोजेनेसिस की स्थिति निर्धारित करने के लिए सीडी 31 के स्तर का उपयोग किया गया था। (ए) मधुमेह और सामान्य समूहों में सीडी 31 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। प्रत्येक त्वचा के नमूने के लिए एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व (आईओडी) मूल्य और पिक्सेल क्षेत्र (एरिया) की गणना इमेज-प्रो प्लस 6.0 सॉफ्टवेयर के साथ की गई थी। औसत ऑप्टिकल घनत्व (एओडी) मान (एओडी = आईओडी / एरिया) भी प्राप्त किया गया था। एओडी मान सीडी 31 की सकारात्मक अभिव्यक्ति के सीधे आनुपातिक था। (बी) मधुमेह और सामान्य समूहों में सीडी 31 सकारात्मक अभिव्यक्ति की मात्रात्मक तुलना। डेटा को एसडी ± ** पी < 0.01 के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। स्केल: एक पट्टी = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल टी 1 डीएम घाव मॉडलिंग में विवादित संचालन को स्पष्ट करता है। एसटीजेड इंजेक्शन प्रोटोकॉल, टी 1 डीएम प्रेरण सफलता मानदंड, रक्त ग्लूकोज स्थिरीकरण समय, और घाव स्थान और आकार पर चिंताओं को इस काम में संबोधित किया गया है। इसके अलावा, टी 1 डीएम घाव भरने के मूल्यांकन के लिए पैथोलॉजिकल विशेषताओं और मापने योग्य मापदंडों को स्पष्ट किया गया है।

चूहों ने एसटीजेड इंजेक्शन से पहले 18 घंटे तक उपवास किया ताकि ग्लूकोज या β-कोशिकाओं के लिए इसके एनालॉग के प्रतिस्पर्धी बंधन से बचा जा सके, जो एसटीजेड की प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है। टी 1 डीएम को प्रेरित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि एसटीजेड की एक उच्च खुराक है, जो आइलेट्स को नुकसान पहुंचाकर और इंसुलिन स्राव को कम करके रक्त शर्कराको बढ़ाती है। पूर्व-प्रायोगिक परीक्षणों से पता चला कि उच्च सफलता दर और कम मृत्यु दर के लिए इष्टतम एसटीजेड खुराक 55 मिलीग्राम / किग्रा थी, जो पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट की गई इष्टतम खुराक22,23,24 से कम है। इस प्रोटोकॉल में, टी 1 डीएम को 55 मिलीग्राम / किग्रा एसटीजेड के एकल इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन का उपयोग करके प्रेरित किया गया था।

एसटीजेड इंजेक्शन के 3 दिन बाद रक्त शर्करा का स्तर 16.7 mmol / L से अधिक था। हालांकि, एसटीजेड इंजेक्शन के बाद 7 वें दिन 16.7 mmol / L से अधिक रक्त शर्करा का स्तर सफल T1DM मॉडलिंग के लिए अनुशंसित मानदंड है, क्योंकि आइलेट क्षति की सीमा चूहों के बीच भिन्न होती है, और नैदानिक समय का उचित विस्तार झूठी-नकारात्मक दर को कम कर सकता है। इसके अलावा, एसटीजेड इंजेक्शन के 5 सप्ताह बाद रक्त शर्करा में उतार-चढ़ाव स्थिर हो गया, और चूहों ने इस अवधि के दौरान धीरे-धीरे वजन बढ़ाया, पिछले निष्कर्षों25,26 के अनुरूप। यह इंगित करता है कि टी 1 डीएम मॉडल में रक्त शर्करा के स्तर को कम से कम 6 सप्ताह तक स्थिर किया जाना चाहिए, और 6 सप्ताह के बाद चूहे के वजन में वृद्धि घाव मॉडलिंग के दौरान मृत्यु दर को कम करती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल ने एसटीजेड इंजेक्शन के 8 सप्ताह बाद घाव मॉडलिंग का आयोजन किया।

घाव लगने के बाद 7 वें और 14 वें दिन घाव बंद होने की दर सामान्य घाव समूह की तुलना में मधुमेह में काफी कम थी, जो धीमी गति से उपचार का संकेत देती है। इसके अलावा, सामान्य समूह की तुलना में मधुमेह में घाव पुन: उपकलाकरण और एंजियोजेनेसिस काफी कम थे। यह दर्शाता है कि टी 1 डीएम घाव मॉडल सामान्य चूहों की तुलना में धीमी घाव भरने और पुन: उपकलाकरण में देरी दिखाता है, जो कम घाव एंजियोजेनेसिस के रोग संबंधी परिवर्तनों से संबंधित हो सकता है। हालांकि, 14 वें दिन, टी 1 डीएम घाव भरने की दर भी 90% से ऊपर थी, जो मानव मधुमेह के घावों की पुरानी गैर-चिकित्सा विशेषता से अलग है। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि घाव भरने के लिए कृन्तकों के शारीरिकतंत्र मनुष्यों से भिन्न होते हैं। नतीजतन, सबसे अच्छा घाव व्यास कम से कम 20 मिमी है, जो मधुमेह के घाव के अध्ययन में हस्तक्षेप की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए समय देने के लिए पर्याप्त बड़ा है। घाव के स्थान को स्कैपुला और रीढ़ की हड्डी से बचना चाहिए, क्योंकि इन दो साइटों में निरंतर गति घाव भरने में बाधा डाल सकती है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल की विधि का उपयोग करके टी 1 डीएम घाव मॉडल का निर्माण प्रभावी है। प्रोटोकॉल क्रोनिक मधुमेह के घावों की कुछ विशेषताओं को दोहराता है, जैसे कि धीमी गति से घाव भरने, पुन: उपकला में देरी, और सामान्य चूहे के घावों की तुलना में एंजियोजेनेसिस में कमी। हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या मॉडल मधुमेह के घावों के अन्य पुराने फेनोटाइप को दोहरा सकता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सबसे मौलिक और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन करता है, जो चूहों में त्वचा के संकुचन के मुद्दे के लिए जिम्मेदार नहीं है। भविष्य के शोध इस प्रोटोकॉल में घाव स्प्लिंट्स के उपयोग को शामिल कर सकते हैं या पुराने मधुमेह के घावों के अतिरिक्त मॉडल का पता लगा सकते हैं, जो भविष्य में शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती होगी।

Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि इस पांडुलिपि में हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82104877) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antifade mounting medium Southern Biotechnology Associates, Inc. 0100-01
AutoFluo Quencher Servicebio Technology co., Ltd. G1221
Automatic slide stainer Thermo Fisher Scientific Inc. Varistain™ Gemini ES
CD31 Servicebio Technology co., Ltd. GB11063-2
Citrate antigen retrieval solution Servicebio Technology co., Ltd. G1201
Cover glass Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. 10212432C
DAPI Servicebio Technology co., Ltd. G1012
Decolorization shaker Scilogex S1010E
Depilatory cream Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd. —
Dimethyl benzene Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. 64-17-5
Drug oscillator Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd. VM-370
Electric razor Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd. FC5908
Embedding machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd. JB-P5
Ethanol absolute Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd. 1330-20-7
Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG Servicebio Technology co., Ltd. GB22303
Goat serum Thermo Fisher Scientific Inc. 16210064
Hematoxylin and eosin staining solution Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd. DH0020
Image J software National Institutes of Health —
Microwave oven Midea Group Co., Ltd.  M1-L213B
Mini centrifuge Scilogex D1008
Neutral balsam Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004160
PBS buffer Biosharp G4202
Portable blood glucose meter Sinocare Inc. GA-3
Rapid tissue processor Thermo Fisher Scientific Inc. STP420 ES
Rat fixator Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd GEGD-Q10G1
Slicing machine Thermo Fisher Scientific Inc. HM325
Slides glass Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd. 80312-3181
sodium citrate buffer Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. c1013
Streptozotocin Sigma 57654595

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References

  1. Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
  2. Grennan, D. Diabetic foot ulcers. Journal of the American Medical Association. 321 (1), 114 (2019).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6 (2014).
  4. Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615 (2019).
  5. Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
  6. Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
  7. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78 (2021).
  8. Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
  9. Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
  10. Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
  11. Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
  12. Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
  13. Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
  14. Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
  15. Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364 (2016).
  16. Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
  17. Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
  18. Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267 (2012).
  19. Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A. Diabetes and wound angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1419 (2017).
  20. Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533 (2020).
  21. Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
  22. Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
  23. Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
  24. Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10 (2019).
  25. Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
  26. Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258 (2022).
  27. Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).

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Wang, W., Bai, D., Wu, C., Li, H., Xie, X., Ji, W., Gao, J. A Protocol for Constructing a Rat Wound Model of Type 1 Diabetes. J. Vis. Exp. (192), e64914, doi:10.3791/64914 (2023).

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