Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64928
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, 2Cellular and Molecular Biology Graduate Program, Colorado State University College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Abstract

Визуализация кальция (Ca2+) в основном используется для изучения активности нейронов, но становится все более очевидным, что субклеточная обработка Ca2+ является важнейшим компонентом внутриклеточной передачи сигналов. Визуализация субклеточной динамики Ca2+ in vivo, где нейроны могут быть изучены в их нативной, интактной схеме, оказалась технически сложной в сложных нервных системах. Прозрачность и относительно простая нервная система нематоды Caenorhabditis elegans обеспечивают клеточно-специфическую экспрессию и визуализацию in vivo флуоресцентных меток и индикаторов. Среди них флуоресцентные индикаторы, которые были модифицированы для использования в цитоплазме, а также в различных субклеточных компартментах, таких как митохондрии. Этот протокол позволяет проводить нератиометрическую визуализациюCa2 + in vivo с субклеточным разрешением, что позволяет анализировать динамику Ca2+ вплоть до уровня отдельных дендритных шипов и митохондрий. Здесь используются два доступных генетически кодируемых индикатора с разным сродством кCa2 +, чтобы продемонстрировать использование этого протокола для измерения относительных уровней Ca2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе в одной паре возбуждающих интернейронов (AVA). Вместе с генетическими манипуляциями и продольными наблюдениями, возможными у C. elegans, этот протокол визуализации может быть полезен для ответа на вопросы о том, как обработка Ca2+ регулирует функцию и пластичность нейронов.

Introduction

Ионы кальция (Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca2+ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов 1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca2+ в своей цитоплазме3. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca2+ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca2+ по всему нейрону.

ГетерогенностьCa2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca2+-зависимых механизмов1. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca 2+ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca2+ в сочетании с InsP3 необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca2+ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор4. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca2+ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения 5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca2+ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона 6,7.

Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са2+ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca2+ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca 2+ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Создание трансгенных штаммов

  1. Используя метод клонированияпо выбору 8,9, клонируйте векторы экспрессии, чтобы они содержали промотор Pflp-18 или Prig-3 (для AVA-специфического сигнала в вентральном нервном мозге), затем индикатор выбора Ca2+, а затем 3'-UTR (см. обсуждение для получения дополнительной информации)10. Список плазмид и их источников можно найти в дополнительной таблице 1.
  2. Следуйте установленному протоколу создания трансгенных штаммов путем микроинъекции смеси ДНК (<100 нг/мкл; см. Дополнительную таблицу 1 для концентраций каждой плазмиды), содержащей трансген-индикатор Ca 2+ (~20 нг / мкл) и спасательную ДНК lin-15+ (маркер отбора) в гонаду 1-дневного взрослого C. elegans10 (генотип: ЛИН-15(Н765ТС); фенотип: мультивульва)10,11.
    ЗАМЕТКА. Поддерживайте родителей lin-15 (n765ts) при 15 ° C, чтобы подавить чувствительную к температуре мутацию.
  3. Поддерживайте инъецированных родителей при температуре 20 ° C до тех пор, пока потомство F1 не достигнет совершеннолетия, чтобы обеспечить трансгенный отбор с использованием отсутствия фенотипа с несколькими вульвами.
  4. Клональное прохождение13 взрослого потомства F1, не имеющего фенотипа мультивульвы, так как это указывает на экспрессию внехромосомного массива, содержащего показатель Ca2+ 11.
  5. Оцените экспрессию показателя Ca2+ у потомства F2 или F3, у которых нет фенотипа с несколькими вульвами, путем установки и визуализации взрослых в возрасте 1 дня, как описано далее в разделе 3.
    ЗАМЕТКА. Для быстрого получения изображений, как описано здесь, требуется относительно высокая экспрессия индикатора (см. обсуждение для более подробной информации).
  6. Проведение экспериментов на последующих поколениях трансгенных штаммов с оптимальной экспрессией показателяCa2+ (подробнее см. обсуждение), поддерживая штаммы в стандартных условиях (20 °C на планшетах NGM)12.

2. Оптическая настройка

  1. Используйте микроскоп, способный к длительной покадровой съемке.
    ЗАМЕТКА. Репрезентативные данные были получены с помощью конфокального микроскопа с инвертированным вращающимся диском, оснащенного лазерами возбуждения 488 нм и 561 нм.
  2. Используйте объектив с малым увеличением (т. е. 10x/0,40) для грубой локализации червя.
  3. Чтобы достичь субклеточного разрешения, переключитесь на нейроны и локализуйте их, используя объектив с большим увеличением.
    ЗАМЕТКА. Для получения репрезентативных данных в этом исследовании был использован объектив 100x/1,40 NA oil.
  4. Получайте изображения с помощью сверхчувствительной камеры, способной быстро получать изображения (>50 кадров в секунду).
  5. Используйте стандартный эмиссионный фильтр для выбранного индикатора Ca2+ (т. е. эмиссионный фильтр 525 нм ± 50 нм для GCaMP6f и mitoGCaMP).
  6. Добавьте корректор Z-дрейфа (ZDC) для получения потоков изображений продолжительностью более 10 с, так как высыхание агаровой прокладки во время сеанса визуализации приводит к тому, что нейрит выходит из фокуса в течение нескольких секунд.
    ЗАМЕТКА. Если установка микроскопии не позволяет проводить ZDC или если желательны длительные (>20 минут) периоды визуализации, нанесите границу силиконовой смазки или расплавленного вазелина вокруг агаровой прокладки, чтобы замедлить высыхание.

3. Подготовка глистов к визуализации

  1. Подготовка агаровых подушечек
    1. Сделайте 3 мл 10% агара, растворив молекулярный агар в M912 в стеклянной пробирке для культивирования размером 13 мм x 100 мм и разогрев в микроволновой печи в течение нескольких секунд (см. Таблицу материалов).
      ЗАМЕТКА. Расплавленный агар можно хранить на тепловом блоке до 1 часа или делать свежим каждый раз, когда требуются агаровые прокладки.
    2. Поместите предметное стекло микроскопа между двумя дополнительными предметными стеклами, каждое из которых имеет два слоя лабораторной ленты (см. рис. 1A-i).
    3. Отрежьте наконечник наконечника пипетки объемом 1,000 мкл (без фильтра) и используйте его, чтобы нанести небольшую каплю агара на центральное покровное стекло (рис. 1A-i).
    4. Разровняйте агар, нажав еще один слайд вниз поверх агара (рис. 1A-ii).
    5. После охлаждения нарежьте агар на небольшой диск, используя отверстие стеклянной пробирки для культивирования размером 13 мм x 100 мм (рис. 1A-iii), а затем удалите окружающий агар.
  2. Приготовление червячного раствора
    1. Растворите порошок мусцимола в M9, чтобы получить запас 30 мМ. Разделить на аликвоты по 50 мкл и хранить при температуре 4 °C.
    2. Размораживайте новую аликвоту 30 мМ мусцимола каждые 3-5 дней (и храните при температуре 20 ° C во время использования).
    3. Разбавьте мусцимол 30 мМ в соотношении 1:1 гранулами полистирола, чтобы получить раствор для прокатки.
  3. Позиционирование червя для визуализации
    1. Поместите 1.6 мкл раскатывающего раствора в центр агаровой подушечки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество жидкости должно быть скорректировано для визуализации молодых (меньше) или пожилых животных (больше).
    2. Используя предпочтительный червячный медиатор (т.е. медиатор из стеклянной или платиновой проволоки)13, перенесите червя желаемого возраста без фенотипа11 с несколькими вульвами в рулонный раствор на агаровой подушечке (рис. 1A-iv).
      ЗАМЕТКА. Репрезентативные данные получены от гермафродитов возрастом 1 день (штамм GCaMP6f = FJH185; штамм mitoGCaMP; FJH597; см. Дополнительную таблицу 1), которые могут быть идентифицированы по наличию только одного ряда яиц. Подробнее о работе с глистами разного возраста смотрите в обсуждении.
    3. Подождите ~ 5 минут, пока мусцимол уменьшит движение червя, а затем бросьте покровное стекло размером 22 мм x 22 мм поверх агаровой подушечки, физически ограничивая движение червя.
    4. Для визуализации нейритов в вентральном нервном мозге сверните червя в ориентацию, показанную на рисунке 1B, C, слегка сдвинув покровное стекло.
      ЗАМЕТКА. Чтобы визуализировать вентральный нервный тяж, расположите червя головой вверх и катите червя, пока кишечник не окажется с правой стороны проксимальной части, а левой - с дистальной части червя (с точки зрения зрителя). Инвертируйте эту ориентацию (рис. 1C) для визуализации нейритов в дорсальном нервном мозге.
  4. Установка червя на микроскоп
    1. Нанесите каплю иммерсионного масла на покровное стекло, прежде чем устанавливать его на предметный столик микроскопа.
    2. Найдите червя с помощью объектива с малым увеличением (10x) в светлом поле.
    3. Переключитесь на 100-кратный объектив и отрегулируйте фокусировку.
    4. Определите местонахождение нейрита AVA с помощью подсветки GCaMP или mitoGCaMP с помощью лазера визуализации с длиной волны 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшие регулировки, чтобы предотвратить раздавливание червя или снятие покровного стекла.

4. Получение потоков изображений с высоким разрешением

  1. В естественных условиях Визуализация GCaMP
    1. Установите время экспозиции 20 мс.
    2. Отрегулируйте настройки лазера и съемки до тех пор, пока базальная флуоресценция GCaMP не достигнет среднего диапазона динамического диапазонакамеры 14. Обратитесь к обсуждению для получения предложений по оптимизации параметров визуализации с использованием других установок микроскопии.
      ЗАМЕТКА. Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 50% и затухание = 1. Измените дополнительные настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 200 и усиление предварительного усилителя = 1.
    3. После того, как нейрит AVA будет обнаружен с помощью флуоресценции GCaMP при 100-кратном увеличении, установите ZDC (см. Таблицу материалов) в диапазон ±30 мкм и инициируйте непрерывную автофокусировку. Перед получением изображения вручную скорректируйте фокальную плоскость по мере необходимости.
    4. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением. Продолжительность до 10 минут может быть достигнута с помощью установки, используемой в этом исследовании.
  2. Визуализация in vivo mitoGCaMP
    1. Выполните шаги 4.1.1-4.1.2 по мере необходимости, чтобы получить базальную флуоресценцию mitoGCaMP в среднем диапазоне для динамического диапазонакамеры 14.
      ЗАМЕТКА. Для оптической установки, используемой в этом исследовании, установите лазер визуализации с длиной волны 488 нм на следующие выходные настройки: мощность лазера = 20% и затухание = 10. Измените настройки сбора данных следующим образом: усиление ЭМ = 100 и усиление предварительного усилителя = 2.
    2. После того, как митохондрии в нейрите AVA будут расположены с помощью флуоресценции mitoGCaMP, установите ZDC, как описано выше на шаге 3.3.
    3. Получение потока изображений со 100-кратным увеличением.

5. Анализ потока изображений

  1. Откройте поток изображений в соответствующем программном обеспечении для анализа значений пикселей в серии изображений (см. Таблицу материалов).
  2. С помощью инструмента « Выделение многоугольника » определите интересующую субклеточную область (ROI), содержащую GCaMP или mitoGCaMP.
  3. Нажмите « Инструменты анализа >» > ROI Manager. В диспетчере рентабельности инвестиций нажмите кнопку Добавить , а затем Дополнительно > Мультимера. В окне «Мультимера» нажмите кнопку «ОК», чтобы автоматически получить среднюю, минимальную и максимальную интенсивность окупаемости инвестиций в пикселях, определенную выше для каждого кадра потока изображения для дальнейшего анализа.
    ЗАМЕТКА. Рекомендуется, чтобы средняя интенсивность пикселей (Fсредняя) нормализовалась до минимальной интенсивности (F min) для каждого ROI с использованием отношения Fсреднего / Fmin для учета различий флуоресценции из-за позиционирования в z-плоскости. Откажитесь от потоков изображения с червячным движением во время визуализации, так как это также повлияет на измерения флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эти два протокола позволяют быстро получать дифференциальные уровни Ca2+ в субклеточных областях и органеллах отдельных нейритов in vivo с высоким пространственным разрешением. Первый протокол позволяет измерять цитоплазматический Ca2+ с высоким временным и пространственным разрешением. Это демонстрируется здесь с использованием клеточно-специфической экспрессии GCaMP6f в глутаматергических интернейронах команды AVA15, нейриты которых проходят по всей длине вентрального нервного мозга. Быстрое получение флуоресценции GCaMP6f (50 Гц) позволило обнаружить направленное распространение притока Ca2+ (рис. 2A и дополнительное видео 1). Субклеточная количественная оценка флуоресценции GCaMP6f показала, что начало притока Ca 2+ было задержано в части нейрита, находящейся всего в 10 мкм (рис. 2B). Кроме того, этот протокол позволил провести несколько наблюдений за разделенными событиями Ca 2+ и подпороговыми событиями Ca2+. Например, было замечено, что дендритные шиповидные структуры, обнаруженные вдоль нейрита AVA, имели вспышки флуоресценции GCaMP6f, которые происходили независимо от активации нейритов и не приводили к распространению притока Ca 2+ (рис. 2C, D и дополнительное видео 2).

Второй протокол был направлен на быстрое измерение относительных уровней Ca2+ в отдельных митохондриях при одиночных нейритах. Использование штамма червя с AVA-специфической экспрессией митохондриального матрикса-локализованного индикатораCa 2+ mitoGCaMP позволило быстро обнаружить изменения флуоресценции mitoGCaMP на уровне отдельных митохондрий в нейрите AVA. Этот протокол визуализации выявил различные режимы поглощения Ca2+ митохондриями, по крайней мере, в этом нейроне. Во-первых, результаты, показанные на рисунке 3A, представляют собой пример синхронного поглощения относительно большого количества Ca2+ в подмножество митохондрий. В частности, эти данные показали, что поглощение Ca2+ некоторыми митохондриями было синхронизировано (Mito1 и Mito2; Рисунок 3A, B и дополнительное видео 3), в то время как соседние митохондрии, по-видимому, не занимали Ca2+ (Mito3; Рисунок 3А,Б). Точно так же было замечено, что подмножества митохондрий быстро поглощают и высвобождают небольшое количество Ca2+. Это также оказалось синхронным (Mito1 и Mito3, рис. 3C, D и дополнительное видео 4), но опять же только для подмножества митохондрий (Mito 2, рис. 3C, D).

Figure 1
Рисунок 1: Установка и перекатывание C. elegans для визуализации вентрального нервного тяжа. (А) Иллюстрация этапов подготовки агаровых подушечек и сбора одного червя в раскатывающийся раствор. (B) Пример положения червя до его перемещения для визуализации. Красная стрелка указывает на необходимость броска червя вправо, чего можно добиться, сдвинув покровное стекло вправо (синяя стрелка). Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Правильная ориентация, необходимая для визуализации вентрального нервного тяжа. Примечание: кишечник находится на правой стороне зрителя (с помощью вертикального микроскопа) в проксимальной половине, а затем с левой стороны в дистальной половине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Быстрое получение флуоресценции GCaMP6f с субклеточным разрешением в нейритах AVA и шиповидных структурах. (A) Репрезентативные изображения флуоресценции GCaMP6f при бифуркации нейритов AVAL и AVAR. Масштабная линейка = 5 мкм. (B) Количественная оценка флуоресценции GCaMP6f, нормализуемая до минимальной флуоресценции (F) для этой области (Fmin) для проксимальной (оранжевой) и дистальной (синий) областей, определенных на нижнем изображении на панели A. (C) Репрезентативные изображения флуоресценции GCaMP6f в позвоночноподобной проекции нейрита AVA. (D) Нормализованная флуоресценция GCaMP6f в нейрите (оранжевый) и позвоночнообразной проекции (синий) из соответствующих областей на нижнем изображении панели C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Быстрая визуализация поглощения кальция отдельными митохондриями в нейрите AVA. (А,С) Репрезентативные изображения флуоресценции mitoGCaMP с течением времени. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Следы нормализованной флуоресценции GCaMP (F / F min) для соответствующих митохондрий, показанных на нижнем изображении панели A. (D)F / Fmin более 40 с изображения в областях, выделенных на нижнем изображении на панели C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео 1: Флуоресценция GCaMP6f в нейрите AVA. Видео было визуализировано с 2-кратной скоростью. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 2: Флуоресценция GCaMP6f в шипообразной проекции на нейрит AVA. Видео было визуализировано с 2-кратной скоростью. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 3: Флуоресценция MitoGCaMP в митохондриальном поглощении кальция, синхронизированном с нейритами AVA. Видео было визуализировано с 4-кратной скоростью. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительное видео 4: Флуоресценция MitoGCaMP в нейритах AVA - быстрое поглощение и высвобождение кальция митохондриями. Видео было визуализировано с 4-кратной скоростью. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Дополнительная таблица 1: Генетические реагенты и штаммы, используемые в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Первое соображение при реализации описанного метода связано с выбором показателя Ca2+ с идеальными характеристиками для данного вопроса исследования. Цитоплазматические показатели Ca2+ обычно имеют высокое сродство к Ca2+, а чувствительность этих показателей кCa2+ обратно пропорциональна кинетике (скорости включения/выключения)16,17. Это означает, что либо чувствительность Ca2+, либо кинетика должны быть расставлены по приоритетам в зависимости от интересующего явления. Для субклеточных компартментов с относительно высоким базальным уровнем Са2+, таких как ER, следует рассматривать показатели Ca2+ с низким сродством Ca2+ 18. Для получения рекомбинантной ДНК для клеточно-специфической экспрессии индикатора Ca 2+ следует использовать предпочтительный метод клонирования для вставки клеточно-специфического промотора19,20 с последующим индикатором выбора Ca 2+ и 3'-UTR. Относительно высокие уровни экспрессии в нейронах AVA могут быть достигнуты путем конструирования плазмиды с промоторами Pflp-18 или Prig-3, let-858 или unc-54 3' UTR и микроинъекции этой плазмиды в дозе 15-25 нг/мкл (см. Дополнительную таблицу 1).

Успешная микроинъекция плазмид, содержащих индикатор Ca2+ и lin-15+, в гонаду червей-мутантов lin-15 (n765ts) даст потомство F1, которое экспрессирует индикатор Ca2 + и будет спасено для фенотипа с несколькими вульвами. Только подмножество (30-80%) поколения F1 будет передавать синтетическую ДНК поколению F2. Экспрессию показателя Ca2+ следует оценивать у спасенного потомства F2 или F3 на планшетах с передачей синтетической ДНК <60% путем монтажа и визуализации флуоресценции у взрослых в возрасте 1 дня, спасенных для фенотипа мультивульвы. Идеальный уровень экспрессии определяется исходя из свойств и расположения показателяCa2+, а также биологического вопроса. Если требуется быстрое получение изображения, то идеально подходит относительно высокая экспрессия. Однако было обнаружено, что чрезвычайно высокая экспрессия показателей Ca2+ вызывает субклеточную неправильную локализацию, а также неспецифическую экспрессию в других клетках или тканях.

Генетически кодируемые индикаторы Ca 2+ широко использовались для анализа Ca2+ in vivo у C. elegans, а также у других модельных организмов. В некоторых из этих исследований был достигнут мониторинг одноклеточного разрешения уровней Ca 2+ в теле нейрональных клеток21,22,23,24. Измерения притока Ca 2+ в нейрональных субкомпартментах были достигнуты in vivo у C. elegans, а также у позвоночных систем, но только путем регистрации активности индикатора Ca 2+ во всем нейрите 25,26 или популяциях дендритов 27. Хотя измерение активности Ca 2+ в телах нейрональных клеток и дендритах в целом отражает пиковую активность клетки, оно не позволяет наблюдать динамику притока Ca 2+ (т. е. направление или скорость распространения) или подпороговые переходные процессы Ca2+. Немногие исследования in vivo смогли различить обработку Ca2+ в нейронах с пространственным и временным разрешением, продемонстрированным здесь. Следует отметить, что временная динамика притока Ca 2+ в большинстве нейронов28 C. elegans, по-видимому, медленнее, чем в нейронах29 позвоночных, поэтому вполне вероятно, что этого протокола быстрой визуализации будет недостаточно для захвата аналогичной временной динамики в системах позвоночных. Тем не менее, последние достижения в области двухфотонной микроскопии позволяют получать сверхбыструю (120 Гц) субклеточную визуализацию кальция в отдельных дендритах гиппокампа у свободно ведущих себя мышей30, что дает надежду на достижение аналогичной визуализации Ca2+ с высоким разрешением у позвоночных.

Важно отметить, что этот нератиометрический подход к визуализации in vivo Ca2+ требует использования мусцимола, который ингибирует сокращение мышц стенки тела, тем самым ограничивая движение червя во время визуализации31. Если во время визуализации наблюдается чрезмерное движение (постоянное движение более чем у ~ 20% червей), следует сделать новый раствор для прокатки с только что размороженной аликвотой мусцимола, а время, в течение которого червь купается в прокатном растворе перед прокатыванием, должно быть увеличено. Мусцимол является агонистом рецептора ГАМК, что означает, что он ингибирует ГАМКергические нейроны, в том числе те, которые обеспечивают вход в нейроны AVA. Кроме того, многие возбуждающие нейроны, включая AVA, экспрессируют низкие уровни рецепторов ГАМК, поэтому вполне вероятно, что использование мусцимола в этом протоколе снижает активность нейронов. Однако при использовании этого протокола общая спонтанная активация AVA снижается всего на ~ 29% в присутствии мусцимола (неопубликованные данные). Активация других нейронов может быть более резко снижена мусцимолом, и это можно проверить, заменив мусцимол на M9 в вращающемся растворе и проведя визуализацию в теле нейрональной клетки при малом увеличении32. Альтернативой использованию мусцимола было бы использование ратиометрического показателя Ca2+ 33,34, который позволил бы проводить коррекцию флуоресценции за счет движения червя. Недостатком этого подхода является то, что он требует оптической установки, способной получать изображения с двумя длинами волн, и ограничивает возможность использования индикатора Ca2+ в сочетании со многими другими флуоресцентными инструментами.

Одним из основных ограничений описанной системы микроскопии является уменьшение излучаемого света вращающимся диском, что приводит к потере информации. Эта система может быть модифицирована, чтобы обеспечить больший захват излучаемого света путем реализации диска с отверстиями для штифтов большего диаметра. Однако это изменение уменьшит осевое (z-плоскость) разрешение и увеличит фоновую флуоресценцию. Другой возможной микроскопической установкой для этой цели может быть быстросканирующий световой микроскоп, который был усовершенствован в последние годы, чтобы обеспечить быструю (до 50 Гц) визуализацию in situ и in vivo35.

Оценка пространственно-временной динамики цитоплазматического и митохондриального Ca 2+ позволит лучше понять, как локальные переходные процессы Ca2+ и даже подпороговые события могут вызывать кальций-зависимую передачу сигналов или модулировать митохондриальную биологию. Эта субклеточная визуализация in vivo Ca2+ может быть особенно полезна для изучения синаптической пластичности, зависящих от активности изменений в метаболизме нейронов и гомеостатической модуляции возбудимости нейронов. Дальнейшее исследование того, как локальные, субклеточные среды адаптируются к определенным состояниям нейрональной активности (т.е. пространственно-специфическим концентрациям и времени жизни Ca2+), даст представление о том, как дисгомеостаз Ca2+ приводит к патогенным изменениям в функции нейронов. Возможность изучать это на живом, неповрежденном организме особенно полезна, поскольку она позволяет проводить лонгитюдные исследования, которые прольют свет на то, как и почему гомеостаз Ca2+ изменяется при естественном старении и нейродегенерации, связанной с болезнью. Применение этого метода для изучения старения и нейродегенерации несколько ограничено ранним биологическим возрастом у C. elegans (<4 дня взрослой жизни). Действительно, физические манипуляции во время установки и позиционирования червей для визуализации затруднены примерно через 5 дней взрослой жизни, когда черви становятся вялыми из-за снижения мышечного тонуса и целостности кутикулы.

Быстрая визуализация in vivo динамики и субклеточной обработки Ca2+ будет способствовать нашему пониманию того, как возбудимость нейронов и внутриклеточная передача сигналов тонко регулируются пространственно и временно. Этот протокол может принести пользу широкому кругу исследований и исследователей во многих областях из-за разнообразия Ca2+-зависимых процессов и их центральной роли в функционировании нейронов. Например, применение этого метода в здоровых нейронах даст представление о том, почему повышенный цитоплазматический Ca2+ во время старения возникает в сочетании с нарушениями синаптической пластичности, неэффективным митохондриальным дыханием, а также другими дисфункциями36,37. Кроме того, этот метод может быть использован для исследования причин возрастного дисгомеостазаCa 2+ 38. Однако применение этого метода к вопросам, связанным со старением и нейродегенерацией, несколько ограничено ранними стадиями старения (<5 дня взрослой жизни)38. Как упоминалось выше, визуализация пожилых взрослых червей (>5 дней взрослой жизни) затруднена с использованием нашего метода прокатки, но достижения в микрофлюидике C. elegans показывают перспективность визуализации с аналогичным пространственным разрешением до 12 дней взрослой жизни39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) (R01-NS115947 присуждена Ф. Хорндли). Мы также хотели бы поблагодарить доктора Аттилу Стетака за плазмиду pAS1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.40 Oil objective   Olympus   UPlanSApo
10x/0.40 Objective  Olympus   UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass  VWR  48366-227 
Agarose SFR  VWR  J234-100G 
Beam homogenizer Andor Technologies Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table  TMC  With vibration control
Disposable culture tubes VWR  47729-572  13 mm x 100 mm
Environmental chamber Thermo Scientific 3940 Set to 20 °C
Filter wheel or slider ASI For 25 mm diameter filters
FJH 185 Caenorhabditis Genetics Center  FJH 185 Worm strain
FJH 597 Caenorhabditis Genetics Center FJH 597 Worm strain
GFP bandpass emission filter  Chroma  525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner  Andor Technologies  4 laser lines 
ILE solid state 488 nm laser Andor Technologies  50 mW
ImageJ National Institutes of Health Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope  Olympus  With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera  Andor Technologies 
Low auto-fluorescence immersion oil  Olympus  Z-81226
MetaMorph  Molecular Devices  Version 7.10.1 
Microscope control box Olympus IX3-CBH
Muscimol  MP Biomedical / Sigma 02195336-CF 
pAS1 AddGene 194970 Plasmid
pBSKS Stratagene
pCT61 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23 Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1  AddGene  194969 Plasmid
Polybead microspheres  Polysciences Inc.  00876-15  0.094 µm
Stability chamber Norlake Scientific NSRI241WSW/8H Set to 15 °C
Stage controller ASI With filter wheel control
Standard microscope slide Premiere 9108W-E 75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller Olympus I3-TPC
Z-drift corrector  Olympus  IX3-ZDC2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
  2. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
  4. Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
  5. Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
  6. Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
  7. Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer's disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
  8. Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
  9. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
  10. Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
  11. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
  14. Ogama, T. A beginner's guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
  15. Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
  16. Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
  17. Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
  18. de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
  19. Bhatla, N. C. elegans neural network. , Available from: http://wormweb.org/neurainet#c=BAG&m=1 (2014).
  20. Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
  21. Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
  22. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  23. Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
  24. Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
  25. Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
  26. Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
  27. Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
  28. Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
  29. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
  30. O'Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
  31. Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
  32. Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
  33. Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
  34. Cho, J. -H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
  35. Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
  36. Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
  37. Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
  38. Chen, C. -H., Chen, Y. -C., Jiang, H. -C., Chen, C. -K., Pan, C. -L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
  39. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  40. Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).

Tags

Неврология выпуск 193
Субклеточная визуализация обработки кальция <em>нейронами in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., … More

Doser, R., Knight, K. M., Deihl, E., Hoerndli, F. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (193), e64928, doi:10.3791/64928 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter