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Neuroscience

TACI: 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक इमेजजे प्लगइन

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64953
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 4, 1
1School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2CMU-Pitt Joint Computational Biology, School of Medicine, University of Pittsburgh, 3Eastern Virginia Medical School, 4Department of Physics, University of Miami

Summary

कैल्शियम इमेजिंग का ट्रैकमेट विश्लेषण (टीएसीआई) 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक ओपन-सोर्स इमेजजे प्लगइन है जो जेड-अक्ष पर गति की जांच करता है और संबंधित समय बिंदु पर सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रत्येक जेड-स्टैक के अधिकतम मूल्य की पहचान करता है। यह पार्श्व (x / y) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स को अलग कर सकता है लेकिन विभिन्न z-विमानों पर।

Abstract

न्यूरोसाइंस में अनुसंधान डेटा सेट से व्यापक जानकारी निकालने के लिए जटिल इमेजिंग और कम्प्यूटेशनल टूल का उपयोग करने के लिए विकसित हुआ है। कैल्शियम इमेजिंग एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है जिसे विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए परिष्कृत सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है, लेकिन कई प्रयोगशालाएं आधुनिक मानकों को पूरा करने के लिए प्रोटोकॉल को अपडेट करते समय कम्प्यूटेशनल तरीकों को अपनाने के लिए संघर्ष करती हैं। सॉफ्टवेयर के लिए प्रोग्रामिंग ज्ञान और पेवॉल की कमी के कारण कठिनाइयां उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा, कैल्शियम इमेजिंग के दौरान रुचि की कोशिकाएं सभी दिशाओं में आंदोलनों को प्रदर्शित करती हैं। पार्श्व (x/y) दिशा में गति को ठीक करने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं।

यह पेपर 3 डी कैल्शियम इमेजिंग में जेड-अक्ष पर गति की जांच करने के लिए एक नए इमेजजे प्लगइन, ट्रैकमेट एनालिसिस ऑफ कैल्शियम इमेजिंग (टीएसीआई) का उपयोग करके एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। यह सॉफ्टवेयर एक न्यूरॉन के सभी जेड-पदों से अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य की पहचान करता है और इसका उपयोग संबंधित टी-स्थिति में न्यूरॉन की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए करता है। इसलिए, यह उपकरण पार्श्व (एक्स / वाई) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स को अलग कर सकता है लेकिन अलग-अलग जेड-प्लेन पर दिखाई देता है। इमेजजे प्लगइन के रूप में, टीएसीआई 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल, ओपन-सोर्स कम्प्यूटेशनल टूल है। हमने फ्लाई लार्वा थर्मोसेंसिटिव न्यूरॉन्स का उपयोग करके इस वर्कफ़्लो को मान्य किया जो तापमान में उतार-चढ़ाव के दौरान सभी दिशाओं में आंदोलनों को प्रदर्शित करते थे और फ्लाई ब्रेन से प्राप्त 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट।

Introduction

इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर न्यूरोनल उत्तेजना का एक सटीक मार्कर है। कैल्शियम इमेजिंग न्यूरोनल गतिविधि को समझने के लिए इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में परिवर्तन कोमापता है 1. न्यूरोसाइंस में अध्ययन ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता को मापने के लिए तकनीकों के विकास के कारण इस पद्धति का तेजी से उपयोग किया है, जिसमें आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई), जैसे जीसीएएमपी 2,3 शामिल हैं, जिन्हें आनुवंशिक दृष्टिकोणके माध्यम से न्यूरॉन्स के विशिष्ट सेटों में गैर-आक्रामक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। लेजर और माइक्रोस्कोप घटकों की कम लागत ने कैल्शियम इमेजिंग 4 के उपयोग में भी वृद्धि कीहै। महत्वपूर्ण रूप से, कैल्शियम इमेजिंग स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में एक साथ एकल न्यूरॉन्स के साथ-साथ बड़ी न्यूरॉन आबादी को रिकॉर्ड करने और अध्ययन करने की अनुमतिदेता है।

फिर भी, कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है क्योंकि (1) इसमें समय के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को ट्रैक करना शामिल है, (2) प्रतिदीप्ति संकेत रुक-रुक कर गायब हो जाता है या न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के साथ फिर से प्रकट होता है, और (3) न्यूरॉन्स सभी दिशाओं में आगे बढ़ सकते हैं, विशेष रूप से एक फोकल प्लेन के अंदर और बाहर या कई विमानों पर दिखाई दे सकते हैं। 6. मैनुअल विश्लेषण समय लेने वाला है और अव्यावहारिक हो जाता है क्योंकि रिकॉर्डिंग की लंबाई और न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ जाती है। कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर प्रोग्राम विकसित किए गए हैं। इससे पहले, सॉफ्टवेयर को सीमित प्रयोगात्मक संदर्भ में डिजाइन किया गया था, जिससे अन्य प्रयोगशालाओं के लिए इसे अपनाना मुश्किल हो गया था। सॉफ्टवेयर साझाकरण के लिए आधुनिक मानकों को पूरा करने के हालिया प्रयासों ने कई उपकरणों के विकास को जन्म दिया है जो विभिन्न समूहों में कैल्शियम इमेजिंग डेटा का लगातार विश्लेषण कर सकते हैं 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . हालांकि, इनमें से अधिकांश उपकरणों को प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता होती है और / या वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर पर निर्भर करते हैं। प्रोग्रामिंग ज्ञान और सॉफ्टवेयर पेवॉल की कमी शोधकर्ताओं को इन तरीकों को अपनाने से रोकती है। इसके अलावा, इनमें से कई उपकरण एक्स / वाई गति को सही करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, हालांकि जेड-अक्ष पर गति को भी स्पष्ट रूप से निदान और सही करने की आवश्यकता होतीहै। 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल टूल की आवश्यकता है जो जेड-ड्रिफ्ट का प्रदर्शन करने वाले न्यूरॉन्स पर केंद्रित है और कई जेड-प्लेन पर दिखाई देता है। आदर्श रूप से, इस उपकरण को ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना चाहिए और अन्य प्रयोगशालाओं को आसानी से अपनाने की अनुमति देने के लिए प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।

यहां, हमने 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक नया इमेजजे प्लगइन, टीएसीआई विकसित किया। सबसे पहले, सॉफ्टवेयर का नाम बदलता है, यदि आवश्यक हो, और जेड-पदों द्वारा 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटा को व्यवस्थित करता है। रुचि की कोशिकाओं को प्रत्येक जेड-स्थिति में ट्रैक किया जाता है, और उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता ट्रैकमेट या अन्य कम्प्यूटेशनल टूल द्वारा निकाली जाती है। टीएसीआई को तब जेड-अक्ष पर गति की जांच करने के लिए लागू किया जाता है। यह जेड-स्टैक के अधिकतम मूल्य की पहचान करता है और इसका उपयोग संबंधित समय बिंदु पर सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए करता है। यह वर्कफ़्लो सभी दिशाओं में गति के साथ 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है और / या पार्श्व (एक्स / वाई) दिशा में अतिव्यापी न्यूरॉन्स के साथ लेकिन विभिन्न जेड-स्थितियों में दिखाई देता है। इस वर्कफ़्लो को मान्य करने के लिए, मस्तिष्क में फ्लाई लार्वा थर्मोसेंसिटिव न्यूरॉन्स और मशरूम न्यूरॉन्स से 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट का उपयोग किया गया था। ध्यान दें, टीएसीआई एक ओपन-सोर्स इमेजजे प्लगइन है और इसे किसी भी प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता नहीं है।

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Protocol

1. कैल्शियम इमेजिंग

  1. मक्खी लार्वा तैयार करना
    नोट: मक्खियों और लार्वा को 12 घंटे: 12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।
    1. सीओ2 के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। प्रत्येक फ्लाई शीशी में 20-45 पुरुषों और 20-45 महिलाओं को क्रमबद्ध करें, और उन्हें सीओ 2 जोखिम से उबरने के लिए कम से कम24 घंटे से 48 घंटे दें।
      नोट: सीओ2 के लिए फ्लाई एक्सपोजर सबसे कम समय तक चलना चाहिए।
    2. लार्वा की उम्र को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, मक्खियों को खमीर कणिकाओं वाली नई शीशियों में टैप करें, और उन्हें अंडे देने के लिए 4-8 घंटे की अनुमति दें। मक्खियों को नई शीशियों में पलटकर निकालें।
    3. 20% डब्ल्यू / वी सुक्रोज समाधान के 10 एमएल का उपयोग करके लार्वा को 72 घंटे पर इकट्ठा करें।
  2. माइक्रोस्कोप और तापमान नियंत्रण सेटअप
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके एक स्टेज इंसर्ट के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) और एक जेड-अक्ष पीजो चरण पर इमेजिंग करें: लेजर, आर्गन; स्कैन मोड, फ्रेम; फ्रेम आकार, 512 x 512; गति, अधिकतम; चैनल / बिट गहराई, 1/8 बिट; ज़ूम, 1.5; जेड-स्टैक, स्लाइस = 15, कीप = स्लाइस; फोकस डिवाइस और रणनीति, निश्चित फोकस; फोकस, निश्चित फोकस पर।
    2. थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर बनाने के लिए हीट ट्रांसफर कंपाउंड द्वारा हीट सिंक में एक पेल्टियर कूलिंग मॉड्यूल संलग्न करें। पेल्टियर 2 ए बिजली की आपूर्ति द्वारा संचालित है।
    3. तापमान रिकॉर्ड करने के लिए डेटा अधिग्रहण डिवाइस में थर्मोकपल माइक्रोप्रोब संलग्न करें।
  3. कैल्शियम इमेजिंग
    1. लार्वा को 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) में 3x कुल्ला करें।
    2. ग्लास स्लाइड के केंद्र में पिपेट 75 μL 1x PBS।
    3. 1x PBS में एक या दो लार्वा डालें और लार्वा के पास थर्मोकपल माइक्रोप्रोब रखें।
      नोट: लार्वा और माइक्रोप्रोब के बीच की दूरी ~ 5 मिमी होनी चाहिए। लार्वा स्थानांतरित हो सकता है यदि माइक्रोप्रोब उनके बहुत करीब स्थित है। एक बड़ी दूरी के परिणामस्वरूप गलत तापमान रीडिंग हो सकती है।
    4. लार्वा और थर्मोकपल माइक्रोप्रोब को ग्लास कवरस्लिप से कवर करें। नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें।
    5. माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड रखें, 25x उद्देश्य का उपयोग करके फोकस ढूंढें, और थर्मोइलेक्ट्रिक कूलर को स्लाइड पर रखें।
      नोट: पेल्टियर को सीधे स्लाइड पर रखा जाता है जहां लार्वा तापमान उत्तेजनाओं को वितरित करने के लिए होते हैं।
    6. कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर में, रुचि के फ्लोरोसेंट कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें। अतिसंतृप्ति से बचने के लिए लेजर शक्ति समायोजित करें। जेड-स्टैक सेटिंग में पहला और अंतिम स्लाइस स्थान सेट करें।
      नोट: फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए रिकॉर्डिंग से पहले सबसे कम संभव लेजर शक्ति का उपयोग करें।
    7. एक ही समय में जेड-स्टैक स्कैनिंग और तापमान रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    8. बिजली की आपूर्ति को नियंत्रित करें जो पेल्टियर को पेल्टियर सतह के तापमान को बदलने के लिए शक्ति देता है। तापमान को कम करने के लिए बिजली की आपूर्ति चालू करें और तापमान बढ़ाने के लिए इसे बंद कर दें।
    9. जेड-स्टैक स्कैनिंग और तापमान रिकॉर्डिंग बंद करें।

2. 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटा का विश्लेषण

  1. कैल्शियम इमेजिंग डेटा को TIFF फ़ाइलों में निर्यात करें और उन्हें TIFF फ़ाइलों के आधार नाम के समान नाम के साथ एक फ़ोल्डर में सहेजें।
    नोट: फ़ाइल नाम में कोई अल्पविराम नहीं होना चाहिए।
    1. ZEN (काला संस्करण) से कैल्शियम इमेजिंग डेटा निर्यात करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: फ़ाइल प्रकार, TIFF; संपीड़न, LZW; चैनल, 2; जेड-स्थिति, सभी; समय, सब; चरण, 1; क्षेत्र, भरा हुआ।
  2. संस्थापन
    1. Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases) से TACI-Calcium_Imaging.jar डाउनलोड करें।
    2. मेनू बार में प्लगइन्स पर क्लिक करके FIJI में प्लगइन स्थापित करें और फिर ड्रॉपडाउन मेनू में इंस्टॉल करें पर क्लिक करें (प्लगइन्स | स्थापित करें)। फिर, FIJI को पुनरारंभ करें।
      नोट: प्लगइन्स का उपयोग न करें | प्लगइन स्थापित करें.
    3. प्लगइन्स पर क्लिक करके प्लगइन चलाएं और फिर TACI-कैल्शियम इमेजिंग (प्लगइन्स) चुनें टीएसीआई-कैल्शियम इमेजिंग)।
  3. TIFF फ़ाइल नामों को आवश्यक संरचना में कनवर्ट करने के लिए RENAME फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    नोट: उपकरण डिफ़ॉल्ट संरचना के रूप में filename_h # t # z # c # .tif का उपयोग करता है (h # और c # वैकल्पिक हैं; #: एक धनात्मक पूर्णांक)। यदि छवि फ़ाइल नाम डिफ़ॉल्ट संरचना में नहीं हैं, तो RENAME फ़ंक्शन निष्पादित किया जाना चाहिए।
    1. वह फ़ोल्डर चुनें जिसमें TIFF छवियों को फ़ोल्डर ब्राउज़ करें क्लिक करके नाम बदलने की आवश्यकता है.
    2. पैरामीटर जानकारी भरें। पांच पैरामीटर सूचीबद्ध हैं, जिनमें फ़ाइल नाम, चरण, मैक्स टी-पोजिशन, मैक्स जेड-पोजिशन और चैनल शामिल हैं। प्रत्येक पैरामीटर में तीन मान होते हैं: पूर्ववर्ती पाठ, पैरामीटर मान और आदेश।
      नोट: जानकारी मामले-संवेदनशील है। यदि छवि फ़ाइल नामों में पैरामीटर से पहले एक वाक्यांश है, तो वाक्यांश को संबंधित पैरामीटर के पूर्ववर्ती पाठ के रूप में भरें। यदि छवि फ़ाइल नामों में सभी मापदंडों के बाद एक वाक्यांश है, तो वाक्यांश को पोस्ट टेक्स्ट के रूप में भरें।
      1. फ़ाइल नाम, मैक्स टी-पोजिशन और मैक्स जेड-पोजिशन दर्ज करना सुनिश्चित करें और मैक्स टी-पोजिशन और मैक्स जेड-पोजिशन के पैरामीटर मानों में सभी अंक शामिल हैं।
      2. फ़ोल्डर नाम का उपयोग कर फ़ाइल नाम स्वचालित रूप से भरे जाने की प्रतीक्षा करें.
      3. यदि TIFF फ़ाइल नामों में चरण और चैनल शामिल नहीं हैं, तो संबंधित पैरामीटर मान रिक्त छोड़ दें, और क्रम में Na चुनें।
    3. समान नाम और _r वाला फ़ोल्डर बनाने के लिए नाम बदलें क्लिक करें. ध्यान दें कि फ़ोल्डर में, TIFF फ़ाइल नामों को ORGANIZE फ़ंक्शन के साथ संगत होने के लिए पुनर्गठित किया गया है ।
      नोट: _r को TIFF छवियों के फ़ाइल नामों में जोड़ा गया है।
  4. TIFF छवियों को एक फ़ोल्डर में समान z-स्थिति से सहेजने के लिए ORGANIZE फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    नोट: फ़ोल्डर नाम में अंदर TIFF फ़ाइलों के आधार नाम के समान नाम होना चाहिए और इसमें कोई अल्पविराम नहीं होना चाहिए।
    1. वह फ़ोल्डर चुनें जिसमें TIFF छवियों को फ़ोल्डर ब्राउज़ करें क्लिक करके व्यवस्थित करने की आवश्यकता है.
    2. यदि पैरामीटर CSV फ़ाइल (param.csv) मौजूद है, तो पैरामीटर मानों को स्वचालित रूप से भरे जाने की प्रतीक्षा करें।
      नोट: परम.csv फ़ाइल में एक आवश्यक स्वरूप है। फ़ाइल नाम, चरण, position_t, position_z, चैनल और is_gray सहित पैरामीटर, कॉलम A से शुरू होने वाले बाएं से दाएं पंक्ति 1 में भरे जाने चाहिए। प्रत्येक पैरामीटर के लिए संगत मान पंक्ति 2 में भरे जाने चाहिए।
    3. यदि पैरामीटर CSV फ़ाइल (param.csv) मौजूद नहीं है, तो मैन्युअल रूप से पैरामीटर मान भरें। सुनिश्चित करें कि चरण और चैनल के पैरामीटर मूल्यों में अक्षर शामिल हैं, जबकि टी स्थिति और जेड स्थिति के पैरामीटर मान टी- और जेड-पदों की सबसे बड़ी संख्या होनी चाहिए। यदि छवि फ़ाइल नामों में चरण या चैनल शामिल नहीं है, तो Na दर्ज करें।
    4. जरूरत पड़ने पर ग्रेस्केल टीआईएफएफ छवियां बनाएं। छवियों को ग्रे करने के लिए ग्रे के बॉक्स को छोड़ दें?
    5. समान नाम और _gray_stacks के साथ फ़ोल्डर बनाने के लिए व्यवस्थित करें पर क्लिक करें और फ़ोल्डर में समान नाम और _# (#: z-स्थिति) वाले फ़ोल्डर उत्पन्न करें. ध्यान दें कि TIFF फ़ाइलों को z-पोजिशन द्वारा संबंधित फ़ोल्डरों में क्रमबद्ध किया जाता है और परम.csv नामक एक फ़ाइल उत्पन्न होती है, जिसमें पैरामीटर और उनके मान पाए जा सकते हैं।
  5. प्रत्येक जेड-स्थिति से रुचि की कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालने के लिए फिजी में ट्रैकमेट का उपयोग करें।
    नोट: यह चरण अन्य इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा भी पूरा किया जा सकता है।
    1. FIJI द्वारा Z-स्थिति फ़ोल्डर में TIFF छवियों को खोलें।
    2. प्लगइन्स पर क्लिक करके TrackMate चलाएँ | ट्रैकिंग | TrackMate, और यदि आवश्यक हो तो निम्न पैरामीटर समायोजित करें।
      1. डीओजी या एलओजी डिटेक्टरों का उपयोग करें।
      2. ब्लॉब व्यास, दहलीज और माध्य फ़िल्टर बदलें। कोशिकाओं के व्यास के समान होने के लिए ब्लॉब व्यास को समायोजित करें। यदि कोशिकाएं अंडाकार हैं, तो ब्लॉब व्यास को मामूली अक्ष के समान समायोजित करें।
        नोट: सीमा बढ़ाने से सिग्नल तीव्रता को प्रभावित किए बिना पृष्ठभूमि शोर को सिग्नल के रूप में उठाए जाने से बचने में मदद मिलती है (पूरक चित्रा 1)। हालांकि, सीमा में वृद्धि सच्चे संकेतों को याद कर सकती है (पूरक चित्रा 1)। यदि संकेत मजबूत हैं, तो नमक और काली मिर्च शोर को कम करने के लिए औसत फ़िल्टर का उपयोग करें।
      3. अप्रासंगिक संकेतों में से कुछ को हटाने के लिए फ़िल्टर सेट करें, यदि सभी नहीं। फ़िल्टर X और Y स्थानिक फ़िल्टर हैं। वास्तविक संकेतों से दूर अप्रासंगिक संकेतों को हटाने के लिए फ़िल्टर एक्स और वाई का उपयोग करें।
        नोट: जब फ़िल्टर एक छवि पर सेट किए जाते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अन्य सभी छवियों की जांच करना महत्वपूर्ण है कि वास्तविक संकेत ों को हटाया नहीं गया है।
      4. लिंकिंग अधिकतम दूरी, गैप-क्लोजिंग मैक्स डिस्टेंस और गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप सेट करें। लिंकिंग अधिकतम दूरी और गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी को 3x-5x ब्लॉब व्यास पर सेट करें, खासकर जब नमूने समय के साथ काफी आगे बढ़ते हैं, ताकि पटरियों की संख्या को कम करने में मदद मिल सके। स्टैक में छवियों की संख्या के लिए गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप सेट करें।
      5. रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) की प्रतिदीप्ति तीव्रता को सीएसवी फ़ाइल में निर्यात करें। यदि कोई पुराना TrackMate संस्करण उपयोग किया जाता है, तो कार्रवाई चुनें विंडो में सभी स्पॉट आँकड़े निर्यात करें. यदि TrackMate संस्करण 7.6.1 या उच्चतर है, तो प्रदर्शन विकल्प विंडो में स्पॉट चुनें। CSV फ़ाइलों में इंटरैक्टिव फ़ाइलों के रूप में निर्यात या सहेजें.
        नोट: दोनों फाइलें छवि विंडो के साथ इंटरैक्टिव हैं; आरओआई को हाइलाइट करने से छवि विंडो में संबंधित आरओआई प्रदर्शित होता है। इन फ़ाइलों में संबंधित समय बिंदुओं (POSITION_T) पर रुचि की कोशिकाओं की औसत तीव्रता (MEAN_INTENSITY या MEAN_INTENSITY_CH1) शामिल हैं। एक ही TRACK_IDs को अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक ही आरओआई का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। हालांकि, यह हमेशा सच नहीं होता है और जब आवश्यक हो तो मैन्युअल रूप से ठीक करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि TrackMate कुछ समय बिंदुओं पर ROIs को नहीं पहचानता है, तो वे समय बिंदु प्रदर्शित नहीं होते हैं।
  6. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालें, और Background_list.csv फ़ाइल बनाएं।
    नोट: इस अध्ययन में, प्रत्येक जेड-स्थिति के लिए पृष्ठभूमि की तीव्रता का अनुमान तीन से पांच पड़ोसी समान आकार के ब्लॉब्स के औसत मूल्य का उपयोग करके लगाया गया था जिसमें प्रतिदीप्ति संकेत नहीं थे और अलग-अलग समय बिंदुओं से थे।
    1. Background_list.csv फ़ाइल में एक आवश्यक प्रारूप है: प्रत्येक कॉलम में एक न्यूरॉन की जानकारी होती है, जो न्यूरॉन 0 से शुरू होती है। पंक्ति 1 में न्यूरॉन संख्याओं को भरें, जैसे न्यूरॉन 0। फिर, विश्लेषण किए गए प्रत्येक जेड-स्थिति के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता प्रदान करें- यदि न्यूरॉन 0 के लिए पांच जेड-पदों का विश्लेषण किया जाता है, तो न्यूरॉन 0 के नीचे पांच पृष्ठभूमि तीव्रता मान भरें।
      नोट: TACI EXTRACT फ़ंक्शन के लिए Background_list.csv फ़ाइल आवश्यक है। यदि पृष्ठभूमि नगण्य है, तो प्रत्येक न्यूरॉन की शून्य-पृष्ठभूमि तीव्रता के साथ Background_list.csv प्रदान की जानी चाहिए।
  7. प्रत्येक टी-स्थिति पर अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता की पहचान करने के लिए एक्सट्रैक्ट फ़ंक्शन का उपयोग करें और समीकरण (1) में दिखाए गए अनुसार ऍफ़ / एफ0 की गणना करें।
    Equation 1(1)
    1. एक फ़ोल्डर बनाएं और न्यूरॉन नंबर का उपयोग करके इसे नाम दें, जो न्यूरॉन 0 से शुरू होता है। फ़ोल्डर में संबंधित न्यूरॉन की प्रतिदीप्ति जानकारी वाले सीएसवी फ़ाइलों को सहेजें। प्रत्येक सीएसवी फ़ाइल में एक जेड-स्थिति की जानकारी होती है, इसलिए सीएसवी फ़ाइलों की संख्या विश्लेषण किए गए जेड-पदों की संख्या के बराबर होती है। CSV फ़ाइलों को Mean_Intensity # .csv (# z-स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है) के रूप में नाम दें और प्रत्येक CSV फ़ाइल में कम से कम दो स्तंभ शामिल हैं: POSITION_T और MEAN_INTENSITY या MEAN_INTENSITY_CH1।
      नोट: रुचि के प्रत्येक कक्ष के लिए एक फ़ोल्डर बनाएँ।
    2. चरण 2.7.1 में बनाई गई Background_list.csv फ़ाइल और फ़ोल्डर्स को एक फ़ोल्डर में सहेजें। फ़ाइलें ब्राउज़ करें पर क्लिक करके यह फ़ोल्डर चुनें.
      नोट: Background_list.csv फ़ाइल में पृष्ठभूमि मानों की संख्या प्रत्येक न्यूरॉन के लिए Mean_Intensity # .csv फ़ाइलों की संख्या से मेल खाना चाहिए।
    3. पृष्ठभूमि फ़ाइल स्वचालित रूप से भर जाती है। टी पदों की संख्या के लिए टी-पदों की सबसे बड़ी संख्या भरें।
    4. प्रत्येक न्यूरॉन के लिए CSV फ़ाइलों और प्लॉटों सहित परिणाम फ़ोल्डर बनाने के लिए निकालें क्लिक करें. सीएसवी फाइलों में प्रत्येक टी-स्थिति में अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता और एएफ / एफ0 पर जानकारी शामिल है। प्लॉट टी-पोजीशन पर एएफ /एफ0 के लाइन चार्ट हैं।
      नोट: इस अध्ययन में, समीकरण (1) का उपयोग करके ऍF / F0 की गणना की गई थी। प्रत्येक जेड-स्थिति का पहला मान एफ0 के रूप में उपयोग किया गया था। यदि यह एफ0 उपयुक्त नहीं है20, तो प्लगइन python_files फ़ोल्डर में प्रत्येक न्यूरॉन के लिए कच्चे डेटा सहित फाइलें प्रदान करता है।
  8. प्रत्येक न्यूरॉन के एएफ / एफ0 को औसत करने के लिए मर्ज फ़ंक्शन का उपयोग करें, एसईएम की गणना करें, और टी-पदों पर औसत एएफ / एफ0 प्लॉट करें।
    1. फ़ाइलें ब्राउज़ करें पर क्लिक करके EXTRACT फ़ंक्शन द्वारा बनाए गए परिणाम फ़ोल्डर का चयन करें.
    2. टी-पदों की सबसे बड़ी संख्या के साथ टी पदों की संख्या भरें।
    3. merged_data.csv फ़ाइल और Average_dF_F0.png प्लॉट सहित merged_data फ़ोल्डर बनाने के लिए मर्ज क्लिक करें. सीएसवी फ़ाइल में औसत पर जानकारी और प्रत्येक टी-स्थिति पर एसईएम एएफ / एफ0 शामिल है। प्लॉट टी-पोजीशन पर औसत एएफ / एफ0 का एक लाइन चार्ट है।

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Representative Results

3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण का वर्कफ़्लो
इस अध्ययन में, हमने एक नया इमेजजे प्लगइन, टीएसीआई विकसित किया, और जेड-ड्रिफ्ट को ट्रैक करने और 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया जो कई जेड-पदों में दिखाई देने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को इंगित करता है (चित्रा 1)। इस उपकरण के चार कार्य हैं: नाम बदलें, व्यवस्थित करें, निकालें, और मर्ज करें। सबसे पहले, यदि छवि नाम ORGANIZE फ़ंक्शन के साथ संगत नहीं हैं, तो RENAME फ़ंक्शन छवि नामों को आवश्यक संरचना में परिवर्तित कर सकता है। फिर, आईएनजीई फ़ंक्शन ग्रेस्केल्स (यदि आवश्यक हो) और जेड-पदों द्वारा 3 डी कैल्शियम इमेजिंग टीआईएफएफ डेटा को व्यवस्थित करता है। एक ही z-स्थिति से छवियाँ एक फ़ोल्डर में सहेजी जाती हैं। इसके बाद, विभिन्न इमेजिंग विश्लेषण उपकरणों का उपयोग आरओआई का पता लगाने और ट्रैक करने और हर जेड-स्थिति के लिए समय के साथ उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालने के लिए किया जा सकता है। इस चरण को पूरा करने के लिए एक इमेजजे प्लगइन, ट्रैकमेट का उपयोग किया गया था। TrackMate एकल कणों21 को ट्रैक करने के लिए एक ओपन-सोर्स इमेजजे प्लगइन है। कैल्शियम इमेजिंग11,21,22,23 सहित लाइव-सेल इमेजिंग से जुड़े विभिन्न जैविक अध्ययनों में कणों को ट्रैक करने के लिए इसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। TrackMate, एक स्वचालित तरीके से, पार्श्व (x / y) दिशा में कोशिकाओं को ट्रैक करता है, ROIs का पता लगाता है, और लाइव-इमेजिंग डेटा सेट 4,12 से संकेत निकालता है। रुचि के प्रत्येक सेल के लिए, एक्सट्रैक्ट फ़ंक्शन टी-पोजिशन द्वारा सभी जेड-पदों से प्रतिदीप्ति तीव्रता को क्रमबद्ध करता है, प्रत्येक टी-स्थिति के अधिकतम मूल्यों की पहचान करता है, पृष्ठभूमि को घटाता है, और ऍF / F0 की गणना और प्लॉट करता है। अंत में, मर्ज फ़ंक्शन कई कोशिकाओं के ऍF / F0 के औसत की गणना और प्लॉट करता है।

तापमान में परिवर्तन के लिए फ्लाई लार्वा कूल न्यूरॉन्स की कैल्शियम प्रतिक्रियाएं
हमने फ्लाई लार्वा कूल न्यूरॉन्स में तापमान में उतार-चढ़ाव के जवाब में कैल्शियम परिवर्तनों का उपयोग करके इस विधि को मान्य किया। एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, जीसीएएमपी 6 एम24, आईआर 21 ए-गैल 4 25 द्वारा लार्वा शांत न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था। जब लगभग 27 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आता है, तो न्यूरॉन्स में कम इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर होता है (चित्रा 2 ए और चित्रा 3)। जब तापमान लगभग 10 डिग्री सेल्सियस तक कम हो गया था और वहां रखा गया था, तो इंट्रासेल्युलर कैल्शियम का स्तर तेजी से बढ़ गया और बनाए रखा गया (चित्रा 2 बी और चित्रा 3)। तापमान बढ़ने पर कैल्शियम का स्तर तेजी से गिर गया (चित्रा 3)।

एक मक्खी मस्तिष्क 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट का विश्लेषण
हमने फ्लाई ब्रेन 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट11 का उपयोग करके इस विधि को भी मान्य किया। चित्रित ट्रांसजेनिक मक्खियों (VT50339-Gal4; यूएएस-जीसीएएमपी 6 एफ) ने मस्तिष्क11 में मशरूम शरीर में जीसीएएमपी 6 एफ व्यक्त किया। 45 जेड-पोजिशन (1.5 μm अंतराल पर स्पेस) से डेटा 225 s (250 समय बिंदु) के लिए 50 हर्ट्ज पर एकत्र किया गया था, और डेटासेट के पहले आधे हिस्से (125 समय बिंदु) का विश्लेषण किया गया था। जब रिकॉर्डिंग शुरू हुई, तो सात न्यूरॉन्स में स्पष्ट प्रतिदीप्ति थी, और उनमें से चार का विश्लेषण किया गया था (चित्रा 4 ए)। इन न्यूरॉन्स में तीव्रता समय के साथ कम हो गई (चित्रा 4 बी)। जब ऑक्टेनोल लागू किया गया था (चित्रा 4 सी), कई न्यूरॉन्स उज्ज्वल हो गए। 10 न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति को समय बिंदु 92 (चित्रा 4 डी) पर एक साथ बढ़ते हुए पाया गया, यह सुझाव देते हुए कि ये मशरूम न्यूरॉन्स ऑक्टेनोल गंध का जवाब देते हैं। यद्यपि ऑक्टेनोल को 5 एस के लिए लागू किया गया था, इन न्यूरॉन्स में उच्च प्रतिदीप्ति केवल एक समय बिंदु (0.9 एस) में देखी गई थी और फिर जल्दी से गिरा दी गई थी, यह सुझाव देते हुए कि प्रतिक्रिया फासिक और क्षणिक है।

अतिव्यापी कोशिकाओं का पृथक्करण
चित्रा 5 ए तीन न्यूरॉन्स की अधिकतम प्रक्षेपण छवि प्रस्तुत करता है। सफेद तीर दो न्यूरॉन्स को इंगित करता है जो एक्स / वाई विमान में अतिव्यापी थे, लेकिन ऑर्थो व्यू ( चित्रा 5 बी में नीले और नारंगी तीर के निशान) में अलग थे, यह दर्शाता है कि ये न्यूरॉन्स अलग-अलग जेड-पदों में दिखाई देते हैं; नारंगी सेल में जेड 7 (चित्रा 5 सी) पर सबसे मजबूत संकेत था, जबकि नीले सेल में जेड 10 (चित्रा 5 डी) पर सबसे मजबूत संकेत था। उपकरण ने इन दो कोशिकाओं को अलग किया और नारंगी सेल (चित्रा 5 ई) के विलंबित लेकिन मजबूत सक्रियण का खुलासा किया।

Figure 1
चित्रा 1: 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने के लिए टीएसीआई का उपयोग करके वर्कफ़्लो। TACI के चार कार्य हैं: नाम बदलना, व्यवस्थित करना, निकालना और मर्ज करना। सबसे पहले, यदि TIFF नाम ORGANIZE फ़ंक्शन के साथ संगत नहीं हैं, तो RENAME फ़ंक्शन छवि नामों को आवश्यक संरचना में परिवर्तित कर सकता है। फिर, आईएनजीई फ़ंक्शन ग्रेस्केल्स (यदि आवश्यक हो) और जेड-पदों द्वारा 3 डी कैल्शियम इमेजिंग टीआईएफएफ डेटा को व्यवस्थित करता है। एक ही z-स्थिति से छवियाँ एक फ़ोल्डर में सहेजी जाती हैं। इसके बाद, विभिन्न इमेजिंग विश्लेषण उपकरणों का उपयोग आरओआई का पता लगाने और ट्रैक करने और हर जेड-स्थिति में उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालने के लिए किया जा सकता है। रुचि के प्रत्येक सेल के लिए, एक्सट्रैक्ट फ़ंक्शन संबंधित समय बिंदुओं द्वारा प्रतिदीप्ति तीव्रता को क्रमबद्ध करता है, प्रत्येक टी-स्थिति के अधिकतम मूल्यों की पहचान करता है, पृष्ठभूमि को घटाता है, और गणना करता है और एएफ / एफ0 की गणना और प्लॉट करता है। अंत में, मर्ज फ़ंक्शन कई कोशिकाओं के ऍF / F0 के औसत की गणना और प्लॉट करता है। संक्षेप: टीएसीआई = कैल्शियम इमेजिंग का ट्रैकमेट विश्लेषण; आरओआई = रुचि के क्षेत्र; F0 = प्रतिदीप्ति में परिवर्तन और प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: निष्क्रिय और सक्रिय अवस्थाओं में फ्लाई लार्वा कूल कोशिकाओं की कैल्शियम इमेजिंग। (A) कोशिकाएं निष्क्रिय अवस्था में मुश्किल से दिखाई देती हैं। (बी) कोशिकाएं सक्रिय अवस्था में दृढ़ता से फ्लोरोसेंट होती हैं। विभिन्न रंग के तीर अलग-अलग कोशिकाओं को इंगित करते हैं। जीनोटाइप Ir21a-Gal4 है; UAS-GCaMP6m. z5-13: 5 से 13 तक z-स्थिति पर छवियां। बी में, सफेद तीर द्वारा इंगित सेल को जेड 5 से जेड 8 पर दिखाया गया है; नारंगी और नीले तीर द्वारा इंगित कोशिकाओं को z8 से z13 पर दिखाया गया है। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रारंभिक तीव्रता (एफ0) की तुलना में प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ) में परिवर्तन के रूप में प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। जीनोटाइप Ir21a-Gal4 है; UAS-GCaMP6m. n = तीन जानवरों से 7 कोशिकाएं। निशान = एसईएम ± माध्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक फ्लाई ब्रेन 3 डी कैल्शियम इमेजिंग डेटासेट का विश्लेषण करना। (ए) समय बिंदु 1 (टी 1) पर अधिकतम प्रक्षेपण छवि। संख्या 0-3 चार विश्लेषण किए गए न्यूरॉन्स को इंगित करती है। (बी) समय के दौरान ए में न्यूरॉन्स 0-3 के प्रतिदीप्ति परिवर्तन 0 से 125 अंक देते हैं। (सी) समय बिंदु 92 (टी 92) पर अधिकतम प्रक्षेपण छवि। संख्या 0-9 10 विश्लेषित न्यूरॉन्स को इंगित करती है। (डी) समय के दौरान सी में न्यूरॉन्स 0-9 के प्रतिदीप्ति परिवर्तन 0 से 125 अंक देते हैं। या तो 5 एस हवा या 5 एस ऑक्टेनोल लागू किया गया था, जैसा कि ग्रे में दिखाया गया है। स्केल बार = कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता की 10,000 इकाइयाँ। संक्षिप्त नाम: OCT = ऑक्टेनोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: अधिकतम मान के आधार पर अतिव्यापी कोशिकाओं का पृथक्करण। (A) दो न्यूरॉन्स अधिकतम प्रक्षेपण छवि (m) में अतिव्यापी (सफेद तीर) हैं। जीनोटाइप Ir21a-Gal4 है; UAS-GCaMP6m. (बी) ये न्यूरॉन्स ऑर्थो व्यू (नीले और नारंगी तीर) में अलग-अलग हैं। (C, D) नारंगी सेल जेड 7 (सी) पर दिखाई देता है, जबकि नीला सेल जेड 10 (डी) पर दिखाई देता है। स्केल बार = 10 μm. (ई) नारंगी और नीली कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति परिवर्तनों को अलग-अलग जेड-पदों से अधिकतम मूल्यों का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। संक्षिप्त नाम: ऍF/F0 = प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का अनुपात प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: कमजोर कैल्शियम संकेतों वाले दो न्यूरॉन्स का विश्लेषण विभिन्न थ्रेसहोल्ड पर डीओजी और एलओजी डिटेक्टरों का उपयोग करके किया जाता है। (ए-सी) पहला न्यूरॉन (Ir21a-Gal8026/UAS-GCaMP6;Ir93a-Gal427) का विश्लेषण DoG और LoG द्वारा अलग-अलग थ्रेसहोल्ड पर किया जाता है। (ए) सीमा 0.1 पर निर्धारित की गई है। डीओजी और एलओजी दोनों सभी 36 टाइम पॉइंट्स का पता लगाते हैं। (बी) सीमा 0.3 पर निर्धारित की गई है। 36 टाइम प्वाइंट्स में से डीओजी ने 36 और एलओजी ने 35 का पता लगाया है। (C) सीमा 1.0 पर निर्धारित की गई है। 36 टाइम प्वाइंट्स में से डीओजी ने 34 और एलओजी ने 15 का पता लगाया है। (डी-एफ) दूसरे न्यूरॉन (UAS-GCaMP6;Ir68a-Gal428) का विश्लेषण DoG और LoG द्वारा अलग-अलग थ्रेसहोल्ड पर किया जाता है। (डी) सीमा 0.1 पर निर्धारित की गई है। डीओजी सभी 36 टाइम पॉइंट्स का पता लगाता है, और एलओजी 34 का पता लगाता है। (E) सीमा 0.3 पर निर्धारित है। 36 टाइम प्वाइंट्स में से डीओजी ने 33 और एलओजी ने 18 का पता लगाया है। (एफ) सीमा 1.0 पर निर्धारित की गई है। 36 टाइम प्वाइंट्स में से डीओजी ने 14 और एलओजी ने केवल एक का पता लगाया है। ध्यान दें, सीमा बढ़ाने से इसकी तीव्रता पढ़ने पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है यदि आरओआई को मान्यता दी जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: अधिकतम मान एक सेल की तीव्रता का एक अच्छा प्रतिनिधि है। (ए) विभिन्न जेड-दूरी वाले जेड-स्टैक का अनुकरण किया जाता है। (बी) विभिन्न जेड-पदों वाले जेड-स्टैक का अनुकरण किया जाता है। (सी) जेड-स्टैक विभिन्न तीव्रता वाले सिम्युलेटेड कोशिकाओं से बनाए जाते हैं। संक्षिप्तरूप: अधिकतम = जेड-स्टैक का अधिकतम मूल्य; ground_truth = सिम्युलेटेड सेल की मात्रा और इसकी भरी हुई तीव्रता का उत्पाद। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: टीएसीआई और 3 डी-आरओआई विधियों के बीच तुलना। (ए) नारंगी और नीले रंग द्वारा इंगित दो कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति परिवर्तन टीएसीआई और आईओआर प्रो में लिखे गए एक कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं। जीनोटाइप प्रकार R11F02-Gal429 है; UAS-GCaMP6m. (बी) नारंगी और नीले रंग द्वारा इंगित दो कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति परिवर्तन ों को टीएसीआई और आईएमएआरआईएस का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। जीनोटाइप प्रकार Ir21a-Gal4 है; UAS-GCaMP6m. संक्षिप्त नाम: ऍF/F0 = प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का अनुपात प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन ने एक नया इमेजजे प्लगइन, टीएसीआई विकसित किया, और 3 डी कैल्शियम इमेजिंग का विश्लेषण करने वाले वर्कफ़्लो का वर्णन किया। वर्तमान में उपलब्ध कई उपकरण एक्स / वाई गति को सही करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, हालांकि जेड-अक्ष पर गति को भी स्पष्ट रूप से निदान या सही करने की आवश्यकता होतीहै। एक जीवित जीव में छवि अधिग्रहण के दौरान, जीव के स्थिर होने पर भी जेड-अक्ष पर आंदोलन अपरिहार्य होता है, और कुछ उत्तेजनाएं, जैसे तापमान परिवर्तन, अक्सर महत्वपूर्ण जेड-बहाव का कारण बनती हैं। जेड-स्टैक्स की ऊंचाई बढ़ाने से पूरी इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान रुचि की कोशिकाओं को रिकॉर्ड करने की अनुमति मिलेगी; हालांकि, जेड-अक्ष पर गति का विश्लेषण करना तुच्छ नहीं है, खासकर जब व्यक्तिगत कोशिकाएं कई जेड-पदों में दिखाई देती हैं। यदि इस तरह के आंदोलन को अनदेखा किया जाता है, तो शोधकर्ता इन कोशिकाओं की सटीक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को प्राप्त नहीं करेंगे। टीएसीआई प्रत्येक जेड-स्थिति से प्रतिदीप्ति संकेतों को निकालकर जेड-बहाव को सही करता है। टीएसीआई का एक महत्वपूर्ण कदम प्रत्येक समय बिंदु पर अधिकतम मूल्य को क्रमबद्ध करना है और सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए इसका उपयोग करना है। इसलिए, इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान रुचि की कोशिकाओं के सभी जेड-पदों को शामिल करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, हम पांच या अधिक जेड-पदों में दिखाई देने वाले सेल की अनुमति देने की सलाह देते हैं ताकि जेड-दूरी और जेड-पोजीशन अधिकतम मूल्य को प्रभावित न करें (पूरक चित्रा 2 ए, बी)। इसके अलावा, टीएसीआई उन कोशिकाओं के पृथक्करण की अनुमति देता है जो पार्श्व (एक्स / वाई) दिशा में ओवरलैप होते हैं लेकिन विभिन्न जेड-पदों में दिखाई देते हैं।

जेड-बहाव को 3 डी आरओआई 8,11,29 से प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालकर भी ठीक किया जा सकता है। हमने दो 3 डी-आरओआई विधियों के साथ टीएसीआई की तुलना की। सबसे पहले, क्लेन एट अल ने IGOR Pro में लिखा एक कस्टम सॉफ्टवेयर बनाया जो कच्चे सिग्नल29 उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक 3 डी ROI में सबसे चमकीले 100 पिक्सेल का उपयोग करता है। इस विधि और टीएसीआई ने समान परिणाम उत्पन्न किए (पूरक चित्रा 3 ए)। दूसरा, हमने 3 डी आरओआई को मॉडल करने और उनकी औसत तीव्रता निकालने के लिए एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर आईएमएआरआईएस (संस्करण 9.8.2) लागू किया। हालांकि टीएसीआई और आईएमएआरआईएस के परिणामों ने समान रुझान प्रदर्शित किए, लेकिन फोल्ड परिवर्तन अलग थे (पूरक चित्रा 3 बी)। यह विसंगति एल्गोरिदम के कारण हो सकती है। ध्यान दें, टीएसीआई द्वारा निकाला गया अधिकतम मूल्य जमीनी सच्चाई तीव्रता (पूरक चित्रा 2 सी) के आनुपातिक है।

यद्यपि यह वर्कफ़्लो अर्ध-स्वचालित है और अभी भी शोधकर्ताओं से मैन्युअल प्रयासों की आवश्यकता होती है, यह 3 डी कैल्शियम इमेजिंग विश्लेषण के लिए एक कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह वर्कफ़्लो ImageJ पर आधारित है और इसके लिए वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर या प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता नहीं है। इस वर्कफ़्लो के लिए सीमाएँ और संभावित समाधान निम्नानुसार हैं. सबसे पहले, TACI केवल TIFF फ़ाइलों और एक विशिष्ट फ़ाइल नाम संरचना को स्वीकार करता है: filename_h # t # z # c # .tif (h # और c # वैकल्पिक हैं)। हालांकि, ImageJ के साथ संगत अन्य फ़ाइल स्वरूपों को ImageJ द्वारा आसानी से TIFF फ़ाइलों में परिवर्तित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्लगइन में एक नामांक फ़ंक्शन है जो छवि नामों को आवश्यक संरचना में परिवर्तित करता है ताकि यह विभिन्न प्रणालियों से प्राप्त कैल्शियम इमेजिंग डेटा के साथ संगत हो।

दूसरा, प्लगइन निरंतर पृष्ठभूमि के साथ कैल्शियम इमेजिंग डेटा के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रत्येक समय बिंदु पर आरओआई तीव्रता से संबंधित पृष्ठभूमि जानकारी को घटाना उतार-चढ़ाव वाली पृष्ठभूमि को सही करने का एक तरीका है। उपकरण python_files फ़ोल्डर में प्रत्येक समय बिंदु पर ROI तीव्रता प्रदान करता है। पृष्ठभूमि तीव्रता को (1) छवियों की औसत तीव्रता या (2) बिना सक्रिय कोशिकाओं वाले आरओआई की औसत तीव्रता द्वारा दर्शाया जा सकता है। ImageJ छवियों की औसत तीव्रता प्राप्त करने के तरीके प्रदान करता है (छवि पर क्लिक करके ) स्टैक | स्टैक को मापें) और यादृच्छिक आरओआई की औसत तीव्रता (विश्लेषण पर क्लिक करके ) उपकरण | ROI प्रबंधक | मल्टी मेजर)। यदि कैल्शियम इमेजिंग के दौरान फोटोब्लीचिंग होती है, तो ब्लीच सुधार फ़ंक्शन (छवि पर क्लिक करके ) समायोजित करें | ब्लीच सुधार) TrackMate से पहले चलाया जा सकता है।

अंत में, जेड-पदों में सेल पंजीकरण को इस वर्कफ़्लो में शामिल करने की आवश्यकता है यदि एक साथ बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के लिए टीएसीआई का उपयोग किया जाता है। तदनुसार, एक अतिरिक्त फ़ंक्शन विकसित करने की आवश्यकता है जो मर्ज फ़ंक्शन द्वारा आवश्यक डेटा संरचना में प्रतिदीप्ति तीव्रता पर जानकारी को व्यवस्थित करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

फ्रैलिन इमेजिंग सेंटर में एक ज़ीस एलएसएम 880 का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग डेटा एकत्र करने के लिए किया गया था। हम आईएमएआरआईएस सॉफ्टवेयर के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ मिशेल एल ओल्सन और युहांग पैन को स्वीकार करते हैं। हम पांडुलिपि पर रचनात्मक टिप्पणियों के लिए डॉ लेनवुड एस हीथ और गिटहब रीडमी फाइल पर टिप्पणियों के लिए स्टीवन गियावसिस को स्वीकार करते हैं। इस काम को एनआईएच आर 21 एमएच 122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) और एनआईएच आर 01 जीएम 140130 (https://www.nigms.nih.gov/) द्वारा एलएन तक समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt Fill Needel BD 303129
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific  10035-04-8 Fly food ingredient
Carbon dioxide Airgas UN1013 Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit Genesee 59-180
Confocal microscope LSM880 Zeiss 4109002107876000 An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software Measurement Computing
Dextrose Genesee 62-113 Fly food ingredient
Drosophila Agar Genesee 66-111 Fly food ingredient
Ethanol Decon Labs, Inc. 64-17-5 Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80 Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4 Dr. Aravinthan DT Samuel lab A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6 Bloomington Drosophila Stock Center 42750
Flypad Genesee 59-114
General purpose forged brass regulator Gentec G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-031
Green Drosophila tubing Genesee 59-124
Heat transfer compound MG Chemicals 860-60G
Heatsink Digi-Key Electronics ATS2193-ND Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator AmScope LED-6W
Inactive Dry Yeast Genesee 62-108 Fly food ingredient
Incubator Pervical DR-41VL Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate Thermo Scientific 126965000 Fly food ingrediete
Micro cover glass VWR  48382-126 22 x 40 mm
Microscope slides Fisher Scientific  12-544-2 25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish Kleancolor
Narrow Drosophila vials Genesee 32-113RL
Objective  Zeiss 420852-9871-000 LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module TE Technology TE-127-1.0-0.8 30 x 30 mm
Plugs Genesee 49-102
Power Supply Circuit Specialists CSI1802X 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture Princeton Artist Brush Co. Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate Thermo Scientific 033241-36 Fly food ingredient
Stage insert  Wienecke and Sinske 432339-9030-000
Stereo Microscope Olympus SZ61 Any stereo microscope works
T-Fitting Genesee 59-123
Thermocouple data acquisition device Measurement Computing USB-2001-TC Single channel
Thermocouple microprobe Physitemp IT-24P 
Yellow Cornmeal Genesee 62-101 Fly food ingredient
Z-axis piezo stage Wienecke and Sinske 432339-9000-000

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 190
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Omelchenko, A. A., Bai, H., Hussain, S., Tyrrell, J. J., Klein, M., Ni, L. TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (190), e64953, doi:10.3791/64953 (2022).

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