Summary
Nós descrevemos um ensaio qualitativo para a adesão e invasão de levedura ágar como uma medida de diferenciação invasivo e pseudohyphal. Este ensaio simples pode ser usado para avaliar o fenótipo invasivo de mutantes diversas, bem como as pistas efeitos ambientais e vias de sinalização na diferenciação de levedura.
Abstract
Leveduras são encontradas em biofilmes naturais, onde muitos microrganismos colonizam superfícies. Em ambientes artificiais, tais como superfícies de objetos feitos pelo homem, os biofilmes podem reduzir a produtividade industrial, destruir estruturas, e ameaçam a vida humana. 1-3 Por outro lado, aproveitando o poder de biofilmes pode ajudar a limpar o meio ambiente e geração de energia sustentável. 08/04 A capacidade de S. cerevisiae para colonizar superfícies e participar em biofilmes complexo foi ignorada na maior parte, até a redescoberta dos programas de diferenciação desencadeada por várias vias de sinalização e sugestões ambientais a este organismo. 9, 10 O interesse de continuar no uso de S. cerevisiae como organismo modelo para entender a interação e convergência das vias de sinalização, como o Ras-PKA, Kss1 MAPK e Hog1 vias de osmolaridade, rapidamente colocado S. cerevisiae na junção de biofilme biologia e da pesquisa de transdução de sinal. 20/11 Para este fim, a diferenciação de células de levedura em longas e adesivo, filamentos pseudohyphal tornou-se uma leitura conveniente para a ativação de vias de transdução de sinal em várias mudanças ambientais. No entanto, filamentação é uma coleção de fenótipos complexos, o que faz a dosagem para ele como se fosse um fenótipo simples enganosa. Na última década, vários ensaios foram adotados com sucesso a partir de estudos biofilme bacteriano para a pesquisa de leveduras, tais como ensaios MAT formação para medida de dispersão colônia em agar suave e coloração violeta cristal para medir quantitativamente a adesão da superfície celular. 12, 21 No entanto, tem havido alguma confusão em ensaios desenvolvidos para avaliar qualitativamente os fenótipos adesiva e invasiva de leveduras em ágar. Aqui, apresentamos um método simples e confiável para avaliar a qualidade adesiva e invasiva de cepas de leveduras com fácil de compreender as etapas para isolar a avaliação de adesão da avaliação invasão. Nosso método, adotado a partir de estudos anteriores, 10, 16 envolve células que crescem em meios líquidos e revestimento em condições diferenciais de nutrientes para o crescimento de grandes manchas, que em seguida, lave com água para avaliar a adesão e esfregar as células completamente fora da superfície do ágar para avaliar a invasão em o ágar. Nós eliminamos a necessidade de estrias células em ágar, o que afeta a invasão de células no agar. Em geral, observamos que as cepas haplóides que invadem agar são sempre cola, mas não todas as estirpes adesivo pode invadir o ágar. Nossa abordagem pode ser usada em conjunto com outros ensaios a dissecar cuidadosamente os passos e requisitos de diferenciação de transdução de sinal de levedura, diferenciação, quorum sensing, e formação de biofilme.
Protocol
- Colocar 200ul de culturas de interesse crescente em placas sintéticas mídia com as condições necessárias a fome (SC com glicose 2% versus SC com glicose 0,2%, por exemplo) Se a densidade de culturas são muito diferentes um do outro, ajustar a contagem de células por cultura 200ul de modo que cada gota tem aproximadamente a mesma quantidade de células.
- Certifique-se manter registros de que queda nas placas é que a cultura.
- Mantenha a tampa entreaberta prato e deixe em temperatura ambiente ou a 30 ° C até gotas estão secos.
- Placas de vedação com parafilme e filme plástico (opcional) e deixar em 30 ° C por 3-7 dias.
- Documentar o crescimento de células em placas (por leitura óptica, tirar uma foto digital, etc)
- Lave as células fora da superfície do ágar com água de alta pressão (de preferência água DI) para cerca de um minuto tendo o cuidado para o agar para não levantar e mudar a orientação.
- Se livrar do excesso de água batendo placas em toalhas de papel e deixá-las abertas para secar.
- Uma vez que as placas são secas documento de adesão em cada prato (por digitalização ou tirando fotos digitais)
- Células com um dedo enluvado, esfregue delicadamente off formam a superfície do ágar em água corrente por aproximadamente um minuto.
- Seca as placas como antes.
- Se estiver usando um escopo de dissecação, remover a agulha antes de colocar placas para a plataforma do microscópio.
- Invasão documento com ampliação de 10x ou 40x. Certifique-se de se concentrar na parte do meio de cada círculo, para as bordas serão muito lotado para ver morfologias de células individuais. As bordas podem indicar o nível de crescimento filamentoso e pode ser documentada para referência futura. Digitalização ou tirar uma foto digital de toda a placa também pode ser útil.
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Discussion
Células de levedura mostrar modos diversos de diferenciação de acordo com a disponibilidade de nutrientes e condições ambientais, incluindo a formação de esporos sob condições de estresse de fome e, filamentação sob várias tensões de nutrientes e floculação. Diversas leveduras, incluindo S. cerevisiae e C. albicans, também podem ser encontradas em biofilmes formados por um conjunto diversificado de microorganismos. Embora haja alguma correlação com filamentação e comportamento invasivo, não está claro exatamente como filamentação pode causar invasão e colonização de superfícies e tecidos. Levedura pode certamente ser encontrado em ambas as formas vegetativas e filamentosas em biofilmes na natureza, bem como lugares onde eles ameaçam a saúde humana, tais como cateteres e órgãos humanos infectados. 13/10 Para entender as vias de sinalização utilizados por leveduras para infectar os animais e para participar em biofilmes nocivos e benéficos, devemos desenvolver ensaios acessível e confiável. Aqui nós temos desenvolvido um ensaio, adotada a partir de adesão já existentes e disponíveis para testes de invasão de leveduras, que nos permitem determinar qualitativamente os fenótipos adesiva e invasiva de cepas de leveduras e mutantes em várias condições. O ensaio aqui apresentado elimina a exigência de estrias células de levedura sobre o ágar, onde a mera ação de estrias na superfície de ágar mudanças as qualidades invasivas e adesivo de levedura. Imagem digital de invadir as células, especialmente por um microscópio permite a avaliação semi-quantitativa do grau de invasão e aderência. Detecção de células, tais invasivo e adesivo é cortesia da única célula ensaio invasão agar desenvolvido pelo laboratório Sprague 9 e pode ser adaptado para fazer experimentos curso do tempo.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Lisa Schneper e Katrin Duevel de suas idéias no desenvolvimento deste ensaio.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
