Summary
Bu protokol, canlı hücrelerde Stub1 aracılı peksofajiyi tetiklemek ve izlemek için talimatlar sağlar.
Abstract
Memeli hücreleri, Stub1 aracılı peksofaji yoluyla peroksizomları çevirebilir. Yol potansiyel olarak peroksizomların miktarının ve kalitesinin hücresel kontrolüne izin verir. Bu işlem sırasında, ısı şoku proteini 70 ve ubikitin E3 ligaz, Stub1, peksofajiyi başlatmak için döndürülecek peroksizomlar üzerine translokasyona sahiptir. Stub1 ligaz aktivitesi, ubikitin ve diğer otofaji ile ilgili modüllerin hedeflenen peroksizomlarda birikmesine izin verir. Peroksizomal lümen içindeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin yükselmesi, Stub1 aracılı peksofajiyi aktive edebilir. Bu nedenle, bu yolu tetiklemek ve izlemek için boya destekli ROS üretimi kullanılabilir. Bu makalede, memeli hücre kültürlerinde peksofajiyi başlatmak için iki sınıf boya, floresan proteinleri ve sentetik floroforlar kullanma prosedürleri özetlenmektedir. Bu boya destekli ROS üretim tabanlı protokoller, yalnızca küresel olarak bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları hedeflemek için kullanılamaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir. Ayrıca Stub1 aracılı peksofajinin canlı hücre mikroskobu kullanılarak nasıl takip edilebileceğini de açıklıyoruz.
Introduction
Peroksizomlar, çoğu ökaryotik hücrede bulunan tek zara bağlı organellerdir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli yağ asitlerinin, pürin katabolizmasının ve eter fosfolipid ve safra asidi sentezinin beta-oksidasyonunu gerçekleştirmek için gerekli metabolik bir bölmedir1. Peroksizom türevi asetil-CoA, metabolizmadaki merkezi sinyalizasyonu düzenleyerek lipid homeostazını kontrol eder2. Bu nedenle, tehlikeye giren peroksizomal fonksiyonların nörodejeneratif bozukluklar, yaşlanma, kanserler, obezite ve diyabet dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda ima edilmesi şaşırtıcı değildir 3,4,5. Peroksizomal operasyonun sürdürülmesinde önemli bir süreç peksofajidir. Pekzofaji, peroksizomların otofaji ile seçici devri için katabolik bir süreçtir. Hücreler, peroksizomların miktarını ve kalitesini kontrol etmeye yardımcı olmak için peksofaji kullanır, böylece uygun peroksizomal fonksiyonu sağlar. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, PEX1 peroksizomal biyogenez faktörleri 1 ve 6'daki mutasyonların neden olduğu peroksizom kaybının kontrolsüz peksofaji6'dan kaynaklandığını göstermiştir. Özellikle, tüm peroksizom biyogenez bozukluğu (PBD) hastalarının% 65'i, memeli hücrelerinde PEX1, PEX6 ve PEX26'dan oluşan peroksizomal AAA ATPaz kompleksinde eksiklikler barındırmaktadır7.
Pekzofajiyi başlatmak ve incelemek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Mayada, sağlanan besinler peroksizoma bağımlı karbon kaynaklarından peroksizomdan bağımsız karbon kaynaklarına (hücresel peroksizom sayılarını düşürmek için) geçtiğinde peksofaji tetiklenir8. Örneğin, metanol tarafından yetiştirilen Pichia pastoris hücrelerinin metanol ortamından glikoz ortamına ve etanol ortamına transferi, sırasıyla 8,9,10 mikropeksofaji ve makropeksofajiyi indükler. Mikropeksofaji sekestörleri, vakuolün fincan benzeri vakuolar sekestrasyon membranları ve mikropekzofajiye özgü membran aparatı (MIPA) olarak adlandırılan kapak benzeri bir yapı oluşturacak şekilde yeniden şekillendirilerek peroksizomları bozunma için kümeledi. Makropeksofajide, bireysel peroksizomlar, peksofagozomlar olarak bilinen çift zarlı yapılar tarafından yutulur, ardından yıkım için vakuol ile füzyon 8,9,10 yapılır. Saccharomyces cerevisiae'deki Atg36p ve Pichia pastoris'teki Atg30p gibi peksofaji reseptörlerinin fosforilasyonu, reseptörlerin çekirdek otofaji makinelerini işe almaları ve otofagozomlara peroksizomal hedeflemeyi kolaylaştırmaları için kritik öneme sahiptir 8,11.
Memeli hücrelerinde, peksofaji ubikitinasyon ile indüklenebilir. Peroksizomal membran proteinleri PMP34 veya PEX3'ün sitozolik tarafta ubikitin ile etiketlenmesi peksofaji12'yi indükler. PEX3'ün aşırı ekspresyonu, lizozomlar13 tarafından peroksizom ubikitinasyonunu ve peroksizom eliminasyonunu indükler. Ek olarak, PEX5'in bir C-terminali EGFP ile füzyonu, monoubikitinlenmiş PEX5'in ihracatını bozar ve peksofaji14 ile sonuçlanır. Öte yandan, peksofajiH2O2tedavisi ile de tetiklenebilir. Peroksizomlar reaktif oksijen türleri (ROS) üretir; Spesifik olarak, çok uzun zincirli yağ asitlerinin (> 22 karbon) beta-oksidasyonunun ilk adımını katalize eden peroksizomal enzim Acox1, sadece asetil-CoA değil, aynı zamanda peroksizomal ROS da üretir. H2O2tedavisi altında artan ROS seviyelerine yanıtolarak, memeli hücreleri ROS üretimini azaltmak ve stresi hafifletmek için peksofajiyi aktive eder. H2O2tedavisinin ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) peroksizomlara alımını yönlendirdiği bildirilmiştir. ATM daha sonra peksofaji15 ile peroksizomal ciroyu teşvik etmek için PEX5'i fosforile eder.
Peroksizomlar ROS üreten merkezler olduğundan, ROS hasarına da eğilimlidirler. ROS kaynaklı peroksizomal yaralanmalar, peroksizom kalite kontrol yollarını başlatmak için hücreleri peksofajiyi aktive etmeye zorlar (hasarlı peroksizomun otofaji ile uzaklaştırılması). Burada, ROS kaynaklı peroksizomal hasarın talep üzerine tetiklenmesi için bir yaklaşım özetliyoruz. Protokol, 16,17,18,19,20 organelleri içinde ışıkla aktive edilen ROS üretiminden yararlanır (Şekil 1). Boya etiketli peroksizomlar aydınlatılır ve peroksizomal lümen içinde ROS üretimine yol açar, bu da özellikle peroksizomal hasarı tetikler. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığı gösterilmiştir. ROS stresli peroksizomlar, ubikitin E3 ligaz Stub1'i, peksofaji16 ile bireysel olarak uzaklaştırılmak üzere otofagozomlara yutulmalarına izin vermek için işe alırlar. Bu protokol, aynı hücre içindeki yaralı ve sağlıklı peroksizomların kaderini hızlandırılmış mikroskopi ile karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (tüm hücrelerde) küresel olarak zarar vermek için de kullanılabilir ve bu da peksofaji yolunun biyokimyasal analizine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peroksizom lümeninde diKillerRed veya kendi kendini etiketleyen proteinleri (SLP'ler) eksprese eden hücrelerin hazırlanması
- İstenilen hücreleri cam tabanlı hücre kültürü tabaklarına tohumlayın. Buradaki deney için, 840 μL kültür ortamında (DMEM / F-12% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) 2 x 105 insan SHSY5Y hücresini veya 840 μL kültür ortamında (DMEM% 10 sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) 20 mm çapında bir cam mikro kuyuya sahip 35 mm'lik bir kültür kabında tohumlayın.
NOT: Tohumlanan hücre sayısı, diğer spesifikasyonlardaki cam tabanlı tabaklar kullanılırken cam mikro kuyu alanına göre orantılı olarak ayarlanmalıdır. - Hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2/37 ° C'nin altında büyütün.
- Bir transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri istenen plazmidlerle transfekte edin.
- Canlı hücrelerdeki peroksizomları etiketlemek için PMP34-TagBFP kullanın. Peroksizom lümeninde ROS üretimi için peroksizom hedefli diKillerRed-VKSKL veya SLP-VKSKL (+ boya etiketli SLP ligandları) kullanın (ışıkla aktive edilen ROS üretimi yoluyla). Bu protokolde, kendi kendini etiketleyen protein HaloTag-VKSKL21'i kullanıyoruz. Sırasıyla Stub1 / Hsp70'in translokasyonunu, ubikitinlenmiş proteinlerin birikimini ve ROS stresli peroksizomlar, transfektif EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub veya EGFP-LC3B üzerinde otofagozomların oluşumunu izlemek için. Peroksizomal lümende ROS üretimini kontrol etmek için, peroksizom lokalize floresan redoks probu roGFP2-VKSKL22 ile birlikte transfekt diKillerRed-VKSKL.
- SHSY5Y hücre transfeksiyonu için, plazmidleri 55 μL serumsuz DMEM / F-12 içinde seyreltin ve 55 μL serumsuz DMEM / F12 içinde 1 μL transfeksiyon reaktifini seyreltin. Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş reaktif ile birleştirin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Kompleksi, daha önce antibiyotiksiz SHSY5Y için 100 μL kültür ortamı ile kaplanmış 20 mm'lik mikro kuyucuğa ekleyin (% 10 fetal sığır serumu ile DMEM / F-12). Tabağı yavaşça ileri geri sallayın.
- NIH3T3 hücre transfeksiyonu için, plazmidleri ve transfeksiyon reaktifini seyreltmek için serumsuz DMEM / F-12 yerine azaltılmış serum ortamını kullanın. Kaplama kültür ortamını SHSY5Y ile antibiyotiksiz NIH3T3 hücreleri için kültür ortamı ile değiştirin (% 10 sığır serumu ile DMEM).
- 2 saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı çıkarın ve 1 mL taze kültür ortamı ekleyin. NIH3T3 veya SHSY5Y hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Diğer hücre hatları da Stub1 aracılı peksofajiyi (örneğin, HeLa hücreleri) incelemek için kullanılabilir.
2. Peroksizomların boya etiketli SLP ligandlarla boyanması (ışıkla aktive edilen ROS üretimi için)
- Transfeksiyondan 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın ve 20 mm'lik cam mikro kuyucuğa 100 μL 200 nM HaloTag TMR ligand veya 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag ligand ekleyin.
NOT: Boya etiketli SLP ligandları, her hücre hattı için ilgili kültür ortamı ile seyreltilmelidir. Janelia Fluor 646 etiketli ligandların seçilmesi, aşağı akış floresan görüntüleme için mavi, yeşil ve kırmızı kanalları serbest bırakacaktır. - Çanağı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre aktarın. 1 saat boyunca lekeleyin. 1 saat sonra, boyama ortamını iyice çıkarın ve 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.
3. Lazer taramalı konfokal mikroskopta peroksizomların ROS gerilmesi
- İstenilen hücreleri içeren cam tabanlı bir çanağı, bir sahne üstü inkübatör ile donatılmış lazer taramalı bir konfokal mikroskop üzerine yerleştirin.
- Araç Penceresi'ne tıklayın, Oküler'i seçin ve iletilen ışığı açmak için DIA düğmesine tıklayın (Şekil 2A). Çanağı mikroskop göz merceğinden görüntüleyin ve odak düğmesini çevirerek hücreleri odak noktasına getirin.
- LSM'yi seçin ve Boya ve Dedektör Seç düğmesine tıklayın (Şekil 2B). Hücreleri görüntülemek için uygun lazer ve filtre ayarlarını seçmek üzere açılır pencerede istediğiniz boyalara çift tıklayın (Şekil 2C). Hücrelerin floresan sinyallerini taramaya başlamak üzere hızlı lazer taramayı başlatmak için Canlı panelde Livex4'e tıklayın (Şekil 2D).
- Joystick denetleyicisini kullanarak sahneyi hareket ettirin ve ROS stresi (peroksizomlar üzerinde) uygulamak için orta diKillerRed-VKSKL veya SLP-VKSKL eksprese eden hücreleri bulun. İstediğiniz hücrenin görüntüsünü alın.
- Araç Penceresi'ne tıklayın ve LSM Stimülasyonu'nu seçin (Şekil 2E). Elips düğmesine tıklayın ve canlı görüntü penceresinde, ROS geriliminin uygulanacağı adım 3.4'te elde edilen istenen peroksizomları içeren 15 μm çapında dairesel bir ROI çizmek için fareyi kullanın (Şekil 2F) (örnek için Şekil 3'e bakın).
- ROS stresi uygulamak için, diKillerRed-PTS1 veya TMR etiketli SLP ligandına sahip hücreler için 561 nm ve Janelia Fluor 646 etiketli SLP ligandı ile boyanmış hücreler için 640 nm kullanın.
- ROS gerilimini uygulamak için lazer dalga boyunu seçin. İstediğiniz lazer yüzdesini ve süresini girin (Şekil 2G).
- Al'a tıklayın ve her biri 30 sn boyunca ROI'ler boyunca 561/640 nm ışıkla taramayı başlatmak için Stimülasyon düğmesine tıklayın (Şekil 2H). Bu, burada kullanılan konfokal mikroskopta hem 561 nm hem de 640 nm için ~% 5'lik bir lazer gücü ayarına karşılık gelir. Bu işlem peroksizomlarda ROS üretimine yol açacaktır.
NOT: Farklı boyutlarda yatırım getirileri seçilebilir. Her bir yatırım getirisi için aydınlatma süresi, alanına göre orantılı olarak ayarlanmalıdır. - 30 sn lazer aydınlatmadan sonra, ROI'lerdeki peroksizomlar diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646 sinyallerini kaybetmiş olacaklardır. Bu sinyal kaybı, aydınlatılanları bir hücre içindeki aydınlatılmamış peroksizomlardan (hasarlı ve sağlıklı) ayırt etmeyi sağlar.
4. Canlı hücrelerde peksofajinin hızlandırılmış görüntüleme ile izlenmesi
- EGFP etiketli Stub1, Hsp70, Ub, p62 veya LC3B'nin, çerçeveler arasında 10 dakikalık aralıklarla hızlandırılmış görüntüleme ile aydınlatılmış/ROS stresli peroksizomlara translokasyonunu izleyin (örneğin, bkz. Şekil 3-7).
NOT: EGFP-Stub1 veya EGFP-Hsp70 sinyalleri aydınlatmadan 10-20 dakika sonra görünmeye başlar ve ~ 40 dakika sonra aydınlatmaya kadar tüm hasarlı peroksizomlarda kalır. EGFP-Ub sinyalleri aydınlatmadan 30 dakika sonra görünür ve 2-3 saat sürer. EGFP-p62 translokasyonu aydınlatmadan 60 dakika sonra görünür ve EGFP-LC3B sinyalleri aydınlatmadan ~ 3 saat sonra görünür hale gelir. - ImageJ kullanarak hasarlı peroksizomlardaki (Stub1, Ub, p62 veya LC3B'den) EGFP sinyallerini sayısallaştırın. Üç kanallı bir görüntüyü (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) ölçmek üzere ImageJ'yi kullanmak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Görüntüyü açın ve tüm aydınlatılmış peroksizomları (PMP34-TagBFP sinyali pozitif ve HaloTag ligand sinyali ağartılmış; Şekil 8A).
- PMP34-TagBFP kanalını seçmek için Çoğalt'a tıklayın (Şekil 8A). Peroksizomları işaretlemek için Resim >> Eşiği Ayarla açılır menüsünü kullanarak bir eşik ayarlayın (Şekil 8B).
- Işıklı peroksizomların tam bölgelerini belirlemek için Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i seçin. ImageJ, bu ilgi alanlarını (ROI) ROI yöneticisine kaydeder (Şekil 8C).
- EGFP konjuge Ub, p62 veya LC3B'den gelen floresan sinyalini analiz etmek üzere EGFP kanalını seçmek için Çoğalt'a tıklayın (Şekil 8D). YG Yöneticisi'nde tüm YG'leri seçin (Şekil 8E).
- Peroksizomlar üzerindeki EGFP sinyallerini ölçmek için ROI Manager'da Measure uygulayın (Şekil 8E). Sonuçlar tablosunda her YG için alanın değerini ve entegre yoğunluğu (tüm piksel yoğunluklarının toplamı) bulun (Şekil 8E).
- Aydınlatmadan sonra farklı zaman noktalarında ortalama EGFP floresan yoğunluklarını elde etmek için, entegre EGFP yoğunluğunu aydınlatılmış peroksizomların toplam alanına bölün (PMP34-TagBFP sinyali pozitif ve HaloTag ligand sinyali negatif alanları). Peroksizomlar üzerinde biriken sinyali elde etmek için, bir zaman noktasındaki ortalama yoğunluğu = 0 zamanındaki ortalama yoğunluktan çıkarın ve ardından = 0 zamanındaki ortalama yoğunlukla normalleştirin.
5. Bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (her hücrede) küresel olarak zarar vermek
- Adım 1'i (peroksizom hedefli diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] veya SLP [SLP-VKSKL] eksprese eden hücrelerin hazırlanması) ve adım 2'yi (SLP ligandı ile peroksizomların boyanması [ışıkla aktive edilen ROS üretimi için]) gerçekleştirin.
- 1 saatlik TMR etiketli ligand boyamasından sonra, boyama ortamını çıkarın ve 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; bir katalaz inhibitörü) içeren 1 mL kültür ortamı ekleyin.
NOT: Katalaz, peroksizom lümeninde eksprese edilen bir ROS temizleyicidir, bu nedenle 3-AT tedavisi, peroksizomlar üzerindeki ışığa bağlı oksidatif hasarı arttırmaya yardımcı olur. - Kültür kabını bir LED'in (555-570 nm) üzerine yerleştirin. Tüm hücreleri bir inkübatörde 9 saat boyunca 1,8 W /cm2 güç yoğunluğuyla aydınlatın.
NOT: Bu adımı bir inkübatörün dışında gerçekleştirmek için, kültür kabını 37°C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirin. 3-AT içeren ortama 20 mM HEPES ekleyin ve gaz değişimini en aza indirmek için kültür kabını şeffaf bir filmle örtün. HEPES, LED aydınlatma sırasında CO2 inkübatörü dışındaki hücre kültüründe fizyolojik pH'ı koruyan bir tamponlama ajanıdır. - Peroksizomlardaki EGFP-Ub, EGFP-p62 veya EGFP-LC3B sinyallerini görüntüleyerek LED kaynaklı hasarın başarısını doğrulayın. Yukarıda özetlenen aydınlatma koşulunu kullanarak, HaloTag-VKSKL'yi kararlı bir şekilde ifade eden SHSY5Y hücrelerinin% 82'si Stub1 aracılı peksofaji gösterdi.
- Aşağı akış biyokimyasal analizi için hücreleri toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gösterilen Stub1 aracılı peksofaji indüksiyon şeması, peroksizom lümen içindeki boya destekli ROS üretiminden yararlanır. Bu işlem minimum ışık yoğunluğu gerektirir. Bu nedenle, floresan proteinler veya boyalar içeren peroksizomlar, standart lazer taramalı konfokal mikroskoplar kullanılarak aydınlatılabilir. Fokal aydınlatma, floresan muhabir roGFP2-VKSKL tarafından belirtildiği gibi, bireysel peroksizomlar içinde anlık ve lokalize ROS üretimine yol açar (Şekil 9). Görüntüleme sırasında ek ROS oluşumunu önlemek için roGFP2-VKSKL ölçümlerinde diKillerRed-VKSKL'yi görüntülemedik. Şekil 9'daki sağ alttaki diKillerRed-VKSKL görüntüsü, hasarlı peroksizomlarınnerede 13 olduğunu açıkça belirtmek için tüm roGFP2-VKSKL ölçümleri yapıldıktan sonra alınmıştır. Veriler ayrıca, aydınlatılmamış peroksizomların etkilenmediğini ve metodolojinin hassasiyetini gösterdiğini göstermektedir. ROS, peroksizom yerleşik moleküllerinin küçük bir kısmının oksidasyonuna yol açarak peroksizom disfonksiyonuna yol açar. Bu akut operasyon, kişinin çeşitli peroksizom kalite kontrol yollarının sağlam bir şekilde araştırılmasını sağlar.
Bu metodolojiyi Stub1 aracılı peksofajiyi izlemek için kullanabildik. Stub1 aracılı peksofajide, Hsp70, otofaji ile peroksizom döngüsünü başlatmak için Stub1'i ROS stresli peroksizomlara alır. Bu işlem sırasında, Hsp70, Stub1, ubikitinlenmiş proteinler, otofaji adaptörü p62 ve LC3B, peksofajiyi yönlendirmek için ROS stresli peroksizomlarda sırayla görünür (Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6 , Şekil 7)13. Hızlandırılmış görüntüleme yoluyla, peksofajide bu kritik faktörlerin işe alınma zamanlamasını ve sırasını takip etmek mümkün olmuştur. Peroksizomları fokal olarak yaralamak için metodolojiyi kullanarak, Hsp70 / Stub1 makinesinin özellikle hasarlı peroksizomları hedeflediğini (ancak işlevsel olanları değil) kolayca gösterebiliriz. Bireysel peroksizomlarda ROS üretimini ortaya çıkarmanın yanı sıra, Stub1 aracılı peksofajinin biyokimyasal karakterizasyonu için bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara aynı anda zarar vermek için aynı stratejiyi kullanmak mümkündü (Şekil 10).
Şekil 1: Peroksizomlarda ışıkla aktive edilen ROS üretimi için şematik. (A) Peroksizomal ROS üretiminin ışıkla nasıl tetikleneceğinin şeması. KillerRed tandem dimerleri veya floresan SLP ligandları gibi boyalar, peroksizom hedefleme dizileri (VKSKL) kullanılarak peroksizomlara hedeflenir. (B) 3-AT, katalazı inhibe eder ve peroksizomal lümendeki ROS seviyelerini arttırmak için burada gösterilen şema ile birlikte kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Peroksizomlarda ROS üretimini aktive etmek için konfokal mikroskop kullanmak. (A) Protokoldeki adım 3.2 için ekran görüntüsü. (B-D) Protokoldeki adım 3.3 için ekran görüntüleri. (E-F) Protokoldeki adım 3.5 için ekran görüntüleri. (G) Protokoldeki adım 3.7 için ekran görüntüsü. (H) Protokoldeki adım 3.8 için ekran görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ROS gerilmeli peroksizomlarda EGFP-Stub1'in translokasyonu. SHSY5Y hücreleri HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP ve EGFP-Stub1 ile transfekte edildi. Transfeksiyondan bir gün sonra, hücreler 37 ° C'de (200 nM, 1 saat) HaloTag TMR ligandı ile boyandı. Burada, bu örnekteki hücrelerden birinden gelen veriler gösterilir. (A) Bu hücredeki beyaz dairesel bölge 561 nm aydınlatma için seçildi. (B) Beyaz dairesel bölgedeki aydınlatılmış peroksizomlar TMR floresanlarını hemen kaybettiler. (C) EGFP-Stub1, aydınlatılmış peroksizomlar üzerine t = 20 dk. Sol Üst Insets: beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümü. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EGFP-Hsp70'in ROS gerilmeli peroksizomlar tarafından işe alınması. HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP ve EGFP-Hsp70 eksprese eden SHSY5Y hücrelerindeki peroksizomlar 1 saat boyunca 200 nM HaloTag TMR ligand ile boyandı. Burada, bu örnekteki hücrelerden birinden gelen veriler gösterilir. (A) Hücredeki beyaz dairesel bölge 561 nm aydınlatmaya tabi tutuldu. (B) Bu aydınlatılmış bölgedeki aydınlatılmış peroksizomlar, foto-beyazlatma nedeniyle TMR floresanlarını hemen kaybettiler. (C) EGFP-Hsp70, 20 dakika sonra aydınlatılmış peroksizomlara translokasyonlu. Sağ alt insets: beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümü. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ROS stresli peroksizomlarda ubikitinlenmiş protein birikiminin hızlandırılmış görüntülemesi. (A) HaloTag TMR ligand boyamasından 1 saat sonra, EGFP-Ub, PMP34-TagBFP ve HaloTag-VKSKL eksprese eden bir SHSY5Y hücresindeki beyaz dairesel bölgedeki peroksizomlar 561 nm ile aydınlatıldı. (B) Bölge içindeki TMR floresansı aydınlatıldıktan sonra ağartıldı. EGFP-Ub daha sonra özellikle aydınlatılmış peroksizomlar üzerinde birikir (t = 40 dakika ve 561 nm aydınlatmadan 2 saat sonra gösterilir). Sağ alt insets: (C)'deki beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümü. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Otofaji adaptörü p62'nin ROS gerilimli peroksizomlar üzerinde birikmesi . (A) EGFP-p62, PMP34-TagBFP ve HaloTag-VKSKL'yi (HaloTag TMR ligandı ile boyanmış; 200 nM, 1 saat) ifade eden bir SHSY5Y hücresindeki beyaz dairesel bölge 561 nm ışıkla aydınlatıldı. (B) Aydınlatma, hedeflenen peroksizomlar üzerindeki TMR sinyallerinin derhal kaybolmasına neden oldu. (C) Aydınlatmadan 2.5 saat sonra, peroksizomlar EGFP-p62'yi işe aldı. Sağ üst insets: (C)'deki beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümleri. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: EGFP-LC3B'nin ROS gerilmeli peroksizomlara translokasyonu . (A) HaloTag TMR ligand boyamasından sonra (200 nM, 1 saat), EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP ve HaloTag-VKSKL'yi eksprese eden bir SHSY5Y hücresi beyaz dairesel bölge içinde 561 nm ile aydınlatıldı. (B) Aydınlatmadan sonra, beyaz dairesel bölgedeki peroksizomların TMR sinyali ağartıldı. (C) Aydınlatmadan 3,5 saat sonra, EGFP-LC3B, ROS stresli peroksizomlara yer değiştirir. Sağ üst insets: (C)'deki beyaz kare bölgelerin büyütülmüş görünümleri. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: ImageJ kullanarak hasarlı peroksizomlardaki floresan sinyallerinin ölçülmesi . (A) Protokoldeki adım 4.2.1 ve adım 4.2.2 için ekran görüntüsü. (B) Protokoldeki adım 4.2.2 için ekran görüntüsü. (C) Protokoldeki 4.2.3 adımları için ekran görüntüsü. (D) Protokoldeki adım 4.2.4 için ekran görüntüsü. (E) Protokoldeki adım 4.2.4 ve adım 4.2.5 için ekran görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Bireysel peroksizomlarda ışıkla aktive edilen ROS üretimi. Peroksizom lokalize redoks probu roGFP2-VKSKL, hedeflenen peroksizomlar içindeki ışıkla aktive edilen ROS üretimini doğrulamak için kullanıldı. DiKillerRed-VKSKL ve roGFP2-VKSKL eksprese eden bir NIH3T3 hücresinin beyaz dairesel bölgesindeki peroksizomlar 561 nm ışıkla aydınlatıldı ve bunlar (A) 561 nm ışık aydınlatmasından önce ve (B) 561 nm ışık aydınlatmasından sonra gösterildi. Solda: 405 nm uyarma (macenta) ile roGFP2-VKSKL emisyonu; orta: 488 nm uyarımlı roGFP2-VKSKL emisyonu (yeşil). 405 nm (macenta) tarafından uyarılan roGFP2-VKSKL emisyon sinyalinin 488 nm (yeşil) tarafından uyarılan emisyon sinyaline oranı, peroksizomlar içindeki ROS seviyelerini izler. (B)'deki beyaz dairesel bölge, 561 nm aydınlatmayı takiben diKillerRed-VKSKL emisyonunun anında kaybolduğunu gösterir. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara küresel olarak zarar veriyor. HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub ve PMP34-TagBFP'yi eksprese eden SHSY5Y hücreleri 1 saat boyunca HaloTag TMR ligand ile boyandı. (A) LED aydınlatmadan önce, EGFP-Ub floresansı sitoplazmada homojendi ve peroksizomlarla (HaloTag TMR ligandı ve PMP34-TagBFP ile işaretlenmiş) kolokalize olmadı. (B) 9 saatlik LED aydınlatmadan sonra, EGFP-Ub sinyali, (B) deki iki panelde belirtildiği gibi, konfokal bir kapta yetiştirilen hücrelerdeki tüm peroksizomlar üzerinde birikir. Tüm ölçek çubukları: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, peroksizomal ROS seviyelerini ışıkla yükselterek hücre kültürlerinde Stub1 aracılı peksofajinin nasıl tetikleneceğini ayrıntılarıyla açıklar. Protokol boya destekli ROS üretimine dayandığından, ilgili hücreler içinde diKillerRed-VKSKL veya boya etiketli SLP ligand boyamasının yeterli ekspresyonunun sağlanması gerekir. Farklı hücre tiplerinin veya farklı genetik geçmişlere sahip hücrelerin biraz farklı özelliklere sahip peroksizomları barındırabileceği göz önüne alındığında, peksofajinin indüksiyonunu sağlamak için tam aydınlatma koşullarını ayarlamak gerekebilir. Stub1 aracılı peksofajinin aktivasyonunu taramak için sağlam bir önlem, EGFP-Ub'nin aydınlatılmış peroksizomlara (aydınlatmadan 1 saat sonra) translokasyon olup olmadığını izlemektir13. Sağlıklı hücrelerde, EGFP-Ub sinyalleri genellikle sitoplazmada eşit olarak dağıtılır. Bu nedenle, aydınlatılmış peroksizomlara translokasyonunun gözlemlenmesi kolaydır. Aydınlatma koşulunu optimize etmek için, ışık yoğunluğu veya aydınlatma süresi değiştirilebilir. Peroksizomlara zarar vermeye çalışırken boyaların aşırı aydınlatılmasından kaçınmak da en iyisidir, çünkü bazıları aşağı akış görüntülemeye müdahale edebilecek fotokimyasal işlemlere maruz kalabilir. Örneğin, KillerRed'in aşırı aydınlatılmasının zayıf yeşil floresan olmasına neden olabileceği gösterilmiştir. Aşırı aydınlatma, aydınlatma23'ün hemen ardından aydınlatılmış peroksizomlar üzerinde soluk yeşil sinyaller üretir (EGFP tabanlı muhabirlerin translokasyonunun aksine, gerçekleşmesi onlarca dakika ila saatler sürebilir).
Metodoloji, araştırmacıların bir hücre içindeki peroksizomların bir kısmını bozmak için standart lazer taramalı konfokal mikroskopları kullanmalarına izin vererek, sağlıklı ve hasarlı peroksizomlar arasındaki kader farkının doğrudan karşılaştırılmasına izin verir. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, buradaki protokol, hücrelerdeki tüm peroksizomlar veya diğer organeller yerine peroksizomların sadece küçük bir kısmına ROS stresine neden olur. Bu nedenle, kalan sağlıklı peroksizomların aynı hücredeki ROS stresli peroksizomların peksofajisi üzerindeki etkisini incelemek mümkündür.
Bütün bir yemeğin aydınlatılmasıyla, bir hücre kültürü içindeki tüm peroksizomları hedeflemek ve Stub1 aracılı peksofajinin biyokimyasal analizine izin vermek de mümkündür. Hsc70 / Stub1'in hasarlı peroksizomları nasıl tanıdığı ve hangi peroksizomal substratların Stub1'in ubikitinasyonları bu protokol kullanılarak araştırılabilecek sorulardır. Daha genel olarak, peroksizom bozulma protokolü diğer peroksizom kalite kontrol yollarını araştırmak için de kullanılabilir. Peroksizomların, endoplazmik retikulum, mitokondri ve lipit damlacıkları da dahil olmak üzere hücre içindeki birçok farklı hücresel organele yakından bağlı olduğu göz önüne alındığında, hücrelerin peroksizom bozukluğuna yanıt olarak tüm hücresel yapıların davranışlarını sistematik olarak nasıl modüle ettiğini araştırmak da ilginç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden MOST 111-2311-B-001-019-MY3 araştırma hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J.
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
