Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Övervakning av Stub1-medierad pexofagi

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65010
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Summary

Detta protokoll innehåller instruktioner för utlösning och övervakning av Stub1-medierad pexofagi i levande celler.

Abstract

Däggdjursceller kan vända peroxisomer genom Stub1-medierad pexofagi. Vägen tillåter potentiellt cellulär kontroll av kvantiteten och kvaliteten på peroxisomer. Under denna process translokerar värmechockprotein 70 och ubiquitin E3-ligaset, Stub1, till peroxisomer som ska vändas för att initiera pexofagi. Stub1-ligasaktiviteten möjliggör ackumulering av ubiquitin och andra autofagirelaterade moduler på riktade peroxisomer. Förhöjning av nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) inom peroxisomalt lumen kan aktivera Stub1-medierad pexofagi. Man kan därför använda färgämnesassisterad ROS-generering för att utlösa och övervaka denna väg. Denna artikel beskriver procedurerna för användning av två klasser av färgämnen, fluorescerande proteiner och syntetiska fluoroforer, för att initiera pexofagi inom däggdjurscellkulturer. Dessa färgämnesassisterade ROS-generationsbaserade protokoll kan inte bara användas för att rikta in sig på alla peroxisomer inom en cellpopulation globalt utan kan också möjliggöra manipulation av enskilda peroxisomer i enskilda celler. Vi beskriver också hur Stub1-medierad pexofagi kan följas med hjälp av levande cellmikroskopi.

Introduction

Peroxisomer är enkelmembranbundna organeller som finns i de flesta eukaryota celler. Peroxisomer är ett metaboliskt fack som är nödvändigt för att utföra beta-oxidation av mycket långkedjiga fettsyror, purinkatabolism och eterfosfolipid- och gallsyrasyntes1. Peroxisom-härledd acetyl-CoA kontrollerar lipidhomeostas genom att reglera den centrala signaleringen i metabolism2. Därför är det ingen överraskning att komprometterade peroxisomala funktioner är underförstådda i olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa störningar, åldrande, cancer, fetma och diabetes 3,4,5. En viktig process vid upprätthållandet av peroxisomal drift är pexofagi. Pexophagy är en katabol process för selektiv omsättning av peroxisomer genom autofagi. Celler använder pexophagy för att hjälpa till att kontrollera kvantiteten och kvaliteten på peroxisomer, vilket säkerställer korrekt peroxisomal funktion. En nyligen genomförd studie visade att peroxisomförlust orsakad av mutationer i PEX1 peroxisomal biogenes faktor 1 och 6 är resultatet av okontrollerad pexofagi6. I synnerhet har 65% av alla patienter med peroxisombiogenessjukdom (PBD) brister i det peroxisomala AAA ATPas-komplexet, bestående av PEX1, PEX6 och PEX26 i däggdjursceller7.

Ett antal metoder kan användas för att initiera och studera pexofagi. I jäst utlöses pexophagy när de tillförda näringsämnena byts från peroxisomberoende kolkällor till peroxisomoberoende kolkällor (för att sänka cellulära peroxisomantal)8. Exempelvis inducerar överföringen av metanolodlade Pichia pastoris-celler från metanolmedium till glukosmedium och etanolmedium mikropexofagi respektive makropexofagi 8,9,10. Micropexophagy sekvestrerar grupperade peroxisomer för nedbrytning genom att omforma vakuolen för att bilda koppliknande vakuolära sekvestreringsmembran och en lockliknande struktur som kallas mikropexophagy-specifik membranapparat (MIPA). I makropexofagi uppslukas enskilda peroxisomer av dubbelmembranstrukturer som kallas pexofagosomer, följt av fusion med vakuolen för nedbrytning 8,9,10. Fosforyleringen av pexofagireceptorer, såsom Atg36p i Saccharomyces cerevisiae och Atg30p i Pichia pastoris, är avgörande för receptorerna att rekrytera kärnautofagimaskiner och för att underlätta peroxisomal inriktning mot autofagosomer 8,11.

I däggdjursceller kan pexofagi induceras genom ubiquitination. Märkning av de peroxisomala membranproteinerna PMP34 eller PEX3 med ubiquitin på den cytosoliska sidan inducerar pexofagi12. Överuttryck av PEX3 inducerar peroxisomubiquitinering och peroxisomeliminering av lysosomer13. Dessutom försämrar fusionen av PEX5 med en C-terminal EGFP exporten av monoubiquitinerad PEX5 och resulterar i pexophagy14. Å andra sidan kan pexophagy också utlösas avH2O2-behandling. Peroxisomer producerar reaktiva syreradikaler (ROS); specifikt producerar det peroxisomala enzymet Acox1, som katalyserar det första steget av beta-oxidation av mycket långkedjiga fettsyror (> 22 kol), inte bara acetyl-CoA utan också peroxisomal ROS. Som svar på de ökade ROS-nivåerna underH2O2-behandlingaktiverar däggdjursceller pexofagi för att sänka ROS-produktionen och lindra stress. Det har rapporterats attH2O2-behandlingdriver rekryteringen av ataxi-telangiektasi muterad (ATM) till peroxisomer. ATM fosforylerar sedan PEX5 för att främja peroxisomal omsättning genom pexophagy15.

Eftersom peroxisomer är ROS-genererande centra är de också benägna att ROS-skador. ROS-framkallade peroxisomala skador tvingar celler att aktivera pexofagi för att initiera peroxisomkvalitetskontrollvägar (avlägsnande av den skadade peroxisomen genom autofagi). Här beskriver vi ett tillvägagångssätt för on-demand utlösning av ROS-framkallad peroxisomal skada. Protokollet utnyttjar ljusaktiverad ROS-produktion inom organellerna 16,17,18,19,20 (figur 1). Färgmärkta peroxisomer belyses, vilket leder till ROS-produktion inom peroxisomalt lumen, vilket specifikt utlöser peroxisomal skada. Med hjälp av detta protokoll visas att ROS-stressade peroxisomer avlägsnas genom en ubiquitinberoende nedbrytningsväg. ROS-stressade peroxisomer rekryterar ubiquitin E3-ligaset Stub1 för att tillåta deras uppslukning i autofagosomer för individuellt avlägsnande av pexophagy16. Man kan använda detta protokoll för att jämföra ödet för skadade och friska peroxisomer inom samma cell genom time-lapse-mikroskopi. Metoden kan också användas för att globalt skada alla peroxisomer (i alla celler) på en odlingsskål, vilket möjliggör biokemisk analys av pexofagivägen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av celler som uttrycker diKillerRed eller självmärkande proteiner (SLP) i peroxisomlumen

  1. Frö de önskade cellerna på glasbottnade cellodlingsrätter. För experimentet här, frö 2 x 105 humana SHSY5Y-celler i 840 μL odlingsmedium (DMEM / F-12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) eller 6 x 104 mus NIH3T3-celler i 840 μL odlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% bovint serum och 1% penicillin / streptomycin) på en 35 mm odlingsskål med en 20 mm diameter glasmikrobrunn.
    OBS: Antalet celler som sås bör justeras proportionellt enligt glasmikrobrunnsområdet vid användning av glasbottenskålar med andra specifikationer.
  2. Odla cellerna under 5% CO2/37 ° C i 24 timmar.
  3. Transfekt cellerna med önskade plasmider med hjälp av ett transfektionsreagens.
    1. Använd PMP34-TagBFP för att märka peroxisomerna i levande celler. Använd antingen peroxisomriktad diKillerRed-VKSKL eller SLP-VKSKL (+ färgmärkta SLP-ligander) för ROS-generering i peroxisomlumen (genom ljusaktiverad ROS-produktion). I detta protokoll använder vi det självmärkta proteinet HaloTag-VKSKL21. För att övervaka translokationen av Stub1/Hsp70, ackumulering av ubiquitinerade proteiner och bildning av autofagosomer på ROS-stressade peroxisomer, transfekt EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub respektive EGFP-LC3B. För att kontrollera ROS-generering i peroxisomalt lumen, samtransfekt diKillerRed-VKSKL med den peroxisomlokaliserade fluorescerande redoxsonden roGFP2-VKSKL22.
    2. För SHSY5Y-celltransfektion, späd plasmiderna i 55 μL serumfritt DMEM/F-12 och späd 1 μL transfektionsreagens i 55 μL serumfritt DMEM/F12. Kombinera det utspädda DNA:t med det utspädda reagenset. Blanda försiktigt och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
    3. Tillsätt komplexet till 20 mm mikrobrunnen som tidigare pläterats med 100 μL odlingsmedium för SHSY5Y utan antibiotika (DMEM/F-12 med 10% fetalt bovint serum). Skaka försiktigt skålen fram och tillbaka.
    4. För NIH3T3-celltransfektion, ersätt reducerat serummedium med serumfritt DMEM/F-12 för utspädning av plasmiderna och transfektionsreagenset. Byt ut pläteringsodlingsmediet med SHSY5Y med odlingsmediet för NIH3T3-celler utan antibiotika (DMEM med 10% bovint serum).
  4. Efter 2 timmars transfektion, avlägsna det transfektionsreagensinnehållande mediet och tillsätt 1 ml färskt odlingsmedium. Inkubera NIH3T3- eller SHSY5Y-cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 i 24 timmar.
    OBS: Andra cellinjer kan också användas för att studera Stub1-medierad pexofagi (t.ex. HeLa-celler).

2. Färgning av peroxisomer med färgmärkta SLP-ligander (för ljusaktiverad ROS-produktion)

  1. Vid 24 timmar efter transfektion, avlägsna odlingsmediet och tillsätt 100 μL 200 nM HaloTag TMR-ligand eller 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag-ligand på 20 mm glasmikrobrunnen.
    OBS: De färgmärkta SLP-liganderna ska spädas med respektive odlingsmedium för varje cellinje. Att välja Janelia Fluor 646-märkta ligander kommer att frigöra de blå, gröna och röda kanalerna för fluorescensavbildning nedströms.
  2. Överför skålen till en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Fläck i 1 h. Efter 1 timme, ta bort färgningsmediet noggrant och tillsätt 1 ml färskt odlingsmedium.

3. ROS-betoning av peroxisomer på ett laserscanningskonfokalmikroskop

  1. Placera en glasbottnad skål som innehåller de önskade cellerna på ett laserskanningskonfokalmikroskop utrustat med en sceninkubator.
  2. Klicka på Verktygsfönster, välj Okulärt och klicka på DIA-knappen (Figur 2A) för att slå på det överförda ljuset. Visa skålen genom mikroskopokularet och sätt cellerna i fokus genom att vrida på fokusknappen.
  3. Välj LSM och klicka på knappen Färgämne &; Detektorval (bild 2B). Dubbelklicka på önskade färgämnen i popup-fönstret för att välja lämpliga laser- och filterinställningar för avbildning av cellerna (figur 2C). Klicka på Livex4 i Live-panelen för att starta snabb laserskanning för att starta screening för cellernas fluorescenssignaler (figur 2D).
  4. Flytta runt scenen med joystickkontrollen och lokalisera mediet diKillerRed-VKSKL- eller SLP-VKSKL-uttryckande celler för att applicera ROS-spänning (på peroxisomerna). Skaffa en bild av önskad cell.
  5. Klicka på Verktygsfönster och välj LSM-stimulering (bild 2E). Klicka på ellipsknappen och använd musen i livebildfönstret för att rita en cirkulär ROI på 15 μm i diameter (figur 2F) som innehåller de önskade peroxisomer som förvärvats i steg 3.4 på vilka ROS-spänning kommer att appliceras (se figur 3 för ett exempel).
  6. För att applicera ROS-stress, använd 561 nm för celler med diKillerRed-PTS1- eller TMR-märkt SLP-ligand och använd 640 nm för celler färgade med Janelia Fluor 646-märkt SLP-ligand.
  7. Välj laservåglängden för applicering av ROS-spänningen. Ange önskad laserprocent och varaktighet (bild 2G).
  8. Klicka på Skaffa och klicka på stimuleringsknappen (figur 2H) för att initiera skanningen med 561/640 nm ljus genom ROI i 30 s vardera. Detta motsvarar en ~ 5% lasereffektinställning för både 561 nm och 640 nm på det konfokalmikroskop som används här. Denna operation kommer att leda till ROS-produktion i peroxisomerna.
    OBS: Man kan välja ROI i olika storlekar. Man bör proportionellt justera belysningstiden för varje ROI enligt dess område.
  9. Efter 30 s laserbelysning kommer peroxisomer inom ROI att ha förlorat sina diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646-signaler. Denna signalförlust gör att man kan skilja de upplysta från de icke-upplysta peroxisomerna (skadade kontra friska) i en cell.

4. Övervakning av pexofagi i levande celler genom time-lapse-avbildning

  1. Följ translokationen av EGFP-märkta Stub1, Hsp70, Ub, p62 eller LC3B till de belysta/ROS-stressade peroxisomerna genom timelapse-avbildning med 10 minuters intervall mellan bildrutorna (för exempel, se figur 3-7).
    OBS: EGFP-Stub1 eller EGFP-Hsp70 signaler börjar visas 10-20 min efter belysning och stanna på alla skadade peroxisomer tills ~ 40 min efter belysning. EGFP-Ub-signalerna visas 30 min efter belysning och varar i 2-3 timmar. EGFP-p62-translokation visas 60 min efterbelysning och EGFP-LC3B-signaler blir synliga ~ 3 timmar efter belysning.
  2. Kvantifiera EGFP-signalerna på de skadade peroxisomerna (från Stub1, Ub, p62 eller LC3B) med ImageJ. Utför följande steg för att använda ImageJ för att kvantifiera en trekanalsbild (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL).
    1. Öppna bilden och använd elliptiska val eller frihandsval för att omsluta området som innehåller alla upplysta peroxisomer (PMP34-TagBFP-signal positiv och HaloTag-ligandsignal blekt; Figur 8A).
    2. Klicka på Duplicera för att välja PMP34-TagBFP-kanalen (bild 8A). Ställ in ett tröskelvärde med hjälp av rullgardinsmenyn Bild > Justera > tröskelvärde för att markera peroxisomerna (figur 8B).
    3. Välj Analysera > Analysera partiklar för att bestämma de exakta regionerna för de upplysta peroxisomerna. ImageJ registrerar dessa intressanta regioner (ROI) i ROI-hanteraren (figur 8C).
    4. Klicka på Duplicera för att välja ut EGFP-kanalen för att analysera fluorescenssignalen från EGFP-konjugerad Ub, p62 eller LC3B (figur 8D). Välj alla ROI i ROI-hanteraren (bild 8E).
    5. Tillämpa mått i ROI Manager för att mäta EGFP-signalerna på peroxisomerna (figur 8E). Hitta värdet på arean och den integrerade densiteten (summan av alla pixelintensiteter) för varje avkastning på investeringen i resultattabellen (bild 8E).
    6. För att erhålla den genomsnittliga EGFP-fluorescensintensiteten vid olika tidpunkter efter belysning, dela den integrerade EGFP-intensiteten med den totala ytan av belysta peroxisomer (PMP34-TagBFP-signalpositiva och HaloTag-ligandsignalnegativa områden). För att erhålla den ackumulerade signalen på peroxisomerna, subtrahera den genomsnittliga intensiteten vid en tidpunkt med den genomsnittliga intensiteten vid tiden = 0 och normalisera sedan med den genomsnittliga intensiteten vid tiden = 0.

5. Globalt skadar alla peroxisomer (i varje cell) på en odlingsrätt

  1. Utför steg 1 (beredning av celler som uttrycker peroxisomriktade diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] eller SLP [SLP-VKSKL]) och steg 2 (färgning av peroxisomer med SLP-liganden [för ljusaktiverad ROS-produktion]).
  2. Efter 1 h TMR-märkt ligandfärgning, avlägsna färgningsmediet och tillsätt 1 ml odlingsmedium innehållande 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; en katalashämmare).
    OBS: Katalas är en ROS-asätare uttryckt i peroxisomlumen, så 3-AT-behandling hjälper till att öka den ljusframkallade oxidativa skadan på peroxisomerna.
  3. Placera odlingsskålen ovanför en lysdiod (555-570 nm). Belysa alla celler med en effekttäthet på 1,8 W / cm2 i 9 timmar i en inkubator.
    OBS: För att utföra detta steg utanför en inkubator, placera odlingsskålen på en 37 ° C värmeplatta. Tillsätt 20 mM HEPES till det 3-AT-innehållande mediet och täck odlingsskålen med en transparent film för att minimera gasutbytet. HEPES är ett buffertmedel som upprätthåller fysiologiskt pH i cellodling utanför en CO2-inkubator under LED-belysning.
  4. Validera framgången för LED-framkallade skador genom att avbilda EGFP-Ub-, EGFP-p62- eller EGFP-LC3B-signalerna på peroxisomerna. Med hjälp av belysningsvillkoret som beskrivs ovan visade 82% av SHSY5Y-cellerna stabilt uttryckt HaloTag-VKSKL Stub1-medierad pexophagy.
  5. Skörda cellerna för nedströms biokemisk analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det Stub1-medierade pexophagy induktionsschemat som visas här utnyttjar färgassisterad ROS-generering inom peroxisomlumen. Denna operation kräver minimala ljusintensiteter. Peroxisomer som innehåller fluorescerande proteiner eller färgämnen kan därför belysas med hjälp av vanliga laserscanningskonfokalmikroskop. Fokal belysning leder till momentan och lokal ROS-produktion inom enskilda peroxisomer, vilket indikeras av den fluorescerande reportern roGFP2-VKSKL (figur 9). Vi avbildade inte diKillerRed-VKSKL i roGFP2-VKSKL-mätningarna för att undvika ytterligare ROS-generering under avbildning. Den nedre högra diKillerRed-VKSKL-bilden i figur 9 togs efter att alla roGFP2-VKSKL-mätningar gjordes för att tydligt indikera var de skadade peroxisomerna var13. Data visar också att obelysta peroxisomer inte påverkas, vilket indikerar metodens precision. ROS leder till oxidation av en liten del av peroxisombosatta molekyler, vilket leder till peroxisomdysfunktion. Denna akuta operation gör att man kan sondra de olika peroxisomkvalitetskontrollvägarna robust.

Vi kunde använda denna metod för att övervaka Stub1-medierad pexofagi. I Stub1-medierad pexofagi rekryterar Hsp70 Stub1 på ROS-stressade peroxisomer för att initiera peroxisomomsättning genom autofagi. Under denna process uppträder Hsp70, Stub1, ubiquitinerade proteiner, autofagiadapter p62 och LC3B sekventiellt på ROS-stressade peroxisomer för att driva pexofagi (figur 3, figur 4, figur 5, figur 6 , figur 7)13. Genom time-lapse-avbildning var det möjligt att följa tidpunkten och ordningen för rekryteringen av dessa kritiska faktorer vid pexofagi. Genom att använda metoden för att skada peroxisomer fokalt kunde vi enkelt visa att Hsp70/Stub1-maskinerna specifikt riktar sig mot skadade peroxisomer (men inte funktionella). Bortsett från att framkalla ROS-produktion inom enskilda peroxisomer var det möjligt att använda samma strategi för att samtidigt skada alla peroxisomer på en odlingsrätt för den biokemiska karakteriseringen av Stub1-medierad pexofagi (figur 10).

Figure 1
Figur 1: Schematisk för ljusaktiverad ROS-produktion i peroxisomer. (A) Schematisk bild av hur peroxisomal ROS-generering utlöses av ljus. Färgämnen som KillerRed tandemdimerer eller fluorescerande SLP-ligander riktas in i peroxisomer genom användning av peroxisommålsekvenser (VKSKL). (B) 3-AT hämmar katalas och kan användas tillsammans med schemat som visas här för att öka ROS-nivåerna i peroxisomalt lumen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Använda ett konfokalmikroskop för att aktivera ROS-produktion i peroxisomer. (A) Skärmbild för steg 3.2 i protokollet. (B-D) Skärmbilder för steg 3.3 i protokollet. (E-F) Skärmbilder för steg 3.5 i protokollet. (G) Skärmbild för steg 3.7 i protokollet. (H) Skärmbild för steg 3.8 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Translokation av EGFP-Stub1 på ROS-stressade peroxisomer. SHSY5Y-celler transfekterades med HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP och EGFP-Stub1. En dag efter transfektionen färgades cellerna med HaloTag TMR-liganden vid 37 °C (200 nM, 1 timme). Här visas data från en av cellerna i det här exemplet. (A) Det vita cirkulära området i denna cell valdes för 561 nm belysning. (B) De belysta peroxisomerna i det vita cirkulära området förlorade omedelbart sin TMR-fluorescens. (C) EGFP-Stub1 translokerad på de belysta peroxisomerna vid t = 20 min. Övre vänstra infällningar: förstorad vy av de vita fyrkantiga regionerna . Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Rekrytering av EGFP-Hsp70 med ROS-stressade peroxisomer. Peroxisomer i SHSY5Y-cellerna som uttrycker HaloTag-VKSKL, PMP34-TagBFP och EGFP-Hsp70 färgades med 200 nM HaloTag TMR-ligand i 1 timme. Här visas data från en av cellerna i det här exemplet. (A) Det vita cirkulära området i cellen utsattes för 561 nm belysning. (B) De belysta peroxisomerna i detta upplysta område förlorade omedelbart sin TMR-fluorescens på grund av fotoblekning. (C) EGFP-Hsp70 translokerad på de belysta peroxisomerna 20 min senare. Nedersta högra infällningar: förstorad vy av de vita fyrkantiga områdena. Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Time-lapse-avbildning av ubiquitinerad proteinackumulering på ROS-stressade peroxisomer. (A) Efter 1 timmes HaloTag TMR-ligandfärgning belystes peroxisomer inom det vita cirkulära området i en SHSY5Y-cell som uttrycker EGFP-Ub, PMP34-TagBFP och HaloTag-VKSKL med 561 nm. (B) TMR-fluorescensen inom området blektes efter belysning. EGFP-Ub ackumuleras senare specifikt på de belysta peroxisomerna (t = 40 min och 2 h efter att 561 nm-belysningen visas. Nedersta högra indrag: förstorad vy av de vita fyrkantiga områdena i (C). Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Ansamling av autofagiadaptern p62 på ROS-stressade peroxisomer . (A) Det vita cirkulära området i en SHSY5Y-cell som uttrycker EGFP-p62, PMP34-TagBFP och HaloTag-VKSKL (färgat med HaloTag TMR-liganden; 200 nM, 1 h) belystes med 561 nm ljus. (B) Belysningen orsakade omedelbar förlust av TMR-signalerna på de riktade peroxisomerna. (C) Vid 2,5 h efter belysning rekryterade peroxisomerna EGFP-p62. Övre högra infällningar: förstorade vyer av de vita fyrkantiga områdena i (C). Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Translokation av EGFP-LC3B till ROS-stressade peroxisomer. (A) Efter HaloTag TMR-ligandfärgning (200 nM, 1 h) belystes en SHSY5Y-cell som uttryckte EGFP-LC3B, PMP34-TagBFP och HaloTag-VKSKL med 561 nm inom det vita cirkulära området. (B) Efter belysning blektes TMR-signalen från peroxisomerna i det vita cirkulära området. (C) Vid 3,5 h efter belysning flyttas EGFP-LC3B till de ROS-stressade peroxisomerna. Övre högra infällningar: förstorade vyer av de vita fyrkantiga områdena i (C). Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Kvantifiering av fluorescenssignalerna på skadade peroxisomer med ImageJ . (A) Skärmbild för steg 4.2.1 och steg 4.2.2 i protokollet. (B) Skärmbild för steg 4.2.2 i protokollet. (C) Skärmbild för steg 4.2.3 i protokollet. (D) Skärmbild för steg 4.2.4 i protokollet. (E) Skärmbild för steg 4.2.4 och steg 4.2.5 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Ljusaktiverad ROS-produktion inom enskilda peroxisomer. Den peroxisomlokaliserade redoxsonden roGFP2-VKSKL användes för att validera den ljusaktiverade ROS-produktionen inom de riktade peroxisomerna. Peroxisomerna inom det vita cirkulära området i en NIH3T3-cell som uttrycker diKillerRed-VKSKL och roGFP2-VKSKL belystes med 561 nm ljus, och dessa visas (A) före 561 nm ljusbelysning och (B) efter 561 nm ljusbelysning. Vänster: roGFP2-VKSKL-emission med 405 nm excitation (magenta); mitten: roGFP2-VKSKL-emission med 488 nm excitation (grön). Förhållandet mellan roGFP2-VKSKL-emissionssignalen exciterad med 405 nm (magenta) över emissionssignalen exciterad med 488 nm (grön) spårar ROS-nivåerna i peroxisomerna. Det vita cirkulära området i (B) visar den omedelbara förlusten av diKillerRed-VKSKL-utsläpp efter 561 nm belysning. Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Globalt skadar alla peroxisomer på en odlingsrätt. SHSY5Y-celler som uttrycker HaloTag-VKSKL, EGFP-Ub och PMP34-TagBFP färgades med HaloTag TMR-ligand i 1 timme. (A) Före LED-belysning var EGFP-Ub-fluorescens homogen i cytoplasman och samlokaliserades inte med peroxisomerna (markerade med HaloTag TMR-liganden och PMP34-TagBFP). (B) Efter 9 timmars LED-belysning ackumuleras EGFP-Ub-signalen på alla peroxisomer i cellerna som odlas i en konfokal skål, såsom anges i de två panelerna i (B). Alla skalstreck: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man utlöser Stub1-medierad pexofagi inom cellkulturer genom att höja peroxisomala ROS-nivåer med ljus. Eftersom protokollet bygger på färgassisterad ROS-generering måste man säkerställa tillräckligt uttryck av diKillerRed-VKSKL eller färgämnesmärkt SLP-ligandfärgning i cellerna av intresse. Med tanke på att olika celltyper eller celler med olika genetisk bakgrund kan hysa peroxisomer med något olika egenskaper, kan man behöva ställa in de exakta belysningsförhållandena för att säkerställa induktion av pexophagy. En robust åtgärd för att screena för aktivering av Stub1-medierad pexofagi är att övervaka om EGFP-Ub translokerar på de belysta peroxisomerna (1 h efter belysning)13. I friska celler är EGFP-Ub-signaler vanligtvis jämnt fördelade i cytoplasman. Dess translokation på upplysta peroxisomer är därför lätt att observera. För att optimera belysningsförhållandena kan ljusintensiteten eller belysningstiden ändras. Det är också bäst att undvika överbelysning av färgämnen när man försöker skada peroxisomerna, eftersom vissa kan genomgå fotokemiska processer som kan störa nedströms avbildning. Till exempel har det visat sig att överbelysningen av KillerRed kan få den att bli svagt grön fluorescerande. Överbelysning genererar svaga gröna signaler på de upplysta peroxisomerna omedelbart efter belysning23 (till skillnad från translokation av EGFP-baserade reportrar, som kan ta tiotals minuter till timmar att inträffa).

Metoden gör det möjligt för forskare att använda vanliga laserskanningskonfokalmikroskop för att försämra en bråkdel av peroxisomer i en cell, vilket möjliggör direkta jämförelser av skillnaden i öde mellan friska och skadade peroxisomer. Jämfört med de befintliga metoderna orsakar protokollet här ROS-stress till endast en liten del av peroxisomerna snarare än alla peroxisomer eller andra organeller i cellerna. Så det är möjligt att studera effekten av de återstående friska peroxisomerna på pexophagy av ROS-stressade peroxisomer i samma cell.

Genom belysning av en hel skål är det också möjligt att rikta in sig på alla peroxisomer i en cellkultur, vilket möjliggör biokemisk analys av Stub1-medierad pexofagi. Hur Hsc70/Stub1 känner igen skadade peroxisomer och vilka peroxisomala substrat Stub1 ubiquitinerar är alla frågor som kan utforskas med hjälp av detta protokoll. Mer allmänt kan peroxisomnedsättningsprotokollet också användas för att söka efter andra peroxisomkvalitetskontrollvägar. Med tanke på att peroxisomer är intimt kopplade till många olika cellulära organeller i cellen, inklusive endoplasmatisk retikulum, mitokondrier och lipiddroppar, skulle det också vara intressant att undersöka hur celler systematiskt modulerar beteendet hos alla cellulära strukturer som svar på peroxisomnedsättning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inte några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av ett MOST 111-2311-B-001-019-MY3 forskningsbidrag från National Science and Technology Council i Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell  MatTek P35G-1.5-20-C 20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) Sigma Aldrich A8056
bovine serum ThermoFisher Scientific 16170060
Cell culture incubator Nuaire NU-4750
diKillerRed-PTS1 Academia Sinica made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher Scientific 11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ThermoFisher Scientific 11330032
EGFP-C1 Clontech pEGFP-C1 The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70 Academia Sinica Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B Addgene 11546
EGFP-p62 Academia Sinica generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1 Academia Sinica generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub Addgene 11928
fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10437028
HaloTag TMR ligand  Promega G8252
HaloTag-PTS1 Academia Sinica PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080
Inverted Confocal Microscope  Olympus FV3000RS 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand Promega GA1120
LED VitaStar PAR64 80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000  ThermoFisher Scientific 11668 transfection reagent
NIH3T3 cell ATCC CRL-1658 adherent
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 319850 reduced serum media
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140
PMP34-TagBFP Academia Sinica PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1 Academia Sinica generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell ATCC CRL-2266 adherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Tags

Biologi utgåva 195 Pexofagi peroxisomer Hsc70 Stub1 autofagi ROS
Övervakning av Stub1-medierad pexofagi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring… More

Chen, B. H., Yang, W. Y. Monitoring Stub1-Mediated Pexophagy. J. Vis. Exp. (195), e65010, doi:10.3791/65010 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter