Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

इन विट्रो और विवो मॉडल का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका-मध्यस्थता संवहनी कैल्सीफिकेशन का विश्लेषण

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/65013
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Florida International University

Summary

यह पेपर खनिज क्षमता का निरीक्षण करने के लिए कैल्सीफाइड बाह्य पुटिकाओं को निकालने के बाद मुराइन महाधमनी को अलग करके संवहनी कैल्सीफिकेशन प्राप्त करने और मूल्यांकन करने के लिए पद्धति प्रस्तुत करता है।

Abstract

कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया में मौत का प्रमुख कारण है, और संवहनी कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है; हालांकि, वर्तमान में संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए कोई उपचार या चिकित्सीय विकल्प नहीं हैं। कैल्सीफिकेशन विशेष बाह्य पुटिकाओं (ईवी) के भीतर शुरू होता है, जो कैल्शियम और फॉस्फेट आयनों को एकत्र करके न्यूक्लियेटेड फॉसी के रूप में काम करते हैं। यह प्रोटोकॉल मुराइन महाधमनी में कैल्सीफिकेशन प्राप्त करने और मूल्यांकन करने और संबंधित निकाले गए ईवी का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, माउस का सकल विच्छेदन किसी भी प्रासंगिक अंगों, जैसे गुर्दे, यकृत और फेफड़ों को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है। फिर, मुराइन महाधमनी को महाधमनी जड़ से ऊरु धमनी तक अलग और उत्पादित किया जाता है। दो से तीन महाधमनी को फिर एक पाचन समाधान में पूल किया जाता है और रुचि के ईवी को अलग करने के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से गुजरने से पहले इनक्यूबेट किया जाता है। इसके बाद, ईवी की खनिज क्षमता को उच्च-फॉस्फेट समाधान में इनक्यूबेशन और 340 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश अवशोषण को मापने के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। अंत में, कोलेजन हाइड्रोगेल का उपयोग विट्रो में ईवी द्वारा उत्पादित कैल्सीफाइड खनिज गठन और परिपक्वता का निरीक्षण करने के लिए किया जाता है।

Introduction

कैल्सीफिकेशन कार्डियोवैस्कुलर बीमारी की मृत्यु दरऔर रुग्णता का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है। कैल्सीफिकेशन कैल्शियम और फॉस्फेट खनिजों के निर्माण के कारण धमनी दीवार यांत्रिकी को बदलदेता है। एथेरोस्क्लेरोसिस में, कैल्सीफिकेशन स्थानीय तनाव को बढ़ा सकता है और इसके परिणामस्वरूप पट्टिका टूट सकती है, जो दिल के दौरे का प्रमुख कारण है। मेडियल कैल्सीफिकेशन - अक्सर क्रोनिक किडनी रोग के परिणामस्वरूप - अधिक व्यापक है और महत्वपूर्ण धमनी कठोरता, शिथिलता और हृदय अधिभार 2,3 की ओर जाता है। वर्तमान में, संवहनी कैल्सीफिकेशन के उपचार या रोकथाम के लिए कोई चिकित्सीय विकल्प नहीं हैं।

संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं (वीएसएमसी) एक ओस्टियोब्लास्ट जैसे फेनोटाइप को अपनाती हैं और कैल्सीफाइंग बाह्य पुटिकाओं (ईवी) को छोड़ती हैं जो नवजात खनिजों को न्यूक्लियेट करती हैं, इस प्रकार कैल्सीफिकेशन 4,5,6 को चलाती हैं। यह प्रक्रिया हड्डी 7 में ओस्टियोब्लास्ट के शारीरिक खनिज करण जैसादिखता है। यद्यपि खनिजीकरण का समापन बिंदु संवहनी दीवार और हड्डी मैट्रिक्स में समान है, तंत्र जिसके द्वारा कैल्सीफाइंग ईवी उत्पन्न होते हैं,दो ऊतकों में भिन्न होते हैं। कई प्रकार के मॉडल हैं जिनका उपयोग संवहनी कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इन विट्रो में, सेल कल्चर मॉडल वीएसएमसी के ओस्टोजेनिक संक्रमण और बाद में विशेष मीडिया के साथ खनिज गठन की नकल करते हैं।

विवो कैल्सीफिकेशन में अध्ययन करते समय, उपयोग किया जाने वाला मॉडल अध्ययन किए जा रहे कैल्सीफिकेशन के प्रकार पर निर्भर करता है। हाइपरलिपिडेमिक माउस मॉडल का उपयोग अक्सर एथेरोस्क्लेरोटिक कैल्सीफिकेशन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जो लिपिड युक्त सजीले टुकड़े9 के भीतर अधिक फोकल दिखाई देता है। इसके विपरीत, औसत दर्जे का कैल्सीफिकेशन पूरे वाहिका में अधिक व्यापक है और अक्सर क्रोनिक किडनी रोग मॉडल का उपयोग करके अध्ययन किया जाता है जो गुर्दे की विफलता को प्रेरित करने के लिए एडेनिन युक्त आहार आहार का उपयोग करते हैं या गुर्दे के महत्वपूर्ण हिस्सों को हटाने के लिए सर्जिकलतकनीकों को नियोजित करते हैं। संवहनी कैल्सीफिकेशन के आक्रामक मॉडल ने हाइपरलिपिडेमिक और क्रोनिक किडनी रोग मॉडल12 दोनों के संयोजन का उपयोग किया है। यह प्रोटोकॉल औसत दर्जे के और एथेरोस्क्लेरोटिक कैल्सीफिकेशन दोनों के लिए मुराइन महाधमनी में संवहनी कैल्सीफिकेशन का आकलन करने, महाधमनी दीवार से ईवी निकालने और इन विट्रो सेल कल्चर मॉडल से प्राप्त ईवी में खनिज क्षमता का अवलोकन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। भविष्य के अध्ययन संवहनी कैल्सीफिकेशन के यंत्रवत विश्लेषण में और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों का आकलन करने के लिए इन प्रक्रियाओं का उपयोग कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

फ्लोरिडा इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा विवो कार्य को अनुमोदित और देखरेख की गई थी और वर्तमान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) दिशानिर्देशों के अनुरूप था। इस प्रोटोकॉल के लिए, माउस के तनाव, वजन, उम्र और लिंग के आधार पर प्रक्रिया भिन्न नहीं होती है। अध्ययन किए जा रहे कैल्सीफिकेशन के प्रकार, आहार और उपचार अध्ययन की लंबाई और उपयोग किए गए माउस के वजन को बदल सकते हैं और अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले माउस के विशिष्ट तनाव और लिंग पर निर्भर हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, नर और मादा दोनों C57BL / 6J चूहों का उपयोग किया गया था, और उन्हें कैल्सीफिकेशन आहार खिलाया गया था। चूहों को 20 सप्ताह से 24 सप्ताह की उम्र के बीच बलिदान किया गया था।

1. महाधमनी का अलगाव और छांटना

  1. फ्लोरोसेंट मार्कर
    1. इच्छामृत्यु से अड़तालीस घंटे पहले, चूहों को एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग एजेंट, 20 μM OsteoSense 680 के साथ इंजेक्ट करें, एक अंतःशिरा इंजेक्शन के माध्यम से 100 μL प्रति 25 ग्राम की अनुशंसित खुराक पर।
    2. फ्यूम हुड के नीचे, चार टी-पिन के साथ एक स्टायरोफोम बोर्ड रखें, एक पेपर टॉवल के साथ पंक्तिबद्ध एक बाल्टी, एक पेपर तौलिया के साथ भरी हुई 50 एमएल ट्यूब, एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब, विच्छेदन उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें), और एक स्प्रे बोतल में इथेनॉल रखें। बर्फ पर पीबीएस के साथ बीकर रखें।
  2. खून निकालना
    1. पेपर तौलिया से भरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2 एमएल आइसोफ्लुरेन जोड़ें। ट्यूब को बाल्टी में रखें, और इसे अपने ढक्कन के साथ बंद करें।
      सावधानी: आइसोफ्लुरेन को एक अच्छी तरह से हवादार स्थान में संभाला जाना चाहिए जिसमें अल्पकालिक जोखिम की विषाक्तता के कारण निकास हवा का कोई पुनर्चक्रण नहीं होना चाहिए।
    2. एक समय में बाल्टी में एक माउस स्थानांतरित करें। एक बार बेहोश होने के बाद, माउस को पृष्ठीय स्थिति में पेपर तौलिया पर रखें। गैर-प्रमुख हाथ की हथेली से माउस को पकड़ते हुए, अंगूठे और पॉइंटर उंगली का उपयोग करके कानों को वापस रखें।
    3. चिमटी का उपयोग करके, आंखों में से एक का उत्पादन करें। रक्त संग्रह शुरू करने के लिए माउस को 1.5 एमएल ट्यूब के ऊपर रखें, जिसके दौरान 1 एमएल रक्त एकत्र किया जाना चाहिए। एक बार जब रक्त निकलना बंद हो जाता है, तो माउस को आगे की बेहोशी के लिए बाल्टी में वापस रखें।
  3. इच्छामृत्यु
    1. विच्छेदन मैट पर एक पेपर तौलिया रखें। एक बार जब माउस बेहोश हो जाता है, तो माउस को चटाई पर लापरवाह स्थिति में रखें। प्रत्येक अंग को पकड़ने के लिए टी-पिन का उपयोग करके माउस को लापरवाह स्थिति में सुरक्षित करें।
    2. शराब के साथ माउस के पेट को स्प्रे करें। चिमटी का उपयोग करके, छाती क्षेत्र में त्वचा को उठाएं। कैंची के साथ, वक्ष गुहा में मध्यवर्ती रेखा को काट लें। एक बार उरोस्थि को केंद्र में काट दिया जाता है, तो रिबकेज के दोनों ओर डायाफ्राम काट लें।
    3. यदि आवश्यक हो, तो हृदय और फेफड़ों को उजागर करने के लिए रिबकेज के ललाट भाग को काट दें।
  4. अंग हटाना
    1. चिमटी का उपयोग करके, त्वचा को उठाएं और मध्य रेखा के नीचे चीरा लगाएं। किसी भी अतिरिक्त त्वचा या वसा को हटा दें। प्रजनन अंगों और मूत्राशय को हटा दें, साथ ही मध्य रेखा के बाहर किसी भी वसा को हटा दें।
    2. गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) अंगों को दाईं ओर ले जाएं, और मध्य रेखा में आंतों का पालन करें। एक बार पाए जाने के बाद, मध्य रेखा को उठाएं, और जीआई पथ को पेट तक एक्साइज करें।
    3. किडनी को मध्य रेखा से दूर उठाकर आबकारी। जितना संभव हो सके किडनी के करीब काट लें।
    4. इसके बाद, लोब को उठाकर और मध्य रेखा से काटकर यकृत को हटाना शुरू करें।
    5. दिल और महाधमनी को शांत करें। 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, ठंडे पीबीएस को दाहिने वेंट्रिकल में इंजेक्ट करें। फेफड़ों के फुलने और सफेद होने की प्रतीक्षा करें। फेफड़ों को हटा दें, साथ ही किसी भी अतिरिक्त डायाफ्राम या रिबकेज को हटा दें।
  5. हड्डी हटाने
    1. कैंची की एक जोड़ी चौड़ी खोलें, और उन्हें पूंछ के ऊपर माउस के निचले क्षेत्र में रखें। नीचे की ओर काटें, और रीढ़ की हड्डी को त्वचा से उठाना शुरू करें। मध्य रेखा के किनारों से वसा को हटा दें। एक बार जब त्वचा अलग हो जाती है, तो हृदय के ठीक ऊपर काटकर रीढ़ और बरकरार अंगों को उत्तेजित करें। यदि स्टीरियोस्कोप में परिवहन किया जाता है, तो बर्फ की बाल्टी में पीबीएस के बीकर में रीढ़ और बरकरार अंगों को रखें।
    2. रीढ़ और अंगों को विच्छेदन डिश में ले जाएं। बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरें। सुइयों का उपयोग करके रीढ़ और रिबकेज को पिन करें।
    3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, दिल को सावधानी से उठाने के लिए चिमटी का उपयोग करें, और रीढ़ की हड्डी के ऊपर और महाधमनी के नीचे काटना शुरू करें। इसे तब तक जारी रखें जब तक रीढ़ की हड्डी के निचले हिस्से तक नहीं पहुंच जाता। विच्छेदन डिश से रीढ़ की हड्डी को हटा दें, और दिल और किसी भी बाहरी वसा या मांसपेशियों को पिन करें।
  6. माइक्रोडिसेक्शन
    1. दिल के ठीक नीचे के क्षेत्र से शुरू करके, तीन ट्यूबलर संरचनाओं की पहचान करें: अन्नप्रणाली, वेना कावा और महाधमनी। महाधमनी के स्पष्ट दृश्य क्षेत्र के लिए अन्नप्रणाली और वेना कावा को हटा दें।
    2. माइक्रोडिसेक्शन फोर्स और कैंची का उपयोग करके, वसा ऊतक को उठाना शुरू करें और जितना संभव हो उतना महाधमनी के करीब काटें। सुनिश्चित करें कि महाधमनी को न काटें। इसे तब तक जारी रखें जब तक कि सभी महाधमनी के साथ-साथ ऊरु धमनियां उजागर न हो जाएं।
    3. दिल में, महाधमनी चाप पर तीन शाखाओं को उजागर करते हुए, सभी वसा ऊतक को हटा दें। बाएं वेंट्रिकल में माइक्रोडिसेक्शन कैंची डालकर और महाधमनी के आसपास की मांसपेशियों को काटकर बाएं वेंट्रिकल से महाधमनी जड़ को हटा दें।
    4. एक बार महाधमनी को अलग और साफ करने के बाद, संवहनी कैल्सीफिकेशन की कल्पना करने के लिए निकट-अवरक्त स्कैनर का उपयोग करके महाधमनी की छवि बनाएं।
    5. कैल्शियम ट्रेसर के कुल संकेत को निर्धारित करने के लिए कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 1) का उपयोग करें, जो कुल स्कैन किए गए महाधमनी क्षेत्र में सामान्यीकृत है। MATLAB स्क्रिप्ट जैव सूचना विज्ञान टूलबॉक्स ऐड-इन का उपयोग करफ़ंक्शन करता है। MATLAB को पहले महाधमनी के निकट-अवरक्त स्कैन से TIFF फ़ाइलों के स्थान पर निर्देशित किया जाता है, फिर अलग-अलग फ़ाइलों को खोला जाता है, और पिक्सेल तीव्रता मान TIFF फ़ाइलों से निकाले जाते हैं।
      1. एक बार जब छवि को रंग मानचित्र के साथ उपयोगकर्ता को प्रस्तुत किया जाता है, तो अधिकतम पैमाने के रूप में सबसे बड़े कैल्सीफिकेशन के साथ महाधमनी का चयन करें।
      2. जब MATLAB पूछता है कि कमांड विंडो में "छवि में कितने नमूने हैं?" तो वर्तमान छवि में महाधमनी की संख्या इनपुट करें, और प्रत्येक महाधमनी को एक-एक करके चुनें। एक बार महाधमनी का चयन हो जाने के बाद, MATLAB महाधमनी के कुल क्षेत्रफल के मुखौटे के साथ एक द्विआधारी छवि बनाएगा और महाधमनी के कैल्सीफाइड क्षेत्र के मुखौटे के साथ एक और द्विआधारी छवि बनाएगा। इन नकाबपोश छवियों के मूल्यों का उपयोग तब कुल कैल्सीफाइड क्षेत्र, महाधमनी के कुल क्षेत्र, कैल्सीफिकेशन के लिए सकारात्मक प्रतिशत क्षेत्र और कैल्सीफाइड क्षेत्र की औसत तीव्रता निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
      3. महाधमनी का चयन करने के लिए, एक बाएं क्लिक के साथ चार कोनों का चयन करके और छवि के चारों ओर एक बॉक्स बनाकर स्क्रीन पर सबसे हालिया आंकड़े पर रुचि की महाधमनी के चारों ओर एक बॉक्स बनाएं। बॉक्स को बंद करने के लिए, पहले कोने पर डबल-क्लिक करें।
        नोट: उपयोग किए गए कैल्सीफिकेशन के मॉडल के आधार पर सीमा अलग हो सकती है। यह निर्धारित करना उपयोगकर्ता पर निर्भर करता है कि संवहनी कैल्सीफिकेशन के लिए सकारात्मक संकेत क्या मूल्य निर्धारित करता है। एक बार प्रयोग के लिए सीमा निर्धारित हो जाने के बाद, इसे प्रयोग की पूरी अवधि में समान रहना चाहिए।
    6. एक बार मात्रात्मक डेटा निकाले जाने के बाद, समूहों के बीच महत्व दिखाने के लिए टुकी के पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ एक तरफा एनोवा करें।

2. महाधमनी से ईवी को अलग करना और निकालना

नोट: एक बार महाधमनी को अलग और हटा दिया गया है, तो ईवी को ऊतक से निकाला जा सकता है। पाचन समाधान और कई सेंट्रीफ्यूज चक्रों का उपयोग करके, ईवी को कई अलग-अलग तकनीकों के लिए एकत्र और उपयोग किया जा सकता है, जिसमें कैल्सीफिकेशन परख, जेल वैद्युतकणसंचलन और इम्यूनोब्लोटिंग13 शामिल हैं। ईवी को अलग करने और निकालने के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:

  1. महाधमनी को स्कैन करने के तुरंत बाद, पर्याप्त प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए दो से तीन महाधमनी पूल करें।
  2. 0.25 एम सुक्रोज, 0.12 एम सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल), 0.01 एम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 0.02 एम ट्राइस हाइड्रोक्लोराइड और 600 यू / एमएल कोलेजनेज13 युक्त एक पाचन समाधान तैयार करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1.5 एमएल पाचन समाधान में दो से तीन पूल किए गए महाधमनी को इनक्यूबेट करें। समाधान एकत्र करें। सेल मलबे को हटाने के लिए 15 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. माइक्रोवेसिकल्स को हटाने के लिए 33,000 × ग्राम पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें। कैल्सीफिकेशन क्षमता के लिए सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें और उसका आकलन करें (अनुभाग 3 देखें)।
    नोट: यदि ईवी के जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रोटीन इम्यूनोब्लोटिंग का प्रदर्शन किया जाना है तो बाद के चरणों का पालन करें।
  5. 100,000 × ग्राम पर सुपरनैटेंट को 1 घंटे के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें ताकि रुचि के ईवी को अलग किया जा सके।
  6. जबकि सुपरनैटेंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन से गुजर रहा है, प्रोटीज अवरोधक और भंग होने तक भंवर को जोड़कर आरआईपीए लाइसिस और निष्कर्षण बफर ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
  7. एक बार अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन पूरा हो जाने के बाद, गोली को छोड़कर, जिसमें ईवी होते हैं, सुपरनैटेंट को एस्पिरेटेड करें। तैयार आरआईपीए लाइसिस और प्रोटीज अवरोधक मिश्रण में गोली को निलंबित करें। नमूने जेल वैद्युतकणसंचलन और पश्चिमी सोख्ता के लिए तैयार हैं।

3. प्रकाश प्रकीर्णन अवशोषण के साथ बाह्य पुटिकाओं की कैल्सीफिकेशन क्षमता का आकलन करना

नोट: ईवी के वास्तविक समय खनिज गठन को मापने के लिए, हमने मूल रूप से सेल कल्चर14 से ग्रोथ प्लेट कार्टिलेज ईवी से खनिज गठन का अध्ययन करने के लिए विकसित एक परख का उपयोग किया। चूंकि कैल्शियम फॉस्फेट जमाव कैल्सीफिकेशन की पहचान है, कैल्शियम फॉस्फेट यौगिक गठन के परिणामस्वरूप प्रकाश प्रकीर्णन अवशोषण में वृद्धि कैल्सीफिकेशन क्षमताका संकेत है। इन विट्रो वीएसएमसी मॉडल ईवी की कैल्सीफिकेशन क्षमता को मापने के लिए सुविधाजनक हैं। इस तकनीक में, एक छोटे तरंग दैर्ध्य फिल्टर के साथ एक प्लेट रीडर ईवी के इन विट्रो कैल्सीफिकेशन को माप सकता है। अवशोषण रीडिंग 340 एनएम पर दर्ज की गई है, और एक उच्च अवशोषण अधिक कैल्शियम फॉस्फेट खनिज गठन का संकेत है। प्रकाश प्रकीर्णन अवशोषण परख के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:

  1. सेलमलबे को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए वीएसएमसी के वातानुकूलित एकत्रित माध्यम को 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. 30 मिनट के लिए 33,000 × ग्राम पर सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को इकट्ठा करें, और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: एकत्र किए गए सतह पर तैरने वाले में ईवी की उपस्थिति की पुष्टि गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) या नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) के माध्यम से की जा सकती है
  3. एक 300 एमएम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक (एनएएच2पीओ4) बाँझ समाधान तैयार करें। यदि आवश्यक हो तो बाँझ स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए समाधान को फ़िल्टर करें।
  4. ईवी नमूने में 300 mM NaH2PO4 का 1% (v/v) जोड़ें, और धीरे से घोल को अच्छी तरह से मिलाने के लिए पिपेट करें। मिश्रण के घोल के 200 μL को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। माइक्रोप्लेट रीडर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. हर 1 मिनट में 340 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण रिकॉर्ड करने के लिए प्लेट रीडर सेट करें।

4. कोलेजन हाइड्रोगेल के साथ बाह्य पुटिकाओं के कैल्सीफिकेशन खनिज गठन का आकलन करना

नोट: ईवी का एकत्रीकरण और माइक्रोकैल्सीफिकेशन का गठन कोलेजन हाइड्रोगेल के माध्यम से देखा जाता है। ये हाइड्रोगेल एक मचान के रूप में कार्य करते हैं जो विवो15 में देखे गए कोलेजन घनत्व की नकल करता है। यह कैल्सीफिकेशन विकास पर कोलेजन के प्रभाव को दर्शाता है। हाइड्रोगेल में ईवी के खनिज गठन का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल निम्नानुसार है:

  1. दिन 1
    1. डीएमईएम में 2.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान तैयार करें। डीएमईएम मिश्रण में धीरे-धीरे 5 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड जोड़ें जब तक कि रंग लाल न हो जाए। जांचें कि समाधान का पीएच लगभग 7 है।
      नोट: यदि समाधान बैंगनी हो जाता है और बहुत बुनियादी हो जाता है, तो प्रक्रिया को पुनरारंभ करें।
    2. 8-वेल चैंबर ग्लास के प्रत्येक कुएं में 7 के पीएच के साथ 2.5 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन समाधान का पिपेट 300 μL। 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 नियंत्रित आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
  2. चौथा दिन
    1. कुओं में नियंत्रण के रूप में डीएमईएम के 300 μL जोड़ें।
    2. शेष कुओं में पहले एकत्र किए गए ईवी माध्यम के नमूनों में से 300 μL जोड़ें।
    3. 6 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 नियंत्रित आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
  3. दिन 10
    1. 22.5 μL DMEM के साथ Osteosense 680EX का 2.5 μL तैयार करें।
    2. प्रत्येक कुएं में ओस्टियोसेंस और डीएमईएम मिश्रण का पिपेट 2.5 μL। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 नियंत्रित आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
  4. दिन 11
    1. ओस्टियोसेंस फ्लोरेसेंस फ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ हाइड्रोगेल की छवि। उन्हें एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके या लंबी कार्य दूरी के उद्देश्य के साथ शीर्ष से कवरग्लास कक्ष के निचले भाग के माध्यम से चित्रित करें।
    2. इमेजजे में उपलब्ध कण विश्लेषण विकल्पों का उपयोग करके एकत्रित छवियों में कैल्सीफिकेशन की संख्या और कैल्सीफिकेशन आकार का आकलन करें।
      1. छवि का उपयोग करें | समायोजित करें | छवियों को बिनाराइज करने के लिए थ्रेशोल्ड कमांड जैसे कि केवल ओस्टियोसेंस सिग्नल सफेद दिखाई देता है। विश्लेषण का उपयोग करें | छवि में प्रत्येक कैल्सीफिकेशन के लिए जानकारी प्राप्त करने के लिए कणों का विश्लेषण करें। स्थिरता के लिए विश्लेषण की गई प्रत्येक छवि के लिए एक ही दहलीज मापदंडों का उपयोग करना सुनिश्चित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक बार महाधमनी निकाले जाने के बाद, निकट-अवरक्त ऑप्टिकल स्कैनर का उपयोग करके इमेजिंग महाधमनी के साथ-साथ संवहनी कैल्सीफिकेशन का दृश्य प्रतिनिधित्व दिखाती है (चित्रा 1)। स्कैन किए गए फ्लोरोसेंट छवि के भीतर पिक्सेल तीव्रता मान कैल्सीफिकेशन के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और यहां रंगीन हीटमैप का उपयोग करके दिखाए गए हैं। परिमाणीकरण विधियों में एक सकारात्मक सीमा की पहचान करना और इस दहलीज मूल्य से अधिक मूल्यों के साथ महाधमनी के प्रतिशत क्षेत्र की रिपोर्ट करना और / या महाधमनी के भीतर पिक्सेल की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की रिपोर्ट करना शामिल है। जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्राथमिक मानव कोरोनरी धमनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का उपयोग तकनीकों को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। वीएसएमसी से वातानुकूलित मीडिया का उपयोग ईवी की कैल्सीफिकेशन क्षमता को मापने के लिए किया जा सकता है। समय के साथ खनिज गठन को माइक्रोप्लेट रीडर (चित्रा 2 ए, बी) का उपयोग करके 480 एनएम पर प्रकाश अवशोषण द्वारा मापा जाता है। खनिजीकरण के तेजी से चरण के दौरान एक रैखिक प्रतिगमन से पता चला कि नियंत्रण नमूने की तुलना में प्रो-कैल्सीफिक नमूने में अवशोषण वृद्धि 1.5 गुना तेजी से हुई। कोलेजन हाइड्रोगेल के भीतर, कैल्शियम जमा को इमेजिंग ओस्टियोसेंस फ्लोरेसेंस (चित्रा 3 ए, बी) द्वारा देखा जा सकता है। व्यक्तिगत कैल्सीफिकेशन हाइड्रोगेल के भीतर ओस्टियोसेंस-पॉजिटिव क्षेत्रों के रूप में दिखाई देते हैं।

Figure 1
चित्र 1: विच्छेदन के बाद चित्रित महाधमनी। स्कैनिंग के बाद, कैल्सीफिकेशन को सी 57बीएल / 6 जे चूहों के महाधमनी के भीतर देखा जा सकता है। नियंत्रित चूहों (दाएं) से दो महाधमनी की तुलना में क्रोनिक किडनी रोग (दूर बाएं) के साथ माउस की महाधमनी में एक उच्च ओस्टियोसेंस सिग्नल देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ईवी कैल्सीफिकेशन क्षमता को मापने के लिए खनिज अवशोषण। (ए, बी) 340 एनएम पर प्रकाश प्रकीर्णन सामान्य नियंत्रण माध्यम (हल्के ग्रे लाइन) की तुलना में प्रो-कैल्सीफिक माध्यम (डार्क लाइन) में संवर्धित वीएसएमसी से प्राप्त वातानुकूलित माध्यम में उच्च अवशोषण दिखाता है। (सी) परख के पहले 20 मिनट का एक रैखिक प्रतिगमन प्रो-कैल्सीफिक नमूने में तेजी से खनिज गठन दिखाता है। संक्षेप: ईवी = बाह्य पुटिका; वीएसएमसी = संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कोलेजन हाइड्रोगेल में वातानुकूलित मीडिया से खनिज गठन। (ए) नियंत्रण कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया और (बी) कोशिकाओं को प्रो-कैल्सीफिक माध्यम में 21 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था, कोलेजन हाइड्रोगेल में रखा गया था। सुदूर-लाल ओस्टियोसेंस फ्लोरेसेंस फ्लोरेसेंस की इमेजिंग (ए) नियंत्रण नमूने में एक न्यूनतम संकेत दिखाती है और (बी) खनिजों की उपस्थिति जो प्रो-कैल्सीफिक स्थितियों में संवर्धित कोशिकाओं के वातानुकूलित माध्यम से बनती है। स्केल = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: कैल्शियम ट्रेसर के कुल संकेत को निर्धारित करने के लिए एक कस्टम MATLAB स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रोटोकॉल करते समय, सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। मुराइन महाधमनी के अलगाव के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि छिड़काव ठीक से किया जाए। पीबीएस इंजेक्ट करते समय, ध्यान रखा जाना चाहिए कि दाएं वेंट्रिकल को पंचर न किया जाए। इससे तरल सीधे वेंट्रिकल से बाहर लीक हो जाएगा और फेफड़ों के माध्यम से प्रसारित करने में विफल हो जाएगा, जिससे महाधमनी के भीतर रक्त बच जाएगा। एक बार छिड़काव ठीक से आयोजित किया गया है और सूक्ष्म विच्छेदन शुरू हो गया है, तो पूरा होने और स्कैनिंग से पहले सभी वसा और फैटी ऊतक को महाधमनी से हटा दिया जाना चाहिए। शेष वसा कुल ऊतक आकार में डेटा को सामान्य करते समय महाधमनी को बड़ा दिखाई देगा।

विच्छेदन के दौरान माउस महाधमनी के सीमित आकार के कारण, महाधमनी को आधे में छेदना या काटना आम है। यदि ऐसा होता है, तो विच्छेदन को सामान्य रूप से जारी रखने की सिफारिश की जाती है। महाधमनी के टुकड़ों को इमेजिंग के लिए एक साथ रखा जा सकता है। महाधमनी को ईवी अलगाव के लिए टुकड़ों में पाचन समाधान में भी रखा जा सकता है। ईवी के अलगाव की शुरुआत करते समय, पर्याप्त प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए कई महाधमनी की आवश्यकता होती है। इस सीमा का मतलब है कि विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न करने के लिए उचित मात्रा में ऊतक एकत्र करने के लिए अधिक चूहों को विच्छेदित किया जाना चाहिए।

प्रदर्शित विधि में, हम दिखाते हैं कि संस्कृति में वीएसएमसी से वातानुकूलित मीडिया में ईवी से सीधे खनिज क्षमता को कैसे मापा जाए। प्रकाश प्रकीर्णन प्रोटोकॉल एक सरल विधि है जिसका उपयोग वास्तविक समय में ईवी के खनिज गठन को मापने के लिए कियाजाता है। यह उस अवधि में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जिसमें ईवी के भीतर कैल्सीफिकेशन होता है। कोलेजन हाइड्रोगेल खनिज15 के त्रि-आयामी विश्लेषण के लिए ईवी के एकत्रीकरण और कैल्सीफिकेशन को निर्देशित करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। इस प्रकार, हमने केवल इन विट्रो अध्ययनों से ईवी के साथ इन विश्लेषणों का प्रदर्शन किया है; हालांकि, भविष्य के अध्ययनों में, हम माउस महाधमनी से अलग ईवी की खनिज क्षमता का विश्लेषण करने के लिए इन तरीकों को अनुकूलित करने की कोशिश करेंगे।

कार्डियोवैस्कुलर बीमारी दुनिया में मृत्यु का प्रमुख कारण है, जिसमें कैल्सीफिकेशन रुग्णता और मृत्यु दर का सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ता है। उन तंत्रों की पहचान करके जिनके माध्यम से ईवी कैल्सीफिकेशन का कारण बनता है, भविष्य के अध्ययन उन मार्गों को बाधित करके चिकित्सीय रणनीति के रूप में खनिज विकास को नियंत्रित करने पर ध्यान केंद्रित करते हुए आयोजित किए जा सकते हैं जो कैल्सीफाइड ईवी की रिहाई का कारण बनते हैं, साथ ही खनिज करण प्रक्रिया के साथ सीधे बातचीत करके।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) (1आर01एचएल160740 और 5 टी 32 जीएम 132054-04) और फ्लोरिडा हार्ट रिसर्च फाउंडेशन के नेशनल हार्ट, लंग और ब्लड इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम हाइड्रोगेल को संश्लेषित और इमेजिंग करने में मदद के लिए कासंद्रा गोमेज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chambered coverglass Thermo Scientific 155409PK
10 mL Syringe BD 302995
20 G 1 inch Needle BD 305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail Corning 354249
Collagenase Worthington Biochemical LS004174
Curved Forceps Roboz Surgical Instrument RS-8254
Dissection Dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Dissection Pan and Wax United Scientific Supplies DSPA01-W
DMEM Cytiva SH30022.FS
Isoflurane Sigma-Aldrich 26675-46-7
LI-COR Odyssey LI-COR DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)  Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) Roboz Surgical Instrument RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) Roboz Surgical Instrument RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) Roboz Surgical Instrument RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge Beckman Coulter B11229
OsteoSense 680EX Perkin Elmer NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor Thermo Scientific A32963
Potassium Chloride Fischer Chemical P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer G Biosciences 786-489
Sodium Chloride Fischer Chemical BP358
Sodium Hydroxide Thermo Scientific A4782602
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sucrose Sigma S7903
Synergy HTX Multimode Reader Agilent
Tissue culture plate, 96-well Thermo Fisher 167008
T-Pins United Scientific Supplies TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride Fischer Chemical BP153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
  2. Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
  3. Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
  4. Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
  5. Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
  6. Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
  7. New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
  8. Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
  9. Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
  10. Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
  11. El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
  12. Veseli, B. E., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
  13. Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
  14. Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
  15. Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).

Tags

जीव विज्ञान अंक 191
<em>इन विट्रो</em> और विवो मॉडल का उपयोग करके एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिका-मध्यस्थता संवहनी <em>कैल्सीफिकेशन</em> का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ashbrook, S. K., Valentin Cabrera,… More

Ashbrook, S. K., Valentin Cabrera, A. M., Shaver, M., Hutcheson, J. D. Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models. J. Vis. Exp. (191), e65013, doi:10.3791/65013 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter