Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים In Vitro ו-In Vivo

Published: January 27, 2023 doi: 10.3791/65013
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Florida International University

Summary

מאמר זה מציג את המתודולוגיה להשגת והערכת הסתיידות כלי הדם על ידי בידוד אבי העורקים של מורין ואחריו חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מסוידות כדי לבחון את פוטנציאל המינרליזציה.

Abstract

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, והסתיידות כלי הדם היא המנבא המשמעותי ביותר לאירועים קרדיווסקולריים; עם זאת, אין כיום אפשרויות טיפול או טיפול להסתיידות כלי דם. ההסתיידות מתחילה בשלפוחיות חוץ-תאיות מיוחדות (EVs), המשמשות כמוקדי נוקלציה על ידי צבירת יוני סידן ופוספט. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשגה והערכה של הסתיידות באבי העורקים וניתוח כלי הרכב החשמליים שחולצו הקשורים. ראשית, דיסקציה גסה של העכבר מבוצעת כדי לאסוף איברים רלוונטיים, כגון הכליות, הכבד והריאות. לאחר מכן, אבי העורקים מבודד ונכרת מהשורש אבי העורקים לעורק הירך. לאחר מכן שניים עד שלושה אבי עורקים נאגרים ומודגרים בתמיסת עיכול לפני שהם עוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים. לאחר מכן, פוטנציאל המינרליזציה של כלי הרכב החשמליים נקבע באמצעות דגירה בתמיסת פוספט גבוהה ומדידת בליעת האור באורך גל של 340 ננומטר. לבסוף, הידרוג'לים של קולגן משמשים לצפייה בהיווצרות ובהבשלה של מינרלים מסוידים המיוצרים על ידי כלי רכב חשמליים במבחנה.

Introduction

הסתיידות היא המנבא המשמעותי ביותר לתמותה ותחלואה ממחלות לב וכלי דם1. הסתיידות משנה את מכניקת דופן העורקים עקב הצטברות מינרלים של סידן ופוספט2. בטרשת עורקים, הסתיידות עלולה להחמיר את הלחץ המקומי ולגרום לקרע פלאק, שהוא הגורם המוביל להתקפי לב. הסתיידות מדיאלית - הנובעת לעתים קרובות ממחלת כליות כרונית - נפוצה יותר ומובילה להתקשות עורקים משמעותית, תפקוד לקוי ועומס יתר לבבי 2,3. נכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפוליות לטיפול או מניעה של הסתיידות כלי הדם.

תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs) מאמצים פנוטיפ דמוי אוסטאובלסט ומשחררים שלפוחיות חוץ-תאיות מסתיידות (EVs) המעוררות מינרלים מתהווים, ובכך מניעות הסתיידות 4,5,6. תהליך זה דומה למינרליזציה פיזיולוגית של אוסטאובלסטים בעצם7. למרות שנקודת הסיום של מינרליזציה דומה בדופן כלי הדם ובמטריצת העצם, המנגנונים שבאמצעותם נוצרים כלי הרכב החשמליים המסוידים שונים בשתי הרקמות8. ישנם סוגים רבים של מודלים המשמשים לחקר הסתיידות כלי הדם. במבחנה, מודלים של תרביות תאים מחקים את המעבר האוסטאוגני של VSMCs והיווצרות מינרלים לאחר מכן עם מדיה מיוחדת.

כאשר לומדים הסתיידות in vivo, המודל המשמש תלוי בסוג ההסתיידות הנחקרת. מודלים של עכברים היפרליפידמיים משמשים לעתים קרובות לחקר הסתיידות טרשת עורקים, אשר נראית ממוקדת יותר בתוך רבדים עשירים בשומנים9. לעומת זאת, הסתיידות מדיאלית נפוצה יותר בכל כלי הדם ונחקרת לעתים קרובות באמצעות מודלים של מחלת כליות כרונית המשתמשים במשטר תזונה עשיר באדנין כדי לגרום לאי ספיקת כליות או טכניקות כירורגיות להסרת חלקים משמעותיים של הכליות10,11. מודלים אגרסיביים של הסתיידות כלי דם השתמשו בשילוב של מודלים של מחלת כליות היפרליפידמית וכרונית12. פרוטוקול זה מספק שיטה להערכת הסתיידות כלי הדם באבי העורקים המוריני עבור הסתיידות מדיאלית וטרשת עורקים, חילוץ EVs מדופן אבי העורקים, וצפייה בפוטנציאל המינרליזציה ברכבים חשמליים המתקבלים ממודלים של תרביות תאים במבחנה. מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בפרוצדורות אלה בניתוחים מכניסטיים של הסתיידות כלי דם ולהעריך התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

העבודה in vivo אושרה ופוקחה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטה הבינלאומית של פלורידה ותאמה את ההנחיות הנוכחיות של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). עבור פרוטוקול זה, ההליך אינו שונה בהתאם למתח, משקל, גיל ומין של העכבר. סוג ההסתיידות הנחקר, הדיאטות והטיפולים עשויים לשנות את אורך המחקר ואת משקל העכבר המשמש ועשויים להיות תלויים בזן ומין מסוים של עכבר המשמש במחקר. עבור פרוטוקול זה, עכברים זכרים ונקבות כאחד C57BL/6J שימשו, והם הוזנו בדיאטת הסתיידות. העכברים הוקרבו בין גיל 20 שבועות ל-24 שבועות.

1. בידוד וכריתה של אבי העורקים

  1. סמנים פלואורסצנטיים
    1. ארבעים ושמונה שעות לפני המתת חסד, הזריקו לעכברים 20 מיקרומטר OsteoSense 680, חומר הדמיה פלואורסצנטי, במינון המומלץ של 100 μL לכל 25 גרם באמצעות זריקה תוך ורידית.
    2. מתחת למכסה המנוע מניחים לוח קלקר עם ארבעה פינים, דלי מרופד במגבת נייר, צינור 50 מ"ל ממולא במגבת נייר, צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, כלי דיסקציה (ראו טבלת חומרים) ואתנול בבקבוק תרסיס. מניחים כוסות עם PBS על קרח.
  2. לקיחת דם
    1. הוסף 2 מ"ל של isoflurane לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ממולא במגבת נייר. מניחים את הצינור בדלי, וסוגרים אותו עם המכסה שלו.
      זהירות: יש לטפל באיזופלורן בחלל מאוורר היטב ללא מחזור מחדש של אוויר פליטה בשל הרעילות של חשיפה לטווח קצר.
    2. העבר עכבר אחד לתוך הדלי בכל פעם. לאחר ההרגעה, הניחו את העכבר על מגבת הנייר במצב גבי. החזקת העכבר בכף היד הלא דומיננטית, הניחו את האוזניים לאחור באמצעות האגודל והאצבע המצביעה.
    3. באמצעות פינצטה, הבלו אחת העיניים. החזק את העכבר מעל צינור 1.5 מ"ל כדי להתחיל באיסוף הדם, שבמהלכו יש לאסוף 1 מ"ל דם. ברגע שהדם מפסיק להתנקז, החזירו את העכבר לדלי להרגעה נוספת.
  3. המתת חסד
    1. הניחו מגבת נייר על משטח הנתיחה. לאחר הרגעת העכבר, הניחו את העכבר על המזרן במצב שכיבה. אבטח את העכבר במצב שכיבה באמצעות סיכת T כדי להחזיק כל איבר.
    2. לרסס את הבטן של העכבר עם אלכוהול. באמצעות הפינצטה, להרים את העור באזור החזה. בעזרת המספריים, חותכים את הקו המדיאלי לתוך חלל בית החזה. לאחר חיתוך עצם החזה במרכז, חותכים את הסרעפת משני צדי כלוב הצלעות.
    3. במידת הצורך, לחתוך את החלק הקדמי של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב והריאות.
  4. הסרת איברים
    1. בעזרת פינצטה מרימים את העור ומבצעים חתך לאורך קו האמצע. יש להסיר עודפי עור או שומן. הסר את איברי הרבייה ואת שלפוחית השתן, כמו גם כל שומן מחוץ לקו האמצע.
    2. הזיזו את איברי מערכת העיכול (GI) לצד ימין, ועקבו אחר המעיים בקו האמצע. לאחר שנמצאו, הרימו את קו האמצע, והוציאו את מערכת העיכול עד לקיבה.
    3. הבלו את הכליות על ידי הרמת אותם מקו האמצע. לחתוך קרוב ככל האפשר לכליה.
    4. לאחר מכן, להתחיל את הסרת הכבד על ידי הרמת האונות לחתוך מקו האמצע.
    5. לחורר את הלב ואת אבי העורקים. באמצעות מזרק 10 מ"ל, להזריק PBS קר לתוך החדר הימני. חכו שהריאות יתנפחו ויהפכו ללבנות. הסר את הריאות, כמו גם כל עודף דיאפרגמה או כלוב צלעות.
  5. הסרת עצם
    1. פתח זוג מספריים לרוחב, והנח אותם באזור התחתון של העכבר מעל הזנב. חתכו כלפי מטה, והתחילו להרים את עמוד השדרה מהעור. מוציאים את השומן מצידי קו האמצע. ברגע שהעור מנותק, הבלו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים על ידי חיתוך ממש מעל הלב. אם אתם מעבירים לסטריאוסקופ, הניחו את עמוד השדרה ואת האיברים השלמים בתוך של PBS בדלי הקרח.
    2. העבירו את עמוד השדרה והאיברים לתוך צלחת הניתוח. מלאו PBS קר כקרח. הצמידו את עמוד השדרה וכלוב הצלעות באמצעות מחטים.
    3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה כדי להרים את הלב בזהירות, והתחילו לחתוך מעל עמוד השדרה ומתחת לאבי העורקים. המשיכו בכך עד שמגיעים לתחתית עמוד השדרה. הסר את עמוד השדרה מצלחת הניתוח, ונעץ את הלב וכל שומן או שריר חיצוני.
  6. מיקרודיסקציה
    1. החל מהאזור ממש מתחת ללב, זהה את שלושת המבנים הצינוריים: הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים. הסר את הוושט ואת נבוב הווריד כדי לקבל שדה ראייה ברור של אבי העורקים.
    2. בעזרת מלקחיים מיקרודיסקציה ומספריים, מתחילים להרים את רקמת השומן ולחתוך קרוב ככל האפשר לאבי העורקים. הקפד לא לחתוך את אבי העורקים. המשיכו בקו המדיאלי עד לחשיפת כל אבי העורקים וכן עורקי הירך.
    3. בלב, להסיר את כל רקמת השומן, לחשוף את שלושת הענפים בקשת אבי העורקים. הסר את שורש אבי העורקים מהחדר השמאלי על ידי החדרת מספריים microdissection לתוך החדר השמאלי וחיתוך השריר סביב אבי העורקים.
    4. לאחר בידוד וניקוי אבי העורקים, דמיינו את אבי העורקים באמצעות סורק אינפרא אדום קרוב כדי להמחיש הסתיידות כלי דם.
    5. השתמש בסקריפט MATLAB מותאם אישית (קובץ משלים 1) כדי לכמת את האות הכולל של עוקב הסידן, המנורמל לאזור אבי העורקים הסרוק הכולל. סקריפט MATLAB פועל באמצעות התוספת 'ארגז כלים לביואינפורמטיקה'. MATLAB מופנית תחילה למיקום קובצי TIFF מסריקת כמעט אינפרא-אדום של אבי העורקים, הקבצים הבודדים נפתחים לאחר מכן וערכי עוצמת הפיקסלים מחולצים מקובצי TIFF.
      1. לאחר הצגת התמונה למשתמש עם מפת צבע, בחר את אבי העורקים עם ההסתיידות הגדולה ביותר כקנה המידה המרבי.
      2. כאשר MATLAB שואלת "כמה דגימות יש בתמונה?" בחלון הפקודה, הזינו את מספר אבי העורקים בתמונה הנוכחית ובחרו כל אבי עורקים בזו אחר זו. לאחר בחירת אבי העורקים, MATLAB תיצור תמונה בינארית עם מסיכה של השטח הכולל של אבי העורקים ותמונה בינארית נוספת עם מסיכה של האזור המסויד של אבי העורקים. הערכים מתמונות מסיכות אלה משמשים לאחר מכן לקביעת השטח הכולל המסויד, השטח הכולל של אבי העורקים, אזור האחוזים החיוביים להסתיידות והעוצמה הממוצעת של האזור המסויד.
      3. כדי לבחור אבי עורקים, צור תיבה סביב אבי העורקים המעניין את הדמות האחרונה על המסך על ידי בחירת ארבע פינות בלחיצה שמאלית אחת ויצירת תיבה מסביב לתמונה. כדי לסגור את התיבה, לחץ פעמיים על הפינה הראשונה.
        הערה: הסף עשוי להיות שונה בהתאם למודל ההסתיידות שבו נעשה שימוש. זה תלוי במשתמש לקבוע איזה ערך קובע אות חיובי עבור הסתיידות כלי הדם. ברגע שהסף נקבע לניסוי, הוא חייב להישאר זהה לאורך כל תקופת הניסוי.
    6. לאחר חילוץ הנתונים הכמותיים, בצע ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט-הוק של Tukey כדי להראות מובהקות בין הקבוצות.

2. בידוד וחילוץ כלי רכב חשמליים מאבי העורקים

הערה: לאחר בידוד והסרת אבי העורקים, ניתן לחלץ כלי רכב חשמליים מהרקמה. באמצעות תמיסת עיכול ומחזורי צנטריפוגות מרובים, ניתן לאסוף כלי רכב חשמליים ולהשתמש בהם לטכניקות רבות ושונות, כולל בדיקות הסתיידות, אלקטרופורזה בג'ל ואימונובלוטינג13. להלן פרוטוקול הבידוד והחילוץ של כלי רכב חשמליים:

  1. מיד לאחר סריקת אבי העורקים, אגרו שניים עד שלושה אבי עורקים כדי להניב ריכוז חלבון מספיק.
  2. הכינו תמיסת עיכול המכילה 0.25 M סוכרוז, 0.12 M נתרן כלורי (NaCl), 0.01 M אשלגן כלורי (KCl), 0.02 M Tris hydrochloride, ו 600 U / mL collagenase13.
  3. יש לדגור על שניים עד שלושה אבי עורקים מאוגמים ב-1.5 מ"ל של תמיסת עיכול למשך שעתיים ב-37°C. אסוף את הפתרון. צנטריפוגה את התמיסה במהירות של 1,000 × גרם למשך 15 דקות כדי להסיר פסולת תאים.
  4. צנטריפוגו את הסופרנאטנט למשך 30 דקות נוספות ב-33,000 × גרם כדי להסיר מיקרו-שלפוחיות. לאסוף ולהעריך את הסופרנאטנט לפוטנציאל הסתיידות (ראה סעיף 3).
    הערה: בצע את השלבים הבאים אם אלקטרופורזה בג'ל ואימונובלוטציה של חלבונים של כלי רכב חשמליים מבוצעים.
  5. אולטרה-צנטריפוגה של הסופרנאטנט במהירות של 100,000 × גרם למשך שעה אחת כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים המעניינים.
  6. בזמן שהסופרנאטנט עובר אולטרה-צנטריפוגה, הכינו את RIPA lysis ואת חיץ המיצוי (ראו טבלת החומרים) על ידי הוספת מעכב הפרוטאז ומערבולות עד להמסה.
  7. לאחר השלמת האולטרה-צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט, והשאירו את הכדור, המכיל את הרכבים החשמליים. משעים את הגלולה בליזיס RIPA מוכן ותערובת מעכבי פרוטאז. הדגימות מוכנות לאלקטרופורזה בג'ל ולכתמים מערביים.

3. הערכת פוטנציאל ההסתיידות של בועיות חוץ-תאיות עם ספיגת פיזור אור

הערה: כדי למדוד את היווצרות המינרלים בזמן אמת של כלי רכב חשמליים, השתמשנו בבדיקה שפותחה במקור כדי לחקור היווצרות מינרלים מסחוס לוחית גדילה מתרבית תאים14. מכיוון שקיעת סידן פוספט היא סימן ההיכר של הסתיידות, עלייה בספיגת פיזור האור כתוצאה מהיווצרות תרכובת סידן פוספט מעידה על פוטנציאל ההסתיידות14. במבחנה דגמי VSMC נוחים למדידת פוטנציאל ההסתיידות של כלי רכב חשמליים. בטכניקה זו, קורא לוחות עם מסנן אורך גל קצר יכול לכמת את הסתיידות החוץ גופית של כלי רכב חשמליים. קריאת הספיגה נרשמת ב 340 ננומטר, וספיגה גבוהה יותר מעידה על היווצרות יותר מינרלים של סידן פוספט. הפרוטוקול לבדיקת ספיגת פיזור האור הוא כדלקמן:

  1. צנטריפוגה התווך המותנה שנאסף של VSMCs ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תאים14.
  2. צנטריפוגו את הסופרנאטנט ב-33,000 × גרם למשך 30 דקות, אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו לצינור חדש.
    הערה: ניתן לאשר את נוכחותם של כלי רכב חשמליים בסופרנאטנט שנאסף באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) או ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
  3. הכינו תמיסה סטרילית חד-בסיסית של נתרן פוספט בנפח 300 מילימטר (NaH2PO4). סנן את התמיסה כדי להבטיח תנאים סטריליים במידת הצורך.
  4. הוסף 1% (v/v) של 300 mM NaH2PO4 לדגימות EV, ופפט בעדינות את התמיסה כדי לערבב היטב. מעבירים 200 μL של תמיסת התערובת לצלחת של 96 בארות. לדגור את צלחת 96 בארות בקורא microplate ב 37 ° C.
  5. הגדר את קורא הלוחות להקליט את הבליעה באורך גל של 340 ננומטר כל דקה.

4. הערכת היווצרות מינרלים הסתיידות של שלפוחיות חוץ תאיות עם הידרוג'ל קולגן

הערה: צבירה של כלי רכב חשמליים והיווצרות מיקרו-הסתיידויות נצפות באמצעות הידרוג'ל קולגן. הידרוג'לים אלה פועלים כפיגום המחקה את צפיפות הקולגן שנצפתה in vivo15. זה מדגים את ההשפעה של קולגן על צמיחת הסתיידות. הפרוטוקול להערכת היווצרות מינרלים של כלי רכב חשמליים בהידרוג'לים הוא כדלקמן:

  1. יום 1
    1. הכינו תמיסת קולגן במינון 2.5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM. הוסיפו באיטיות 5M נתרן הידרוקסידי לתערובת קולגן/DMEM עד שהצבע משתנה לאדום. בדוק כי ה- pH של הפתרון הוא כ 7.
      הערה: אם הפתרון הופך לסגול והופך לבסיסי מדי, הפעל מחדש את התהליך.
    2. פיפטה 300 μL של תמיסת קולגן 2.5 מ"ג / מ"ל עם pH של 7 לתוך כל באר של זכוכית 8 באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2 לחות מבוקרת למשך 72 שעות.
  2. יום 4
    1. הוסף 300 μL של DMEM כבקרה לתוך הבארות.
    2. הוסף 300 μL של דגימות בינוניות EV שנאספו בעבר לבארות הנותרות.
    3. יש לדגור בלחות מבוקרת של 37°C ו-5% CO2 למשך 6 ימים.
  3. יום 10
    1. הכינו 2.5 μL של Osteosense 680EX עם 22.5 μL של DMEM.
    2. פיפטה 2.5 μL של תערובת Osteosense ו- DMEM לכל באר. יש לדגור בלחות מבוקרת של 37°C ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
  4. יום 11
    1. דמיינו את ההידרוג'לים עם פילטרים המתאימים לפלואורסצנטיות של אוסטאוסנס. דמיינו אותם דרך החלק התחתון של תא זכוכית באמצעות מיקרוסקופ הפוך או מלמעלה עם מטרה למרחק עבודה ארוך.
    2. הערך את מספר ההסתיידויות ואת גודל ההסתיידות בתמונות שנאספו באמצעות אפשרויות ניתוח החלקיקים הזמינות ב- ImageJ.
      1. השתמש בתמונה | התאמה | הפקודה 'סף' לבינאריזציה של התמונות כך שרק אות Osteosense יופיע לבן. השתמש בניתוח | הפקודה 'נתח חלקיקים ' לקבלת מידע לכל הסתיידות בתמונה. הקפד להשתמש באותם פרמטרי סף עבור כל תמונה שנותחה לקבלת עקביות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר חילוץ אבי העורקים, הדמיה באמצעות סורק אופטי אינפרא-אדום קרוב מראה ייצוג חזותי של אבי העורקים כמו גם של הסתיידות כלי הדם (איור 1). ערכי עוצמת הפיקסלים בתמונה הפלואורסצנטית הסרוקה מייצגים את התפלגות ההסתיידות ומוצגים כאן באמצעות מפת חום צבעונית. שיטות הכימות כוללות זיהוי סף חיובי ודיווח על אזור האחוזים של אבי העורקים עם ערכים גדולים מערך סף זה ו/או דיווח על עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של הפיקסלים בתוך אבי העורקים. כפי שניתן לראות באיור 2 ובאיור 3, תאי שריר חלקים ראשוניים של עורק כלילי אנושי ראשוניים זמינים באופן מסחרי שימשו כדי להדגים את הטכניקות. ניתן להשתמש במדיה מותנית של VSMCs כדי למדוד את פוטנציאל ההסתיידות של כלי רכב חשמליים. היווצרות מינרלים לאורך זמן נמדדת על-ידי בליעת אור ב-480 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות (איור 2A,B). רגרסיה ליניארית במהלך השלב המהיר של מינרליזציה גילתה כי העלייה בספיגה התרחשה פי 1.5 מהר יותר במדגם פרו-קלציפי בהשוואה לדגימת ביקורת. בתוך הידרוג'ל קולגן, ניתן להמחיש משקעי סידן באמצעות הדמיה של אוסטאוסנס פלואורסצנטי (איור 3A,B). הסתיידויות בודדות מופיעות כאזורים חיוביים לאוסטאוסנס בתוך ההידרוג'ל.

Figure 1
איור 1: אבי העורקים לאחר דיסקציה. לאחר הסריקה, ניתן להמחיש הסתיידות בתוך אבי העורקים של עכברי C57BL/6J. אות אוסטאוסנס גבוה יותר נצפה בכל אבי העורקים של עכבר עם מחלת כליות כרונית (משמאל) בהשוואה לשני אבי העורקים מעכברי ביקורת (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ספיגת מינרלים למדידת פוטנציאל ההסתיידות של כלי רכב חשמליים. (א,ב) פיזור אור ב-340 ננומטר מראה בליעה גבוהה יותר בתווך המותנה המתקבל מ-VSMCs בתרבית בתווך פרו-קלציפי (קו כהה) בהשוואה למדיום הבקרה הרגיל (קו אפור בהיר). (C) רגרסיה ליניארית של 20 הדקות הראשונות של הבדיקה מראה היווצרות מינרלים מהירה יותר במדגם פרו-קלציפי. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; VSMCs = תאי שריר חלק וסקולריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: היווצרות מינרלים ממדיה מותנית בהידרוג'לים של קולגן. מדיה מותנית מתאי ביקורת (A) ותאי (B) שגודלו בתרבית במשך 21 יום בתווך פרו-קלציפיק הוכנסו להידרוג'ל קולגן. ההדמיה של פלואורסצנטיות אוסטאוסנס האדומה מראה (A) אות מינימלי בדגימת הבקרה ו-(B) נוכחות של מינרלים שנוצרו מהתווך המותנה של תאים שגודלו בתרבית בתנאים פרו-קלציפיים. קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: סקריפט MATLAB מותאם אישית לכימות האות הכולל של עוקב הסידן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לציין את השלבים הקריטיים להשגת תוצאות מוצלחות. במהלך הבידוד של אבי העורקים murine, זה חיוני כי זילוח מבוצע כראוי. בעת הזרקת PBS, יש להקפיד לא לנקב את החדר הימני. זה יגרום לנוזל לדלוף ישירות מהחדר ולא לזרום דרך הריאות, מה שמשאיר דם בתוך אבי העורקים. לאחר שהזילוח בוצע כראוי והמיקרודיסקציה החלה, יש להסיר את כל רקמת השומן ורקמת השומן מאבי העורקים לפני השלמתה וסריקה. שומן שנותר יגרום לאבי העורקים להיראות גדול יותר בעת נרמול הנתונים לגודל הרקמה הכולל.

בשל גודלו המוגבל של אבי העורקים העכבר במהלך דיסקציה, מקובל לנקב או לחתוך את אבי העורקים לשניים. במקרה כזה, מומלץ להמשיך את הדיסקציה כרגיל. ניתן למקם את חלקי אבי העורקים קרוב זה לזה לצורך הדמיה. ניתן גם להכניס את אבי העורקים לתמיסת העיכול בחתיכות לבידוד EV. כאשר מתחילים את הבידוד של כלי הרכב החשמליים, יש צורך באבי עורקים מרובים כדי לייצר מספיק חלבון. מגבלה זו פירושה שיש לנתח יותר עכברים כדי לאסוף את כמות הרקמה המתאימה כדי להפיק תוצאות אמינות.

בשיטה שהודגמה, אנו מראים כיצד למדוד את פוטנציאל המינרליזציה ישירות מכלי רכב חשמליים במדיה מותנית מ-VSMCs בתרבית. פרוטוקול פיזור האור הוא שיטה פשוטה המשמשת למדידת היווצרות המינרלים של כלי רכב חשמליים בזמן אמת14. זה מספק תובנה לגבי התקופה שבה מתרחשת הסתיידות בתוך כלי רכב חשמליים. הידרוג'ל הקולגן מספק פלטפורמה לכוון את הצבירה וההסתיידות של כלי רכב חשמליים לניתוח תלת ממדי של מינרליזציה15. עד כה, ביצענו את הניתוחים האלה רק עם כלי רכב חשמליים ממחקרי מבחנה ; עם זאת, במחקרים עתידיים נבקש להתאים שיטות אלה לניתוח פוטנציאל המינרליזציה של כלי רכב חשמליים שבודדו מאבי העורקים של עכברים.

מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, כאשר הסתיידות היא המנבא המשמעותי ביותר לתחלואה ותמותה. על ידי זיהוי המנגנונים שבאמצעותם כלי רכב חשמליים מובילים להסתיידות, ניתן לערוך מחקרים עתידיים שיתמקדו בשליטה על צמיחת מינרלים כאסטרטגיה טיפולית על ידי עיכוב המסלולים המובילים לשחרור של כלי רכב חשמליים מסוידים, כמו גם על ידי אינטראקציה ישירה עם תהליך המינרליזציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (1R01HL160740 ו- 5 T32GM132054-04) והקרן לחקר הלב של פלורידה. ברצוננו להודות לקסנדרה גומז על עזרתה בסינתזה ובהדמיה של ההידרוג'לים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chambered coverglass Thermo Scientific 155409PK
10 mL Syringe BD 302995
20 G 1 inch Needle BD 305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail Corning 354249
Collagenase Worthington Biochemical LS004174
Curved Forceps Roboz Surgical Instrument RS-8254
Dissection Dish Living Systems Instrumentation DD-90-S
Dissection Pan and Wax United Scientific Supplies DSPA01-W
DMEM Cytiva SH30022.FS
Isoflurane Sigma-Aldrich 26675-46-7
LI-COR Odyssey LI-COR DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)  Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) Roboz Surgical Instrument RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) Roboz Surgical Instrument RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) Roboz Surgical Instrument RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge Beckman Coulter B11229
OsteoSense 680EX Perkin Elmer NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor Thermo Scientific A32963
Potassium Chloride Fischer Chemical P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer G Biosciences 786-489
Sodium Chloride Fischer Chemical BP358
Sodium Hydroxide Thermo Scientific A4782602
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751
Sucrose Sigma S7903
Synergy HTX Multimode Reader Agilent
Tissue culture plate, 96-well Thermo Fisher 167008
T-Pins United Scientific Supplies TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride Fischer Chemical BP153

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
  2. Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
  3. Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
  4. Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
  5. Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
  6. Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
  7. New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
  8. Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
  9. Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
  10. Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
  11. El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
  12. Veseli, B. E., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
  13. Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
  14. Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
  15. Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 191
ניתוח הסתיידות כלי דם חוץ-תאית בתיווך שלפוחית באמצעות מודלים <em>In Vitro</em> <em>ו-In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ashbrook, S. K., Valentin Cabrera,… More

Ashbrook, S. K., Valentin Cabrera, A. M., Shaver, M., Hutcheson, J. D. Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models. J. Vis. Exp. (191), e65013, doi:10.3791/65013 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter