Summary
Dette papir præsenterer metoden til opnåelse og vurdering af vaskulær forkalkning ved isolering af murine aortas efterfulgt af ekstraktion af forkalkede ekstracellulære vesikler for at observere mineraliseringspotentialet.
Abstract
Kardiovaskulær sygdom er den største dødsårsag i verden, og vaskulær forkalkning er den mest betydningsfulde forudsigelse for kardiovaskulære hændelser; Der er dog i øjeblikket ingen behandling eller terapeutiske muligheder for vaskulær forkalkning. Forkalkning begynder inden for specialiserede ekstracellulære vesikler (EV'er), der tjener som nukleerende foci ved at aggregere calcium- og fosfationer. Denne protokol beskriver metoder til opnåelse og vurdering af forkalkning i murine aortas og analyse af de tilhørende ekstraherede EV'er. For det første udføres grov dissektion af musen for at indsamle relevante organer, såsom nyrer, lever og lunger. Derefter isoleres murine aorta og udskæres fra aortaroten til lårbensarterien. To til tre aortaer samles derefter og inkuberes i en fordøjelsesopløsning, inden de gennemgår ultracentrifugering for at isolere de interessante elbiler. Dernæst bestemmes EV'ernes mineraliseringspotentiale ved inkubation i en højfosfatopløsning og måling af lysabsorbansen ved en bølgelængde på 340 nm. Endelig bruges kollagenhydrogeler til at observere den forkalkede mineraldannelse og modning, der produceres af EV'erne in vitro.
Introduction
Forkalkning er den mest betydningsfulde prædiktor for dødelighed og sygelighed i hjerte-kar-sygdomme1. Forkalkning ændrer arterievægsmekanikken på grund af opbygningen af calcium- og fosfatmineraler2. I åreforkalkning kan forkalkning forværre lokal stress og resultere i plaquebrud, som er den største årsag til hjerteanfald. Medial forkalkning - ofte som følge af kronisk nyresygdom - er mere udbredt og fører til betydelig arteriel afstivning, dysfunktion og hjerteoverbelastning 2,3. I øjeblikket er der ingen terapeutiske muligheder for behandling eller forebyggelse af vaskulær forkalkning.
Vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) vedtager en osteoblastlignende fænotype og frigiver forkalkende ekstracellulære vesikler (EV'er), der nukleerer spirende mineraler og dermed driver forkalkning 4,5,6. Denne proces ligner den fysiologiske mineralisering af osteoblaster i knogle7. Selvom mineraliseringens endepunkt er ens i vaskulærvæggen og knoglematrixen, er de mekanismer, hvormed de forkalkende EV'er stammer fra, forskellige i de to væv8. Der er mange typer modeller, der bruges til at studere vaskulær forkalkning. In vitro efterligner cellekulturmodeller den osteogene overgang af VSMC'er og efterfølgende mineraldannelse med specialiserede medier.
Når man studerer in vivo-forkalkning, afhænger den anvendte model af den type forkalkning, der undersøges. Hyperlipidemiske musemodeller bruges ofte til at studere aterosklerotisk forkalkning, som forekommer mere fokal inden for lipidrige plaques9. I modsætning hertil er medial forkalkning mere udbredt i hele vaskulaturen og studeres ofte ved hjælp af kroniske nyresygdomsmodeller, der anvender et adeninrigt diætregime til at fremkalde nyresvigt eller kirurgiske teknikker til at fjerne betydelige dele af nyrerne10,11. Aggressive modeller af vaskulær forkalkning har brugt en kombination af både hyperlipidemiske og kroniske nyresygdomsmodeller12. Denne protokol tilvejebringer en metode til vurdering af vaskulær forkalkning i murine aortas for både medial og aterosklerotisk forkalkning, ekstraktion af EV'er fra aortavæggen og observation af mineraliseringspotentialet i EV'erne opnået fra in vitro-cellekulturmodeller. Fremtidige undersøgelser kan bruge disse procedurer i mekanistiske analyser af vaskulær forkalkning og til at vurdere potentielle terapeutiske interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-arbejdet blev godkendt og overvåget af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Florida International University og overholdt de nuværende retningslinjer fra National Institutes of Health (NIH). For denne protokol varierer proceduren ikke afhængigt af musens stamme, vægt, alder og køn. Den type forkalkning, der undersøges, diæter og behandlinger kan ændre undersøgelsens længde og vægten af den anvendte mus og kan være afhængig af en bestemt stamme og køn af mus, der anvendes i undersøgelsen. Til denne protokol blev både mandlige og kvindelige C57BL/6J-mus brugt, og de blev fodret med en forkalkningsdiæt. Musene blev ofret mellem 20 uger og 24 uger.
1. Isolering og udskæring af aorta
- Fluorescerende markører
- Otteogfyrre timer før eutanasi injiceres musene med 20 μM OsteoSense 680, et fluorescerende billeddannelsesmiddel, i den anbefalede dosis på 100 μL pr. 25 g via en intravenøs injektion.
- Under damphætten skal du placere et isoporbræt med fire t-ben, en spand foret med et papirhåndklæde, et 50 ml rør fyldt med et papirhåndklæde, et 1,5 ml mikrocentrifugerør, dissektionsværktøjer (se materialetabellen) og ethanol i en sprayflaske. Anbring bægerglas med PBS på is.
- Blod trækker
- Tilsæt 2 ml isofluran i et 50 ml konisk rør fyldt med køkkenrulle. Placer røret i spanden, og luk det med låget.
FORSIGTIG: Isofluran skal håndteres i et godt ventileret rum uden recirkulation af udsugningsluft på grund af toksiciteten ved kortvarig eksponering. - Overfør en mus til spanden ad gangen. Når du er bedøvet, skal du placere musen på papirhåndklædet i dorsal position. Hold musen med håndfladen på den ikke-dominerende hånd, placer ørerne tilbage ved hjælp af tommelfingeren og pegefingeren.
- Brug pincetten til at skære et af øjnene. Hold musen over 1,5 ml røret for at starte blodindsamling, hvor 1 ml blod skal opsamles. Når blodet holder op med at dræne, skal du placere musen tilbage i spanden for yderligere sedation.
- Tilsæt 2 ml isofluran i et 50 ml konisk rør fyldt med køkkenrulle. Placer røret i spanden, og luk det med låget.
- Dødshjælp
- Læg et papirhåndklæde på dissektionsmåtten. Når musen er bedøvet, skal du placere musen på måtten i liggende stilling. Fastgør musen i liggende stilling ved hjælp af en t-pin til at holde hvert lem nede.
- Spray musens underliv ned med alkohol. Brug pincetten til at løfte huden i brystområdet. Skær den mediale linje ned i brysthulen med saksen. Når brystbenet er skåret ned i midten, skal du skære membranen på hver side af brystkassen.
- Skær om nødvendigt den forreste del af brystkassen væk for at udsætte hjertet og lungerne.
- Fjernelse af organer
- Brug pincet til at løfte huden og lave et snit ned ad midterlinjen. Fjern overskydende hud eller fedt. Fjern reproduktive organer og blære samt fedt uden for midterlinjen.
- Flyt de gastrointestinale (GI) organer til højre side, og følg tarmene i midterlinjen. Når den er fundet, løft midterlinjen og punktafgifter GI-kanalen op til maven.
- Punktafgifter nyrerne ved at løfte dem væk fra midterlinjen. Skær så tæt på nyrerne som muligt.
- Start derefter fjernelsen af leveren ved at løfte lapperne og skære væk fra midterlinjen.
- Perfus hjertet og aorta. Brug en 10 ml sprøjte til at injicere kold PBS i højre ventrikel. Vent til lungerne blæser op og bliver hvide. Fjern lungerne, samt overskydende membran eller brystkasse.
- Fjernelse af knogler
- Åbn en saks bred, og læg dem i det nederste område af musen over halen. Skær nedad, og begynd at løfte rygsøjlen fra huden. Fjern fedtet fra siderne af midterlinjen. Når huden er løsnet, punktafgifter rygsøjlen og intakte organer ved at skære lige over hjertet. Hvis du transporterer til et stereoskop, skal du placere rygsøjlen og intakte organer i et bægerglas PBS i isspanden.
- Flyt rygsøjlen og organerne ind i dissekeringsskålen. Fyld med iskold PBS. Pin ned rygsøjlen og brystkassen ved hjælp af nåle.
- Under dissektionsmikroskopet skal du bruge pincet til at løfte hjertet forsigtigt og begynde at skære over rygsøjlen og under aorta. Fortsæt dette, indtil bunden af rygsøjlen er nået. Fjern rygsøjlen fra dissekeringsskålen, og fastgør hjertet og eventuelt fremmed fedt eller muskler.
- Mikrodissektion
- Start fra området lige under hjertet, identificer de tre rørformede strukturer: spiserøret, vena cava og aorta. Fjern spiserøret og vena cava for at få et klart synsfelt af aorta.
- Brug mikrodissektionspincet og saks til at løfte fedtvævet og skære så tæt på aorta som muligt. Sørg for ikke at skære aorta. Fortsæt dette ned ad mediallinjen, indtil alle aorta såvel som lårbensarterierne er udsat.
- I hjertet skal du fjerne alt fedtvævet og udsætte de tre grene ved aortabuen. Fjern aortriden fra venstre ventrikel ved at indsætte mikrodissektionssaksen i venstre ventrikel og skære musklen omkring aorta.
- Når aorta er isoleret og renset, skal du afbilde aorta ved hjælp af en nær-infrarød scanner til at visualisere vaskulær forkalkning.
- Brug det brugerdefinerede MATLAB-script (supplerende fil 1) til at kvantificere det samlede signal fra calciumsporeren, som normaliseres til det samlede scannede aortaområde. MATLAB-scriptet fungerer ved hjælp af tilføjelsesprogrammet Bioinformatics toolbox. MATLAB dirigeres først til placeringen af TIFF-filerne fra den nær-infrarøde scanning af aortas, de enkelte filer åbnes derefter, og pixelintensitetsværdierne ekstraheres fra TIFF-filerne.
- Når billedet er præsenteret for brugeren med et farvekort, skal du vælge aorta med den største forkalkning som skalamaksimum.
- Når MATLAB spørger "Hvor mange prøver er der på billedet?" i kommandovinduet, skal du indtaste antallet af aortas i det aktuelle billede og vælge hver aorta en efter en. Når en aorta er valgt, opretter MATLAB et binært billede med en maske af det samlede areal af aorta og et andet binært billede med en maske af det forkalkede område af aorta. Værdierne fra disse maskerede billeder bruges derefter til at bestemme det samlede forkalkede areal, det samlede areal af aorta, det procentvise areal, der er positivt for forkalkning, og den gennemsnitlige intensitet af det forkalkede område.
- For at vælge en aorta skal du lave en boks omkring aorta af interesse på den seneste figur på skærmen ved at vælge fire hjørner med et venstreklik og oprette en boks rundt om billedet. For at lukke boksen skal du dobbeltklikke på det første hjørne.
BEMÆRK: Tærsklen kan være forskellig afhængigt af den anvendte forkalkningsmodel. Det er op til brugeren at bestemme, hvilken værdi der bestemmer et positivt signal til vaskulær forkalkning. Når tærsklen er fastsat for et eksperiment, skal den forblive den samme i hele eksperimentets varighed.
- Når de kvantitative data er ekstraheret, skal du udføre en envejs ANOVA med Tukeys post-hoc-test for at vise signifikans mellem grupperne.
2. Isolering og udtagning af elbiler fra aortas
BEMÆRK: Når aortas er blevet isoleret og fjernet, kan EV'er ekstraheres fra vævet. Ved hjælp af en fordøjelsesopløsning og flere centrifugecyklusser kan elbiler indsamles og bruges til mange forskellige teknikker, herunder forkalkningsanalyser, gelelektroforese og immunoblotting13. Protokollen for isolering og udtrækning af elbiler er som følger:
- Umiddelbart efter scanning af aortas samles to til tre aortas for at give en tilstrækkelig proteinkoncentration.
- Forbered en fordøjelsesopløsning indeholdende 0,25 M saccharose, 0,12 M natriumchlorid (NaCl), 0,01 M kaliumchlorid (KCl), 0,02 M Tris hydrochlorid og 600 U / ml collagenase13.
- Der inkuberes to til tre poolede aortas i 1,5 ml fordøjelsesopløsning i 2 timer ved 37 °C. Saml løsningen. Opløsningen centrifugeres ved 1.000 × g i 15 minutter for at fjerne cellerester.
- Supernatanten centrifugeres i yderligere 30 minutter ved 33.000 × g for at fjerne mikrovesikler. Supernatanten indsamles og vurderes for forkalkningspotentiale (se punkt 3).
BEMÆRK: Følg de efterfølgende trin, hvis gelelektroforese og proteinimmunblotting af EV'erne skal udføres. - Supernatanten ultracentrifugeres ved 100.000 × g i 1 time for at isolere de pågældende elbiler.
- Mens supernatanten ultracentrifugeres, fremstilles RIPA lysis og ekstraktionsbuffer (se materialetabellen) ved tilsætning af proteasehæmmeren og hvirvelstrømmen, indtil den er opløst.
- Når ultracentrifugeringen er afsluttet, aspireres supernatanten, og pelleten, som indeholder elbilerne, efterlades. Pellet suspenderes i den fremstillede RIPA-lysis- og proteasehæmmerblanding. Prøverne er klar til gelelektroforese og western blotting.
3. Vurdering af forkalkningspotentialet for ekstracellulære vesikler med lysspredningsabsorbans
BEMÆRK: For at måle mineraldannelsen i realtid af elbiler brugte vi et assay, der oprindeligt blev udviklet til at studere mineraldannelse fra EV'er med vækstpladebrusk fra cellekultur14. Da calciumphosphataflejring er kendetegnende for forkalkning, er en stigning i lysspredningsabsorbansen som følge af dannelse af calciumphosphatforbindelser tegn på forkalkningspotentialet14. In vitro VSMC-modeller er praktiske til måling af elbilers forkalkningspotentiale. I denne teknik kan en pladelæser med et kort bølgelængdefilter kvantificere in vitro-forkalkningen af elbiler. Absorbansaflæsningen registreres ved 340 nm, og en højere absorbans er tegn på mere calciumphosphatmineraldannelse. Protokollen for lysspredningsabsorbansanalysen er som følger:
- Det konditionerede opsamlede medium af VSMC'er centrifugeres ved 1.000 × g i 5 minutter for at fjerne cellerester14.
- Supernatanten centrifugeres ved 33.000 × g i 30 minutter, supernatanten opsamles og overføres til et nyt glasglas.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af elbiler i den indsamlede supernatant kan bekræftes ved dynamisk lysspredning (DLS) eller nanopartikelsporingsanalyse (NTA) - Der fremstilles en steril opløsning af 300 mM natriumphosphatmonobasisk (NaH2PO4). Filtrer opløsningen for at sikre sterile forhold, hvis det er nødvendigt.
- Der tilsættes 1 % (v/v) 300 mMNaH2PO4 til EV-prøverne, og opløsningen pipetteres forsigtigt for at blande den godt. 200 μL af blandingsopløsningen overføres til en plade med 96 brønde. 96-brøndpladen inkuberes i mikropladelæseren ved 37 °C.
- Indstil pladelæseren til at registrere absorbansen ved en bølgelængde på 340 nm hvert 1. minut.
4. Vurdering af dannelsen af forkalkningsmineraler af ekstracellulære vesikler med kollagenhydrogeler
BEMÆRK: Aggregeringen af EV'er og dannelsen af mikroforkalkninger observeres gennem kollagenhydrogeler. Disse hydrogeler fungerer som et stillads, der efterligner kollagendensiteten observeret in vivo15. Dette viser effekten af kollagen på forkalkningsvækst. Protokollen til vurdering af mineraldannelsen af EV'er i hydrogeler er som følger:
- Dag 1
- Forbered en 2,5 mg/ml kollagenopløsning i DMEM. Tilsæt langsomt 5 M natriumhydroxid til kollagen / DMEM-blandingen, indtil farven skifter til rød. Kontroller, at opløsningens pH-værdi er ca. 7.
BEMÆRK: Hvis opløsningen bliver lilla og bliver for grundlæggende, skal du genstarte processen. - Der pipetteres 300 μL af 2,5 mg/ml kollagenopløsningen med en pH-værdi på 7 i hvert hul i et 8-brønds kammerglas. Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 kontrolleret fugtighed i 72 timer.
- Forbered en 2,5 mg/ml kollagenopløsning i DMEM. Tilsæt langsomt 5 M natriumhydroxid til kollagen / DMEM-blandingen, indtil farven skifter til rød. Kontroller, at opløsningens pH-værdi er ca. 7.
- Dag 4
- Der tilsættes 300 μL DMEM som kontrol i brøndene.
- Der tilsættes 300 μL af de EV-medieprøver, der tidligere er indsamlet, til de resterende huller.
- Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 kontrolleret fugtighed i 6 dage.
- Dag 10
- Forbered 2,5 μL Osteosense 680EX med 22,5 μL DMEM.
- Der pipetteres 2,5 μL af osteosense- og DMEM-blandingen i hvert hul. Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 kontrolleret fugtighed i 24 timer.
- Dag 11
- Billede hydrogelerne med filtre, der passer til Osteosense-fluorescens. Billede dem gennem bunden af et dækglaskammer ved hjælp af et omvendt mikroskop eller fra toppen med et mål om lang arbejdsafstand.
- Vurder antallet af forkalkninger og forkalkningsstørrelsen i de indsamlede billeder ved hjælp af partikelanalyseindstillingerne , der er tilgængelige i ImageJ.
- Brug billedet | Juster | Tærskelkommando til at binarisere billederne, så kun Osteosense-signalet ser hvidt ud. Brug knappen Analysér | Kommandoen Analysér partikler for at få oplysninger om hver forkalkning i billedet. Sørg for at bruge de samme tærskelparametre for hvert billede, der analyseres for konsistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når aortas er ekstraheret, viser billeddannelse ved hjælp af en nær-infrarød optisk scanner en visuel repræsentation af aorta såvel som vaskulær forkalkning (figur 1). Pixelintensitetsværdierne i det scannede fluorescerende billede repræsenterer fordelingen af forkalkning og vises her ved hjælp af et farvet varmekort. Kvantificeringsmetoder omfatter identifikation af en positiv tærskel og rapportering af det procentvise areal af aorta med værdier større end denne tærskelværdi og/eller rapportering af den gennemsnitlige fluorescensintensitet af pixels inden for aorta. Som vist i figur 2 og figur 3 blev kommercielt tilgængelige primære humane kranspulsåre glatte muskelceller brugt til at demonstrere teknikkerne. Konditionerede medier fra VSMC'er kan bruges til at måle elbilers forkalkningspotentiale. Mineraldannelse over tid måles ved hjælp af lysabsorbansen ved 480 nm ved hjælp af en mikropladelæser (figur 2A,B). En lineær regression under mineraliseringens hurtige fase afslørede, at absorbansforøgelsen forekom 1,5 gange hurtigere i den pro-kalcificerede prøve sammenlignet med en kontrolprøve. Inden for kollagenhydrogeler kan calciumaflejringer visualiseres ved billeddannelse af osteosensefluorescens (figur 3A, B). Individuelle forkalkninger fremstår som osteosense-positive regioner i hydrogelen.
Figur 1: Afbildede aortas efter dissektion. Efter scanning kan forkalkning visualiseres i aortas hos C57BL/6J-mus. Et højere osteosense-signal observeres i hele aorta hos en mus med kronisk nyresygdom (yderst til venstre) sammenlignet med de to aortaer fra kontrolmus (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mineralabsorbans til måling af EV-forkalkningspotentialet. (A,B) Lysspredning ved 340 nm viser en højere absorbans i det konditionerede substrat opnået fra VSMC'er dyrket i pro-calcific medium (mørk linje) sammenlignet med det normale kontrolmedium (lysegrå linje). (C) En lineær regression af de første 20 minutter af analysen viser hurtigere mineraldannelse i den pro-kalcifice prøve. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; VSMC'er = vaskulære glatte muskelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mineraldannelse fra konditionerede medier i kollagenhydrogeler. Konditionerede medier fra (A) kontrolceller og (B) celler dyrket i 21 dage i et pro-kalcific medium blev anbragt i kollagenhydrogeler. Billeddannelsen af den langt røde Osteosense-fluorescens viser (A) et minimalt signal i kontrolprøven og (B) tilstedeværelsen af mineraler, der er dannet af det konditionerede medium af celler dyrket under pro-kalcificerede forhold. Skala = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Et brugerdefineret MATLAB-script til kvantificering af calciumsporerens samlede signal. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du udfører protokollen, er det vigtigt at bemærke de kritiske trin for at opnå vellykkede resultater. Under isoleringen af murine aorta er det vigtigt, at perfusionen udføres korrekt. Ved injektion af PBS skal man passe på ikke at punktere højre ventrikel. Dette ville medføre, at væsken lækker direkte ud af ventriklen og undlader at cirkulere gennem lungerne og efterlader blod i aorta. Når perfusionen er udført korrekt, og mikrodissektion er begyndt, skal alt fedt- og fedtvæv fjernes fra aorta før afslutning og scanning. Resterende fedt vil få aorta til at virke større, når dataene normaliseres til den samlede vævsstørrelse.
På grund af den begrænsede størrelse af musens aorta under dissektion er det almindeligt at gennembore eller skære aorta i halvdelen. Hvis dette sker, anbefales det at fortsætte dissektionen som normalt. Aorta stykkerne kan placeres tæt sammen til billeddannelse. Aorta kan også placeres i fordøjelsesopløsningen i stykker til EV-isolering. Når man begynder isoleringen af elbilerne, er der behov for flere aortaer for at give tilstrækkeligt protein. Denne begrænsning betyder, at flere mus skal dissekeres for at indsamle den passende mængde væv for at producere pålidelige resultater.
I den demonstrerede metode viser vi, hvordan man måler mineraliseringspotentialet direkte fra elbiler i konditionerede medier fra VSMC'er i kultur. Lysspredningsprotokollen er en enkel metode, der bruges til at måle mineraldannelsen af elbiler i realtid14. Dette giver indsigt i den periode, hvor forkalkning forekommer i elbiler. Kollagenhydrogelerne giver en platform til at styre aggregering og forkalkning af EV'er til den tredimensionelle analyse af mineralisering15. Indtil videre har vi kun udført disse analyser med elbiler fra in vitro-studier ; I fremtidige undersøgelser vil vi dog søge at tilpasse disse metoder til at analysere mineraliseringspotentialet for elbiler isoleret fra museaortas.
Hjerte-kar-sygdomme er den største dødsårsag i verden, hvor forkalkning er den mest betydningsfulde forudsigelse for sygelighed og dødelighed. Ved at identificere de mekanismer, hvorigennem elbiler fører til forkalkning, kan fremtidige undersøgelser udføres med fokus på at kontrollere mineralvækst som en terapeutisk strategi ved at hæmme de veje, der fører til frigivelse af forkalkede EV'er, samt ved direkte interaktion med mineraliseringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Heart, Lung and Blood Institute of the National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 og 5 T32GM132054-04) og Florida Heart Research Foundation. Vi vil gerne takke Kassandra Gomez for hendes hjælp med at syntetisere og billeddannelse af hydrogelerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al.
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
