Summary
Denne artikkelen presenterer metodikken for å oppnå og vurdere vaskulær forkalkning ved å isolere murine aorta etterfulgt av ekstraksjon av forkalkede ekstracellulære vesikler for å observere mineraliseringspotensialet.
Abstract
Kardiovaskulær sykdom er den ledende dødsårsaken i verden, og vaskulær forkalkning er den viktigste prediktoren for kardiovaskulære hendelser; Imidlertid er det for tiden ingen behandling eller terapeutiske alternativer for vaskulær forkalkning. Forkalkning begynner i spesialiserte ekstracellulære vesikler (EV), som tjener som nukleerende foci ved å aggregere kalsium- og fosfationer. Denne protokollen beskriver metoder for å oppnå og vurdere forkalkning i murine aorta og analysere tilhørende ekstraherte EVer. Først utføres grov disseksjon av musen for å samle eventuelle relevante organer, for eksempel nyrer, lever og lunger. Deretter isoleres murine aorta og skjæres ut fra aortaroten til lårarterien. To til tre aortaer blir deretter samlet og inkubert i en fordøyelsesløsning før de gjennomgår ultrasentrifugering for å isolere elbilene av interesse. Deretter bestemmes mineraliseringspotensialet til elbilene gjennom inkubering i en høyfosfatløsning og måling av lysabsorbansen ved en bølgelengde på 340 nm. Til slutt brukes kollagenhydrogeler til å observere den forkalkede mineraldannelsen og modningen produsert av elbilene in vitro.
Introduction
Forkalkning er den viktigste prediktoren for hjerte- og karsykdom, dødelighet og sykelighet1. Forkalkning endrer arterieveggmekanikken på grunn av opphopning av kalsium- og fosfatmineraler2. Ved aterosklerose kan forkalkning forverre lokalt stress og resultere i plakkbrudd, som er den viktigste årsaken til hjerteinfarkt. Medial forkalkning - ofte som følge av kronisk nyresykdom - er mer utbredt og fører til betydelig arteriell avstivning, dysfunksjon og hjerteoverbelastning 2,3. For tiden er det ingen terapeutiske alternativer for behandling eller forebygging av vaskulær forkalkning.
Vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) vedtar en osteoblastlignende fenotype og frigjør forkalkende ekstracellulære vesikler (EV) som kjerner begynnende mineraler, og driver dermed forkalkning 4,5,6. Denne prosessen ligner den fysiologiske mineraliseringen av osteoblaster i bein7. Selv om endepunktet for mineralisering er lik i vaskulærveggen og beinmatrisen, er mekanismene som de forkalkende EVene kommer fra, forskjellig i de to vevene8. Det finnes mange typer modeller som brukes til å studere vaskulær forkalkning. In vitro etterligner cellekulturmodeller den osteogene overgangen til VSMC og påfølgende mineraldannelse med spesialiserte medier.
Når man studerer in vivo forkalkning, avhenger modellen som brukes av hvilken type forkalkning som studeres. Hyperlipidemiske musemodeller brukes ofte til å studere aterosklerotisk forkalkning, som virker mer fokusert i lipidrike plakk9. I motsetning til dette er medial forkalkning mer utbredt gjennom vaskulaturen og studeres ofte ved hjelp av kroniske nyresykdomsmodeller som benytter et adeninrikt diettregime for å indusere nyresvikt eller kirurgiske teknikker for å fjerne betydelige deler av nyrene10,11. Aggressive modeller av vaskulær forkalkning har brukt en kombinasjon av både hyperlipidemiske og kroniske nyresykdomsmodeller12. Denne protokollen gir en metode for å vurdere vaskulær forkalkning i murine aorta for både mediale og aterosklerotiske forkalkninger, ekstrahere EV fra aortaveggen og observere mineraliseringspotensialet i EVene hentet fra in vitro cellekulturmodeller. Fremtidige studier kan bruke disse prosedyrene i mekanistiske analyser av vaskulær forkalkning og for å vurdere potensielle terapeutiske inngrep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In vivo-arbeidet ble godkjent og overvåket av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Florida International University og i samsvar med gjeldende retningslinjer for National Institutes of Health (NIH). For denne protokollen varierer prosedyren ikke avhengig av musens belastning, vekt, alder og kjønn. Den type forkalkning som studeres, dietter og behandlinger kan endre lengden på studien og vekten av musen som brukes, og kan være avhengig av en bestemt stamme og kjønn av mus som brukes i studien. For denne protokollen ble både mannlige og kvinnelige C57BL/6J-mus brukt, og de ble matet med en forkalkningsdiett. Musene ble ofret mellom 20 uker og 24 ukers alder.
1. Isolering og eksisjon av aorta
- Fluorescerende markører
- Førtiåtte timer før eutanasi, injiser musene med 20 μM OsteoSense 680, et fluorescerende bildebehandlingsmiddel, i anbefalt dose på 100 μL per 25 g via en intravenøs injeksjon.
- Under avtrekkshetten, plasser et Styrofoam-brett med fire t-pinner, en bøtte foret med et papirhåndkle, et 50 ml rør fylt med et papirhåndkle, et 1,5 ml mikrosentrifugerør, disseksjonsverktøy (se materialfortegnelsen) og etanol i en sprayflaske. Legg beger med PBS på is.
- Blod trekker
- Tilsett 2 ml isofluran i et 50 ml konisk rør fylt med papirhåndkleet. Plasser røret i bøtta, og lukk det med lokket.
FORSIKTIG: Isofluran skal håndteres i et godt ventilert rom uten resirkulering av avtrekksluft på grunn av toksisiteten ved kortvarig eksponering. - Overfør en mus i bøtta om gangen. Når du er bedøvet, legg musen på papirhåndkleet i dorsalposisjon. Hold musen med håndflaten på den ikke-dominerende hånden, plasser ørene tilbake med tommelen og pekefingeren.
- Bruk pinsetten, excise ett av øynene. Hold musen over 1,5 ml røret for å starte blodinnsamlingen, hvor 1 ml blod skal samles inn. Når blodet slutter å renne, plasser musen tilbake i bøtte for ytterligere sedasjon.
- Tilsett 2 ml isofluran i et 50 ml konisk rør fylt med papirhåndkleet. Plasser røret i bøtta, og lukk det med lokket.
- Eutanasi
- Legg et papirhåndkle på disseksjonsmatten. Når musen er bedøvet, plasserer du musen på matten i liggende stilling. Fest musen i liggende stilling ved hjelp av en t-pinne for å holde nede hvert lem.
- Spray ned magen på musen med alkohol. Bruk pinsetten, løft huden på brystområdet. Med saksen, kutt ned mediallinjen i brysthulen. Når brystbenet er kuttet ned i midten, kutt membranen på hver side av brystkassen.
- Om nødvendig, kutt bort den fremre delen av brystkassen for å avsløre hjertet og lungene.
- Fjerning av organer
- Bruk pinsett, løft huden og gjør et snitt nedover midtlinjen. Fjern overflødig hud eller fett. Fjern reproduktive organer og blære, samt fett utenfor midtlinjen.
- Flytt gastrointestinale (GI) organer til høyre side, og følg tarmene i midtlinjen. Når den er funnet, løft midtlinjen og øk GI-kanalen opp til magen.
- Excise nyrene ved å løfte dem bort fra midtlinjen. Klipp så nær nyrene som mulig.
- Deretter begynner du fjerning av leveren ved å løfte lobene og kutte bort fra midtlinjen.
- Perfuse hjertet og aorta. Bruk en 10 ml sprøyte til å injisere kald PBS i høyre ventrikkel. Vent til lungene blåses opp og blir hvite. Fjern lungene, samt overflødig membran eller brystkasse.
- Fjerning av bein
- Åpne en saks bredt, og plasser dem på den nedre delen av musen over halen. Skjær nedover, og begynn å løfte ryggraden fra huden. Fjern fettet fra sidene av midtlinjen. Når huden er løsrevet, excise ryggraden og intakte organer ved å kutte rett over hjertet. Hvis du transporterer til et stereoskop, plasser ryggraden og intakte organer i et beger av PBS i isbøtta.
- Flytt ryggraden og organene inn i dissekeringsfatet. Fyll med iskald PBS. Pin ned ryggraden og brystkassen ved hjelp av nåler.
- Under disseksjonsmikroskopet, bruk pinsett for å løfte hjertet forsiktig, og begynn å kutte over ryggraden og under aorta. Fortsett dette til bunnen av ryggraden er nådd. Fjern ryggraden fra dissekeringsfatet, og pin ned hjertet og eventuelt fremmed fett eller muskel.
- Mikrodisseksjon
- Start fra området rett under hjertet, identifiser de tre rørformede strukturer: spiserøret, vena cava og aorta. Fjern spiserøret og vena cava for å ha et klart synsfelt i aorta.
- Ved hjelp av mikrodisseksjon tang og saks, begynne å løfte fettvev og kutte så nær aorta som mulig. Pass på at du ikke kutter aorta. Fortsett dette nedover mediallinjen til alle aorta samt lårarteriene er utsatt.
- I hjertet, fjern alt fettvevet, utsett de tre grenene ved aortabuen. Fjern aortaroten fra venstre ventrikkel ved å sette mikrodisseksjonssaksen inn i venstre ventrikkel og kutte muskelen rundt aorta.
- Når aorta er isolert og rengjort, bilde aorta ved hjelp av en nær-infrarød skanner for å visualisere vaskulær forkalkning.
- Bruk det egendefinerte MATLAB-skriptet (tilleggsfil 1) til å kvantifisere det totale signalet til kalsiumsporeren, som normaliseres til det totale skannede hovedpulsåreområdet. MATLAB-skriptfunksjonene ved hjelp av tillegget Bioinformatikk-verktøykassen. MATLAB blir først rettet til plasseringen av TIFF-filene fra nær-infrarød skanning av aortaene, de enkelte filene åpnes deretter, og pikselintensitetsverdiene trekkes ut fra TIFF-filene.
- Når bildet er presentert for brukeren med et fargekart, velg aorta med størst forkalkning som skala maksimum.
- Når MATLAB spør "Hvor mange eksemplarer er det i bildet?" i kommandovinduet, skriv inn antall aorta i det gjeldende bildet, og velg hver aorta en etter en. Når en aorta er valgt, vil MATLAB lage et binært bilde med en maske av det totale arealet av aorta og et annet binært bilde med en maske av det forkalkede området av aorta. Verdiene fra disse maskerte bildene brukes deretter til å bestemme det totale forkalkede området, det totale arealet av aorta, prosentandelen som er positivt for forkalkning og gjennomsnittlig intensitet av det forkalkede området.
- For å velge en aorta, lage en boks rundt aorta av interesse på den nyeste figuren på skjermen ved å velge fire hjørner med ett venstre klikk og lage en boks rundt bildet. For å lukke boksen, dobbeltklikk på det første hjørnet.
MERK: Terskelen kan være forskjellig avhengig av hvilken forkalkningsmodell som brukes. Det er opp til brukeren å bestemme hvilken verdi som bestemmer et positivt signal for vaskulær forkalkning. Når terskelen er satt for et eksperiment, må den forbli den samme gjennom hele eksperimentets varighet.
- Når de kvantitative dataene er trukket ut, utfør en enveis ANOVA med Tukeys post-hoc-test for å vise signifikans mellom gruppene.
2. Isolere og trekke ut elbiler fra aorta
MERK: Når aortaene er isolert og fjernet, kan EV ekstraheres fra vevet. Ved hjelp av en fordøyelsesløsning og flere sentrifugesykluser kan EV samles inn og brukes til mange forskjellige teknikker, inkludert forkalkningsanalyser, gelelektroforese og immunoblotting13. Protokollen for isolering og utvinning av elbiler er som følger:
- Umiddelbart etter skanning av aortaene, basseng to til tre aorta for å gi en tilstrekkelig proteinkonsentrasjon.
- Tilbered en fordøyelsesløsning inneholdende 0,25 M sukrose, 0,12 M natriumklorid (NaCl), 0,01 M kaliumklorid (KCl), 0,02 M Trishydroklorid og 600 U/ml kollagenase13.
- Inkuber to til tre samlede aortaer i 1,5 ml fordøyelsesløsning i 2 timer ved 37 °C. Samle løsningen. Sentrifuger løsningen ved 1000 × g i 15 minutter for å fjerne celleavfall.
- Sentrifuger supernatanten i ytterligere 30 minutter ved 33 000 × g for å fjerne mikrovesikler. Samle inn og vurdere supernatanten for forkalkningspotensial (se avsnitt 3).
MERK: Følg de påfølgende trinnene hvis gelelektroforese og proteinimmunoblotting av elbilene skal utføres. - Ultrasentrifuge supernatanten ved 100 000 × g i 1 time for å isolere elbilene av interesse.
- Mens supernatanten gjennomgår ultrasentrifugering, klargjør RIPA-lysis og ekstraksjonsbuffer (se materialtabellen) ved å tilsette proteasehemmeren og virvle til den er oppløst.
- Når ultrasentrifugeringen er fullført, aspirerer supernatanten og forlater pelleten, som inneholder elene. Suspender pelleten i den tilberedte RIPA lysis og proteasehemmerblandingen. Prøvene er klare for gelelektroforese og vestlig blotting.
3. Vurdering av forkalkningspotensialet til ekstracellulære vesikler med lysspredningsabsorbans
MERK: For å måle sanntids mineraldannelse av EV, brukte vi en analyse opprinnelig utviklet for å studere mineraldannelse fra vekstplatebrusk EV fra cellekultur14. Siden kalsiumfosfatavsetning er kjennetegnet ved forkalkning, er en økning i lysspredningsabsorbans som følge av dannelse av kalsiumfosfatforbindelse en indikasjon på forkalkningspotensialet14. In vitro VSMC-modeller er praktiske for å måle kalsifiseringspotensialet til elbiler. I denne teknikken kan en plateleser med et kort bølgelengdefilter kvantifisere in vitro-forkalkning av elbiler. Absorbensavlesningen registreres ved 340 nm, og en høyere absorbans indikerer mer kalsiumfosfatmineraldannelse. Protokollen for lysspredningsabsorbansanalysen er som følger:
- Sentrifuge det kondisjonerte oppsamlede mediet av VSMC ved 1000 × g i 5 minutter for å fjerne celleavfall14.
- Sentrifuger supernatanten ved 33 000 × g i 30 minutter, samle supernatanten og overfør den til et nytt rør.
MERK: Tilstedeværelsen av EV i den innsamlede supernatanten kan bekreftes gjennom dynamisk lysspredning (DLS) eller nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) - Klargjør en 300 mM natriumfosfat monobasisk (NaH2PO4) steril løsning. Filtrer oppløsningen for å sikre sterile forhold om nødvendig.
- Tilsett 1 % (v/v) 300 mM NaH2PO4 i EV-prøvene, og pipetter oppløsningen forsiktig for å blande godt. Overfør 200 μL av blandingsoppløsningen til en 96-brønnplate. Inkuber platen med 96 brønner i mikroplateleseren ved 37 °C.
- Sett plateleseren til å registrere absorbansen ved en bølgelengde på 340 nm hvert 1. minutt.
4. Vurdering av forkalkningsmineraldannelsen av ekstracellulære vesikler med kollagenhydrogeler
MERK: Aggregeringen av elbiler og dannelsen av mikroforkalkninger observeres gjennom kollagenhydrogeler. Disse hydrogelene fungerer som et stillas som etterligner kollagentettheten observert in vivo15. Dette demonstrerer effekten av kollagen på forkalkningsvekst. Protokollen for å vurdere mineraldannelsen av elbiler i hydrogeler er som følger:
- Dag 1
- Lag en 2,5 mg/ml kollagenoppløsning i DMEM. Tilsett sakte 5 M natriumhydroksid til kollagen/DMEM-blandingen til fargen endres til rød. Kontroller at oppløsningens pH er ca. 7.
MERK: Hvis løsningen blir lilla og blir for grunnleggende, start prosessen på nytt. - Pipette 300 μL av 2,5 mg/ml kollagenoppløsning med en pH på 7 i hver brønn i et 8-brønns kammerglass. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 -kontrollert fuktighet i 72 timer.
- Lag en 2,5 mg/ml kollagenoppløsning i DMEM. Tilsett sakte 5 M natriumhydroksid til kollagen/DMEM-blandingen til fargen endres til rød. Kontroller at oppløsningens pH er ca. 7.
- Dag 4
- Legg til 300 μL DMEM som en kontroll i brønnene.
- Legg til 300 μL av EV-mediumprøvene samlet inn tidligere til de gjenværende brønnene.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 kontrollert fuktighet i 6 dager.
- Dag 10
- Forbered 2,5 μL Osteosense 680EX med 22,5 μL DMEM.
- Pipette 2,5 μL av Osteosense og DMEM-blandingen i hver brønn. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 -kontrollert fuktighet i 24 timer.
- Dag 11
- Bilde hydrogelene med filtre som passer for Osteosense fluorescens. Bilde dem gjennom bunnen av et dekselglasskammer ved hjelp av et omvendt mikroskop eller fra toppen med et langt arbeidsavstandsmål.
- Vurder antall forkalkninger og forkalkningsstørrelsen i de innsamlede bildene ved hjelp av alternativene for partikkelanalyse som er tilgjengelige i ImageJ.
- Bruk bildet | Justere | Terskelkommando for å binarisere bildene slik at bare Osteosense-signalet vises hvitt. Bruk Analyser | Analyser partikler-kommandoen for å få informasjon for hver forkalkning i bildet. Pass på at du bruker de samme terskelparameterne for hvert bilde som analyseres for konsekvens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når aortaene er ekstrahert, viser avbildning med nær-infrarød optisk skanner en visuell fremstilling av aorta så vel som vaskulær forkalkning (figur 1). Pikselintensitetsverdiene i det skannede fluorescerende bildet representerer fordelingen av forkalkning og vises her ved hjelp av et farget varmekart. Kvantifiseringsmetoder inkluderer å identifisere en positiv terskel og rapportere prosentvis areal av aorta med verdier større enn denne terskelverdien og / eller rapportere gjennomsnittlig fluorescensintensitet av pikslene i aorta. Som vist i figur 2 og figur 3 ble kommersielt tilgjengelige primære humane glatte muskelceller i koronararterien brukt for å demonstrere teknikkene. Betingede medier fra VSMC-er kan brukes til å måle kalsifiseringspotensialet til elbiler. Mineraldannelse over tid måles ved lysabsorbansen ved 480 nm ved hjelp av en mikroplateleser (figur 2A,B). En lineær regresjon i den raske fasen av mineralisering viste at absorbansøkningen skjedde 1,5 ganger raskere i den prokalsifiske prøven sammenlignet med en kontrollprøve. Innenfor kollagenhydrogeler kan kalkavleiringer visualiseres ved avbildning av Osteosense-fluorescens (figur 3A,B). Individuelle forkalkninger fremstår som osteosense-positive regioner i hydrogelen.
Figur 1 Avbildede aortaer etter disseksjon. Etter skanning kan forkalkning visualiseres i aortaene til C57BL/6J-mus. Et høyere Osteosense-signal observeres gjennom hovedpulsåren til en mus med kronisk nyresykdom (helt til venstre) sammenlignet med de to aortaene fra kontrollmus (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mineralabsorbans for å måle EV-kalsifiseringspotensialet. (A,B) Lysspredning ved 340 nm viser en høyere absorbans i det kondisjonerte mediet oppnådd fra VSMC dyrket i prokalsifisk medium (mørk linje) sammenlignet med det normale kontrollmediet (lysegrå linje). (C) En lineær regresjon av de første 20 minuttene av analysen viser raskere mineraldannelse i den prokalsifiske prøven. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; VSMCs = vaskulære glatte muskelceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mineraldannelse fra kondisjonerte medier i kollagenhydrogeler. Kondisjonerte medier fra (A) kontrollceller og (B) celler dyrket i 21 dager i et prokalsifisk medium ble plassert i kollagenhydrogeler. Avbildningen av den langt røde Osteosense-fluorescensen viser (A) et minimalt signal i kontrollprøven og (B) tilstedeværelsen av mineraler som ble dannet fra det kondisjonerte mediet av celler dyrket under prokalsifiske forhold. Skala = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Et tilpasset MATLAB-skript for å kvantifisere det totale signalet til kalsiumsporeren. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når du utfører protokollen, er det viktig å merke seg de kritiske trinnene for å oppnå vellykkede resultater. Under isolering av murine aorta er det viktig at perfusjonen utføres riktig. Ved injeksjon av PBS må det utvises forsiktighet for ikke å punktere høyre ventrikkel. Dette vil føre til at væsken lekker direkte ut av ventrikkelen og ikke klarer å sirkulere gjennom lungene, og etterlater blod i aorta. Når perfusjonen er utført riktig og mikrodisseksjon har begynt, må alt fett- og fettvev fjernes fra aorta før ferdigstillelse og skanning. Resterende fett vil føre til at aorta vises større når normalisering av dataene til den totale vevsstørrelsen.
På grunn av den begrensede størrelsen på musen aorta under disseksjon, er det vanlig å pierce eller kutte aorta i to. Hvis dette skjer, anbefales det å fortsette disseksjonen som normalt. Aortabitene kan plasseres tett sammen for avbildning. Aorta kan også plasseres i fordøyelsessystemet i stykker for EV-isolasjon. Når man begynner isoleringen av elbilene, er det nødvendig med flere aortaer for å gi tilstrekkelig protein. Denne begrensningen betyr at flere mus må dissekeres for å samle riktig mengde vev for å gi pålitelige resultater.
I den demonstrerte metoden viser vi hvordan man måler mineraliseringspotensialet direkte fra elbiler i kondisjonerte medier fra VSMC i kultur. Lysspredningsprotokollen er en enkel metode som brukes til å måle mineraldannelsen til elbiler i sanntid14. Dette gir innsikt i perioden kalsifiseringen skjer innen elbiler. Kollagenhydrogelene gir en plattform for å lede aggregering og forkalkning av EV for tredimensjonal analyse av mineralisering15. Så langt har vi bare utført disse analysene med elbiler fra in vitro-studier ; I fremtidige studier vil vi imidlertid søke å tilpasse disse metodene for å analysere mineraliseringspotensialet til elbiler isolert fra museaorta.
Hjerte- og karsykdommer er den ledende dødsårsaken i verden, med forkalkning som den viktigste prediktoren for sykelighet og dødelighet. Ved å identifisere mekanismene som EV fører til forkalkning, kan fremtidige studier utføres med fokus på å kontrollere mineralvekst som en terapeutisk strategi ved å hemme veiene som fører til frigjøring av forkalkede EVer, samt ved direkte interaksjon med mineraliseringsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 og 5 T32GM132054-04) og Florida Heart Research Foundation. Vi vil gjerne takke Kassandra Gomez for hennes hjelp med å syntetisere og avbilde hydrogelene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
References
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78 (2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Medial arterial calcification: an overlooked player in peripheral arterial disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (8), 1475-1482 (2016).
- Marinelli, A., et al. Diagnosis of arterial media calcification in chronic kidney disease. Cardiorenal Medicine. 3 (2), 89-95 (2013).
- Moe, S. M., Chen, N. X. Mechanisms of vascular calcification in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (2), 213-216 (2008).
- Mir, B., Goettsch, C. Extracellular vesicles as delivery vehicles of specific cellular cargo. Cells. 9 (7), 1601 (2020).
- Ruiz, J. L., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Cardiovascular calcification: Current controversies and novel concepts. Cardiovascular Pathology. 24 (4), 207-212 (2015).
- New, S. E., Aikawa, E. Role of extracellular vesicles in de novo mineralization: An additional novel mechanism of cardiovascular calcification. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 1753-1758 (2013).
- Aikawa, E., Hutcheson, J. D. Cardiovascular Calcification and Bone Mineralization. , Humana Press. Cham, Switzerland. (2020).
- Johnson, T. P. The P-407-induced murine model of dose-controlled hyperlipidemia and atherosclerosis: A review of findings to date. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43 (4), 595-606 (2004).
- Shobeiri, N., et al. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. American Journal of Nephrology. 31 (6), 471-481 (2010).
- El-Abbadi, M. M., et al. Phosphate feeding induces arterial medial calcification in uremic mice: role of serum phosphorus, fibroblast growth factor-23, and osteopontin. Kidney International. 75 (12), 1297-1307 (2009).
- Veseli, B. E., et al.
- Chen, N. X., et al. Transglutaminase 2 accelerates vascular calcification in chronic kidney disease. American Journal of Nephrology. 37 (3), 191-198 (2013).
- Wu, L. N., et al. Physicochemical characterization of the nucleational core of matrix vesicles. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4404-4411 (1997).
- Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).
