Summary
本方案模拟小鼠中枢脊髓综合征（CCS）提高了可重复性，并最大限度地减少了对实验动物的操作损伤，避免了过度破坏解剖结构。本研究中的策略是有利的，因为它允许通过产生一致的结果来研究损伤机制。
Abstract
中央脊髓综合征（CCS）的动物模型可以极大地有益于临床前研究。可识别的解剖通路可以提供微创暴露方法并减少操作过程中对实验动物的额外伤害，从而能够在实验过程中保持一致和稳定的解剖形态，以最大限度地减少个体之间的行为和组织学差异，从而提高实验的可重复性。在这项研究中，使用脊髓损伤同轴平台 （SCICP） 并结合微创技术暴露 C6 水平脊髓。在椎体稳定器的辅助下，我们用SCICP固定了C57BL/6J小鼠的椎骨，并用5 g/mm2 和10 g/mm2 的重量压缩了脊髓，以诱导不同程度的C6脊髓损伤。与之前对CCS的描述一致，结果显示该模型中的病变集中在中央脊髓周围的灰质中，从而可以进一步研究CCS。最后，提供组织学结果作为读者参考。
Introduction
近年来，脊髓损伤 （SCI） 的发病率不断上升，老年人因暴力程度较低的 tauma1 而受伤更多。这些损伤更常累及颈椎，更常导致不完全性神经功能障碍2.
在 21 世纪，CCS 是最普遍的不完全性 SCI 类型，占所有 SCI 的一半以上。 与传统的不完全性 SCI 相比，CCS 的特征是上肢损伤不成比例地多于下肢3。其特征是主要表现为上肢无力，感觉和膀胱功能障碍不太明显。CCS 被认为是由创伤后中央区域出血和水肿引起的，或者正如最近提出的那样，由椎管狭窄中脊髓受压引起的 Wallerian 变性引起。CCS 的管理缺乏高水平的证据作为指导，这需要全面了解其病理生理学4.然而，CCS的模型尚未被报道。合适的动物模型对于理解病理生理学至关重要，可以为临床和临床前研究提供研究基础5,6,7,8,9,10。
本研究通过脊髓损伤同轴平台（SCICP）和微创手术计划建立了小鼠CCS模型，从而进一步研究和了解CCS。该模型在研究过程中通过组织学、磁共振成像 （MRI） 和免疫荧光分析被证明是有效的。
Protocol
实验经山东大学奇路医学院实验动物伦理与福利委员会批准（批准号：22021）。它们是根据美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物第 85-23 号，1996 年修订）进行的。本研究中使用的所有小鼠均为9-10周龄雌性C57BL/6J小鼠，购自济南鹏岳实验动物公司（中国济南）。参与这项研究的9只小鼠被同样随机分配到对照组、轻度组和重度组。在受伤后7天、28天和70天，每组处死一只小鼠。
1. C6椎板切除术和脊髓暴露
注意：曝光是在显微镜下进行的。注意两个方面可以避免出血：（i）应避免所有血管。（ii） 肌肉需要在肌肉的起点和终点分开。
- 准备手术器械和SCICP。
注：SCICP的结构已在先前的研究11中报道。与先前研究的不同之处在于，本方案通过压迫完成脊髓损伤。该平台的两种不同重量（10.4 g 和 20.8 g）可分别产生 5 g/mm2 和 10 g/mm2 的压缩（图 1）。脊髓暴露和压迫步骤如图 2 所示。 - 使用鼻锥吸入给小鼠异氟醚（诱导：3%-5%，维持：1.5%-2%）。
- 麻醉生效后，探索小鼠颈部后方中线处的小凸起，这是第二胸椎（T2）的棘突。
- 剃掉这个凸起周围的头发。用碘伏溶液的三次交替应用对皮肤进行消毒，然后使用75%乙醇的皮肤防腐剂。
- 将鼠标俯卧在手术台上。涂抹眼药膏以保护眼睛。
- 在胸部下方铺设一个 3-4 毫米厚的垫子，以允许颈椎弯曲，便于在手术过程中暴露椎板间隙和畅通无阻的气道。注射丁丙诺啡作为术前镇痛药（0.05-0.1mg/kg，SQ）。
- 用无菌手术刀在第二胸椎棘突中心做一个1-1.5厘米的纵向切口，以暴露筋膜层（图2A）。
- 用无菌微剪刀去除 T2 上方的部分脂肪组织，以找到 T2 棘突。
- 用微型剪刀将双侧斜方肌和菱形肌与C5-T2沿中线分开（图2B）。
- 用微型剪刀分离C5-T2椎骨层上的肌肉，并用无菌微型牵开器将肌肉层缩回两侧（图2C）。
- 切开椎骨表面的多裂肌和颈椎肌肉。
- 根据棘突的最高点定位 T2。从 T2 开始依次探测喙端的棘突以定位 C6（图 3）。
- 用镊子提起C6层，切断层，脊髓暴露（图2D）。
2.颈椎脊髓压迫性损伤
- 用椎体稳定器夹住 C6-7 小关节，并将其锁定（图 2E）。
- 将无菌重量尖端对准暴露的脊髓，并确保尖端的平底平行于脊髓的背面（图2F）。
- 调整套筒，使重物压迫脊髓。当重量与脊髓保持恒定的相对位置时，停止调整（图2G）。
注意： 不要让这个过程太猛烈或太快，以防重量对脊髓施加挫伤力。 - 按压 5 分钟后取下重物和椎体稳定器。
- 在显微镜下观察压缩后脊髓的颜色变化（图2H）。
- 用无菌 PBS 冲洗并使用吸力清洁操作部位。
- 使用聚丙烯不可吸收缝合线（尺寸：6-0）将肌肉和皮肤分层缝合。
- 对手术区域进行消毒，将鼠标放在温暖的垫子上，直到鼠标恢复完全意识，然后将鼠标放回鼠笼中。
- 每8-12小时注射丁丙诺啡镇痛（0.05-0.1mg / kg，SQ），持续3天。
3. 组织学分析
- 在受伤后第7天，第28天或第70天通过腹膜内注射1.25%三溴乙醇（0.02mL / g体重）麻醉小鼠。经心静脉输注小鼠 60 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 20 mL 4% 多聚甲醛11。
- 用微剪刀从病变中心两侧横断距病变中心0.5厘米处的脊髓，并保留1厘米长的部分。
- 将保存的脊髓切片在4°C下浸入30%蔗糖中48小时。
- 用OCT包埋组织，用冷冻组将组织切成6μm厚的切片，然后将切片收集在载玻片上。
- 苏木精和伊红染色
- 用 1x PBS 冲洗 6 μm 切片 5 分钟 3 次以去除残留的 OCT。
- 将切片浸入苏木精中 90 秒。在流水下清洗切片 3 分钟。
- 将切片浸入曙红中4分钟。在 95% 酒精中浸泡 30 秒以去除多余的曙红。
- 最后，用酒精（95%酒精和100%酒精连续两次）使载玻片脱水30秒，并将载玻片放入二甲苯浴中澄清2分钟。然后，用盖玻片和树脂凝胶密封切片。
- 普鲁士蓝染色
- 将载玻片浸没在亚铁氰化钾（10%）和盐酸（10%）的等量混合物中20分钟。
- 用蒸馏水冲洗 3 次，并用 Nuclear Fast Red 复染 5 分钟。
- 用蒸馏水冲洗三次，然后用 95% 酒精冲洗一次，用 100% 酒精冲洗两次，每次 5 分钟。
- 在二甲苯中清除切片两次，每次3分钟，然后用树脂凝胶12密封。
- 免疫荧光染色
- 将载玻片与以下一抗在37°C孵育1小时：兔抗电离钙结合衔接分子1（Iba-1）（1：500），其在神经损伤后在小胶质细胞中上调;小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（1：300），在中枢神经系统的星形胶质细胞中表达;兔抗神经丝-200 （NF-200） （1：2000），在神经丝中表达。
- 在室温 （RT） 下与二抗一起孵育 1 小时：Alexa Fluor488 山羊抗小鼠和 Alexa Fluor594 山羊抗兔 （1：1,000）。
- 拍摄照片并用荧光显微镜进一步分析13.
4. 磁共振成像
- 在受伤后7天用异氟烷麻醉（1%-2%异氟烷，20%-30%O2）麻醉小鼠，通过迷你面罩施用。
- 以矢状方向扫描颈椎脊髓。使用以下设置进行 MRI 成像：多切片和交错方式的自旋回波 （SE） 序列，TR/TE = 2500/12 ms，视场 （FOV） 上的采集矩阵 = 256 x 128 矩阵 （FOV） = 12 x 8 mm2，切片厚度 = 1 mm，激发次数 （NEX） = 2。
注意：在扫描过程中将鼠标的呼吸频率保持在 10-15/分钟，以消除与呼吸相关的图像伪影14。
Representative Results
矢状HE切片表明，尽管重度组灰质的受损区域较宽，但白质的连续性仍然存在。此外，重度组和轻度组之间受损灰质面积的差异支持了方案中组设置的合理性（图4）。
冠状HE切片显示病变主要存在于两组的灰质中。在重度组中，灰质周围的白质结构更容易受到影响，但白质的轮廓仍然保持不变（图5）。NF-200免疫荧光表明，即使重症组灰质周围的白质受到影响，但白质仍然相对完整。这些结果与先前研究4 中描述的CCS特征一致（图6）。
在轻度组或重度组受伤后 7 天，矢状 HE 切片均未发现红细胞。普鲁士蓝染色显示轻度组无含铁血黄素沉着症，重度组无含铁血黄素沉着症。这些结果表明，诱发出血可能需要相对严重的损伤程度（图7）。
免疫荧光显示轻度和重度损伤中GFAP和Iba-1表达升高的区域，提示炎症反应和病变中神经胶质瘢痕的形成。此外，重度组比轻度组表现出更大的病变面积（图8）。
MRI是一种相对微创的观察脊髓的方法。结果表明，在轻度和重度组中，病变中均存在低信号信号变化，信号轮廓较高。重症组的低信号区域明显更大（图9）。低信号提示该区域网织红细胞裂解物沉淀，周围的高信号提示炎症反应。在之前的研究中，我们确实进行了几次行为测试。例如，前肢的握力测试显示存在显着差异15。
图 1：SCICP 的套筒和重量。 根据 C6 椎板切除术后测量的脊髓暴露面积，尖端的表面积设计为 1.3 mm x 1.6 mm。砝码涂有PTFE，有效减少套筒内壁与砝码之间的摩擦。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：脊髓的暴露和压迫。 （A）皮肤纵向切口;（B） 将肌肉与T2棘突分开;（C） 分离层上方的肌肉;（D） C6椎板切除术;（五）固定椎体;（F） 确定压缩的位置;（G） 脊髓受压;（H） 脊髓压迫后脊髓上方的白质没有明显损伤。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：小鼠颈椎骨骼解剖结构。 箭头指示的部位是 T2 棘突。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：矢状 HE 染色切片。 （A） 颈椎脊髓矢状切片。（乙、丙）重度组的损伤比轻度组更严重，但两者都集中在中央脊髓周围的灰质上。7、28 和 70 dpi 图像表明，同一损伤组在不同时期的损伤表达没有显著差异，并且上脊髓和下脊髓白质的连续性得以维持。比例尺：1 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图5：颈椎脊髓损伤冠状HE染色切片。 （A-C）损伤主要影响中心索周围的灰质，如图 B 和 C 所示。重度损伤组比轻度损伤组遭受的损伤范围更广，轻度损伤组更容易影响白质。比例尺：400μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：损伤后的 NF-200 冠状免疫荧光。 NF-200 反应在白质轮廓上没有显着差异。比例尺：400μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图7：普鲁士蓝染色。 （A-C） 重度组见含铁血黄素沉着症，轻度组未见。比例尺：400μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 8：损伤后的矢状面 GFAP 和 Iba-1 免疫荧光。 （A-C） 随着损伤程度的增加，GFAP和Iba-1反应的面积增加。比例尺：1 毫米。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 9：颈椎脊髓损伤后的矢状 MRI（T2 加权图像）。 轻度和重度损伤组的损伤区域为低信号，重度损伤组的低信号区域明显更宽。 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在众多类型的脊髓损伤中，CCS 是最有可能治疗的损伤类型之一 3,4。由于缺乏实验室研究模型，1950年代对CCS的研究集中在临床研究和尸体解剖调查上3,16,17。本研究表明使用兼容的工具和微创程序来建立小鼠的 CCS 模型。从技术角度来看，该平台具有较强的可操作性和良好的可重复性。鉴于实验结果证明了有效性，我们建立最接近先前研究为 CCS4 定义的标准模型的技术。
先前对压缩性损伤的研究主要使用动脉瘤夹、球囊和校准镊子 9,10,18。此外，大多数损伤发生在胸脊髓水平18。本研究选择C6水平的脊髓作为损伤段，以研究CCS的特征。值得关注的是，CCS模型的存活率也是保证实验一致性的重要因素。本研究报道了对小鼠颈椎脊髓造成双侧压缩性损伤，而高水平的脊髓创伤性损伤，尤其是双侧损伤，如果过于严重，对实验动物来说可能是致命的。根据 El-Bohy 的说法，C4/5 脊髓更有可能影响下行球脊髓束和呼吸相关的运动神经元，这导致实验动物呼吸抑制和死亡 18,19,20,21,22,23.在这项研究中，对 C6 颈脊髓具有不同程度压迫的小鼠具有显着差异化的损伤特征，表明组织学检查。尽管 Forgione 报道的小鼠颈椎脊髓钳夹模型存在显着的行为和组织学差异，但需要破坏椎弓根、关节突、椎板甚至神经根才能用改良的钳夹夹住脊髓，这对颈椎结构的稳定性有显着影响24。另一项关于颈椎损伤的研究报告称，使用横突作为固定部位5.尽管关节突起不被破坏，但过度肌肉组织分解同样可能导致脊髓稳定性受到影响。在本研究中，仅切除第 6颈椎板以保持颈椎脊髓的稳定性，保留相邻的关节并避免过度的肌肉损伤。同时，脊髓上方的压迫可防止神经根受损。
HE结果表明，各组小鼠颈脊髓损伤区域主要在CCS特征的中枢脊髓附近灰质，不同组间损伤范围存在显著差异。值得注意的是，我们展示的病理切片可能减轻了损伤表现，因为标本是在受伤后几天收集的。免疫荧光（NF-200）显示脊髓白质区神经束损伤较小，这也证实了CCS损伤主要集中在中央脊髓周围。免疫荧光结果与先前的病理组织学结果相结合。先前的研究表明，CCS 会导致中索附近水肿，导致血肿，并最终导致皮质脊髓外侧束内侧部分功能障碍 3。据报道，出血是 CCS 的典型组成部分，但在随后的影像学检查和尸检研究中很少见17。在这项研究中，受伤后 7 天的 HE 结果表明所有组都有组织水肿的迹象;然而，在损伤区域没有发现残留的红细胞。因此，采用普鲁士蓝检查损伤区域有无出血，结果与重度损伤组损伤区在损伤后7 d观察到的含铁血黄素沉着症相符，而轻度组则不然。 MRI T2图像显示，轻度和重度损伤在损伤后7 d损伤区域均有低信号区域， 表明网织红细胞裂解物在这里沉积。这些结果提供了间接证据，表明先前报道的结果之间的差异可能是由于 MRI 测试可能比组织学测试14 更敏感，此外还有损伤的严重程度，这也可能影响损伤区域的出血量。GFAP在受损区域也广泛表达。同时，在完整区域也观察到 Iba-1 表达，表明炎症反应持续存在，与 MRI 结果一致，其中病变中低信号区域周围的高信号环表明存在炎症反应。最终，根据本研究的结果，模型中的损伤区域集中在中心索周围的灰质上，这与先前报道的描述基本一致13。不幸的是，我们并没有在每只实验动物身上重复进行MRI检查，以显示损伤部位如何随时间动态变化。未来的研究人员可以将其纳入他们的工作中，以便更好地研究CCS。此外，使用定义灰质的 NeuN 等神经元标志物进行免疫标记也可以包含在研究中。
总之，病理学和 MRI 扫描结果的特征与先前研究中描述的 CCS 特征非常相似4.本协议对CCS进行建模可行，有助于对CCS进行进一步的研究和理解。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了干细胞与转化研究国家重点研发计划（2019YFA0112100）和国家自然科学国家重点计划（81930070）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
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