Summary
Das vorliegende Protokoll, das das zentrale Rückenschnursyndrom (CCS) bei Mäusen simuliert, hat die Wiederholbarkeit verbessert und die Operationsschäden der Versuchstiere minimiert, wodurch eine übermäßige Störung der anatomischen Struktur vermieden wurde. Die Strategie in dieser Studie ist vorteilhaft, da sie die Erforschung von Verletzungsmechanismen ermöglicht, indem sie konsistente Ergebnisse liefert.
Abstract
Tiermodelle des Zentralschnursyndroms (CCS) könnten der präklinischen Forschung einen erheblichen Nutzen bringen. Identifizierbare anatomische Pfade können minimalinvasive Expositionsansätze ermöglichen und zusätzliche Verletzungen von Versuchstieren während des Betriebs reduzieren, wodurch die Aufrechterhaltung einer konsistenten und stabilen anatomischen Morphologie während der Experimente ermöglicht wird, um Verhaltens- und histologische Unterschiede zwischen Individuen zu minimieren und die Reproduzierbarkeit von Experimenten zu verbessern. In dieser Studie wurde das Rückenmark auf C6-Ebene mit einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen (SCICP) und einer Kombination mit einer minimal-invasiven Technik exponiert. Mit Hilfe eines Wirbelstabilisators fixierten wir die Wirbel und komprimierten das Rückenmark von C57BL/6J-Mäusen mit 5 g/mm2 und 10 g/mm2 Gewichten mit SCICP, um eine C6-Rückenmarksverletzung unterschiedlichen Grades zu induzieren. In Übereinstimmung mit der vorherigen Beschreibung von CCS zeigen die Ergebnisse, dass die Läsion in diesem Modell in der grauen Substanz um den zentralen Strang konzentriert ist, was weitere Forschungen zu CCS ermöglicht. Abschließend werden histologische Ergebnisse als Referenz für die Leser zur Verfügung gestellt.
Introduction
In den letzten Jahren ist die Inzidenz von Rückenmarksverletzungen (SCI) stetig gestiegen, wobei mehr Verletzungen bei älteren Menschen durch weniger heftiges Taumaauftreten 1. Diese Verletzungen betreffen häufiger die Halswirbelsäule und führen häufiger zu einer inkompletten neurologischen Dysfunktion2.
Im 21. Jahrhundert ist CCS die am weitesten verbreitete Form der inkompletten Rückenmarksverletzung und macht mehr als die Hälfte aller Querschnittlähmungen aus. Im Vergleich zur konventionellen inkompletten Rückenmarksverletzung ist CCS durch eine unverhältnismäßig stärkere Beeinträchtigung der oberen als der unteren Extremitäten gekennzeichnet3. Sie ist gekennzeichnet durch eine vorwiegende Schwäche der oberen Extremitäten mit weniger signifikanten sensorischen und Blasenfunktionsstörungen. Es wird angenommen, dass CCS durch posttraumatische Blutungen und Ödeme in der Zentralregion verursacht wird oder, wie kürzlich vorgeschlagen, durch Wallersche Degeneration durch Kompression des Rückenmarks bei Spinalkanalstenose. Für die Behandlung von CCS fehlt es an Evidenz auf hohem Niveau, was ein umfassendes Verständnis der Pathophysiologie erfordert4. Es wurden jedoch keine Modelle von CCS berichtet. Für das Verständnis der Pathophysiologie sind geeignete Tiermodelle unerlässlich, die eine Forschungsgrundlage für klinische und präklinische Studien bieten können 5,6,7,8,9,10.
In dieser Studie wird ein CCS-Modell in Mäusen mit einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen (SCICP) und einem minimal-invasiven Operationsplan etabliert, der die weitere Erforschung und das Verständnis von CCS ermöglicht. Das Modell wird im Laufe des Forschungsprozesses durch histologische, Magnetresonanztomographie (MRT) und Immunfluoreszenzanalyse valide gemacht.
Protocol
Die Experimente wurden vom Ethik- und Tierschutzausschuss der Universität Shandong Cheeloo College of Medicine genehmigt (Zulassungsnummer: 22021). Sie wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, der von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde (NIH Publications No. 85-23, überarbeitet 1996). Bei allen in dieser Studie verwendeten Mäusen handelte es sich um 9-10 Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse, die von der Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China) gekauft wurden. Insgesamt 9 Mäuse, die an dieser Studie teilnahmen, wurden gleichermaßen in die Kontrollgruppe, die leichte und die schwere Gruppe randomisiert. 7, 28 und 70 Tage nach der Verletzung wurde eine Maus aus jeder Gruppe getötet.
1. C6-Laminektomie und Rückenmarksexposition
HINWEIS: Die Belichtung wurde unter dem Mikroskop durchgeführt. Blutungen können vermieden werden, indem auf zwei Aspekte geachtet wird: (i) Alle Blutgefäße sollten vermieden werden. (ii) Muskeln müssen am Ursprung und am Endpunkt des Muskels getrennt werden.
- Bereiten Sie chirurgische Instrumente und SCICP vor.
ANMERKUNG: Die Struktur von SCICP wurde in der vorangegangenen Studie11 beschrieben. Der Unterschied zur vorherigen Studie besteht darin, dass das vorliegende Protokoll eine Rückenmarksverletzung durch Kompression erreicht. Zwei unterschiedliche Gewichte (10,4 g und 20,8 g) dieser Plattform können eine Kompression von 5 g/mm2 bzw. 10 g/mm2 erzeugen (Abbildung 1). Die Freilegung des Rückenmarks und die Kompressionsschritte sind in Abbildung 2 dargestellt. - Verabreichung von Isofluran an die Maus durch Inhalation mit einem Nasenkegel (Induktion: 3%-5%, Erhaltung: 1,5%-2%).
- Nachdem die Anästhesie ihre Wirkung entfaltet hat, untersuchen Sie eine kleine Ausbuchtung an der Mittellinie hinter dem Hals von Mäusen, die der Dornfortsatz des zweiten Brustwirbels (T2) ist.
- Rasieren Sie die Haare um diese Wölbung herum. Desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Anwendungen einer Jodophorlösung, gefolgt von Hautantiseptika 75% Ethanol.
- Positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf dem Operationstisch. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen zu schützen.
- Legen Sie ein 3-4 mm dickes Polster unter die Brust, um eine gewölbte Krümmung der Halswirbelsäule zu ermöglichen, die Freilegung des Zwischenlaminaraums und einen ungehinderten Atemweg während der Operation zu erleichtern. Injizieren Sie Buprenorphin als präoperative Analgesie (0,05-0,1 mg/kg, SQ).
- Machen Sie einen 1-1,5 cm langen Längsschnitt mit einem sterilen Skalpell mittig auf den Dornfortsatz des 2. Brustwirbels, um die Faszienschicht freizulegen (Abbildung 2A).
- Entfernen Sie einen Teil des Fettgewebes oberhalb von T2 mit einer sterilen Mikroschere, um den Dornfortsatz T2 zu finden.
- Trennen Sie den bilateralen Trapezmuskel und die Rautenmuskulatur von C5-T2 entlang der Mittellinie mit einer Mikroschere (Abbildung 2B).
- Trennen Sie die Muskeln an der Lamina der C5-T2-Wirbel mit einer Mikroschere und ziehen Sie die Muskelschicht mit sterilen Mikroretraktoren zu den Seiten zurück (Abbildung 2C).
- Durchtrennen Sie den Multifidus und die Halswirbelsäulenmuskulatur an der Oberfläche der Wirbel.
- Lokalisieren Sie T2 entsprechend dem höchsten Punkt der Dornfortsätze. Sondieren Sie die Dornfortsätze sukzessive von T2 zum rostralen Ende hin, um C6 zu lokalisieren (Abbildung 3).
- Heben Sie die C6-Lamina mit einer Pinzette an, schneiden Sie die Lamina ab, und das Rückenmark wird freigelegt (Abbildung 2D).
2. Kompressionsverletzung des zervikalen Rückenmarks
- Klemmen Sie die C6-7 Facettengelenke mit dem Wirbelstabilisator und verriegeln Sie ihn (Abbildung 2E).
- Richten Sie die sterile Gewichtsspitze auf das freiliegende Rückenmark und stellen Sie sicher, dass die flache Unterseite der Spitze parallel zur dorsalen Oberfläche des Rückenmarks positioniert ist (Abbildung 2F).
- Passen Sie die Manschette so an, dass das Gewicht das Rückenmark zusammendrückt. Hören Sie auf, sich anzupassen, wenn das Gewicht eine konstante relative Position zum Rückenmark beibehält (Abbildung 2G).
HINWEIS: Machen Sie diesen Vorgang nicht zu heftig oder zu schnell, falls das Gewicht eine Prellungskraft auf das Rückenmark ausübt. - Entfernen Sie das Gewicht und den Wirbelstabilisator nach einer 5-minütigen Kompression.
- Beobachten Sie die Farbveränderungen des Rückenmarks nach der Kompression unter dem Mikroskop (Abbildung 2H).
- Spülen Sie mit sterilem PBS und saugen Sie die Operationsstelle ab.
- Vernähen Sie die Muskeln und die Haut schichtweise mit einem nicht resorbierbaren Polypropylen-Nahtmaterial (Größe: 6-0).
- Desinfizieren Sie den Operationsbereich, legen Sie die Maus auf ein warmes Pad, bis die Maus wieder bei vollem Bewusstsein ist, und setzen Sie sie dann wieder in den Mäusekäfig ein.
- Injizieren Sie Buprenorphin zur Analgesie (0,05-0,1 mg/kg, SQ) alle 8-12 Stunden für 3 Tage.
3. Histologische Analyse
- Betäubung der Maus durch intraperitoneale Injektion von 1,25 % Tribromethanol (0,02 ml/g Körpergewicht) an den Tagen 7, 28 oder 70 nach der Verletzung. Die Maus wird transkardial mit 60 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 20 ml 4%igem Paraformaldehyd11 infundiert.
- Durchtrennen Sie das Rückenmark in einem Abstand von 0,5 cm von der Läsionsmitte von beiden Seiten mit einer Mikroschere und bewahren Sie den 1 cm langen Abschnitt auf.
- Den konservierten Rückenmarksabschnitt 48 h lang bei 4 °C in 30%ige Saccharose eintauchen.
- Betten Sie das Gewebe mit OCT ein, schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryotom in 6 μm dicke Abschnitte und sammeln Sie die Abschnitte auf einem Objektträger.
- Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
- Spülen Sie die 6-μm-Abschnitte mit 1x PBS 3 Mal 5 min lang, um OCT-Reste zu entfernen.
- Tauchen Sie die Abschnitte 90 s lang in Hämatoxylin. Waschen Sie die Abschnitte 3 Minuten lang unter fließendem Wasser.
- Tauchen Sie die Abschnitte für 4 Minuten in Eosin. 30 Sekunden lang in 95%igem Alkohol einweichen, um überschüssiges Eosin zu entfernen.
- Zum Schluss werden die Objektträger 30 Sekunden lang mit Alkohol (95 % Alkohol und zweimal nacheinander 100 % Alkohol) dehydriert und 2 Minuten lang in ein Xylolbad gelegt. Versiegeln Sie dann die Abschnitte mit einem Deckglas und einem Harzgel.
- Preußisch-blaue Färbung
- Tauchen Sie die Objektträger für 20 Minuten in eine gleichmäßige Mischung aus Kaliumferrocyanid (10 %) und Salzsäure (10 %).
- 3 Mal mit destilliertem Wasser abspülen und 5 Minuten lang mit Nuclear Fast Red gegenfärben.
- Dreimal mit destilliertem Wasser spülen, gefolgt von einem Spülgang mit 95% Alkohol und zwei Spülungen mit 100% Alkohol für 5 Minuten.
- Reinigen Sie die Abschnitte zweimal in Xylol für jeweils 3 Minuten und versiegeln Sie sie dann mit Harzgel12.
- Immunfluoreszenz-Färbung
- Inkubieren Sie die Objektträger mit den folgenden Primärantikörpern für 1 h bei 37 °C: Kaninchen-antiionisiertes Kalzium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba-1) (1:500), das in Mikroglia nach Nervenverletzung hochreguliert wurde; saures Anti-Glia-Fibrillenprotein (GFAP) der Maus (1:300), das in Astrozyten im Zentralnervensystem exprimiert wird; Kaninchen-Anti-Neurofilament-200 (NF-200) (1:2000), das in Neurofilament exprimiert wird.
- Mit Sekundärantikörpern für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubieren: Alexa Fluor488 Ziegen-Anti-Maus und Alexa Fluor594 Ziegen-Anti-Kaninchen (1:1.000).
- Machen Sie Fotos und analysieren Sie sie weiter mit einem Fluoreszenzmikroskop13.
4. Magnetresonanztomographie
- Betäuben Sie die Maus 7 Tage nach der Verletzung mit einer Isofluran-Anästhesie (1%-2% Isofluran, 20%-30%O2), die über eine Mini-Maske verabreicht wird.
- Scannen Sie das zervikale Rückenmark in sagittaler Ausrichtung. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die MRT-Bildgebung: Spin-Echo-Sequenz (SE) in Multislice- und Interleaved-Methode mit TR/TE = 2500/12 ms, Aufnahmematrix = 256 x 128 Matrix über dem Sichtfeld (FOV) = 12 x 8 mm2, Schichtdicke = 1 mm und Anzahl der Anregungen (NEX) = 2.
HINWEIS: Halten Sie die Atemfrequenz der Maus während des Scannens bei 10-15/min, um atmungsbedingte Bildartefakte zu eliminieren14.
Representative Results
Der sagittale HE-Schnitt deutet darauf hin, dass, obwohl der geschädigte Bereich in der grauen Substanz in der schweren Gruppe breiter war, eine Kontinuität über der weißen Substanz vorhanden war. Darüber hinaus unterstützt der Unterschied in der geschädigten grauen Substanz zwischen der schweren und der milden Gruppe die Angemessenheit der Gruppeneinstellung im Protokoll (Abbildung 4).
Die koronalen HE-Schnitte zeigen, dass die Läsion in beiden Gruppen hauptsächlich in der grauen Substanz existiert. In der schweren Gruppe war die Struktur der weißen Substanz, die die graue Substanz umgibt, mit größerer Wahrscheinlichkeit betroffen, aber der Umriss der weißen Substanz blieb erhalten (Abbildung 5). Die NF-200-Immunfluoreszenz deutet darauf hin, dass die weiße Substanz in der schweren Gruppe noch relativ intakt war, obwohl die weiße Substanz um die graue Substanz herum betroffen war. Diese Ergebnisse stimmen mit den in der vorangegangenen Studie4 beschriebenen Merkmalen für CCS überein (Abbildung 6).
In sagittalen HE-Schnitten wurden 7 Tage nach der Verletzung weder in der leichten noch in der schweren Gruppe rote Blutkörperchen gefunden. Die Preußisch-Blau-Färbung zeigte keine Hämosiderose in der milden, sondern in der schweren Gruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Induktion von Blutungen einen relativ schweren Grad an Schädigung erfordern kann (Abbildung 7).
Die Immunfluoreszenz zeigte Bereiche mit erhöhter GFAP- und Iba-1-Expression sowohl bei leichten als auch bei schweren Verletzungen, was auf eine Entzündungsreaktion und die Bildung einer glialen Narbe in der Läsion hindeutet. Außerdem wies die schwere Gruppe eine größere Läsionsfläche auf als die milde Gruppe (Abbildung 8).
Die MRT ist eine relativ minimalinvasive Methode zur Beobachtung des Rückenmarks. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl in der leichten als auch in der schweren Gruppe eine hypointense Signaländerung in der Läsion mit einer hohen Signalkontur vorliegt. Die schwere Gruppe zeigte eine signifikant größere hypointense Signalfläche (Abbildung 9). Das hypointense Signal deutet auf einen Niederschlag des Retikulozytenlysats in diesem Bereich hin, und das umgebende hyperintense Signal deutet auf eine Entzündungsreaktion hin. In unserer vorherigen Studie haben wir mehrere Verhaltenstests durchgeführt. So zeigt beispielsweise der Griffkrafttest in den Vordergliedmaßen einen signifikanten Unterschied15.
Abbildung 1: Die Hülse und die Gewichte von SCICP. Die Oberfläche der Spitze wurde auf 1,3 mm x 1,6 mm festgelegt, basierend auf der freigelegten Fläche des Rückenmarks, die nach der C6-Laminektomie gemessen wurde. Das Gewicht ist mit PTFE beschichtet, wodurch die Reibung zwischen der Innenwand der Hülse und dem Gewicht effektiv reduziert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Freilegung und Kompression des Rückenmarks. (A) Längsschnitt der Haut; (B) Trennen Sie die Muskeln rostral vom Dornfortsatz T2; (C) Trennen Sie die Muskeln oberhalb der Laminae; (D) C6-Laminektomie; (E) Fixierung des Wirbelkörpers; (F) Bestimmung des Ortes der Kompression; g) Kompression des Rückenmarks; (H) Keine signifikante Schädigung der weißen Substanz oberhalb des Rückenmarks nach Rückenmarkskompression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Anatomie des Gebärmutterhalsskeletts der Maus. Die durch den Pfeil gekennzeichnete Stelle ist der Dornfortsatz T2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die sagittalen HE-gefärbten Schnitte. (A) Sagittaler Schnitt des zervikalen Rückenmarks. (B,C) Die schwere Gruppe wies schwerere Schäden auf als die milde Gruppe, aber beide konzentrierten sich auf die graue Substanz um den zentralen Strang. Die Bilder mit 7, 28 und 70 dpi deuten darauf hin, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Ausprägung von Verletzungen in derselben Verletzungsgruppe zu verschiedenen Zeiträumen gibt und dass die Kontinuität der weißen Substanz im oberen und unteren Rückenmark erhalten bleibt. Maßstab: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zervikale Rückenmarksverletzung, koronale HE-gefärbte Abschnitte. (A-C) Die Verletzung betrifft in erster Linie die graue Substanz, die den zentralen Strang umgibt, wie in den Tafeln B und C zu sehen ist. Die Gruppe mit schweren Verletzungen leidet unter einem größeren Schadensspektrum als die Gruppe mit leichten Verletzungen, die mit größerer Wahrscheinlichkeit die weiße Substanz betreffen. Maßstab: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: NF-200 koronale Immunfluoreszenz nach Verletzungen. NF-200-Reaktion ohne signifikanten Unterschied in der Kontur der weißen Substanz. Maßstab: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Preußischblaue Färbung. (A-C) Hämosiderose wurde in der schweren, aber nicht in der milden Gruppe beobachtet. Maßstab: 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Sagittale GFAP- und Iba-1-Immunfluoreszenz nach Verletzungen. (A-C) Mit zunehmendem Verletzungsgrad nimmt auch die Fläche der GFAP- und Iba-1-Antwort zu. Maßstab: 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Sagittale MRT nach zervikaler Rückenmarksverletzung (T2-gewichtete Bilder). Die Verletzungsregion wurde in den Gruppen mit leichten und schweren Verletzungen als hypointenses Signal beobachtet, mit einem signifikant breiteren Bereich des hypointensen Signals in der Gruppe mit schweren Verletzungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Von den zahlreichen Arten von Rückenmarksverletzungen ist CCS eine der potenziell am besten behandelbaren Verletzungsarten 3,4. Aufgrund des Mangels an Laborforschungsmodellen konzentrierte sich die CCS-Forschung ab den 1950er Jahren auf klinische Studien und Leichenpräparationsuntersuchungen 3,16,17. Die vorliegende Studie zeigt, wie kompatible Werkzeuge und minimalinvasive Verfahren verwendet werden, um das CCS-Modell von Mäusen zu etablieren. Aus technischer Sicht verfügt diese Plattform über eine starke Bedienbarkeit und gute Reproduzierbarkeit. Angesichts der Tatsache, dass die Ergebnisse des Experiments die Validität belegen, ist unsere Technik zur Etablierung des Modells, das dem Standard, den frühere Studien für CCS4 definiert haben, am nächsten kommt.
In früheren Studien zu Kompressionsverletzungen wurden hauptsächlich Aneurysma-Clips, Ballons und kalibrierte Pinzetten verwendet 9,10,18. Darüber hinaus traten die meisten Verletzungen auf der Ebene des thorakalen Rückenmarksauf 18. Das Rückenmark auf C6-Ebene wurde in dieser Studie als verletztes Segment ausgewählt, um die Charakteristika von CCS zu untersuchen. Es ist erwähnenswert, dass die Überlebensrate des CCS-Modells auch ein wesentlicher Faktor für die Gewährleistung der experimentellen Konsistenz ist. Die vorliegende Studie berichtet von einer bilateralen Kompressionsverletzung des zervikalen Rückenmarks der Maus, während eine traumatische Verletzung des Rückenmarks auf hohem Niveau, insbesondere bilaterale Verletzungen, für Versuchstiere tödlich sein kann, wenn sie zu schwerwiegend ist. Laut El-Bothy ist es wahrscheinlicher, dass das C4/5-Rückenmark den absteigenden bulbospinalen Trakt und die respiratorischen Motoneuronen beeinflusst, was bei Versuchstieren zu Atemdepression und Tod führt 18,19,20,21,22,23., In dieser Studie wiesen Mäuse mit unterschiedlichen Kompressionsgraden am zervikalen Rückenmark C6 signifikant differenzierte Verletzungsmerkmale auf, die auf histologische Untersuchungen. Obwohl es signifikante Verhaltens- und histologische Unterschiede in dem von Forgione berichteten Modell der zervikalen Rückenmarksklemmung der Maus gab, war eine Störung der Pedikel, der Gelenkfortsätze, der Lamina und sogar der Nervenwurzeln erforderlich, um das Rückenmark mit den modifizierten Klemmen zu klemmen, was einen signifikanten Einfluss auf die Stabilität der zervikalen Strukturen hatte24. Eine weitere Studie über zervikale Verletzungen berichtete über die Verwendung des Querfortsatzes als Fixationsstelle5. Auch wenn die Gelenkfortsätze nicht geschädigt werden konnten, konnte ein übermuskulärer Gewebeabbau ebenfalls zu einer Beeinträchtigung der Stabilität des Rückenmarks führen. In der vorliegenden Studie wurde nur die 6. zervikale Lamina reseziert, um die Stabilität des zervikalen Rückenmarks zu erhalten, wobei die angrenzenden Gelenke erhalten blieben und übermäßige Muskelschäden vermieden wurden. Gleichzeitig verhindert die Kompression von oberhalb des Rückenmarks eine Schädigung der Nervenwurzeln.
Die HE-Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Bereich der Schädigung des zervikalen Rückenmarks der Mäuse in jeder Gruppe hauptsächlich in der grauen Substanz in der Nähe des zentralen Rückenmarks lag, was CCS charakterisierte, mit signifikanten Unterschieden im Umfang der Verletzung zwischen den verschiedenen Gruppen. Bemerkenswert ist, dass die pathologischen Schnitte, die wir zeigten, die Manifestation der Verletzung gelindert haben könnten, da die Proben einige Tage nach der Verletzung entnommen wurden. Die Immunfluoreszenz (NF-200) zeigte eine geringere Schädigung der Nervenbahnen in der Region der weißen Substanz des Rückenmarks, was auch bestätigte, dass sich die Schädigung bei CCS hauptsächlich auf das zentrale Rückenmark konzentrierte. Das Immunfluoreszenzergebnis wurde durch frühere histologische Ergebnisse der Pathologie verstärkt. Frühere Studien haben gezeigt, dass CCS zu Ödemen in der Nähe des zentralen Rückenmarks führt, die zu Hämatomen und schließlich zu Funktionsstörungen im medialen Teil des lateralen kortikospinalen Trakts führen3. Blutungen wurden als typische Komponente des CCS beschrieben, werden aber in nachfolgenden Bildgebungs- und Autopsiestudien selten beobachtet17. In dieser Studie deuteten die HE-Ergebnisse 7 Tage nach der Verletzung auf Anzeichen eines Gewebeödems in allen Gruppen hin; Es wurden jedoch keine verbleibenden roten Blutkörperchen im Verletzungsbereich gefunden. Daher wurde Preußischblau verwendet, um den Verletzungsbereich auf Blutungen zu untersuchen, und die Ergebnisse entsprachen der Hämosiderose, die im Verletzungsbereich der Gruppe mit schweren Verletzungen 7 Tage nach der Verletzung beobachtet wurde, während dies in der Gruppe mit leichten Verletzungen nicht der Fall war. MRT-T2-Bilder zeigten, dass sowohl leichte als auch schwere Verletzungen 7 Tage nach der Verletzung niedrige Signalbereiche im geschädigten Bereich der Verletzung aufwiesen. Dies deutet hier auf die Ablagerung von Retikulozytenlysat hin. Diese Ergebnisse liefern Indizien dafür, dass die Diskrepanz zwischen den zuvor berichteten Befunden wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass der MRT-Test potenziell sensitiver ist als der histologische Test14, zusätzlich zur Schwere der Verletzung, die auch das Ausmaß der Blutung im Verletzungsbereich beeinflussen kann. GFAP wurde auch im geschädigten Bereich großflächig exprimiert. Gleichzeitig wurde die Iba-1-Expression auch in intakten Bereichen beobachtet, was auf die Persistenz einer Entzündungsreaktion hindeutet, die mit den MRT-Ergebnissen übereinstimmt, wobei ein Ring aus hyperintensen Signalen um den hypointensen Signalbereich in der Läsion auf das Vorhandensein einer Entzündungsreaktion hindeutet. Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Studie wurde der Verletzungsbereich im Modell auf die graue Substanz um den zentralen Strang konzentriert, was im Allgemeinen mit den zuvor berichteten Beschreibungen übereinstimmt13. Leider haben wir nicht bei jedem Versuchstier eine MRT wiederholt durchgeführt, um zu zeigen, wie sich die Verletzungsstelle mit der Zeit dynamisch verändert. Zukünftige Forscher können dies in ihre Arbeit einbeziehen, um CCS besser zu untersuchen. Auch die Immunmarkierung mit neuronalen Markern wie NeuN, die die graue Substanz definieren, kann in die Studie einbezogen werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Charakteristika der Befunde in der Pathologie und in MRT-Scans große Ähnlichkeiten mit denen aufweisen, die in früheren Studien für CCS beschrieben wurden4. Das vorliegende Protokoll, das CCS modelliert, ermöglicht die weitere Erforschung und das Verständnis von CCS.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Project of Stem Cell and Transformation Research (2019YFA0112100) und dem State Key Program of National Natural Science of China (81930070) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | Abcam | ab8135 | Dilution ratio (1:2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | Biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | ||
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | Leica | ||
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1:600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1:1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1:1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Phosphate buffered solution (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| Prussian Blue Iron Stain Kit (With Eosin) | Solarbio | G1424 | |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| Tris Buffered Saline+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1:19) |
| Xylene | Fuyu Reagent |
References
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223 (2020).
- Brooks, N. P.
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J.
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832 (2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381 (2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H.
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538 (2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305 (2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283 (2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604 (2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604 (2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751 (2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
