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Biology

वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में रासायनिक विषाक्तता का आकलन

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/65029
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 3, 4, 5, 1, 1
1Department of Biology, Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology, Indiana University, 3School of Biosciences, University of Birmingham, 4O'Neill School of Public and Environmental Affairs, Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एक कुशल और सस्ती विधि का वर्णन करता है जो वयस्क ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की व्यवहार्यता पर रासायनिक विषाक्त पदार्थों के प्रभावों का आकलन करने के लिए तरल मीडिया का उपयोग करता है।

Abstract

मानव उद्योग सैकड़ों हजारों रसायनों को उत्पन्न करते हैं, जिनमें से कई को पर्यावरणीय सुरक्षा या मानव स्वास्थ्य पर प्रभाव के लिए पर्याप्त रूप से अध्ययन नहीं किया गया है। रासायनिक सुरक्षा जानकारी की यह कमी स्तनधारियों में वर्तमान परीक्षण विधियों से बढ़ जाती है जो महंगी, श्रम-गहन और समय लेने वाली हैं। हाल ही में, वैज्ञानिक और नियामक रासायनिक सुरक्षा परीक्षण के लिए नई दृष्टिकोण पद्धतियों (एनएएम) को विकसित करने के लिए काम कर रहे हैं जो सस्ता, अधिक तेजी से और पशु पीड़ा को कम करते हैं। उभरने वाले प्रमुख एनएएम में से एक स्तनधारी मॉडल के प्रतिस्थापन के रूप में अकशेरुकी जीवों का उपयोग है ताकि मनुष्यों सहित दूर से संबंधित प्रजातियों में कार्रवाई के संरक्षित रासायनिक तरीकों को स्पष्ट किया जा सके। इन प्रयासों को आगे बढ़ाने के लिए, यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो रासायनिक सुरक्षा का आकलन करने के लिए फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल उजागर वयस्क मक्खियों की व्यवहार्यता और भोजन व्यवहार को मापने के लिए एक सरल, तेज और सस्ती प्रक्रिया का वर्णन करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को जीनोमिक और मेटाबोलिक दृष्टिकोण के लिए नमूने उत्पन्न करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल सटीक विष विज्ञान में उपयोग के लिए एक मानक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला को स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है।

Introduction

मनुष्य लगातार विभिन्न स्रोतों से रसायनों के संपर्क में आते हैं, जिनमें हवा1, भोजन2, पानी3,4, दवाएं5, सफाई एजेंट6, व्यक्तिगत देखभाल उत्पाद 7, औद्योगिक रसायन 7, और निर्माण सामग्री 7 शामिल हैं। इसके अलावा,हर साल हजारों नए रसायनों को पेश किया जाता है, जिनमें से कई स्वास्थ्य और पर्यावरण सुरक्षा के लिए ठीक से जांच नहीं की जाती हैं। पर्याप्त रासायनिक सुरक्षा परीक्षण की यह कमी चूहों और चूहों जैसे स्तनधारी मॉडल पर अधिक निर्भरता से उपजी है। जबकि ऐसे कृंतक मॉडल जानकारीपूर्ण हैं, इन प्रणालियों में रासायनिक सुरक्षा परीक्षण महंगा, समय लेने वाला है, और अक्सर परीक्षण पशु9 के लिए पीड़ा के अस्वीकार्य स्तर का कारण बनता है।

स्तनधारी रासायनिक सुरक्षा परीक्षण से जुड़े वित्तीय और नैतिक बोझ, साथ ही स्तनधारी अध्ययनों की समय लेने वाली प्रकृति, नए रसायनों के आसपास के डेटा की कमी के लिए प्रमुख योगदान कारक हैं। इस मुद्दे को हल करने के लिए, अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (ईपीए), यूरोपीय रसायन एजेंसी (ईसीएचए), स्वास्थ्य कनाडा और अन्य एजेंसियां उन उपायों को लागू कर रही हैं जो नियामक ढांचे10 में नई दृष्टिकोण पद्धतियों (एनएएम) को शामिल करते हैं, इस प्रकार उत्तरी अमेरिकी और यूरोपीय नीति को जानवरों के उपयोग को बदलने, कम करने और परिष्कृत करने के लिए अंतर्राष्ट्रीय लक्ष्यों के अनुरूप रखते हैं (3 आर प्रिंसिपल)11, 12,13,14. एनएएम में मुख्य रूप से इन विट्रो और सिलिको मॉडल पर आधारित विभिन्न प्रकार के परख शामिल हैं जो स्तनधारी परीक्षण प्रजातियों पर लगाए गए प्रतिकूलपरिस्थितियों को देखने के बजाय रासायनिक विषाक्तता की यंत्रवत समझ प्रदान करते हैं, जिससे रासायनिक जोखिम मूल्यांकन के लिए डेटा उत्पादन की दर बढ़ जाती है, जबकि अभी भी उच्च निष्ठा आउटपुट15 का उत्पादन होता है।. हालांकि, ये विधियां अभी तक प्रणालीगत विषाक्तता से बचाने के लिए साबित नहीं हुई हैं, जिसमें इंटरऑर्गन संचार और अंतःस्रावी सिग्नलिंग से जुड़ी महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं का विघटन शामिल है। इसके अलावा, वे विशिष्ट ऊतकों के भीतर रसायनों के जैव संचय, व्यक्तिगत यौगिकों को अवशोषित और स्रावित करने की क्षमता और व्यवहार और रासायनिक जोखिम के बीच परस्पर क्रिया के लिए जिम्मेदार नहीं हो सकते हैं।

इन विट्रो और कम्प्यूटेशनल मॉडल की सीमाओं के कारण, स्तनधारी मॉडल को कम करने या बदलने के लिए एनएएम के सफल उपयोग में विवो मॉडल में अकशेरुकी भी शामिल होना चाहिए, जैसे कि फ्रूट फ्लाई, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर। मक्खी में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यह जीव संरक्षित आनुवंशिक मार्गों का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है जो विषाक्त अणुओं 16,17,18,19,20,21,22 के खिलाफ पशु कोशिकाओं की रक्षा करते हैं। इसके अलावा, मक्खी मनुष्यों के लिए उल्लेखनीय आनुवंशिक समानता दिखाती है, जिसमें 65% से अधिक मानव रोगों 23,24,25 के लिए कार्यात्मक होमोलॉग और महत्वपूर्ण कार्यात्मक मार्गों का और भी अधिक संरक्षण शामिल है। ये विशेषताएं, उनके अपेक्षाकृत छोटे जीवन चक्र, कम रखरखाव लागत और आसानी से अवलोकन योग्य व्यवहार प्रतिक्रियाओं के साथ मिलकर, ड्रोसोफिला को एक विष विज्ञान मॉडल27,28,29,30 के रूप में उपयोग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल बनाती हैं। इसके अलावा, मक्खियों में कृंतक मॉडल की तुलना में बहुत अधिक थ्रूपुट होता है और चयापचय, शरीर विज्ञान और हार्मोन सिग्नलिंग पर प्रभाव पड़ता है जो अन्य गैर-जीव एनएएम9 द्वारा आसानी से पता लगाने योग्य नहीं होते हैं।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क ड्रोसोफिला पर रासायनिक जोखिम के प्रभावों के परीक्षण के लिए एक रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है। विधि को कुशल, सस्ती और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जबकि शोधकर्ताओं को परीक्षण रसायन के संपर्क में होना चाहिए और मेटाबोलॉमिक्स और अन्य ओमिक्स दृष्टिकोणों के लिए नमूना संग्रह को समायोजित करना चाहिए। प्रोटोकॉल को प्रति प्रयोग एक एकल रसायन के परीक्षण के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन आसानी से अन्य प्रयोगात्मक मापदंडों को समायोजित कर सकता है, जैसे कि विभिन्न सॉल्वैंट्स या रसायनों के संयोजन।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में सभी चरणों के लिए नाइट्राइल दस्ताने पहनें। प्रत्येक मूल्यांकन किए गए रसायन के लिए सुरक्षा डेटा शीट के अनुसार एक प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा और / या श्वासयंत्र पहनें।

1. शीशी और आर्द्रता कक्ष की तैयारी

नोट: चरण 1.1-1.5 अन्य प्रयोगात्मक अनुभागों को शुरू करने से पहले किसी भी समय पूरा किया जा सकता है। संदूषण को रोकने के लिए शीशी की तैयारी के दौरान नाइट्राइल दस्ताने हर समय पहने जाने चाहिए।

  1. ग्रेड 1 सेल्यूलोज क्रोमैटोग्राफी पेपर की चार शीट ्स को स्टैक करें ( सामग्री की तालिका देखें) और उन्हें चौड़ी स्ट्रिप्स में 2 में काट लें। फूल के आकार के फिल्टर पेपर को 1.5 इंच के पेपर पंच का उपयोग करके पंच करें जिसमें फूल के आकार का डाई होता है।
  2. फिल्टर पेपर को 28.5 मिमी व्यास पॉलीप्रोपाइलीन शीशी के तल तक धकेलने के लिए 22 मिमी x 220 मिमी अनवार्निश्ड लकड़ी के डोवेल का उपयोग करें। पुष्टि करें कि फिल्टर पेपर का ढेर सुरक्षित रूप से शीशी के तल पर स्थित है।
  3. तैयार शीशियों को प्लास्टिक या कार्डबोर्ड ट्रे में स्टोर करें और ट्रे को उपयोग तक बड़े (~ 280 मिमी x 240 मिमी) प्लास्टिक बैग में रखें।
  4. 606.24 मिमी x 225.42 मिमी x 403.22 मिमी प्लास्टिक टब के प्लास्टिक ढक्कन में 120 मिमी x 280 मिमी छेद काटकर एक आर्द्रता कक्ष का निर्माण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। वायु प्रवाह की अनुमति देने के लिए छेद पर गोंद जाल।
  5. चरण 1.4 में उपयोग किए जाने वाले प्लास्टिक टब के तल में फिट होने के लिए प्लास्टिक ग्रिड के एक हिस्से को लौवर छत प्रकाश पैनलों (मूल रूप से 610 मिमी x 1220 मिमी) से काटें।
    नोट: आर्द्रता कक्ष बनाने के लिए विभिन्न प्लास्टिक टब और प्लास्टिक / धातु ग्रिड सामग्री की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है।

2. फ्लाई हसबेंडरी

  1. मानक ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (बीडीएससी) मीडिया 31 युक्त कांच की दूध की बोतलों में वयस्क मक्खियों (न्यूनतम30 वयस्कों) की संस्कृतियों को शुरू करें। बोतलों को एक नाजुक टास्क वाइप में लपेटे गए रेयान प्लग के साथ बंद करें। बोतलों पर भीड़ न लगाएं।
    नोट: आवश्यक बोतलों की संख्या आयोजित किए जा रहे रासायनिक एक्सपोजर की संख्या और परीक्षण तनाव के जीनोटाइप पर निर्भर करती है। आम तौर पर, मजबूत और फेकुंड स्टॉक का उपयोग करते समय एक ही बोतल से कई सौ मक्खियों को प्राप्त किया जा सकता है। मानक परख ओरेगन-आर जंगली-प्रकार की मक्खियों (बीडीएससी स्टॉक # 2057) का उपयोग करती है, लेकिन इस प्रोटोकॉल के साथ रुचि के किसी भी जीनोटाइप (ओं) का उपयोग किया जा सकता है। याद रखें कि कम प्रजनन और / या व्यवहार्यता के साथ समझौता किए गए जीनोटाइप को बोतल संस्कृतियों में वृद्धि की आवश्यकता होती है।
  2. कल्चर बोतलों की ट्रे को लगभग 60% आर्द्रता और 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि तीसरा लार्वा इनस्टार या शुरुआती प्यूपल चरण नहीं देखा जाता है। यह चरण बोतल के किनारों पर घूमने वाले लार्वा की उपस्थिति और बोतल की दीवारों पर प्यूपे की उपस्थिति से पहचाना जाता है।
    नोट: केवल 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र की लाइट-ऑन अवधि के दौरान मक्खियों को संभालना। मजबूत स्टॉक के लिए, बोतलें वर्णित शर्तों के तहत 3-4 दिनों के बाद इस चरण में पहुंचती हैं।
    1. वयस्क मक्खियों को हटा दें और मीडिया की तरलता निर्धारित करें। यदि उल्टा होने पर मीडिया बोतल के किनारे बहता है, तो माध्यम बहुत तरल होता है। फ्लाई फूड को ठोस बनाने के लिए बोतल के तल में एक नाजुक टास्क वाइप या रेयान बॉल डालें।
  3. जब मक्खियां बंद होने लगती हैं, तो सभी वयस्कों को बोतलों से साफ करें और प्यूपे को 48 घंटे तक बंद करने की अनुमति दें। इस बिंदु पर, कल्चर बोतलों से साफ़ किए गए किसी भी वयस्क को स्टॉक का प्रचार करने के लिए या तो नई बोतलों में स्थानांतरित किया जा सकता है (चरण 2.1 देखें) या छोड़ दिया जा सकता है।
  4. 48 घंटे की अवधि में बंद होने वाली मक्खियों को मानक बीडीएससी मीडिया युक्त नई बोतलों में स्थानांतरित करें। उम्र 3 दिनों के लिए।
    नोट: इन बोतलों में वयस्क 3-5 दिन पुराने हैं और घातकता और खिलाने के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है। वयस्क मक्खियों को उम्र देने के लिए उपयोग की जाने वाली बोतलों में अंडे और लार्वा होंगे। नतीजतन, इन बोतलों का उपयोग मक्खियों की अगली पीढ़ी के प्रचार के लिए किया जा सकता है।

3. रासायनिक जोखिम के लिए मक्खियों की तैयारी

  1. सीओ2 के साथ 5-7 दिन की मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें। एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को उनके जननांग का उपयोग करके सेक्स द्वारा क्रमबद्ध करें। एनेस्थेटाइजिंग और सेक्सिंग मक्खियों के साथ सहायता के लिए, संदर्भ28 देखें।
  2. मानक बीडीएससी मीडिया युक्त शीशियों में 20 नर या 20 मादा मक्खियों के समूह रखें। शीशी को रेयान प्लग से बंद करें और नर और मादा शीशियों को अलग-अलग स्टोर करें। मादा मक्खियों वाली शीशियों को एक पट्टी के साथ चिह्नित करें। गलती से लिंगों के मिश्रण से बचने के लिए नर मक्खियों के साथ शीशियों को अचिह्नित छोड़ दें।
    नोट: चरण 3.2 में तैयार की जाने वाली शीशियों की संख्या एक्सपोज़र प्रयोगों के आकार से निर्धारित होती है। जैसा कि चरण 5.3 और 5.6 में वर्णित है, एकल परीक्षण रसायन के लिए एक विशिष्ट रेंज फाइंडिंग प्रयोग के लिए पुरुषों की न्यूनतम 40 शीशियों और महिलाओं की 40 शीशियों की आवश्यकता होती है। चरण 7.4 और 7.8 में वर्णित एक मानक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्रयोग के लिए पुरुषों की न्यूनतम 63 शीशियों और महिलाओं की 63 शीशियों की आवश्यकता होती है।
  3. शीशियों को 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 60% आर्द्रता पर और 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के साथ स्टोर करें। इस समय के दौरान, एनेस्थीसिया से उबरने के दौरान मक्खियों को भोजन में फंसने से रोकने के लिए छांटे गए शीशियों की ट्रे को 60 डिग्री कोण पर सहारा दें।
    नोट: यह कदम मक्खियों को सीओ2 संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति देता है। एक्सपोजर प्रोटोकॉल के शेष के दौरान मक्खियों को फिर से एनेस्थेटाइज न करें।
  4. 48 घंटे की वसूली अवधि के बाद, चरण 1.3 में तैयार शीशियों में 0.75 मिलीलीटर बाँझ शुद्ध पानी जोड़ें। इस चरण में तैयार शीशियों की संख्या चरण 3.2 में स्थापित शीशियों की संख्या के समान होनी चाहिए।
  5. चरण 3.2 से मक्खियों वाली कांच की शीशी को खोलकर, इसे तैयार प्लास्टिक की शीशी के मुंह में डालकर, और फिर एक बेंचटॉप के खिलाफ प्लास्टिक की शीशी के निचले हिस्से को टैप करके भुखमरी की शीशी में छांटे गए, लिंग-मिलान वाली मक्खियों को स्थानांतरित करें। प्लास्टिक की शीशी को सेल्यूलोज एसीटेट प्लग (आमतौर पर फ्लूग के रूप में जाना जाता है) के साथ बंद करें।
    1. इस स्थानांतरण में खोई गई किसी भी मक्खियों को रिकॉर्ड करें (बाद में प्रत्येक शीशी के लिए मक्खियों की शुरुआती संख्या के रिकॉर्ड में स्थानांतरित करें)।
    2. भुखमरी की शीशियों को चिह्नित करें जिसमें मादा मक्खियां होती हैं। गलती से लिंगों के मिश्रण से बचने के लिए नर मक्खियों के साथ शीशियों को अचिह्नित छोड़ दें।
  6. रात भर के जोखिम के लिए आर्द्रता कक्ष तैयार करें। इस कक्ष को बनाने के तरीके के विवरण के लिए चरण 1.4-1.5 देखें।
    1. आर्द्रता कक्ष के तल में छह मानक पेपर तौलिए रखें। पेपर तौलिए को 100 मिलीलीटर पानी के साथ भिगोदें।
    2. गीले तौलिए के ऊपर प्लास्टिक ग्रिड (चरण 1.5) रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि शीशियां संतृप्त पेपर तौलिए के संपर्क में न आएं।
  7. भुखमरी की शीशियों की ट्रे को आर्द्रता कक्षों के भीतर एक क्षैतिज स्थिति में रखें। आर्द्रता कक्षों को रात भर 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (लगभग 60% आर्द्रता पर) में रखें।
    नोट: आदर्श रूप से, रात भर भुखमरी की अवधि लगभग 16 घंटे तक रहती है; हालांकि, समय को अलग-अलग प्रयोगशाला कार्यक्रमों के लिए समायोजित किया जा सकता है।

4. स्टॉक समाधान की तैयारी

नोट: मक्खियों को खमीर-सुक्रोज तरल मीडिया में परीक्षण रसायन खिलाया जाता है। यह खंड केंद्रित फीडिंग मीडिया और परीक्षण रसायनों के स्टॉक समाधान तैयार करने का वर्णन करता है।

  1. बाँझ शुद्ध पानी में घुलने वाला 4x खमीर-सुक्रोज घोल तैयार करें जिसमें 16% सुक्रोज और 6% खमीर अर्क (m/v) ( सामग्री की तालिका देखें) शामिल है। उचित नसबंदी समय के लिए तरल चक्र पर समाधान को आटोक्लेव करें (उदाहरण के लिए, 1 एल के लिए 40 मिनट)।
    नोट: समाधान थोक में बनाया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में संग्रहीत किया जा सकता है। उपयोग से 1 दिन पहले अलग-अलग एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखकर पिघलाएं।
  2. परीक्षण रसायन का एक स्टॉक तैयार करें। प्रारंभिक प्रयोग के लिए, स्टॉक समाधान उच्चतम सांद्रता पर बनाया जाना चाहिए ताकि रसायन को पानी में पूरी तरह से भंग किया जा सके।
    नोट: परीक्षण रसायन को भंग करने के लिए पानी के अलावा अन्य सॉल्वैंट्स का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करने के लिए चेतावनी के बारे में चर्चा देखें।
  3. 10 एमएल बाँझ शुद्ध पानी में 1 ग्राम एफडी&सी ब्लू नंबर 1 ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलकर 100x ब्लू डाई स्टॉक समाधान तैयार करें।
    नोट: ब्लू डाई स्टॉक समाधान थोक में बनाया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट में संग्रहीत किया जा सकता है।

5. एक्सपोजर शीशियों की तैयारी: रेंज फाइंडिंग प्रयोग

नोट: प्रोटोकॉल के चरण 5 और 6 को परीक्षण रसायन की सबसे कम खुराक की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो 100% घातकता को प्रेरित करता है और उच्चतम खुराक जो घातक फेनोटाइप को प्रेरित करने में विफल रहता है। यदि ये सांद्रता पहले से ही पिछले प्रयोग द्वारा निर्धारित की जाती हैं, तो खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की गणना के लिए चरण 7 और 8 देखें। एक्सपोजर शीशियों में मक्खियों को जोड़ने से पहले एक्सपोजर मीडिया को तुरंत तैयार किया जाना चाहिए।

  1. आठ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को निम्नानुसार लेबल करें: (i) कोई रसायन नहीं, (ii) उच्चतम सांद्रता, (iii) 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200, और 1: 1,000।
  2. सभी आठ लेबल ट्यूबों में 2.5 एमएल 4x खमीर / सुक्रोज स्टॉक समाधान जोड़कर चरण 5.1 से लेबल किए गए सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक्सपोजर मीडिया तैयार करें।
    1. "कोई रसायन नहीं" लेबल वाली ट्यूब में 7.5 मिलीलीटर बाँझ शुद्ध पानी जोड़ें। यह कमजोर पड़ने नकारात्मक नियंत्रण है।
    2. "उच्चतम एकाग्रता" लेबल ट्यूब में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान के 7.4 एमएल जोड़ें। इस ट्यूब में बाँझ शुद्ध पानी के 100 μL जोड़ें, इसलिए अंतिम मात्रा 10 एमएल है। इस समाधान में परीक्षण रसायन की दाढ़ता की गणना और रिकॉर्ड करें।
      नोट: ट्यूब में बाँझ शुद्ध पानी के 100 μL को जोड़ने से यह सुनिश्चित होता है कि इस चरण में रासायनिक एकाग्रता चरण 5.5 में उपयोग की जाने वाली के समान है, जहां भोजन व्यवहार का आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में एक्सपोजर मीडिया में एक ब्लू डाई स्टॉक समाधान जोड़ा जाता है।
    3. शेष ट्यूबों में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान और बाँझ शुद्ध पानी की उचित मात्रा जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब की अंतिम मात्रा 10 एमएल होनी चाहिए। "उच्चतम एकाग्रता" ट्यूब के सापेक्ष इन ट्यूबों में परीक्षण रसायनों की अंतिम एकाग्रता 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 और 1: 1, 000 होनी चाहिए।
  3. चरण 5.1 में उत्पन्न एक्सपोजर मीडिया की प्रत्येक व्यक्तिगत एकाग्रता के लिए आठ एक्सपोज़र शीशियों को तैयार करें और लेबल करें। शीशियों के आठ सेट (कुल 64 शीशियां) होने चाहिए जिनमें निम्नलिखित लेबल हों: कोई रासायनिक नहीं, उच्चतम एकाग्रता, 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200, और 1: 1,000।
    1. एक्सपोजर शीशियों के संबंधित सेट में चरण 5.2.3 में तैयार किए गए 0.75 एमएल एक्सपोजर मीडिया।
  4. आठ 5 एमएल अलग-अलग ट्यूबों को निम्नानुसार लेबल करें: (i) कोई रसायन नहीं, (ii) उच्चतम सांद्रता, (iii) 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200, और 1: 1,000।
  5. सुक्रोज स्टॉक समाधान के 500 μL और आठ लेबल 5 एमएल ट्यूबों में 20 μL ब्लू डाई स्टॉक समाधान को मिलाकर ब्लू डाई एक्सपोजर मीडिया तैयार करें।
    1. "कोई रसायन नहीं" लेबल ट्यूब में 1.48 मिलीलीटर बाँझ शुद्ध पानी जोड़ें। यह कमजोर पड़ने नकारात्मक नियंत्रण है।
    2. "उच्चतम एकाग्रता" लेबल ट्यूब में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान के 1.48 एमएल जोड़ें। इस ट्यूब में कोई पानी नहीं मिलाया जाता है। इस समाधान में परीक्षण रसायन की दाढ़ता की गणना और रिकॉर्ड करें।
    3. शेष ट्यूबों में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान और बाँझ शुद्ध पानी की उचित मात्रा जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब की अंतिम मात्रा 2 मिलीलीटर होनी चाहिए। "उच्चतम एकाग्रता" ट्यूब के सापेक्ष इन ट्यूबों में परीक्षण रसायन की अंतिम एकाग्रता 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 और 1: 1, 000 होनी चाहिए।
  6. ब्लू एक्सपोजर मीडिया की प्रत्येक व्यक्तिगत एकाग्रता के साथ दो एक्सपोज़र शीशियों को तैयार करें और लेबल करें। शीशियों के आठ सेट (कुल 16 शीशियां) होने चाहिए जिनमें निम्नलिखित लेबल हों: कोई रासायनिक, उच्चतम एकाग्रता, 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200, और 1: 1,000। इन शीशियों पर "नीला" शब्द भी लिखा जाना चाहिए।
    1. नीले एक्सपोजर शीशियों के संबंधित सेट में नीले एक्सपोजर मीडिया के पिपेट 0.75 मिलीलीटर है।

6. फ्लाई केमिकल एक्सपोजर: रेंज फाइंडिंग एक्सपेरिमेंट

  1. चरण 3.7 से रात भर भूखे मक्खियों की शीशियों का उपयोग करके रासायनिक एक्सपोजर शीशियां तैयार करें:
    1. भूखे मादा मक्खियों की चार शीशियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) को प्रत्येक रासायनिक एकाग्रता के चार एक्सपोजर शीशियों में स्थानांतरित करें। इन शीशियों को "महिला" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
    2. भूखे नर मक्खियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) की चार शीशियों को प्रत्येक रासायनिक सांद्रता के चार एक्सपोजर शीशियों में स्थानांतरित करें। इन शीशियों को "पुरुष" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
  2. चरण 3.7 से रात भर भूखे मक्खियों की शीशियों का उपयोग करके नीली डाई युक्त रासायनिक एक्सपोजर शीशियां तैयार करें:
    1. प्रत्येक रासायनिक सांद्रता के लिए भूखे मादा मक्खियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) की एक शीशी को एक नीले रंग की एक्सपोज़र शीशी में स्थानांतरित करें। इस शीशी को "महिला" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
    2. भूखे नर मक्खियों की एक शीशी (प्रति शीशी 20 मक्खियों) को प्रत्येक रासायनिक एकाग्रता के लिए एक नीले जोखिम की शीशी में स्थानांतरित करें। इस शीशी को "पुरुष" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
  3. स्थानांतरण के बाद प्रत्येक शीशी में मौजूद मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड करें और मरने या भागने वाली संख्या को नोट करें। आम तौर पर, सभी 20 मक्खियों को रात भर भुखमरी और स्थानांतरण से बचना चाहिए।
  4. एक्सपोजर शीशियों को ताजा तैयार आर्द्रता कक्षों में क्षैतिज रूप से रखें (आर्द्रता कक्ष की तैयारी के लिए चरण 3.6 देखें)। कक्षों को लगभग 60% आर्द्रता और 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  5. रासायनिक एक्सपोजर की शुरुआत के बाद 24 और 48 घंटे में एक्सपोजर शीशियों की जांच करें। प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक शीशी में मृत मक्खियों की संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।
    नोट: इस परख के लिए रीडआउट के रूप में मृत्यु का उपयोग किया जाता है, लेकिन प्रोटोकॉल को अन्य फेनोटाइप्स की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उजागर मक्खियों को आमतौर पर ट्रांसक्रिप्टोमिक और मेटाबोलिक अध्ययन के लिए इन समय बिंदुओं पर एकत्र किया जाता है।
  6. रासायनिक एक्सपोजर की शुरुआत के बाद 24 घंटे में नीले एक्सपोजर शीशियों की जांच करें। यह निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित तकनीकों का उपयोग करें कि क्या उजागर मक्खियों ने नीले जोखिम मीडिया का सेवन किया है:
    1. नीले मल के संकेतों के लिए शीशी की दीवारों की जांच करें, जो एक्सपोजर शीशी के साथ-साथ फ्लूग पर छोटे बिंदुओं के रूप में दिखाई देते हैं।
    2. सीओ2 के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और नीली डाई की उपस्थिति के लिए पेट की जांच करें।
      नोट: आम तौर पर, 24 घंटे के बाद नीले जोखिम शीशियों का विश्लेषण किया जाता है। हालांकि, यह चरण इसके बजाय 48 घंटे पर किया जा सकता है। जिन मक्खियों ने सामान्य रूप से खाया है, उनके पेट के माध्यम से एक नीली पट्टी होती है, यह दर्शाता है कि एक्सपोजर मीडिया आंत में प्रवेश कर गया है।
    3. असामान्य भोजन व्यवहार के लिए मक्खियों की जांच करें, जैसे कि पुनरुत्थान, फसल विघटन, और आंतों के अवरोध समारोह का टूटना (जीआई पथ तक सीमित होने के बजाय पूरे जीव में नीली डाई की उपस्थिति से संकेत मिलता है, जिसे आमतौर पर स्मर्फिंग32,33 के रूप में जाना जाता है)।
  7. सभी दूषित शीशियों, फिल्टर पेपर, फ्लूग्स और मक्खियों को उचित रासायनिक अपशिष्ट कंटेनरों में फेंक दें। यदि जीवित मक्खियां शीशियों में रहती हैं, तो उन्हें उचित अपशिष्ट कंटेनर में फेंकने से पहले मक्खियों को मारने के लिए शीशियों को फ्रीज करें।
    नोट: एक्सपोज़र शीशियों और मक्खियों का निपटान प्रयोग में विश्लेषण किए जा रहे रसायन (ओं) द्वारा निर्धारित किया जाता है। हमेशा रासायनिक सुरक्षा डेटा शीट पर उल्लिखित रासायनिक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें। यदि रेंज फाइंडिंग प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सांद्रता सबसे कम खुराक पर मक्खियों को मारती है, तो कमजोर पड़ने की श्रृंखला का उपयोग करके अनुभाग 6 को दोहराएं, जिसकी शुरुआत सबसे कम सांद्रता से होती है जो 100% जानवरों को मारती है।

7. एक्सपोज़र शीशियों की तैयारी: खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करना

नोट: चरण 5 और 6 में उल्लिखित प्रोटोकॉल को मोटे तौर पर फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए आवश्यक रासायनिक एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल के चरण 7 और 8 का उपयोग सटीक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की गणना करने के लिए किया जाता है।

  1. परीक्षण रासायनिक सांद्रता की गणना करें जिसे निम्नलिखित विधि का उपयोग करके खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए:
    1. परीक्षण रसायन की सबसे कम सांद्रता निर्धारित करें जो 48 घंटे में 100% उजागर मक्खियों को मारता है।
    2. परीक्षण रसायन की उच्चतम सांद्रता निर्धारित करें जिसका 48 घंटे पर व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।
    3. एक अतिरिक्त चार सांद्रता की गणना करें जो चरण 7.1.1 और 7.1.2 में निर्धारित सांद्रता के बीच समान रूप से वितरित की जाती हैं।
  2. निम्नलिखित सांद्रता के दाढ़ के साथ नौ अलग-अलग 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को लेबल करें: (i) कोई रासायनिक नहीं, (ii) चरण 7.1.1 में निर्धारित एकाग्रता, (iii) चरण 7.1.2 में निर्धारित एकाग्रता, (iv) 7.1.3 में निर्धारित सांद्रता, (v) चरण 7.1.1 में निर्धारित एकाग्रता का दोगुना, (vi) चरण 7.1.2 में निर्धारित एकाग्रता का 1:2 कमजोर होना।
    नोट: खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की सटीक गणना के लिए 7.1.1 में निर्धारित सांद्रता से दोगुनी सांद्रता और चरण 7.1.2 में निर्धारित 1: 2 कमजोर पड़ने वाली सांद्रता को शामिल करना महत्वपूर्ण है।
  3. चरण 7.2 में तैयार किए गए नौ लेबल वाले व्यक्तिगत 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2.5 एमएल 4एक्स खमीर / सुक्रोज स्टॉक समाधान जोड़कर एक्सपोजर मीडिया तैयार करें।
    1. "कोई रसायन नहीं" लेबल वाली ट्यूब में 7.5 मिलीलीटर बाँझ शुद्ध पानी जोड़ें। यह कमजोर पड़ने नकारात्मक नियंत्रण है।
    2. शेष ट्यूबों में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान और बाँझ शुद्ध पानी की उचित मात्रा जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब की अंतिम मात्रा 10 एमएल होनी चाहिए। एक व्यक्तिगत ट्यूब के भीतर रसायन की अंतिम एकाग्रता ट्यूब के बाहर लिखे गए के बराबर होनी चाहिए।
  4. चरण 7.2 में उत्पन्न एक्सपोजर मीडिया की प्रत्येक एकाग्रता के लिए 12 एक्सपोजर शीशियां तैयार करें और लेबल करें। शीशियों के नौ सेट (कुल 108 शीशियां) होनी चाहिए।
  5. एक्सपोजर शीशियों के संबंधित सेट में 0.75 एमएल एक्सपोजर मीडिया का पाइपेट।
    नोट: चरण 7.6 से 7.8 वैकल्पिक हैं। यदि चरण 7.2 में तैयार परीक्षण रासायनिक सांद्रता को भोजन व्यवहार को प्रभावित नहीं करने के लिए जाना जाता है, तो इन चरणों को छोड़ा जा सकता है।
  6. चरण 7.2 में उपयोग की जाने वाली सांद्रता की एक ही श्रृंखला के साथ ब्लू एक्सपोजर मीडिया के लिए नौ अलग-अलग 5 एमएल ट्यूब तैयार करें और लेबल करें।
  7. सुक्रोज स्टॉक समाधान के 500 μL और ब्लू डाई स्टॉक समाधान के 20 μL मिश्रण करके ब्लू डाई एक्सपोजर मीडिया तैयार करें।
    1. "कोई रसायन नहीं" लेबल ट्यूब में 1.48 मिलीलीटर शुद्ध बाँझ पानी जोड़ें। यह कमजोर पड़ने नकारात्मक नियंत्रण है।
    2. शेष ट्यूबों में परीक्षण रासायनिक स्टॉक समाधान और शुद्ध बाँझ पानी की उचित मात्रा जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब की अंतिम मात्रा 2 एमएल होनी चाहिए। एक व्यक्तिगत ट्यूब के भीतर रसायन की अंतिम एकाग्रता ट्यूब के बाहर लिखे गए के बराबर होनी चाहिए।
  8. ब्लू एक्सपोजर मीडिया की प्रत्येक व्यक्तिगत एकाग्रता के लिए दो एक्सपोज़र शीशियां तैयार करें और लेबल करें। शीशियों के नौ सेट (कुल 18 शीशियां) होनी चाहिए, जिसमें शीशियों के प्रत्येक सेट को चरण 7.2 में सूचीबद्ध सांद्रता के साथ लेबल किया जाना चाहिए। इन शीशियों पर "नीला" शब्द भी लिखा जाना चाहिए।
    1. नीले एक्सपोजर शीशियों के संबंधित सेट में नीले एक्सपोजर मीडिया के पिपेट 0.75 मिलीलीटर है।

8. फ्लाई केमिकल एक्सपोजर: खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करना।

  1. चरण 3.7 से रात भर भूखे मक्खियों की शीशियों का उपयोग करके रासायनिक एक्सपोजर शीशियां तैयार करें:
    1. भूखे मादा मक्खियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) की छह शीशियों को प्रत्येक रासायनिक सांद्रता के छह एक्सपोजर शीशियों में स्थानांतरित करें। इन शीशियों को "महिला" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
    2. भूखे नर मक्खियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) की छह शीशियों को प्रत्येक रासायनिक एकाग्रता के छह एक्सपोजर शीशियों में स्थानांतरित करें। इन शीशियों को "पुरुष" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
  2. चरण 3.7 से रात भर भूखे मक्खियों की शीशियों का उपयोग करके नीली डाई युक्त रासायनिक एक्सपोजर शीशियां तैयार करें:
    1. प्रत्येक रासायनिक सांद्रता के लिए भूखे मादा मक्खियों (प्रति शीशी 20 मक्खियों) की एक शीशी को एक नीले रंग की एक्सपोज़र शीशी में स्थानांतरित करें। इस शीशी को "महिला" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
    2. भूखे नर मक्खियों (बीस मक्खियों प्रति शीशी) की एक शीशी को प्रत्येक रासायनिक एकाग्रता के लिए एक नीले जोखिम शीशी में स्थानांतरित करें। इस शीशी को "पुरुष" लेबल करें। चरण 3.5 में वर्णित समान स्थानांतरण विधि का उपयोग करें।
  3. स्थानांतरण के बाद प्रत्येक शीशी में मौजूद मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड करें। आम तौर पर, सभी 20 मक्खियों को रात भर भुखमरी और स्थानांतरण से बचना चाहिए, लेकिन सुनिश्चित करें कि स्थानांतरण के दौरान मरने या भागने वाली किसी भी मक्खियों को कुल में से घटाया जाए।
  4. एक्सपोजर शीशियों को ताजा तैयार आर्द्रता कक्षों में क्षैतिज रूप से रखें (आर्द्रता कक्ष की तैयारी के लिए चरण 3.6 देखें)। कक्षों को लगभग 60% आर्द्रता और 12:12 घंटे प्रकाश: अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  5. रासायनिक एक्सपोजर की शुरुआत के बाद 24 और 48 घंटे में एक्सपोजर शीशियों की जांच करें। प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक शीशी में मृत मक्खियों की संख्या की गणना और रिकॉर्ड करें।
  6. रासायनिक एक्सपोजर की शुरुआत के बाद 24 घंटे में नीले एक्सपोजर शीशियों की जांच करें। भोजन व्यवहार में परिवर्तन का आकलन करने के लिए चरण 6.6 में उल्लिखित विधि का उपयोग करें।
  7. सभी दूषित शीशियों, फिल्टर पेपर, फ्लूग्स और मक्खियों को उचित रासायनिक अपशिष्ट कंटेनरों में फेंक दें। यदि जीवित मक्खियां शीशियों में रहती हैं, तो उचित अपशिष्ट कंटेनर में फेंकने से पहले मक्खियों को मारने के लिए शीशियों को फ्रीज करें।
    नोट: एक्सपोज़र शीशियों और मक्खियों का निपटान प्रयोग में विश्लेषण किए जा रहे रसायन (ओं) द्वारा निर्धारित किया जाता है। हमेशा रासायनिक सुरक्षा डेटा शीट पर उल्लिखित रासायनिक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।

9. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की गणना

  1. डेटा34 का विश्लेषण करने के लिए बेंचमार्क खुराक सॉफ्टवेयर (BMDS, संस्करण 3.2; सामग्री की तालिका देखें) या अन्य समान सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। निम्न BMDS सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।
  2. बीएमडीएस के डेटा टैब पर क्लिक करें और नया डेटा सेट डालें पर क्लिक करें। डेटासेट में नमूनों की संख्या इनपुट करें, डिकोटोमस पर क्लिक करें, और फिर डेटासेट बनाएं पर क्लिक करें। डेटासेट में प्रत्येक प्रतिकृति को एक व्यक्तिगत पंक्ति के रूप में दर्ज करें।
  3. उत्पन्न तालिका के पहले कॉलम में खुराक इनपुट करें, दूसरे कॉलम में किसी भी मक्खियों को छोड़कर मक्खियों की शुरुआती संख्या जो चरण 8.3 से पहले मर गई या खो गई थी) और तीसरे कॉलम में रासायनिक जोखिम से मरने वाली मक्खियों की संख्या।
  4. BMDS के मुख्य टैब पर क्लिक करें।
  5. मॉडल प्रकार का चयन करें मेनू के लिए ड्रॉप-डाउन तीर पर क्लिक करें और डिकोटोमस पर क्लिक करें।
  6. डेटा सेट तालिका में चरण 9.2 से डेटासेट के लिए सक्षम करें पर क्लिक करें।
  7. एमएलई और वैकल्पिक तालिका में विश्लेषण के लिए वांछित मॉडल के लिए बक्से पर क्लिक करें।
    नोट: फ्रिक्वेंटिस्ट प्रतिबंधित डिकोटोमस हिल मॉडल मुख्य रूप से उपयोग किया गया था।
  8. रन विश्लेषण पर क्लिक करें। कार्यक्रम घातकता वक्र (ओं) और मॉडल (ओं) के बारे में अतिरिक्त विवरण के साथ एक आउटपुट फ़ाइल उत्पन्न करेगा।

Representative Results

मक्खी ने लंबे समय से सोडियम आर्सेनाइट (NaASO2) विषाक्तता35,36,37,38 को निर्धारित करने के लिए अध्ययन में एक मॉडल के रूप में कार्य किया है। प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए, नर और मादा मक्खियों को एनएएएसओ2 के संपर्क में लाया गया था, इन परिणामों की तुलना पहले के अध्ययनों के साथ करने के लक्ष्य के साथ। ऊपर वर्णित पद्धति का उपयोग करते हुए, वयस्क ओरेगन-आर (बीडीएससी स्टॉक # 2057) पुरुषों और महिलाओं को एनएएएसओ 2 सांद्रता (0, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2, 1, और2 एमएम) की एक श्रृंखला के संपर्क में लाया गया था और एक्सपोजर की शुरुआत के 48 घंटे बाद घातकता के लिए स्कोर किया गया था (चित्रा 1 ए, बी)।

इस प्रारंभिक विश्लेषण का उद्देश्य सांद्रता की अनुमानित सीमा की पहचान करना था जो एनएएएसओ2 विषाक्तता के अधिक सटीक लक्षण वर्णन की अनुमति देगा। बाद के प्रयोगों में, सांद्रता का चयन किया गया (0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, और 5 एमएम) जो एनएएएसओ2 खुराक-प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 1 सी, डी) को अधिक सटीक रूप से परिभाषित करता है। ध्यान दें कि परिणामी विश्लेषण ने कई सांद्रता की जांच की जो 100% घातकता को प्रेरित करती है। पर्यावरण संरक्षण एजेंसी के सार्वजनिक रूप से उपलब्ध बेंचमार्क खुराक सॉफ्टवेयर संस्करण 3.2.0.125 का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। डेटा को "डिकोटोमस" के रूप में मॉडलिंग किया गया था और बाद के विश्लेषणों के लिए डिकोटोमस हिल मॉडल का उपयोग किया गया था। इस मॉडल के आधार पर, अंतिम एलडी10, एलडी25, और एलडी 50 नर मक्खियों को एनएएएसओ2 खिलाया गया क्रमशः 0.30 एमएम,0.50 एमएम और 0.65 एमएम था। मादा मक्खियों के लिए, ये मान थोड़ा अधिक थे, 0.30 मिमी के एलडी10, 0.65 एमएम के एलडी25 और 0.90 एमएम के एलडी50 के साथ। कुल मिलाकर, इस विधि का उपयोग करके प्राप्त मूल्य ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर35,36,37,38 में आर्सेनिक विषाक्तता के लिए पहले रिपोर्ट किए गए मूल्यों के समान हैं, इस प्रकार कार्यप्रणाली को मान्य करते हैं।

खुराक-प्रतिक्रिया वक्र की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले छह प्रतिकृतियों के अलावा, नर और मादा मक्खियों को एनएएएसओ2 एक्सपोज़र समाधान भी खिलाया गया था जिसमें 1% एफडी और सी ब्लू होता है, जो प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पाचन तंत्र में आसानी से दिखाई देता है। NaAsO 2-खिलाए गए मक्खियों की आंत के भीतर नीली डाई की उपस्थिति के आधार पर, नर और मादा दोनों मक्खियों ने रासायनिक जोखिम की शुरुआत के 24 घंटे बाद भोजन करना जारी रखा, तरल मीडिया के भीतर मौजूद NaASO 2 एकाग्रता की परवाह किए बिना (चित्रा 2)। हालांकि, निगला हुआ भोजन कभी-कभी महिलाओं के लिए 0.2 मिमी और पुरुषों के लिए 0.5 एमएम से अधिक खुराक पर पाया गया (चित्रा 2)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि आर्सेनिक विषाक्तता के लिए ड्रोसोफिला प्रतिक्रिया में पुनरावृत्ति एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: पुरुष और महिला ड्रोसोफिला के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र 48 घंटे के लिए एनएएएसओ2 के साथ इलाज किया जाता है। सभी ग्राफ डिकोटोमस हिल मॉडल के आधार पर परीक्षण किए गए प्रत्येक एनएएएसओ2 एकाग्रता पर मृत मक्खियों के अनुमानित अनुपात को दिखाते हैं। (ए, बी) एनएएएसओ2 सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण उस खुराक का अनुमान लगाने के लिए किया गया था जिस पर मक्खी का प्रत्येक लिंग मरना शुरू होता है। (ए) पुरुष डेटा दिखाता है, और (बी) महिला डेटा दिखाता है। एन = 4 शीशियां, प्रति शीशी 20 मक्खियों के साथ। (C, D) एनएएएसओ2 सांद्रता की एक संकीर्ण सीमा का परीक्षण सटीक खुराक निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिस पर मक्खियों के प्रत्येक लिंग के 10%, 25% और 50% की मृत्यु हो गई थी। इन खुराकों को प्रत्येक ग्राफ के दाईं ओर इंगित किया जाता है। (सी) पुरुष डेटा दिखाता है, और (डी) महिला डेटा दिखाता है। एन = 6 शीशियां, प्रति शीशी 20 मक्खियों के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 24 घंटे के लिए एनएएएसओ2 के साथ इलाज किए गए नर और मादा ड्रोसोफिला के ब्लू डाई परख के प्रतिनिधि परिणाम। माइक्रोग्राफ से पता चलता है कि मक्खियों को एनएएएसओ2 की बढ़ती सांद्रता खिलाया जाता है। पंक्ति (ए) नर मक्खियों को दर्शाती है, और पंक्ति (बी) मादा मक्खियों को दर्शाती है, जिसमें एनएएएसओ2 की एकाग्रता बाएं से दाएं बढ़ रही है। पेट कम सांद्रता पर वक्ष के पास नीले रंग की एक छोटी मात्रा दिखाता है, यह दर्शाता है कि एक्सपोजर मीडिया आंत में प्रवेश करता है। उच्च सांद्रता पर, नीली डाई मुंह के चारों ओर जमा होने लगती है, जिससे पता चलता है कि एक्सपोजर मीडिया को पुनर्जीवित किया जा रहा है। स्केल बार 1 मिमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

फ्रूट फ्लाई ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एनएएम16,18,19,21 के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली के रूप में उभर रहा है। फ्लाई समुदाय के लिए उपलब्ध अद्वितीय आनुवंशिक संसाधनों का लाभ उठाकर, जीनोमिक्स और मेटाबोलॉमिक्स में हालिया प्रगति के साथ मिलकर, ड्रोसोफिला का उपयोग करके रासायनिक सुरक्षा अध्ययन आणविक तंत्र की जल्दी से पहचान करने में सक्षम हैं जिसके द्वारा व्यक्तिगत यौगिक चयापचय, शरीर विज्ञान और सेल सिग्नलिंग में हस्तक्षेप करते हैं (उदाहरण के लिए, देखें39). यह सस्ता प्रोटोकॉल खुराक-प्रतिक्रिया वक्रों को तेजी से परिभाषित करने और बाद में आरएनए-सेक और मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए नमूने उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, इस लचीले प्रोटोकॉल को किसी भी जीनोटाइप के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और रसायनों के कई वर्गों को समायोजित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल का एक उल्लेखनीय पहलू रासायनिक जोखिम में उपयोग किए जाने वाले तरल भोजन की पसंद है, जो पिछले अध्ययन पर आधारित है, लेकिन ड्रोसोफिला18,22 के अधिकांश विषाक्त अध्ययनों द्वारा उपयोग किए जाने वाले ठोस मीडिया से भिन्न है। इस विशिष्ट तरल मीडिया को मानक, ठोस बीडीएससी मीडिया की पोषण सामग्री को प्रतिबिंबित करने के लिए चुना गया था कि मक्खियों को इस प्रोटोकॉल में भी खिलाया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियों को लगातार पोषण प्राप्त होता है। तरल फीडिंग मीडिया की सादगी के कई फायदे हैं। तरल मीडिया ठोस भोजन की तुलना में संभालना आसान है, जिसे पाउडर से पिघलाने और पुन: ठोस या पुनर्गठित करने की आवश्यकता होती है। तरल मीडिया भी सिस्टम के थ्रूपुट को बढ़ाता है, पूरे फीडिंग मीडिया में रासायनिक वितरण भी सुनिश्चित करता है, और खतरनाक यौगिकों के साथ काम करने में बिताए गए समय को कम करता है। इसके अतिरिक्त, मीडिया को गर्म करने के लिए समाधान की आवश्यकता नहीं होती है, जो वाष्पशील परीक्षण यौगिकों के परीक्षण की सुविधा प्रदान करता है। अंत में, खाद्य समाधान में शामिल अपेक्षाकृत कुछ घटकों के कारण, परीक्षण रासायनिक और अन्य आहार घटकों के बीच अवांछनीय पक्ष प्रतिक्रियाओं को कम किया जाता है। भोजन में उपयोग किया जाने वाला खमीर भी निष्क्रिय है, जो भोजन माध्यम की प्रतिक्रियाशीलता को और सीमित करता है। हालांकि, कृपया ध्यान दें कि विधि विकास या लार्वा विषाक्तता के परीक्षण के लिए उपयुक्त नहीं है।

प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली कुछ सामग्रियों को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जैसे कि पॉलीप्रोपाइलीन के बजाय ग्लास फ्लाई शीशियों का उपयोग करना। हालांकि, उपयोग की जाने वाली सामग्रियों को अभिकर्मकों और रासायनिक जोखिमों के बीच अवांछित रासायनिक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए निष्क्रिय और डिस्पोजेबल दोनों के रूप में चुना गया था जो ग्लासवेयर की सफाई के परिणामस्वरूप हो सकते हैं।

तरल भोजन के उपयोग के लिए खाद्य वितरण के लिए एक वाहन की आवश्यकता होती है। सेल्यूलोज एसीटेट फिल्टर पेपर को इसके लचीलेपन और निष्क्रिय प्रकृतिके कारण इस उद्देश्य के लिए चुना गया था। अन्य शोधकर्ताओं ने इसी तरह के प्रोटोकॉल का उपयोग किया, लेकिन अन्य वाहनों के साथ, जैसे कि नाजुक टास्क वाइप्स या ग्लास फाइबर फिल्टर29,30। सेल्यूलोज एसीटेट फिल्टर पेपर इन आवश्यकताओं के अनुकूल है क्योंकि यह एक निष्क्रिय वाहन है जिसे कागज और शीशी की दीवार के बीच बड़े अंतराल के बिना फ्लाई शीशियों के तल में फिट करने के लिए आदर्श आकार में काटा जा सकता है, जिससे मक्खियों के मीडिया या वाहन में फंसने के कारण होने वाली मृत्यु को रोका जा सकता है।

इस प्रणाली की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि एक रसायन की अधिकतम परीक्षण योग्य एकाग्रता रसायन की घुलनशीलता से बंधी होती है। गैर-पानी में घुलनशील यौगिकों को एक अतिरिक्त विलायक की आवश्यकता होती है, जिससे रुचि के रसायन के साथ अतिरिक्त या सहक्रियात्मक प्रभाव हो सकते हैं। यह ऐसी परिस्थितियां भी पैदा कर सकता है जिसमें स्टॉक समाधान तैयार करना संभव नहीं है जो सभी जीवों में वांछित समापन बिंदु प्राप्त करने के लिए पर्याप्त केंद्रित हैं, इसलिए परिणामी डेटा31 के विश्लेषण को सीमित करते हैं। इसे संबोधित करने के लिए, कम पानी की घुलनशीलता वाले रसायनों को खाद्य समाधान में 0.5% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड जोड़कर परीक्षण किया जा सकता है। अन्य सॉल्वैंट्स का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन जीव पर विलायक प्रभाव को कम करते हुए घुलनशीलता को अधिकतम करने के लिए समाधान के भीतर अधिकतम स्वीकार्य विलायक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ब्याज के प्रत्येक विलायक के लिए अतिरिक्त शोध की आवश्यकता होती है।

ड्रोसोफिला में ओल्फेशन प्रतिक्रिया के व्यापक लक्षण वर्णन ने वर्णन किया है कि मक्खियां विषाक्त यौगिकों40,41 का सेवन करने से कैसे बचती हैं, जिससे उपचारित मीडिया पर भोजन कम हो जाता है। ब्लू डाई परख शोधकर्ताओं को प्रयोगात्मक रसायन42,43,44 की प्रत्येक एकाग्रता को खिलाए गए मक्खियों के भोजन व्यवहार को कुशलतापूर्वक स्क्रीन करने की अनुमति देकर इस घटना को संबोधित करती है। मक्खी के जठरांत्र संबंधी मार्ग में नीले रंग की उपस्थिति या अनुपस्थिति इंगित करती है कि क्या मक्खी विषाक्त युक्त माध्यम खा रही है। यद्यपि फ्लाई फीडिंग व्यवहार का आकलन करने के अधिक परिष्कृत तरीके मौजूद हैं, जैसे कि फ्लाई लिक्विड-फूड इंटरैक्शन काउंटर45, यह गुणात्मक विधि उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए बेहतर अनुकूल है।

इस प्रोटोकॉल का एक उल्लेखनीय पहलू यह है कि इसे मक्खियों को स्थानांतरित करने या एक्सपोज़र शीशी में अतिरिक्त तरल जोड़ने की आवश्यकता के बिना 48 घंटे की एक्सपोज़र अवधि के लिए अनुकूलित किया गया है। आर्द्रता कक्ष का उपयोग करना और कक्षों को उच्च आर्द्रता पर रखे गए इनक्यूबेटर में रखने से इस समय सीमा के दौरान फीडिंग मीडिया वाले फिल्टर पेपर को सूखने से रोका जा सकता है। प्रोटोकॉल को लंबे समय तक एक्सपोजर अवधि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन विधि को यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए कि फ़िल्टर पेपर सूखा न हो और निर्जलीकरण के कारण समाधान एकाग्रता या घातकता में महत्वपूर्ण परिवर्तन न हो।

अंत में, इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि यह आनुवंशिक वेरिएंट को आसानी से समायोजित कर सकता है, जो शोधकर्ताओं को ड्रोसोफिला के लिए आनुवंशिक उपकरणों की विशाल सरणी का उपयोग करने की अनुमति देता है ताकि विवो में रासायनिक कार्रवाई के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए जंगली प्रकार के जीवों पर इन प्रारंभिक अध्ययनों का विस्तार किया जा सके। इस संबंध में, ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल को पीटरसन और लॉन्ग द्वारा पहले वर्णित जोव प्रोटोकॉल के पूरक के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है जो जंगली-पकड़े गएमक्खियों के विषाक्त विश्लेषण की अनुमति देता है।

ड्रोसोफिला 32,33,34,35,36 में सोडियम आर्सेनाइट की विषाक्तता पर पिछले अध्ययनों की विस्तृत विविधता के कारण, ओरेगन-आर मक्खियों को हमारे सिस्टम की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए इस यौगिक के साथ इलाज किया गया था। नर मक्खियों ने 0.65 एमएम के एलडी 50 का प्रदर्शन किया, और महिलाओं ने 0.90 एमएम के एलडी50 का प्रदर्शन किया। यह सोडियम आर्सेनाइट-उपचारित वयस्क ड्रोसोफिला के पिछले अध्ययनों के साथ संरेखित है। उदाहरण के लिए, गोल्डस्टीन और बाबिच37 ने पाया कि 50% मक्खियों (मिश्रित लिंग) की मृत्यु 0.5 एमएम एनएएएसओ2 के संपर्क में आने के 7 दिनों के बाद हुई। यद्यपि यह वर्तमान में देखी गई तुलना में थोड़ा कम खुराक है, उनके तरीकों और इस विधि (ठोस जोखिम मीडिया, लंबे समय के पैमाने और मिश्रित लिंगों के उपयोग सहित) के बीच अंतर संभवतः इस अंतर के लिए जिम्मेदार है। महत्वपूर्ण रूप से, दोनों विधियों के परिणामस्वरूप समग्र समान एलडी50 मान थे।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले प्रयोगों के अवलोकन का उपयोग बाद के व्यवहार या यांत्रिक अध्ययनों के लिए आनुवंशिक और आणविक लक्ष्यों को खोजने के लिए किया जा सकता है। एक्सपोजर विधि का उपयोग मेटाबोलॉमिक्स और प्रोटिओमिक्स के नमूने के लिए ड्रोसोफिला के इलाज के लिए भी किया जा सकता है, जिससे यह प्रोटोकॉल सटीक विष विज्ञान के बढ़ते क्षेत्र (सटीक चिकित्सा क्षेत्र46 से मॉडलिंग) के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। इस संबंध में, बाद के जीनोमिक और मेटाबोलॉमिक्स विश्लेषण के लिए चरण 8 के बाद उजागर मक्खियों को एकत्र किया जा सकता है। चरण 8 में एकत्र किए गए नमूने तब संसाधित किए जा सकते हैं, जैसा कि ली और टेनेसेन47 द्वारा वर्णित है, चरण 3 से शुरू होता है।

अंततः, ऊपर वर्णित प्रयोगों से प्राप्त डेटा, साथ ही साथ किसी भी बाद के मेटाबोलॉमिक्स और प्रोटिओमिक्स डेटा का उपयोग आदर्श रूप से क्रॉस-प्रजाति तुलना में किया जाएगा। जैसा कि पहले उल्लेख किया गयाहै, इस तरह के क्रॉस-प्रजाति अध्ययन शक्तिशाली हैं और यह निर्धारित करने में सक्षम हैं कि व्यक्तिगत रसायन संरक्षित जैविक मार्गों में कैसे हस्तक्षेप करते हैं। इस प्रकार, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग फ़ाइला में व्यक्तिगत विषाक्त पदार्थों के जवाब में विकासवादी समानताओं को खोजने और रासायनिक सुरक्षा विनियमन को सूचित करने में मदद करने के लिए किया जा सकता है।

Disclosures

खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के परीक्षण और अनुकूलन में मदद के लिए अपने कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं: अमेया बेलमकर, मर्लिन क्लार्क, अलेक्जेंडर फिट, एम्मा रोज गैलेंट, एथन गोल्डिच, मैथ्यू लोव, मॉर्गन मार्श, काइल मैकक्लंग, एंडी पुगा, डार्सी रोज, कैमरन स्टॉकब्रिज और नोएल ज़ोलमैन। प्रोटोकॉल के लक्ष्यों की पहचान करने में मदद करने के लिए हम प्रेसिजन टॉक्सिकोलॉजी ग्रुप के अपने सहयोगियों, विशेष रूप से हमारे एक्सपोज़र ग्रुप समकक्षों को भी धन्यवाद देते हैं।

इस परियोजना को अनुदान समझौते संख्या 965406 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ। इस प्रकाशन में प्रस्तुत कार्य ASPIS क्लस्टर के भाग के रूप में किया गया था। यह आउटपुट केवल लेखकों के विचारों को दर्शाता है, और यूरोपीय संघ को किसी भी उपयोग के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता है जो इसमें निहित जानकारी से बना हो सकता है। यह प्रकाशन इंडियाना क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंसेज इंस्टीट्यूट के समर्थन से भी संभव हो गया था, जिसे नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज, क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल साइंसेज अवार्ड से अवार्ड नंबर UL1TR002529 द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती हो। इस परियोजना के कुछ हिस्सों को जेआरएस और फाइलोटॉक्स कंसोर्टियम को सम्मानित इंडियाना विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था। जेएमएच और ईएमपी को ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर को एनआईएच पुरस्कार P40OD018537 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0

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References

  1. United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
  2. Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022).
  3. Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.epa.gov/cci (2022).
  4. Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022).
  5. United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
  6. Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022).
  7. United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
  8. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  9. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  10. New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021).
  11. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  12. Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
  13. Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
  14. European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland, 19-20 April 2016 (2016).
  15. Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
  16. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  17. Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
  18. Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
  19. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
  20. Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
  21. Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
  22. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
  23. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  24. Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
  25. Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  26. Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
  27. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  28. Markstein, M. Drosophila Workers Unite! A Laboratory Manual for Working with Drosophila. , Available from: http://marksteinlab.org/wp-content/uploads/2019/01/MicheleMarkstein-DrosophiliaWorkersUnite-PREPRINT-JAN2019.pdf (2018).
  29. Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
  30. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
  31. Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022).
  32. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? - ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
  33. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  34. Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022).
  35. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
  36. Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
  37. Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
  38. Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
  39. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
  40. Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
  41. Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
  42. Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
  43. Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
  44. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
  45. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  46. National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , National Academies Press. US. (2011).
  47. Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).

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जीव विज्ञान अंक 193
वयस्क <em>ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> में रासायनिक विषाक्तता का आकलन
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Holsopple, J. M., Smoot, S. R.,… More

Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).

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