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Immunology and Infection

पित्त एट्रेसिया के अध्ययन के लिए क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक माउस मॉडल

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65044
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 1,2
1School of Medicine, South China University of Technology, 2Provincial Key Laboratory of Research in Structure Birth Defect Disease and Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women and Children’s Medical Center

Summary

हमने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक माउस मॉडल स्थापित किया, जो वायरस-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस पित्त एट्रेसिया (बीए) के यांत्रिक अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल प्रदान करता है और भविष्य के बीए उपचार के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Abstract

बाइलरी एट्रेसिया (बीए) एक घातक बीमारी है जिसमें प्रतिरोधी पीलिया शामिल है, और यह बच्चों में यकृत प्रत्यारोपण के लिए सबसे आम संकेत है। जटिल एटियलजि और अज्ञात रोगजनन के कारण, अभी भी कोई प्रभावी दवा उपचार नहीं हैं। वर्तमान में, रीसस रोटावायरस (आरआरवी) द्वारा प्रेरित क्लासिक बीए माउस मॉडल बीए के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। इस मॉडल को विकास मंदता, त्वचा और श्लेष्म के पीलिया, मिट्टी के मल और गहरे पीले मूत्र की विशेषता है। हिस्टोपैथोलॉजी गंभीर यकृत सूजन और इंट्राहेपेटिक और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं की रुकावट दिखाती है, जो मानव बीए के लक्षणों के समान हैं। हालांकि, इस मॉडल में अंत-चरण चूहों के यकृत में फाइब्रोसिस की कमी होती है और नैदानिक बीए में यकृत फाइब्रोसिस की विशेषताओं को पूरी तरह से अनुकरण नहीं कर सकता है। प्रस्तुत अध्ययन ने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक नया बीए माउस मॉडल विकसित किया, जिसमें प्रत्येक इंजेक्शन के बाद 2 दिनों के अंतराल के साथ एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5-10 μg को चार बार इंजेक्ट किया गया। परिणामों से पता चला है कि कुछ चूहों ने समय की अवधि के बाद विशिष्ट फाइब्रोसिस के साथ क्रोनिक बीए का सफलतापूर्वक गठन किया, जिसका अर्थ है कि ये चूहे बीए के वायरस-प्रेरित यकृत फाइब्रोसिस यंत्रवत अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं और भविष्य के बीए उपचार विकसित करने के लिए एक मंच का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Introduction

बाइलरी एट्रेसिया (बीए) एक गंभीर हेपेटोबिलरी बीमारी है जो अक्सर शिशुओं और छोटे बच्चों में होती है; विशेष रूप से, यह नवजात पीलिया और पीला मल1 के साथ एक ओब्लेरेटिव कोलांगोपैथी के रूप में प्रस्तुत करता है। इसकी नैदानिक विशेषताएं इंट्राहेपेटिक और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं और प्रगतिशील फाइब्रोसिस के भड़काऊ विनाश हैं, जो अंततः यकृत विफलता2 में विकसित होती हैं। आंकड़ों के अनुसार, एशियाई देशों में बीए की घटना यूरोपीय और अमेरिकी देशों की तुलना में अधिक है, और एशियाई देशों में बीए की घटना 1/8,000 है। बीए के एटियलजि में वायरल संक्रमण, असामान्य पित्त नली विकास, प्रतिरक्षा विकार औरआनुवंशिक विविधताएं शामिल हैं। बीए वाले बच्चों में कोलेस्टेसिस में सुधार के लिए कसाई सर्जरी सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, लेकिन अंततः, यह फाइब्रोसिस4 की प्रगति को रोक नहीं सकता है। बीए के लिए वर्तमान उपचार मुख्य रूप से यकृत प्रत्यारोपण पर निर्भर करता है, जो यकृत स्रोतों की कमी से सीमित है। बीए के रोगजनन का गहन अध्ययन इस बीमारी की चुनौतियों को हल करने का सबसे सीधा साधन है। हालांकि, बीए के रोगजनन पर अध्ययन मुख्य रूप से बीए पशु मॉडल पर निर्भर करता है, और एक उपयुक्त पशु मॉडल का चयन करना महत्वपूर्ण है।

बीए के अधिकांश हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों से पता चला है कि पित्त नली हाइपरप्लासिया (बीडीपी), पित्त घनास्त्रता, और पोर्टल नस फाइब्रोसिस बीए की सबसे महत्वपूर्ण रोग संबंधी विशेषताएं हैं, और विभिन्न ग्रेड की अन्य रोग संबंधी विशेषताएं एक ही समय में मौजूद हैं, जैसे कि पोर्टल भड़काऊ सेल घुसपैठ और हेपेटोसाइट सूजन 5,6।. वर्तमान में, विभिन्न प्रकार के माउस मॉडल हैं जो बीए की नकल करते हैं, जैसे कि क्रोनिक 3,5-डाई-थोक्सीकार्बोनिल-1,4-डाइहाइड्रोकोलिडीन (डीडीसी)-फेड माउस मॉडल जिसमें सेगमेंटल पित्त नली रुकावट और पेरिकोलैंगिटिस शामिल है जिसमें एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं7 शामिल हैं और कार्बन टेट्राक्लोराइड8 के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ यकृत फाइब्रोसिस का माउस मॉडल। पित्त नली बंधाव (बीडीएल) मॉडल को पीलिया और रैपिड पोर्टल वेन फाइब्रोसिस9 की विशेषता है। अल्फा-नेफ्थाइलिसोथियोसाइनेट (एएनआईटी)-खिलाया माउस मॉडल इंट्राहेपेटिक पित्त नली और हेपेटोसाइटचोट 10 तक सीमित चोलंगाइटिस के साथ प्रस्तुत करता है। लंबे समय तक पीलिया के साथ एक माउस मॉडल देरी से रीसस रोटावायरस (आरआरवी) टीकाकरण11 से प्रेरित होता है। यद्यपि विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल हैं, विशेष रूप से माउस मॉडल, प्रत्येक मॉडल की अपनी सीमाएं हैं। वे केवल बीए की रोग विशेषताओं के हिस्से का अनुकरण कर सकते हैं, जैसे कि पित्त एट्रेसिया की प्रक्रिया में तीव्र सूजन या यकृत फाइब्रोसिस, और कोई मॉडल नहीं है जो बीए की रोग प्रक्रिया और रोग संबंधी विशेषताओं के साथ अत्यधिक सुसंगत है।

क्लासिक बीए माउस मॉडल आरआरवी द्वारा प्रेरित है, और यह मॉडल मनुष्यों में बीए के लिए सबसे समान मॉडल है। हालांकि, जबकि आरआरवी-प्रेरित बीए मॉडल चूहे एक्स्ट्राहेपेटिक बाइलरी एट्रेसिया के कुछ लोगों के समान नैदानिक लक्षण और रोग संबंधी विशेषताएं दिखाते हैं, इस मॉडल में यकृत फाइब्रोसिस का अभाव है, जो बीए तंत्र के गहन अध्ययन औरनए उपचार के विकास को बहुत सीमित करता है। इसलिए, इस अध्ययन ने क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक नया बीए माउस मॉडल विकसित किया। जन्म के दिन आरआरवी टीकाकरण से पहले एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी को इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। फिर, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5-10 μg को चार बार इंजेक्ट किया गया, प्रत्येक इंजेक्शन के बीच 2 दिनों के अंतराल के साथ। चूहों के बीए लक्षणों में सुधार हुआ, जीवित रहने का समय लंबा था, और चूहों ने क्रोनिक फाइब्रोसिस चरण में प्रवेश किया। यह मॉडल न केवल बीए की तीव्र चरण प्रतिक्रिया का अनुकरण करता है, बल्कि यकृत और प्रगतिशील फाइब्रोसिस की प्रक्रियाओं की नकल भी करता है। इस प्रकार, यह बीए के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक अधिक उपयुक्त पशु मॉडल है, और यह बीए के लिए भविष्य के उपचार विकसित करने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान कर सकता है।

जीआर -1 अणु एक माइलॉयड-व्युत्पन्न सेल सतह मार्कर है जो मूल रूप से न्यूट्रोफिल13 में व्यक्त किया जाता है। एंटी-लाइ 6 जी एंटीबॉडी की कमी 90% से अधिक न्यूट्रोफिल को कम करती है और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा सक्रिय प्रतिक्रिया को बदल देती है। जीआर -1 + सेल आबादी के कार्यों को विशिष्ट स्कैवेंजिंग एंटीबॉडी का उपयोग करके विभिन्न अध्ययनों में रिपोर्ट किया गया है, जिसमें साइटोकिन्स और मध्यस्थ प्रतिरक्षा सुरक्षा14 पर अलग-अलग प्रभाव की पहचान की गई है। हमने आरआरवी-टीकाकृत बीए माउस मॉडल में जीआर -1 + कोशिकाओं के कार्य का अध्ययन किया है। हालांकि, चूंकि जीआर -1 अणु मनुष्यों में व्यक्त नहीं किया गया है, इसलिए बीए रोगियों15 में एक समान अणु, सीडी 177 का अध्ययन किया गया है। हमारा डेटा जीआर -1 + सेल आबादी के महत्व को साबित करता है, विशेष रूप से बीमारी के पुराने फाइब्रोटिक चरण में, और संभावित बीए उपचारों की जांच के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल प्रदान करता है।

Protocol

इस अध्ययन को गुआंगज़ौ योंगनुओ बायोमेडिकल एनिमल सेंटर (आईएसीयूसी-एईडब्ल्यूसी-एफ 2208020) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, जहां सभी पशु प्रयोग किए गए थे।

1. क्रोनिक फाइब्रोटिक बीए माउस मॉडल की स्थापना

नोट: सभी जानवरों को एक ही कमरे में एक विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) वातावरण में रखा गया था, और प्रयोग एक पारंपरिक वातावरण में आयोजित किए गए थे। गर्भावस्था के 12.5 वें दिन (आयु: 10-12 सप्ताह; वजन 35-40 ग्राम) को 12 घंटे के अंधेरे / प्रकाश चक्र के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर विशिष्ट रोगजनकों के बिना एक कमरे में रखा गया था और उन्हें आटोक्लेव भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई थी। नवजात चूहों, जन्म के 24 घंटे के भीतर (औसत शरीर का वजन: 1.5-1.6 ग्राम), माउस बीए मॉडल के लिए चुना गया था।

  1. आरआरवी तैयार करें जैसा कि पहले बताया गयाथा 16.
    नोट: मॉडल चूहों की खराब जीवित रहने की स्थिति के कारण, उन्हें 21 दिन की उम्र में अलग करने की आवश्यकता होती है ताकि उन्हें उसी पिंजरे में अन्य चूहों द्वारा काटने या यहां तक कि मारे जाने से बचाया जा सके।
  2. नवजात चूहों को तीन समूहों में विभाजित करें: नियंत्रण समूह, आरआरवी समूह, और आरआरवी + एंटी-एलवाई 6 जी समूह। इंट्रापरिटोनियल रूप से नवजात चूहों को जन्म के 24 घंटे के भीतर आरआरवी (टिटर: 1.5 x 106 पीएफयू / एमएल) (आरआरवी समूह) या खारा (नियंत्रण समूह) के 20 μL के साथ इंजेक्ट करें। जीआर -1 + कोशिकाओं को कम करने के लिए, आरआरवी इंजेक्शन से 4 घंटे पहले प्रत्येक माउस को एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5 μg के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ इलाज करें।
    नोट: एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी समाधान 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है और इसे जमे हुए नहीं होना चाहिए। उपयोग से पहले एंटीबॉडी को बाहर निकालें और इसे गर्म करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
  3. आरआरवी इंजेक्शन (चित्रा 1 ए) के बाद 12 दिन तक हर 3 दिनों में माउस के पेट में एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 10 μg इंजेक्ट करें।
  4. दैनिक रूप से सभी चूहों की उपस्थिति, वजन और अस्तित्व की जांच और रिकॉर्ड करें।

2. चूहों के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन

  1. पिंजरे से नवजात चूहों को हटा दें। आरआरवी समाधान के 20 μL या एंटी-Ly6G एंटीबॉडी समाधान के 50 μL इंजेक्ट करने के लिए 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। एक हाथ की तर्जनी और अंगूठे से युवा माउस की गर्दन की त्वचा को पिंच करें, और पेट को उजागर करने के लिए अनामिका उंगली और पूंछ की उंगली से माउस के पिछले पैरों को धीरे से पकड़ें।
  2. सुई को ऊपर की ओर झुकाव में उठाएं। सुई को माउस के दाहिने पिछले पैर की मध्य जांघ में त्वचा के साथ 15 ° के कोण पर डालें। चमड़े के नीचे के पथ के साथ चलने के बाद जब तक सुई माउस के दाहिने किनारे तक नहीं पहुंच जाती, सुई को पेट की गुहा में नीचे की ओर निर्देशित करें। फिर, माउस के जिगर के नीचे तरल इंजेक्ट करें।
    नोट: नवजात चूहों के बाएं पेट में उनका पेट और प्लीहा होता है। यदि बाईं ओर एक सुई डाली जाती है, तो पेट को छेदना या स्प्लेनिक रक्तस्राव का कारण बनना आसान होता है।
  3. इंजेक्शन के तुरंत बाद सुई को बाहर निकालें, और इंजेक्शन स्थल पर रक्तस्राव या रिसाव के लिए निरीक्षण करें। यदि कोई है, तो इसे एक आटोक्लेव कपास से पोंछ लें। माउस को उसकी मां के पिंजरे में वापस कर दें।
    नोट: प्रयोगात्मक परिणामों पर इंजेक्शन के दौरान द्रव रिसाव के प्रभाव को कम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन क्रिया सौम्य है, धीरे-धीरे सुई को हटा दें, और इंजेक्शन साइट को 30 सेकंड के लिए कपास के फाहे के साथ दबाएं।

3. नमूना ऊतक का संग्रह

  1. 12 वें दिन, चूहों को 4% आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन के साथ एनेस्थेटाइज करें, और उन्हें माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदित करें। रक्त एकत्र करने के लिए हृदय के बाएं वेंट्रिकल में 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज डालें। रक्त संग्रह के बाद, 10 मिनट के लिए 4% आइसोफ्लुरेन की साँस लेकर चूहों को इच्छामृत्यु दें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें, और यकृत समारोह माप के लिए सीरम को अलग करें।
    नोट: चूहों के जीवित होने पर रक्त संग्रह किया जाना चाहिए। यदि चूहे मर जाते हैं, तो रक्त को रक्त वाहिकाओं में बनाए रखा जाएगा और एकत्र नहीं किया जा सकता है।
  2. यकृत और पित्त नली की सामान्य उपस्थिति को चित्रित करें। इसके बाद, कैंची और चिमटी के साथ आसपास के ऊतकों से माउस यकृत और प्लीहा को विच्छेदित करें।
    नोट: यकृत और अन्य ऊतकों को आरएनए और प्रोटीन निष्कर्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र और आरक्षित किया जाता है या हिस्टोलॉजिकल नमूनों की तैयारी के लिए 10% फॉर्मेलिन में भिगोया जाता है।

4. एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली की फ्लोरेसिन एंजियोग्राफी

  1. माउस को यूथेनाइज़ करने के बाद, कैंची और कपास के फाहे के साथ यकृत, पित्ताशय की थैली और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं को पूरी तरह से उजागर करें।
  2. एक आसन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें, 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज के साथ पित्ताशय की थैली में फ्लोरोसेंट डाई रोडामाइन 123 (20 मिलीग्राम / एमएल) के 5-10 μL इंजेक्ट करें, और तस्वीरें लें। यह प्रक्रिया वही है जो पहले16 में रिपोर्ट की गई थी।
    नोट: एक ही समूह में विभिन्न चूहों का उपयोग नमूना ऊतक संग्रह और प्रतिदीप्ति एंजियोग्राफी के लिए किया जाता है।

5. एच एंड ई धुंधला होना

  1. 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में ताजा माउस यकृत ऊतक डुबोएं।
  2. पैराफिन में ऊतक एम्बेड करने के बाद, पैराफिन ब्लॉक को 4 μm की मोटाई वाले वर्गों में काटने के लिए एक पैराफिन माइक्रोटोम का उपयोग करें, और एक ही स्लाइड पर लगातार दो खंड रखें। उंगलीके कट से बचने के लिए अनुभवी कर्मियों को ऑपरेशन को मानकीकृत करने की आवश्यकता होती है।
  3. स्लाइस को एक स्लाइसिंग रैक में रखें, उन्हें जाइलीन में डिवैक्स करें, उन्हें पूर्ण इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 80% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, और आसुत पानी में क्रमिक रूप से हाइड्रेट करें, और प्रत्येक में 5 मिनट के लिए भिगोएं।
  4. 5 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन घोल के साथ अनुभागों को दाग दें, और उन्हें 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड और 75% अल्कोहल में 5 सेकंड के लिए भिगो दें। साफ पानी से अनुभागों को धो लें, और 1 मिनट के लिए ईओसिन के घोल के साथ दाग दें।

6. सीके 19 और एफ 4/80 इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला।

  1. पहले तीन चरण एच एंड ई धुंधला अनुभाग में ऊतक एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और डीवैक्सिंग के चरणों के समान हैं।
  2. ट्रिस-ईडीटीए बफर (10 mmol / L Tris बेस, 1 mmol / L EDTA समाधान, pH 9.0) के साथ एंटीजन मरम्मत करें, 10 मिनट के लिए माइक्रोवेव ओवन में 95 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को गर्म करें, और फिर उन्हें कमरे के तापमान पर स्वाभाविक रूप से निकालें और ठंडा करें।
  3. अंतर्जात पेरोक्सीडेज को हटाने के लिए ऊतक वर्गों को 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान में रखें।
  4. निरर्थक बंधन को अवरुद्ध करने के लिए स्लाइस को 5% बकरी सीरम के साथ इलाज करें।
  5. प्राथमिक चूहा एंटी-माउस साइटोकेराटिन 19 या चूहा एंटी-माउस एफ 4/80 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को वर्गों में जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ अनुभागों को इनक्यूबेट करें।
  7. माइक्रोस्कोप के तहत क्रोमोजेनिक प्रतिक्रिया का निरीक्षण करने के लिए क्रोमोजेनिक एजेंट के रूप में 3,3'-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी) का उपयोग करें।
  8. चित्र प्राप्त करने के लिए 40x माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइस का निरीक्षण करें, और आवश्यकतानुसार उनका विश्लेषण करें।

7. सिरियस रेड स्टेनिंग

  1. ऊतक एम्बेडिंग, सेक्शनिंग और डीवैक्सिंग के पहले तीन चरणों का पालन करें जैसा कि एच एंड ई स्टेनिंग सेक्शन में वर्णित है।
  2. ऊतक वर्गों को हेमटोक्सिलिन के साथ प्रतिरूप करने के बाद, प्रत्येक ऊतक को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 50 μL Sirius Red Die समाधान के साथ कवर करें।
  3. स्लाइड को कमरे के तापमान पर स्वाभाविक रूप से 4 घंटे के लिए सुखाएं, प्रत्येक स्लाइड में तटस्थ गम की एक बूंद जोड़ें, और बुलबुले से बचने के लिए ऊतक को धीरे-धीरे कवर करने के लिए कवरस्लिप का उपयोग करें। तटस्थ गम को ठोस बनाने के लिए 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड छोड़ दें।
  4. कोलेजन जमाव के विवरण का निरीक्षण करने के लिए एक ध्रुवीकृत कंट्रास्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें; दृश्य के एक स्पष्ट और उपयुक्त क्षेत्र का चयन करें, और माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र की चमक और सफेद संतुलन को समायोजित करें। चित्र प्राप्त करें, और 40x माइक्रोस्कोप के तहत आवश्यकतानुसार उनका विश्लेषण करें।

Representative Results

चूहों को जन्म के 24 घंटे के भीतर एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 5 μg के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था और फिर इंट्रापरिटोनियल रूप से 4 घंटे बाद आरआरवी के 20 μL के साथ इंजेक्शन दिया गया था। फिर, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के 10 μg को 12 वें दिन तक हर 3 दिनों में इंजेक्ट किया गया था (चित्रा 1 ए)। आरआरवी समूह में औसत जीवित रहने का समय 13 दिन था। इसके विपरीत, एंटीबॉडी के साथ इलाज किए गए अधिकांश चूहों ने हल्के पीलिया का विकास किया, और कोई वजन घटाने नहीं देखा गया (चित्रा 1 सी)। लगभग 20% -30% चूहों में लंबे समय तक पीलिया और कम शरीर के वजन के साथ बीए सिंड्रोम था, लेकिन 42 दिनों से अधिक समय तक जीवित रहे। एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी उपचार के बाद, जीआर -1 + कोशिकाओं की संख्या15 कम हो गई, और चूहों ने क्रोनिक फाइब्रोसिस के चरण में प्रवेश किया, जिसे क्रोनिक बीए कहा जाता है। नमूने 12 वें और 42 वें दिन एकत्र किए गए थे, और सिरियस रेड से सना ऊतक स्लाइस यकृत फाइब्रोसिस में क्रमिक वृद्धि दिखाता है। 42 दिनों तक जीवित रहने वाले क्रोनिक बीए चूहों का उपयोग विस्तृत विश्लेषण के लिए किया गया था। छोटे आकार के अलावा, कान, पैर और पूंछ की त्वचा ने चिह्नित पीलिया दिखाया (चित्र 1 ई में नीले तीर)। आरआरवी इंजेक्शन के बाद 6 वें दिन, चूहों के मल का रंग हल्का हो गया, और मूत्र का रंग गहरा हो गया; यह 12 वें दिन नियंत्रण समूह से काफी अलग हो गया, जब आरआरवी समूह के चूहों ने सफेद मल और गहरे पीले रंग का मूत्र दिखाया। 42 वें दिन, क्रोनिक बीए चूहों के मूत्र और मल ने पीलिया की स्पष्ट विशेषताएं भी दिखाईं (चित्रा 1 डी, ई)। बीए चूहों के यकृत को हटा दिया गया और नियंत्रण ों की तुलना में किया गया। यकृत छोटे थे (चित्रा 2 बी), नेक्रोटिक घाव नग्न आंखों को दिखाई दे रहे थे (चित्रा 2 ए, काला त्रिकोण), और पित्त नली एट्रेसिया का एक खंड भी अतिरिक्त रूप से देखा गया था (चित्रा 2 ए, सफेद तारांकन)।

यकृत ऊतक अनुभाग विश्लेषण से पता चला है कि कम खुराक वाले एंटी-एलवाई 6 जी थेरेपी ने पोर्टल नस सूजन को कम कर दिया है। हालांकि, 42 वें दिन यकृत ऊतक स्लाइस में भड़काऊ कोशिका संचय अभी भी देखा गया था (चित्रा 3 ए)। सिरियस रेड स्टेनिंग ने आरआरवी इंजेक्शन के बाद 12 वें दिन पोर्टल क्षेत्र में कोलेजन के जमाव में एक छोटी वृद्धि दिखाई। इसके अलावा, एंटी-लाइ 6 जी एंटीबॉडी के साथ उपचार के बाद कोलेजन अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया था, लेकिन 42 वें दिन बीए ऊतक के नमूनों में कोलेजन अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी (चित्रा 3 बी)। जब एक ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई, तो यह देखा गया कि कोलेजन फाइबर आसन्न यकृत ऊतक में जमा हो गए थे। कोलेजन का पर्याप्त जमाव, मुख्य रूप से हरा, 42 वें दिन बीए ऊतक नमूनों में देखा गया था (चित्रा 3 सी), और कोलेजन जमाव चूहों में और बढ़ गया जो वजन बढ़ने के बिना 42 दिनों तक जीवित रहे। पोर्टल सूजन में कमी के साथ, सीके 19 + पित्त नली कोशिकाओं को 12 वें दिन देखा गया था। 42 वें दिन, हालांकि, परिपक्व पित्त नलिकाएं शायद ही पता लगाने योग्य थीं, भले ही सीके 19 + पित्त नली कोशिकाओं में वृद्धि देखी गई थी (चित्रा 4 ए, लाल तीर पित्त नली उपकला कोशिकाओं को इंगित करते हैं)। क्रोनिक बीए के साथ चूहों में एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाओं के मामले में, चूहों के पोर्टल क्षेत्र के सीरियल विच्छेदन से पता चला कि एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नलिकाएं अवरुद्ध थीं और मैक्रोफेज की भड़काऊ घुसपैठ थी (चित्रा 4 बी, काले तीर मैक्रोफेज का संकेत देते हैं)।

अकेले आरआरवी की तुलना में, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी की कम खुराक के साथ उपचार ने आरआरवी टीकाकरण के बाद 12 वें दिन यकृत एंजाइम के स्तर के संदर्भ में यकृत की चोट को कम कर दिया। सामान्य नियंत्रण समूह की तुलना में क्रोनिक बीए समूह में यकृत में एलानिन एमिनोट्रांसफेरेज़ और क्षारीय फॉस्फेट का स्तर अधिक था। बिलीरुबिन के स्तर में सबसे स्पष्ट परिवर्तन पाए गए, आरआरवी + एंटी-एलवाई 6 जी चूहों ने अकेले आरआरवी के विपरीत तीव्र बीए में टीबीआईएल, डीबीआईएल और आईबीआईएल के स्तर को कम दिखाया। क्रोनिक बीए वाले चूहों में, टीबीआईएल, डीबीआईएल और आईबीआईएल के स्तर में वृद्धि हुई थी (चित्रा 5), यह दर्शाता है कि बीए के क्रोनिक फाइब्रोसिस चरण में यकृत समारोह काफी कम हो गया था।

Figure 1
चित्र 1: आरआरवी से संक्रमित पित्त एट्रेसिया के माउस मॉडल में एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी उपचार के प्रभाव। (ए) एंटीबॉडी और आरआरवी के इंजेक्शन के समय को इंगित करने वाले तीरों के साथ चूहों में तीव्र और पुरानी चरण बीए को प्रेरित करने के लिए एंटीबॉडी की कम खुराक का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) सामान्य नियंत्रण (कॉन्ट) समूह, रीसस रोटावायरस (आरआरवी) समूह और आरआरवी + एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी समूह में चूहों के उत्तरजीविता वक्र। (सी) प्रत्येक समूह में चूहों के शरीर का वजन वक्र। (डी) 12 वें दिन प्रत्येक समूह में चूहों और उनके मल और मूत्र की प्रतिनिधि छवियां। (ई) 42 वें दिन प्रत्येक समूह में चूहों और उनके मल और मूत्र की प्रतिनिधि छवियां। नीले तीर पीले कान और पूंछ का संकेत देते हैं। यह आंकड़ा झांग एट अल .15 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: आरआरवी से संक्रमित पित्त एट्रेसिया के माउस मॉडल में यकृत पर एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी उपचार के प्रभाव । (ए) 42 वें दिन क्रोनिक बीए चूहों (दाएं) और सामान्य चूहों के बीच यकृत शरीर रचना विज्ञान और एक्स्ट्राहेपेटिक पित्त नली फ्लोरेसेंस एंजियोग्राफी की तुलना। (बी) क्रोनिक बीए चूहों और सामान्य चूहों के बीच यकृत के आकार की तुलना। काला त्रिकोण क्रोनिक बीए वाले चूहों में यकृत परिगलन को इंगित करता है। सफेद तारांकन एक्स्ट्राहेपेटिक बाइलरी एट्रेसिया को इंगित करता है। यह आंकड़ा झांग एट अल .15 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सामान्य नियंत्रण (Cont.) समूह, रीसस रोटावायरस (RRV) समूह, और RRV + एंटी-Ly6G एंटीबॉडी समूह में चूहों के यकृत ऊतक स्लाइस 12 वें और 42 वें दिन । (ए) हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) से सना यकृत ऊतक वर्गों की छवियां। (बी) सिरियस रेड स्टेनिंग ने कोलेजन जमाव (पीएसआर) दिखाया। (सी) ध्रुवीकृत प्रकाश माइक्रोस्कोपी (पोल लाइट) का उपयोग करके स्लाइस का आगे अवलोकन। संक्षिप्त नाम: पीवी = पोर्टल नस। स्केल बार = 50 μm। इस आंकड़े को झांग एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सामान्य नियंत्रण (Cont.) समूह, रीसस रोटावायरस (RRV) समूह, और RRV + एंटी-Ly6G एंटीबॉडी समूह से यकृत ऊतक स्लाइस का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधलापन दिन 12 और दिन 42 पर । (ए) विभिन्न उपचार समूहों में पित्त नली उपकला कोशिकाओं मार्कर (सीके 19) की अभिव्यक्ति। (बी) मैक्रोफेज की भड़काऊ कोशिका घुसपैठ विभिन्न उपचार समूहों में प्रदर्शित की गई थी। संक्षिप्त नाम: पीवी = पोर्टल नस। लाल तीर पित्त नली उपकला कोशिकाओं को इंगित करता है। काला तीर मैक्रोफेज को इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm। इस आंकड़े को झांग एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न उपचार समूहों में चूहों में यकृत समारोह की तुलना। प्रयोग के बाद माउस रक्त एकत्र किया गया और अस्पताल के प्रयोगशाला विभाग में परीक्षण किया गया। प्रत्येक समूह में तीन से पांच चूहे थे। * P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. संक्षेप: एएलटी = एलानिन एमिनोट्रांसफेरेज़; एएसटी = एस्पार्टेट एमिनोट्रांसफेरेज़; एएलपी = क्षारीय फॉस्फेट; टीबीआईएल = कुल बिलीरुबिन; डीबीआईएल = प्रत्यक्ष बिलीरुबिन; आईबीआईएल = अप्रत्यक्ष बिलीरुबिन। इस आंकड़े को झांग एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हमारे अध्ययन में, हमने तीव्र बीए सिंड्रोम में सुधार करने, जीवित रहने की दर को बढ़ाने और बीए चूहों को पुराने चरण में प्रवेश करने में सक्षम बनाने के लिए आरआरवी से संक्रमित पित्त एट्रेसिया के माउस मॉडल में जीआर -1 + कोशिकाओं को खत्म करने या कम करने के लिए एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी का उपयोग किया। एंटीबॉडी खुराक को कम करने से हेपेटिक फाइब्रोसिस के साथ क्रोनिक बीए हो सकता है, जो इंगित करता है कि जीआर -1 + कोशिकाओं की संख्या तीव्र और पुरानी चरणों में बीए के परिणाम को बदल देती है। हमारे पिछले अध्ययन में, एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के प्रशासन के बाद जीआर -1 + कोशिकाओं को कम कर दिया गया था, और बीए चूहों की समग्र जीवित रहने की स्थितिमें सुधार हुआ था। इसी समय, यह बताया गया है कि जीआर -1 + मैक्रोफेज19, जीआर -1 + न्यूट्रोफिल 20, जीआर -1 + माइलॉयड कोशिकाएं21, और जीआर -1 + ग्रैनुलोसाइट्स कुछ पशु मॉडल 22 में फाइब्रोसिस को बढ़ा सकते हैं। हालांकि, इस अध्ययन में, चूहों में जीआर -1 + कोशिकाओं को एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी की कम खुराक के साथ आंशिक रूप से समाप्त कर दिया गया था, और कोलेजन जमा बने रहे। नतीजतन, बीमारी को अधिक अच्छी तरह से संबोधित करने के लिए अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है।

एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के आवेदन ने सूजन को कम कर दिया, आंशिक रूप से पित्त नलिकाओं को संरक्षित किया, और चूहों में तीव्र बीए-प्रेरित मृत्यु को रोका। हालांकि, केवल 20% से 30% चूहों ने बीए के पुराने चरण में प्रवेश किया; यह समय बिंदु और एंटी-एलवाई 6 जी एंटीबॉडी के इंजेक्शन की संख्या से संबंधित हो सकता है। हमें सफलता दर में सुधार के लिए इस महत्वपूर्ण बिंदु का और पता लगाने की आवश्यकता है। इसके अलावा, हम मानते हैं कि न केवल जीआर -1 + कोशिकाएं बल्कि अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाएं भी महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं, जैसे कि एनके कोशिकाएं, टी कोशिकाएं, बी कोशिकाएं और मैक्रोफेज।

प्रोटोकॉल के लिए, कुछ विवरणों पर ध्यान देने की आवश्यकता है। (i) इंजेक्शन वाली दवाओं के रिसाव से बचने के लिए, हम 0.33 मिमी व्यास की सुई के साथ 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करते हैं, क्योंकि सुई का व्यास छोटा होता है, और सिरिंज में सुई छेद छोटा होता है, जो दवा रिसाव की संभावना को कम करने के लिए अनुकूल होते हैं। (ii) इंजेक्शन से पहले, माउस को स्थानांतरित करने से रोकने, दवा रिसाव से बचने के लिए तय किया जाना चाहिए, और इस प्रकार, प्रयोगात्मक प्रभाव को और सुनिश्चित करना चाहिए। (iii) दवा इंजेक्शन के दौरान, हमने जहां तक संभव हो माउस लिवर की सतह या निचले मार्जिन में दवा को इंजेक्ट किया ताकि दवा पेट में प्रवेश कर जाए और प्रभावी होने के लिए यकृत से पूरी तरह से संपर्क किया जा सके। (iv) इंजेक्शन आमतौर पर माउस की ऊपरी दाईं जांघ से बनाया जाता है, क्योंकि नवजात माउस का पेट और प्लीहा बाएं पेट में होता है, और पेट दूध से भरा होता है। यदि सुई बाईं ओर से डाली जाती है, तो यह आसानी से पेट को पंचर कर सकती है, जिससे दूध पेट में बह सकता है, या प्लीहा पंचर हो सकता है, जिससे रक्तस्राव होता है।

CD177 Ly6G का एक होमोलॉग है, और बीए रोगियों में CD177 की अभिव्यक्ति की जांच की गई है। सीडी 177 का उपयोग बच्चों में बीए के प्रारंभिक निदान के लिए एक मार्कर के रूप में किया जा सकता है, यह दर्शाता है कि सीडी 177 + कोशिकाएं बीए23 के पाठ्यक्रम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। आरएनए अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करके, हमारी टीम ने पाया कि सीडी 177 कोशिकाएं जीआर -1 + कोशिकाओं की प्रमुख आबादी थीं; इस बीच, आरआरवी के साथ टीका लगाए गए सीडी 177−/- बीएएलबी / सी चूहों ने बीए की शुरुआत में देरी दिखाई और रुग्णता और मृत्यु दरको कम किया। इस प्रकार, हमारे क्रोनिक बीए माउस मॉडल में बीए के रोगजनन और रोग की प्रगति का अध्ययन करने के लिए स्पष्ट फायदे हैं; यह बीए के लिए संभावित उपचार का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल भी प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81974056) से आरजेड और चीन के राष्ट्रीय प्रकृति युवा फाउंडेशन (82101808) और गुआंगज़ौ (नंबर 202102020196) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजना से जेडएल तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mouse Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD 20221000112
rat anti-mouse Ly6G Bio X Cell clone 1A8 West Lebanon, NH
rat anti-mouse cytokeratin 19 Developmental Studies Hybridoma Bank clone TROMA III Iowa City, IA
rat anti-mouse F4/80 R&D Systems MAB5580 Minneapolis, MN
RRV strain  ATCC MMU 18006 Manassas, VA
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX7
Leica light microscopy Leica Microsystems Leica DMI8+DFC7000T Wetzlar, Germany
Hitachi Pre-Analytical Process Automation System Hitachi 7600 Clinical Analyzer Tokyo, Japan
Isoflurane anesthetic RWD R510-22-10
Rhodamine 123 Sigma-Aldrich 83702
sirius red dye Leagene DC0041
paraffin microtome Leica Microsystems RM2235
neutral gum Solarbio G8590

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References

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पित्त एट्रेसिया के अध्ययन के लिए क्रोनिक लिवर फाइब्रोसिस का एक माउस मॉडल
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Wang, X., Zhang, R., Lin, Z., Fu,… More

Wang, X., Zhang, R., Lin, Z., Fu, M., Chen, Y. A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia. J. Vis. Exp. (192), e65044, doi:10.3791/65044 (2023).

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