Summary
Vi etablerte en musemodell av kronisk leverfibrose, som gir en egnet dyremodell for virusindusert leverfibrose mekanistisk studie av biliær atresi (BA) og en plattform for fremtidige BA-behandlinger.
Abstract
Biliær atresi (BA) er en dødelig sykdom som involverer obstruktiv gulsott, og det er den vanligste indikasjonen for levertransplantasjon hos barn. På grunn av den komplekse etiologien og ukjent patogenese er det fortsatt ingen effektive medikamentelle behandlinger. For tiden er den klassiske BA-musemodellen indusert av rhesus rotavirus (RRV) den mest brukte modellen for å studere patogenesen av BA. Denne modellen er preget av vekstretardering, gulsott av hud og slimhinner, leire avføring og mørk gul urin. Histopatologien viser alvorlig leverbetennelse og obstruksjon av de intrahepatiske og ekstrahepatiske gallekanalene, som ligner symptomene på human BA. Imidlertid mangler leveren til sluttstadiet mus i denne modellen fibrose og kan ikke fullt ut simulere egenskapene til leverfibrose i klinisk BA. Den presenterte studien utviklet en ny BA-musemodell av kronisk leverfibrose ved å injisere 5-10 μg anti-Ly6G-antistoff fire ganger, med hull på 2 dager etter hver injeksjon. Resultatene viste at noen av musene vellykket dannet kronisk BA med typisk fibrose etter tidsforløpet, noe som betyr at disse musene representerer en egnet dyremodell for virusindusert leverfibrose mekanistisk studie av BA og en plattform for å utvikle fremtidige BA-behandlinger.
Introduction
Biliær atresi (BA) er en alvorlig hepatobiliær sykdom som ofte forekommer hos spedbarn og små barn; Spesielt presenterer den som en utslettende kolangiopati med neonatal gulsott og blek avføring1. Dens kliniske egenskaper er inflammatorisk ødeleggelse av intrahepatiske og ekstrahepatiske gallekanaler og progressiv fibrose, som til slutt utvikler seg til leversvikt2. Ifølge statistikken er forekomsten av BA i asiatiske land høyere enn i europeiske og amerikanske land, og forekomsten av BA i asiatiske land er 1/8000. Etiologien til BA inkluderer virusinfeksjon, unormal gallegangsutvikling, immunforstyrrelser og genetiske variasjoner3. Kasai kirurgi er den mest brukte metoden for å forbedre kolestase hos barn med BA, men til syvende og sist kan dette ikke forhindre progresjon av fibrose4. Den nåværende behandlingen for BA er hovedsakelig avhengig av levertransplantasjon, som er begrenset av mangel på leverkilder. En grundig studie av patogenesen til BA er det mest direkte middelet for å løse utfordringene ved denne sykdommen. Studier av patogenesen til BA er imidlertid hovedsakelig avhengige av BA-dyremodeller, og det er avgjørende å velge en passende dyremodell.
De fleste histopatologiske studier av BA har vist at gallegangshyperplasi (BDP), galletromlose og portalvenefibrose er de viktigste patologiske egenskapene til BA, og andre patologiske trekk av forskjellige karakterer eksisterer samtidig, for eksempel portal inflammatorisk celleinfiltrasjon og hepatocytthevelse 5,6. For tiden finnes det en rekke musemodeller som etterligner BA, for eksempel den kroniske 3,5-die-thoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidin (DDC)-matede musemodellen med segmental gallegangsobstruksjon og perikolangitt som involverer de ekstrahepatiske gallegangene7 og musemodellen av leverfibrose med en intraperitoneal injeksjon av karbontetraklorid8. Gallegangsligeringsmodellen (BDL) er preget av gulsott og rask portalvenefibrose9. Den alfa-naftylisotiocyanat (ANIT)-matede musemodellen presenterer med kolangitt begrenset til den intrahepatiske gallegangen og hepatocyttskade10. En musemodell med langvarig gulsott induseres av forsinket rhesus rotavirus (RRV) inokulasjon11. Selv om det finnes en rekke dyremodeller, spesielt musemodeller, har hver modell sine egne begrensninger. De kan bare simulere en del av sykdomsegenskapene til BA, for eksempel akutt betennelse eller leverfibrose i prosessen med biliær atresi, og det er ingen modell som er svært konsistent med sykdomsprosessen og patologiske trekk ved BA.
Den klassiske BA-musemodellen er indusert av RRV, og denne modellen er den mest liknende modellen til BA hos mennesker. Imidlertid, mens RRV-induserte BA-modellmus viser lignende kliniske symptomer og patologiske egenskaper til noen av de av ekstrahepatisk biliær atresi, mangler denne modellen leverfibrose, noe som i stor grad begrenser den grundige studien av BA-mekanismene og utviklingen av nye behandlinger12. Derfor utviklet denne studien en ny BA-musemodell av kronisk leverfibrose. Anti-Ly6G-antistoff ble injisert intraperitonealt før RRV-inokulasjon på fødselsdagen. Deretter ble 5-10 μg anti-Ly6G antistoff injisert fire ganger, med mellomrom på 2 dager mellom hver injeksjon. BA-symptomene hos mus ble forbedret, overlevelsestiden ble forlenget, og musene gikk inn i kronisk fibrosestadium. Denne modellen simulerer ikke bare den akutte faseresponsen til BA, men etterligner også leverprosessene og progressiv fibrose. Dermed er det en mer egnet dyremodell for den mekanistiske studien av BA, og det kan gi et teoretisk grunnlag for å utvikle fremtidige behandlinger for BA.
Gr-1-molekylet er en myeloide-avledet celleoverflatemarkør opprinnelig funnet å være uttrykt i nøytrofiler13. Uttømmingen av anti-Ly6G-antistoffer reduserer sirkulerende nøytrofiler med mer enn 90% og endrer responsen aktivert av andre immunceller. Funksjonene til Gr-1+ cellepopulasjoner har blitt rapportert i forskjellige studier ved bruk av spesifikke scavenging antistoffer, med varierende effekter identifisert på cytokiner og mediert immunbeskyttelse14. Vi har studert funksjonen til Gr-1+ celler i RRV-inokulerte BA-musemodeller. Men siden Gr-1-molekylet ikke har blitt funnet å være uttrykt hos mennesker, har et lignende molekyl, CD177, blitt studert hos BA-pasienter15. Våre data beviser betydningen av Gr-1+ cellepopulasjoner, spesielt i kronisk fibrotisk fase av sykdommen, og gir en egnet dyremodell for å undersøke potensielle BA-terapier.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Guangzhou Yongnuo Biomedical Animal Center (IACUC-AEWC-F2208020), hvor alle dyreforsøkene ble utført.
1. Etablering av kronisk fibrotisk BA-musemodell
MERK: Alle dyrene ble holdt i et spesifikt patogenfritt (SPF) miljø i samme rom, og forsøkene ble utført i et konvensjonelt miljø. BALB / c mus på dag 12.5 av svangerskapet (alder: 10-12 uker, vekt 35-40 g) ble holdt i et rom uten spesifikke patogener ved 25 ° C under en 12 timers mørk / lys syklus og ble utstyrt med fri tilgang til autoklavert mat og vann. Nyfødte mus, innen 24 timer etter fødselen (gjennomsnittlig kroppsvekt: 1,5-1,6 g), ble valgt for musens BA-modell.
- Forbered RRV som tidligere rapportert16.
MERK: På grunn av den dårlige overlevelsesstatusen til modellmusene, må de skilles ved 21 dager gamle for å unngå at de blir bitt eller til og med drept av andre mus i samme bur. - Del nyfødte mus i tre grupper: kontrollgruppen, RRV-gruppen og RRV + anti-Ly6G-gruppen. Intraperitonealt injiser de nyfødte musene med 20 μL RRV (titer: 1,5 x 106 PFU / ml) (RRV-gruppe) eller saltvann (kontrollgruppe) innen 24 timer etter fødselen. For å tømme Gr-1+ celler, forbehandle hver mus med en intraperitoneal injeksjon av 5 μg anti-Ly6G antistoff 4 timer før RRV-injeksjonen.
MERK: Anti-Ly6G antistoffoppløsningen oppbevares ved 2-8 °C og skal ikke fryses. Ta antistoffet ut før bruk og sett det i romtemperatur i 30 minutter for å varme opp. - Injiser 10 μg anti-Ly6G antistoff i magen på musen hver 3. dag til dag 12 etter RRV-injeksjonen (figur 1A).
- Sjekk og registrer utseendet, vekten og overlevelsen til alle musene daglig.
2. Intraperitoneal injeksjon av musene
- Fjern nyfødte mus fra buret. Bruk en 1 ml insulinsprøyte til å injisere 20 μL RRV-oppløsning eller 50 mikrol anti-Ly6G-antistoffoppløsning. Klem nakkehuden til den unge musen med pekefingeren og tommelen på den ene hånden, og hold forsiktig bakbenene på musen med ringfingeren og halefingeren for å avsløre magen.
- Løft nålen i en stigning oppover. Stikk nålen inn i midten av låret på høyre bakben av musen i en vinkel på 15° i forhold til huden. Etter å ha beveget seg langs den subkutane banen til nålen når høyre kystkant av musen, rett nålen nedover i bukhulen. Deretter injiserer væsken under leveren av musen.
MERK: Nyfødte mus har magen og milten i venstre underliv. Hvis en nål settes inn på venstre side, er det lett å pierce magen eller forårsake miltblødning. - Trekk nålen ut umiddelbart etter injeksjonen, og se etter blødning eller lekkasje på injeksjonsstedet. Hvis det er noen, tørk det med en autoklavert bomull. Sett musen tilbake i morens bur.
MERK: For å redusere påvirkningen av væskelekkasje under injeksjon på de eksperimentelle resultatene, sørg for at injeksjonen er forsiktig, fjern kanylen sakte og trykk på injeksjonsstedet med en bomullspinne i 30 sekunder.
3. Innsamling av prøvevev
- På dag 12, bedøv musene med 4% isofluran innånding, og dissekere dem under et mikroskop. Sett inn en 1 ml insulinsprøyte i venstre hjertekammer for å samle blod. Etter blodoppsamling, avlive musene ved innånding av 4% isofluran i 10 minutter. Sentrifuger blodet ved 400 × g i 5 minutter ved romtemperatur, og separer serumet for leverfunksjonsmålinger.
MERK: Blodinnsamling må utføres mens musene er i live. Hvis musene dør, vil blodet holdes i blodårene og kan ikke samles. - Fotografer det generelle utseendet til leveren og gallekanalen. Deretter dissekerer musen, leveren og milten fra det omkringliggende vevet med saks og pinsett.
MERK: Leveren og annet vev samles og reserveres ved -80 ° C for RNA og proteinekstraksjon eller gjennomvåt i 10% formalin for fremstilling av histologiske prøver.
4. Fluoresceinangiografi av den ekstrahepatiske gallekanalen
- Etter å ha avlivet musen, må du helt utsette leveren, galleblæren og ekstrahepatiske gallekanaler med saks og bomullspinne.
- Observer under et holdningsmikroskop, injiser 5-10 μL av fluorescerende fargestoff rhodamine 123 (20 mg / ml) i galleblæren med en 1 ml insulinsprøyte, og ta bilder. Denne prosessen er den samme som rapportert i en tidligere16.
MERK: Ulike mus i samme gruppe brukes til prøvevevsinnsamling og fluorescensangiografi.
5. Farging av H&E
- Dypp fersk mus levervev i 10% formalin i 24 timer.
- Etter å ha lagt vevet i parafin, bruk en parafinmikrotome til å kutte parafinblokken i seksjoner med en tykkelse på 4 μm, og plasser to påfølgende seksjoner på samme lysbilde. Erfarent personell er pålagt å standardisere operasjonen for å unngå fingerkutt17.
- Legg skivene i et skivestativ, avvoks dem i xylen, hydrater dem suksessivt i absolutt etanol, 95% etanol, 80% etanol, 70% etanol og destillert vann, og suge i hver i 5 minutter.
- Flekk seksjonene med hematoksylinoppløsning i 5 minutter, og suge dem i 1% saltsyre og 75% alkohol i 5 s. Skyll seksjonene med rent vann, og flekk med eosinoppløsning i 1 min.
6. CK19 og F4/80 immunhistokjemisk farging
- De tre første trinnene er de samme som trinnene for vevsinnbygging, seksjonering og avvoksing i H&E-fargeseksjonen.
- Utfør antigenreparasjon med Tris-EDTA-buffer (10 mmol/L Tris base, 1 mmol / L EDTA-løsning, pH 9,0), varm seksjonene i en mikrobølgeovn ved 95 ° C i 10 minutter, og fjern og avkjøl dem deretter naturlig til romtemperatur.
- Plasser vevsseksjonene i 3% hydrogenperoksidoppløsning i 10 minutter for å fjerne endogen peroksidase.
- Behandle skivene med 5% geiteserum for å blokkere uspesifikk binding.
- Legg til primært cytokeratin fra rotter 19 eller anti-mus F4/80 monoklonalt antistoff fra rotter i seksjonene, og inkuber over natten ved 4 °C.
- Inkuber seksjonene med passende sekundære antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur.
- Bruk 3,3'-diaminobenzidin (DAB) som et kromogent middel for å observere den kromogene reaksjonen under mikroskopet.
- Observer skivene under et 40x mikroskop for å få bilder, og analyser dem etter behov.
7. Sirius rød farging
- Utfør de tre første trinnene av vevsinnbygging, seksjonering og avvoksing som beskrevet i H&E-fargingsdelen.
- Etter at vevsseksjonene er motfarget med hematoksylin, dekk hvert vev med 50 μL Sirius rødfargestoffoppløsning ved romtemperatur i 1 time.
- Tørk lysbildene naturlig ved romtemperatur i 4 timer, legg til en dråpe nøytral tyggegummi til hvert lysbilde, og bruk en deksel for å sakte dekke vevet for å unngå bobler. La lysbildene stå i romtemperatur i 24 timer for å størkne det nøytrale tannkjøttet.
- Bruk en polarisert kontrastlysmikroskopi for å observere detaljene i kollagenavsetning; Velg et klart og passende synsfelt, og juster lysstyrken og hvitbalansen i mikroskopets synsfelt. Få bilder, og analyser dem etter behov under et 40x mikroskop.
Representative Results
Musene ble intraperitonealt injisert med 5 μg anti-Ly6G-antistoff innen 24 timer etter fødselen og deretter intraperitonealt injisert med 20 μL RRV 4 timer senere. Deretter ble det injisert 10 μg anti-Ly6G-antistoff hver 3. dag frem til dag 12 (figur 1A). Median overlevelsestid i RRV-gruppen var 13 dager. Tvert imot utviklet de fleste musene som ble behandlet med antistoffet mild gulsott, og det ble ikke observert noe vekttap (figur 1C). Omtrent 20% -30% av musene hadde BA-syndrom med langvarig gulsott og lav kroppsvekt, men overlevde i mer enn 42 dager. Etter anti-Ly6G antistoffbehandling reduserte antall Gr-1 + celler15, og musene gikk inn i stadiet av kronisk fibrose, kalt kronisk BA. Prøver ble tatt dag 12 og dag 42, og vevsskiver farget med Sirius Red viste en gradvis økning i leverfibrose. De kroniske BA-musene som overlevde i 42 dager ble brukt til detaljerte analyser. I tillegg til den lille størrelsen viste ørene, føttene og halehuden markert gulsott (blå piler i figur 1E). På dag 6 etter RRV-injeksjonen ble avføringsfargen til musene lysere, og urinfargen ble mørkere; Dette ble signifikant forskjellig fra kontrollgruppen på dag 12, da RRV-gruppen mus viste hvit avføring og mørk gul urin. Dag 42 viste urin og avføring hos de kroniske BA-musene også tydelige trekk ved gulsott (figur 1D,E). Leveren til BA-musene ble fjernet og sammenlignet med kontrollene. Leveren var mindre (figur 2B), nekrotiske lesjoner var synlige for det blotte øye (figur 2A, svart trekant), og et segment av gallegangsatresi ble også observert ekstrahepatisk (figur 2A, hvite stjerner).
Analyser av levervevssnitt viste at lavdose anti-Ly6G-behandling reduserte portvenebetennelse. Imidlertid ble det fortsatt observert inflammatorisk celleakkumulering i levervevsskivene ved dag 42 (figur 3A). Sirius Red-farging viste en liten økning i avsetningen av kollagen i portalregionen på dag 12 etter RRV-injeksjonen. Videre ble det ikke observert signifikante endringer i kollagenuttrykk etter behandling med anti-Ly6g-antistoffet, men kollagenuttrykket i BA-vevsprøver ved dag 42 var signifikant økt (figur 3B). Når det ble undersøkt under et polarisert lysmikroskop, ble det observert at kollagenfibre hadde akkumulert i det tilstøtende levervevet. En betydelig avleiring av kollagen, hovedsakelig grønt, ble sett i BA-vevsprøvene ved dag 42 (figur 3C), og kollagenavsetningen økte ytterligere hos mus som overlevde i 42 dager uten vektøkning. Ved reduksjon av portalinflammasjon ble CK19+ gallegangsceller observert på dag 12. På dag 42 var imidlertid modne galleganger knapt påviselige, selv om det ble sett en økning i CK19+ gallegangsceller (figur 4A, røde piler indikerer gallegangsepitelceller). Ved ekstrahepatiske galleganger hos mus med kronisk BA viste seriell disseksjon av portalregionen hos mus at de ekstrahepatiske gallegangene var blokkert og hadde inflammatoriske infiltrater av makrofager (figur 4B, svarte piler indikerer makrofager).
Sammenlignet med RRV alene, reduserte behandling med en lav dose anti-Ly6G antistoff leverskade med hensyn til leverenzymnivåer på dag 12 etter RRV-inokulering. Alaninaminotransferase og alkalisk fosfatase i leveren var høyere i kronisk BA-gruppen enn i den normale kontrollgruppen. De mest uttalte endringene ble funnet i bilirubinnivåene, med RRV + anti-Ly6G-mus som viste reduserte TBIL-, DBIL- og IBIL-nivåer i akutt BA i motsetning til RRV alene. Hos mus med kronisk BA økte nivåene av TBIL, DBIL og IBIL (figur 5), noe som indikerer at leverfunksjonen var signifikant redusert i kronisk fibrosestadium av BA.
Figur 1: Effektene av anti-Ly6G antistoffbehandling i en musemodell av biliær atresi infisert med RRV. (A) Skjematisk illustrasjon av lave doser antistoffer for å indusere akutt og kronisk fase BA hos mus med piler som indikerer tidspunktet for injeksjon av antistoff og RRV. (B) Overlevelseskurver for musene i gruppen med normal kontroll (forts.) og RRV + anti-Ly6G antistoffgruppe. (C) Kroppsvektskurver for musene i hver gruppe. (D) Representative bilder av musene og deres avføring og urin i hver gruppe på dag 12. (E) Representative bilder av musene og deres avføring og urin i hver gruppe på dag 42. De blå pilene indikerer de gule ørene og halen. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Zhang et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effektene av anti-Ly6G antistoffbehandling på leveren i en musemodell av biliær atresi infisert med RRV . (A) Sammenligning av leveranatomi og ekstrahepatisk gallegangsfluorescensangiografi mellom kroniske BA-mus (til høyre) og normale mus på dag 42. (B) Sammenligning av leverstørrelsen mellom kroniske BA-mus og normale mus. Den svarte trekanten indikerer levernekrose hos mus med kronisk BA. Den hvite stjernen indikerer ekstrahepatisk biliær atresi. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Zhang et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levervevsskiver av musene i normalkontrollgruppen (forts.) gruppen, rhesus rotavirus (RRV) gruppen og RRV + anti-Ly6G antistoffgruppen dag 12 og dag 42. (A) Bilder av levervevssnitt farget med hematoksylin og eosin (H&E). (B) Sirius rødfarging viste kollagenavsetning (PSR). (C) Videre observasjon av skivene ved hjelp av polarisert lysmikroskopi (Pol. Light). Forkortelse: PV = portalvene. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er modifisert fra Zhang et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Immunhistokjemisk farging av levervevsskiver fra normalkontrollgruppen (forts.) gruppen, rhesusrotavirusgruppen (RRV) og RRV + anti-Ly6G antistoffgruppen dag 12 og dag 42. (A) Uttrykket av gallegangsepitelcellemarkør (CK19) i forskjellige behandlingsgrupper. (B) Inflammatorisk celleinfiltrasjon av makrofager ble påvist i forskjellige behandlingsgrupper. Forkortelse: PV = portalvene. Den røde pilen indikerer epitelceller i gallekanalen. Den svarte pilen indikerer makrofager. Skala bar = 50 μm. Denne figuren er modifisert fra Zhang et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av leverfunksjon hos mus i ulike behandlingsgrupper. Museblod ble samlet etter forsøket og testet i laboratorieavdelingen på sykehuset. Hver gruppe inneholdt tre til fem mus. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Forkortelser: ALT = alaninaminotransferase; AST = aspartataminotransferase; ALP = alkalisk fosfatase; TBIL = totalt bilirubin; DBIL = direkte bilirubin; IBIL = indirekte bilirubin. Denne figuren er modifisert fra Zhang et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
I vår studie brukte vi anti-Ly6G-antistoff for å eliminere eller redusere Gr-1 + celler i en musemodell av biliær atresi infisert med RRV for å forbedre akutt BA-syndrom, forlenge overlevelsesraten og gjøre det mulig for BA-mus å gå inn i kronisk fase. Reduksjon av antistoffdosen kan føre til kronisk BA med leverfibrose, noe som indikerer at antall Gr-1+ celler endrer resultatet av BA i akutte og kroniske faser. I vår tidligere studie ble Gr-1 + -celler redusert etter administrering av anti-Ly6G-antistoff, og den totale overlevelsesstatusen til BA-musene ble forbedret15. Samtidig er det rapportert at Gr-1+ makrofager19, Gr-1+ nøytrofile20, Gr-1+ myeloide celler21 og Gr-1+ granulocytter kan forsterke fibrose i noen dyremodeller22. I denne studien ble imidlertid Gr-1+ celler hos mus delvis utarmet med lave doser anti-Ly6G-antistoff, og kollagenavsetninger forble. Som et resultat kan det være behov for mer tid til å behandle sykdommen grundigere.
Anvendelsen av anti-Ly6G-antistoffet reduserte betennelse, delvis bevarte gallegangene og forhindret akutt BA-indusert død hos mus. Imidlertid gikk bare 20% til 30% av musene inn i kronisk fase av BA; Dette kan være relatert til tidspunkt og antall injeksjoner av anti-Ly6G antistoff. Vi må utforske dette nøkkelpunktet videre for å forbedre suksessraten. I tillegg vurderer vi at ikke bare Gr-1+ celler, men også andre immunceller kan spille viktige roller, som NK-celler, T-celler, B-celler og makrofager.
Når det gjelder protokollen, må noen detaljer noteres. (i) For å unngå lekkasje av injiserte legemidler bruker vi en 1 ml insulinsprøyte med en nål på 0,33 mm diameter, fordi nålediameteren er liten og nålehullet i sprøyten er lite, noe som bidrar til å redusere muligheten for legemiddellekkasje. (ii) Før injeksjonen skal musen festes for å forhindre at den beveger seg, unngå legemiddellekkasje og dermed ytterligere sikre den eksperimentelle effekten. (iii) Under legemiddelinjeksjon injiserte vi stoffet i overflaten eller nedre margin av museleveren så langt som mulig, slik at stoffet kom inn i magen og fullstendig kontaktet leveren for å tre i kraft. (iv) Injeksjonen er vanligvis laget fra øvre høyre lår av musen, fordi den nyfødte musens mage og milt er i venstre underliv, og magen er full av melk. Hvis nålen settes inn fra venstre side, kan den lett punktere magen, forårsake melk å strømme inn i magen, eller punktere milten, forårsaker blødning.
CD177 er en homolog av Ly6G, og uttrykket av CD177 hos BA-pasienter har blitt undersøkt. CD177 kan brukes som en markør for tidlig diagnose av BA hos barn, noe som indikerer at CD177+ celler spiller en betydelig rolle i løpet av BA23. Ved å analysere RNA-sekvenseringsdataene fant teamet vårt at CD177-celler var den dominerende populasjonen av Gr-1 + -celler; Samtidig viste Cd177−/− BALB/c-mus vaksinert med RRV forsinket debut av BA og redusert sykelighet og mortalitet18. Dermed har vår kroniske BA-musemodell åpenbare fordeler for å studere patogenesen og sykdomsprogresjonen til BA; det gir også en egnet dyremodell for å studere potensielle behandlinger for BA.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (81974056) til RZ og fra National Nature Youth Foundation of China (82101808) og Science and Technology Planning Project of Guangzhou (nr. 202102020196) til Z.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mouse | Guangdong Skarjingda Biotechnology Co., LTD | 20221000112 | |
| rat anti-mouse Ly6G | Bio X Cell | clone 1A8 | West Lebanon, NH |
| rat anti-mouse cytokeratin 19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | clone TROMA III | Iowa City, IA |
| rat anti-mouse F4/80 | R&D Systems | MAB5580 | Minneapolis, MN |
| RRV strain | ATCC | MMU 18006 | Manassas, VA |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX7 | |
| Leica light microscopy | Leica Microsystems | Leica DMI8+DFC7000T | Wetzlar, Germany |
| Hitachi Pre-Analytical Process Automation System | Hitachi | 7600 Clinical Analyzer | Tokyo, Japan |
| Isoflurane anesthetic | RWD | R510-22-10 | |
| Rhodamine 123 | Sigma-Aldrich | 83702 | |
| sirius red dye | Leagene | DC0041 | |
| paraffin microtome | Leica Microsystems | RM2235 | |
| neutral gum | Solarbio | G8590 |
References
- Lakshminarayanan, B., Davenport, M. Biliary atresia: A comprehensive review. Journal of Autoimmunity. 73, 1-9 (2016).
- Bassett, M. D., Murray, K. F.
- Bezerra, J. A., et al. Biliary atresia: Clinical and research challenges for the twenty-first century. Hepatology. 68 (3), 1163-1173 (2018).
- Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A.
- Lee, W. S., Looi, L. M. Usefulness of a scoring system in the interpretation of histology in neonatal cholestasis. World Journal of Gastroenterology. 15 (42), 5326-5333 (2009).
- Russo, P., et al. Key histopathologic features of liver biopsies that distinguish biliary atresia from other causes of infantile cholestasis and their correlation with outcome: A multicenter study. The American Journal of Surgical Pathology. 40 (12), 1601-1615 (2016).
- Fickert, P., et al. Characterization of animal models for primary sclerosing cholangitis (PSC). Journal of Hepatology. 60 (6), 1290-1303 (2014).
- Sonoda, S., et al. Biliary atresia-specific deciduous pulp stem cells feature biliary deficiency. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 582 (2021).
- Xiao, Y., et al. Long noncoding RNA H19 contributes to cholangiocyte proliferation and cholestatic liver fibrosis in biliary atresia. Hepatology. 70 (5), 1658-1673 (2019).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Van Damme, B. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Luo, Z., Shivakumar, P., Mourya, R., Gutta, S., Bezerra, J. A. Gene expression signatures associated with survival times of pediatric patients with biliary atresia identify potential therapeutic agents. Gastroenterology. 157 (4), 1138-1152 (2019).
- Mariotti, V., Strazzabosco, M., Fabris, L., Calvisi, D. F. Animal models of biliary injury and altered bile acid metabolism. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1254-1261 (2018).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40 (1), 35-48 (2008).
- McDermott, A. J., et al. The role of Gr-1(+) cells and tumour necrosis factor-α signalling during Clostridium difficile colitis in mice. Immunology. 144 (4), 704-716 (2015).
- Zhang, R., et al. The role of neonatal Gr-1(+) myeloid cells in a murine model of rhesus-rotavirus-induced biliary atresia. The American Journal of Pathology. 188 (11), 2617-2628 (2018).
- Fu, M., et al. A silver nanoparticle method for ameliorating biliary atresia syndrome in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58158 (2018).
- Sy, J., Ang, L. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Methods in Molecular Biology. 1897, 269-278 (2019).
- Zhang, R., et al. CD177(+) cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. Journal of Hepatology. 77 (5), 1299-1310 (2022).
- Engel, D. R., et al. CX3CR1 reduces kidney fibrosis by inhibiting local proliferation of profibrotic macrophages. Journal of Immunology. 194 (4), 1628-1638 (2015).
- Liang, M., et al. A modified murine model of systemic sclerosis: Bleomycin given by pump infusion induced skin and pulmonary inflammation and fibrosis. Laboratory Investigation. 95 (3), 342-350 (2015).
- Chen, Y., et al. Differential effects of sorafenib on liver versus tumor fibrosis mediated by stromal-derived factor 1 alpha/C-X-C receptor type 4 axis and myeloid differentiation antigen-positive myeloid cell infiltration in mice. Hepatology. 59 (4), 1435-1447 (2014).
- Tomasson, M. H., et al. Fatal myeloproliferation, induced in mice by TEL/PDGFbetaR expression, depends on PDGFbetaR tyrosines 579/581. Journal of Clinical Investigation. 105 (4), 423-432 (2000).
- Zhang, R., Huang, J., Shan, J., Chen, Y., Xia, H. Peripheral blood CD177(+) cells as an early diagnostic marker for biliary atresia: A prospective multicentre study in pediatric patients with cholestasis. Journal of Hepatology. 77 (6), 1714-1716 (2022).
