Mätning av embryonal livskraft och yngelstorlek hos Caenorhabditis elegans

Summary

Här presenterar vi en generell metod för att bestämma embryonal livskraft och totalt antal producerade embryon (yngel) med hjälp av modellorganismen C. elegans.

Abstract

Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för studier av meios, befruktning och embryonal utveckling. C. elegans existerar som självbefruktande hermafroditer, som producerar stora kullar av avkomma - när hanar är närvarande kan de producera ännu större kullar av korsavkomma. Fel i meios, befruktning och embryogenes kan snabbt bedömas som fenotyper av sterilitet, minskad fertilitet eller embryonal dödlighet. Denna artikel beskriver en metod för att bestämma embryonal livskraft och yngelstorlek hos C. elegans. Vi demonstrerar hur man ställer in denna analys genom att plocka en mask på en enskild modifierad ungens, enda bacco-peptonplatta (MYOB), fastställa lämplig tidsram för att räkna livskraftiga avkommor och icke-livskraftiga embryon och förklara hur man exakt räknar levande maskprover. Denna teknik kan användas för att bestämma livskraften vid självbefruktande hermafroditer samt korsbefruktning genom parningspar. Dessa relativt enkla experiment är lätt att anta för nya forskare, såsom studenter och förstaårsstudenter.

Introduction

Sexuell reproduktion i eukaryota organismer kräver produktion av funktionella gameter som sammanfogar för att bilda ett embryo genom befruktningsprocessen. Maternal och faderlig gameter, ägg (ägg) och spermier skapas genom de specialiserade celldelnings- och differentieringsprocesserna för meios och gametogenes¹. Meios börjar med en enda diploid cell och slutar med bildandet av dotterceller som innehåller hälften av antalet kromosomer i den ursprungliga föräldracellen. Från reduktion av ploidi till blandning av genetiskt material via oberoende sortiment och crossover-rekombination tjänar meios flera viktiga funktioner¹. Fel inom meios kan resultera i aneuploidi, där det finns för många eller för få kromosomer i en könscell. Förekomsten av aneuploidi har enorma effekter på människors hälsa, eftersom kromosomala obalanser är en viktig orsak till missfall och utvecklingsstörningar som Downs syndrom och Edwards syndrom².

Befruktning är den process genom vilken moder- och faderns gameter smälter samman för att generera en ny organism³. Gamete-gamete erkännande underlättas av proteiner på gamete ytan³. Fel med gametkompatibilitet leder till infertilitet eftersom spermier och äggfusion inte kan fortsätta. Fusionen av spermier med en oocyt utlöser en mängd händelser som leder till korrekt bildning av ett aktivt embryo som kan börja utvecklingsresan från ett encelligt embryo till en fullt fungerande multicellulär organism via mitotiska uppdelningar⁴. Under hela embryogenesen måste molekylära händelser som reglerar utvecklingen vara tätt reglerade och exakt tidsinställda för att möjliggöra korrekt tillväxt av organismen⁵. Korrekt celldifferentiering under tidig utveckling är avgörande när organismen övergår från ett pluripotent embryo till en fullvärdig organism. På grund av komplexiteten i dessa händelser kan störningar leda till utvecklingsdefekter som resulterar i embryonal dödlighet.

Caenorhabditis elegans är en utmärkt modellorganism för att studera meios, befruktning och embryonal utveckling. C. elegans är en genomskinlig nematod som har två kön, män och hermafroditer. C. elegans hermafroditer, som kan självbefruktas, är det dominerande könet ^6,7. Hermafroditgonaden producerar först spermier under det fjärde larvstadiet (L4), som lagras i spermatheka. Vid övergången L4 till vuxen ålder växlar könslinjen till att producera äggceller, som sedan befruktas via de lagrade spermierna. Män, som uppstår i hermafroditer med en hastighet av mindre än 0,2%, producerar bara spermier och kan para sig med hermafroditer. Vid korsbefruktning konkurrerar manliga spermier ut hermafroditspermier vid befruktning av oocyter⁸. Detta möjliggör relativt enkelt underhåll av homozygota mutanter genom självbefruktande bestånd och för genetisk manipulation genom genetiska korsningar. De två könen möjliggör studier som undersöker skillnader mellan meios i manliga och kvinnliga könslinjer. Vidare, på grund av den transparenta naturen hos C. elegans och dess ägg, kan processerna för meios, gametogenes, befruktning och embryogenes studeras hos levande, intakta djur med hjälp av fluorescensavbildningstekniker.

Vid analys av nya mutationer i gener som kan spela en roll i meios, befruktning och / eller embryonal utveckling hos C. elegans, är ett avgörande första steg att bestämma embryonal livskraft och yngelstorlek eftersom fel i dessa processer ofta leder till ett misslyckande eller minskning av produktionen av livskraftig avkomma. Detta dokument beskriver ett protokoll för bedömning av fertilitet, embryonal livskraft och yngelstorlek från antingen självbefruktande hermafroditer eller korsningar mellan hermafroditer och män. Medan denna klassiska analys har använts i många C. elegans-studier , tillhandahåller vi ett standardiserat protokoll för installation och noggrann kvantifiering. I detta protokoll isoleras enskilda maskar eller hanar/hermafroditpar för att möjliggöra parning och avkommaproduktion. Avkommans produktion och livskraft observeras under en serie dagar för att fastställa antalet livsdugliga avkommor och icke-livsdugliga embryon. Vid experimentets slut analyseras enskilda kullar för att beräkna embryonal livskraftsprocent och total yngelstorlek.

Protocol

Se materialförteckningen för detaljer om alla material som används i detta protokoll.

1. Förbereda experimentplattor

1. Förbered petriskålar med en diameter på 35 mm med modifierade youngrens, endast bactouteptonmedia (MYOB). För att göra MYOB-plattor, tillsätt 20 g Bacto agar, 2 g NaCl, 0,55 g Trizma-HCl, 0,24 g Trizma-OH, 3,1 g Bacto pepton och 1,6 ml kolesterol till 1 L ddH₂O och autoklav i 40 min vid 121 ° C. Låt svalna till 55 °C och häll 4 ml av det smälta mediet i varje 35 mm petriskål med steril teknik.
   OBS: En liter MYOB gör ~ 250 plattor, som kan förvaras vid 4 ° C i upp till 6 månader. Vi rekommenderar minst 10 personer per replikat med tre replikatuppsättningar för varje stam.
2. Använd steril teknik och frö plattorna med en liten fläck (cirka 50 μl) OP50-bakterier i mitten av plattan.
   OBS: Små gräsmattor är särskilt viktiga för att bedöma korsbefruktning eftersom den mindre fläcken leder till ökade möten mellan hanar och hermafroditer, vilket ökar chansen att para sig.

2. Embryonala livsduglighetsanalyser (självbefruktning av hermafroditer)

1. Dag 1
   1. Märk baksidan av varje platta. Var noga med att hålla reda på varje platta och deras respektive maskar under hela experimentet.
      OBS: Föredragen märkningsteknik-Dag 1: mask 1, Dag 1: mask 2, ... etc.
   2. Överför en individuell hermafrodit i L4-steget på varje platta. Se till att inga embryon eller andra maskar överförs till plattan. Låt maskarna utvecklas till vuxna och lägg självavkomman i 24 timmar vid standardodlingstemperaturen 20 °C. Poängsätt dessa tallrikar på dag 3.
      OBS: Temperaturen på experiment kan ändras vid temperaturkänsliga mutationer. För temperaturkänsliga mutationer bör embryonala viabilitetsanalyser utföras vid både tillåtande (15–16 °C) och icke-tillåtande temperaturer (24–26 °C).
2. Dag 2
   1. Märk en uppsättning nya tallrikar-Dag 2: mask 1, Dag 2: mask 2, ... etc.
   2. Överför dag 1 enskilda maskar till de nya plattorna.
      OBS: Dessa maskar borde ha nått vuxen ålder, och vildtypsmaskar borde redan ha börjat lägga embryon.
   3. Låt maskarna lägga embryon i 24 timmar vid 20 °C eller annan lämplig temperatur. Poängsätt dessa tallrikar på dag 4.
3. Dag 3
   1. Märk en uppsättning nya plattor. Dag 3: mask 1, dag 3: mask 2, ... etc.
   2. Överför dag 2 enskilda maskar till nya plattor. Låt dem värpa avkomman i 24 timmar vid 20 °C eller annan lämplig temperatur. Gör dessa tallrikar på dag 5.
      OBS: Vid lägre temperaturer kommer kläckningstiderna att ökas. Justera därefter.
   3. Rita ett rutmönster på ett 35 mm lock med en fin markör. Placera locket med galler under testplattan för räkning för att hålla reda på maskar som tidigare räknats (figur 1A–B).
      1. Använd en differentiell cellräknare, poängsätt dag 1-plattorna för närvaro eller frånvaro av avkomma. Räkna levande larver och okläckta embryon.
         OBS: Vid denna tidpunkt har tillräckligt med tid förflutit så att eventuella livsdugliga embryon borde ha kläckts. Alla okläckta embryon antas vara döda.
      2. Inom en enskild kvadrat räknar du de okläckta embryon och levande larver som är helt inom kvadraten (figur 1C-F).
      3. För maskar som ligger på de fyrkantiga gränserna, räkna baserat på maskhuvudets placering. Räkna maskar med huvuden som rör vid fyrkantens övre och vänstra kanter (räkna inte de som rör vid botten eller höger kanter; Figur 1D). Räkna inte obefruktade oocyter för denna analys (figur 1F).
   4. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok.
4. Dag 4
   1. Poängsätt plåtarna dag 2 genom att räkna levande larver och okläckta embryon, enligt beskrivningen i steg 2.3.3.1. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok.
5. Dag 5
   1. Poängsätt dagens 3 plattor genom att räkna levande larver och okläckta embryon, enligt beskrivningen i steg 2.3.3.1. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok. Analysera data som erhållits med hjälp av metoden som beskrivs i dataanalysen.
      OBS: Vissa genetiska mutanter kan ha antingen en fördröjd eller utökad reproduktionscykel. Övervaka enskilda stammar för fortsatt läggning av embryon bortom dag 3-plattorna. Om embryoproduktionen inte har upphört vid dag 4, fortsätt att överföra vuxna till nya plattor.

3. Analyser av embryonal viabilitet (korsbefruktning av hanar/hermafroditer)

1. Dag 1
   1. Märk baksidan av varje platta. Var noga med att hålla reda på varje platta och deras respektive maskar under hela experimentet.
   2. Överför en individuell L4 hermafroditmask på varje platta. Se till att inga embryon eller andra maskar överförs till plattan.
      OBS: Feminiserade stammar, såsom dimma-2 funktionsförlustmutanter, som inte producerar spermier, kan användas i stället för hermafroditer.
   3. Överför en enda L4-hanmask till varje märkt platta som innehåller en L4-hermafrodit. Se till att inga embryon eller andra maskar överförs till plattan.
      OBS: Stammar som plg-1-varianthanar kan användas för att identifiera om parning har inträffat, eftersom dessa hanar deponerar en kopulatorisk plugg på hermafroditvulva efter parning.
   4. Låt maskarna para sig och värpa avkomman i 24 timmar vid 20 °C eller annan lämplig temperatur. Gör dessa plattor för levande larver kontra okläckta embryon på dag 3.
2. Dag 2
   1. Märk en uppsättning nya plattor och överför maskarna, som i dag 2 ovan. Se i så fall till att överföra både hermafroditen och hanen till nya plattor. Se till att hermafroditen har nått vuxen ålder.
   2. Låt hermafroditerna värpa avkomman i 24 timmar vid 20 °C eller annan lämplig temperatur. Gör dessa plattor för levande larver kontra okläckta embryon på dag 4.
3. Dag 3
   1. Märk en uppsättning nya plattor och överför maskarna, som i dag 3 ovan. Se till att överföra både hermafroditen och hanen till nya plattor.
   2. Låt värpa avkomman i 24 timmar vid 20 °C eller annan lämplig temperatur. Gör dessa plattor för levande kontra okläckta embryon på dag 5.
   3. Räkna levande larver och okläckta embryon från plåtarna dag 1 med hjälp av en differentialräknare, enligt beskrivningen i steg 2.3.3.1.
      OBS: Kasta inte plattorna, eftersom de krävs för dag 4.
   4. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok.
4. Dag 4
   1. Räkna levande avkomma och okläckta embryon från plåtarna dag 2 enligt beskrivningen i steg 2.3.3.1. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok.
   2. Kontrollera dag 1 plattor för män. Om parning har inträffat bör det förväntade genetiska förhållandet mellan hermafroditer och män vara 50:50. Om plattor dag 1 inte innehåller några män, inträffade inte parning mellan hanen och hermafroditen. Kassera detta parningspar och registrera denna observation i laboratorieanteckningsboken.
5. Dag 5
   1. Räkna levande larver och okläckta embryon från plattorna dag 3 enligt beskrivningen i steg 2.3.3.1. Anteckna antalet levande larver och okläckta embryon i en laboratorieanteckningsbok. Analysera data som erhållits med hjälp av de metoder som beskrivs i dataanalysen.

4. Analys av data

1. Beräkna den procentuella andelen embryonal viabilitet för en given biologisk replikat av en stam med hjälp av ekvation (1).
   OBS: Antalet levande avkommor och okläckta embryon erhålls genom att summera den dagliga räkningen under försöksperioden.
   (1)
2. Beräkna yngelstorleken per mask för en given stam genom att summera antalet avkommor (okläckta embryon och larver) som produceras av moderhermafroditen. Beräkna den genomsnittliga yngelstorleken med ekvation (2).
   (2)
3. Rapportera embryots viabilitetsprocent och genomsnittliga yngelstorlek med genomsnittlig och standardavvikelse mellan biologiska replikat. Utför Students t-test som jämför kontroll- och experimentella data.

Representative Results

Vi utförde embryonal livskraft och yngelstorleksanalyser på N2 (vildtyp) och på två stammar som innehåller mutationer i gener som är involverade i meios, him-5 (e1490) och spo-11 (ok79). Eftersom både him-5 och spo-11 spelar en roll i meiotisk crossover-bildning, resulterar mutationer i dessa två gener i bildandet av aneuploida könsceller. Denna embryonala viabilitetsanalys för N2 gav en viabilitetsprocent på 98,9%, medan både him-5 (e1490) och spo-11 (ok79) visade en minskning av avkommans livskraft med en procentandel på 74,9% respektive 0,8% (figur 2A; p < 0,0005). Dessa resultat överensstämmer med tidigare publicerade resultat ^7,9. Den genomsnittliga yngelstorleken för N2, him-5 (e1490) och spo-11 (ok79) bestämdes till 217, 105 respektive 219 (figur 2B). I överensstämmelse med tidigare publikationer har him-5(e1490) en signifikant minskad kullstorlek jämfört med vildtyp, medan spo-11 (ok79) inte har ^7,9.

Figur 1: Demonstration av räkningsuppställning och embryomorfologi på plattor . (A) Bild av ett lock med ett korsstreckat rutmönster ritat med en fin sharpie. (B) En 35 mm MYOB-platta med det mönstrade locket under för räkning. (C) Bild som visar ett synfält med låg förstoring (10x) som visar flera rutor i rutnätet. Vita pilspetsar pekar ut flera larver inom detta synfält. Räkning bör göras med högre förstoring (endast en kvadrat i fältet) för att observera både larver och embryon. Skalstång = 1 000 μm. (D) Tecknad film av locket med rutmönstret placerat under en 35 mm platta. Infällningen anger rätt teknik för att bestämma vilka larver som räknas i en given kvadrat. Räkna uppifrån och ned, från vänster till höger. Räkna alla maskar som är helt inom torget. Ormar som rör gränsen bör räknas utifrån maskhuvudets position, inte svansen. Räkna maskar som vetter mot det aktuella rutnätet eller rutnät som tidigare har räknats (dvs. övre och vänstra kanter). Räkna inte maskar med huvuden som rör botten eller höger kanter. Från insatsen kommer blå maskar att räknas medan röda maskar inte kommer att räknas. (E) Representativ bild av friska N2 L1-kläckta larver (vit pilspets). F) Representativ bild av en obefruktad äggcell (svart pilspets) och ett okläckt embryo (röd pilspets). Obefruktade oocyter bör inte räknas för denna analys. Skalstänger (E,F) = (100 μm). Bilder i C, E och F togs med ett Zeiss AxioZoom-mikroskop, med en kamera fäst för att visa utseendet på larver, embryon och oocyter på maskplattor. För embryonala viabilitetsanalyser görs räkningar medan man observerar plattorna med hjälp av ett stereomikroskop (ingen kamera). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Representativa diagram som visar resultaten från embryonala viabilitetstester och yngelstorlekar. (A) Embryonal viabilitetsprocent för N2, him-5 (e1490) och spo-11 (ok79) vid 20 °C. (B) Yngelstorlekar på N2, him-5 (e1490) och spo-11 (ok79) vid 20 °C . Avkomman till minst 28 hermafroditer poängsattes för varje stam. Det totala antalet okläckta embryon plus larver som poängsattes var N2 = 6302, him-5 (e1490) = 2 945 och spo-11 (ok79) = 7 230. Felstaplar anger standardavvikelsen för tre separata enskilda replikat. Statistik beräknad med hjälp av Students t-test, n.s. = inte signifikant, *p < 0,0005. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Förökning av sexuellt reproducerande arter kräver bildandet av haploida gameter (dvs ägg och spermier) genom meios, som sedan förenas vid befruktning, återställer det diploida kromosomantalet och initierar embryonal utveckling. Fel i någon av dessa processer kan leda till infertilitet, embryonal dödlighet och / eller fosterskador. C. elegans är ett kraftfullt modellsystem för att studera sexuell reproduktion. Effekterna av genmutationer eller knockdown av genuttryck (t.ex. RNA-interferens) kan bedömas relativt snabbt och enkelt med hjälp av de embryonala livsduglighets- och yngelstorleksanalyser som beskrivs ovan. Vi har använt dessa metoder för initial karakterisering av gener involverade i meiotisk kromosomsegregering och befruktning/äggaktivering^10,11,12. En observerad minskning av embryonal livskraft eller yngelstorlek indikerar en störning i meios, gametogenes, befruktning eller embryogenes.

Eftersom embryonal livskraft och yngelstorlek bedöms relativt enkelt genom att räkna avkomma och en enkel matematisk beräkning, är dessa optimala introduktionsexperiment för forskningsnybörjare antingen i laboratoriet eller klassrummet. Lättheten i C. elegans djurhållning och ekonomiska fördelar gör dem särskilt lämpade för experimentella biologikurser. Studenterna får värdefull forskningserfarenhet genom C. elegans djurhållning, lär sig att använda dissekeringsmikroskop och kan ställa biologiska frågor i ett utvecklingssystem som kan besvaras på relativt kort tid (cirka 5 dagar med protokollet som beskrivs i detta papper).

Tidpunkten för antalet avkommor är mycket viktig för embryonala viabilitetsanalyser. Vid 20 °C tar embryogenesen cirka 16 timmar, och reproduktivt mogna vuxna börjar lägga ägg cirka 60 timmar efter kläckning som L1-larver. Eftersom livscykeln är snabb är det viktigt att räkna avkomman inom lämplig fönster, så att embryona hinner kläckas tillräckligt innan avkomman själv börjar lägga ägg. Det är också viktigt att notera att tillväxtperioderna varierar beroende på temperatur. Tillväxten är ungefär 2,1 gånger snabbare vid 24-25 °C än 15-16 °C, och ungefär 1,3 gånger snabbare vid 20 °C än 15-16 °C¹³. I detta protokoll rekommenderar vi att räkningar sker 48 timmar efter att de vuxna har placerats på en ny tallrik. Denna tidsram säkerställer att alla embryon med vildtypsutveckling har tillräckligt med tid att kläckas (>16 timmar), men inte åldras till den grad att de är reproduktionsdugliga. Tester som utförs vid temperaturer lägre än 20 °C kan behöva förlängas (överföra djur i 4 dagar) för att embryon ska kläckas och för att kläckt avkomma ska nå larvstadier som är lättare att observera bland bakterierna på MYOB-plattorna (L3-L4-stadier).

En begränsning för embryonala livsduglighetsanalyser och yngelstorlek är att den specifika utvecklingsprocess som störs inte är uppenbar. Dessa initiala analyser kan dock följas upp med cytologiska tekniker för att bestämma vilken process som påverkas. Till exempel kan dissektion av de vuxna maskarna för att frigöra gonaden följt av 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning och noggrann analys av DNA-morfologi inom könslinjen avslöja om meiotiska processer störs. Dessutom kan DAPI-färgning av embryon avslöja i vilket skede embryogenesen arresteras.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för att analysera antalet producerade embryon (yngel) och andelen embryon som är livskraftiga för olika C. elegans-mutanter. Denna analys kan användas för både självbefruktande hermafroditer och för manliga/hermafroditkorsningar. Med den korta livscykeln för C. elegans kan detta protokoll slutföras på mindre än 1 vecka. Embryonala livsduglighetsanalyser och yngelstorlekar kan användas som första analyser av gener som är involverade i meios, befruktning eller embryonal utveckling, och är lämpliga protokoll för mer avancerade forskare och forskningsnybörjare (både studenter och förstaårsstudenter).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
35 mm Petri dishes	Tritech research	T3501	Semi-stackable, non-vented.
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For MYOB
Bacto-Peptone	Gibco	211677	For MYOB
Cholestrol	Sigma	C8503	For MYOB
Sodium Chloride	J.T. Baker	FW 58.440	For MYOB
Trizma Base	Sigma	T1503	For MYOB
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253	For MYOB
Strains
C. elegans wild type strain	Caenorhabditis Genetics Center	N2
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
him-5(e1490)	Caenorhabditis Genetics Center	DR466
spo-11(ok79)	Caenorhabditis Genetics Center	AV106
Equipment/software
Differential cell counter	Fischer Scientific	02-670-12
MicroSoft Excel or Prism	MicroSoft or GraphPad		For recording and creating graphical representations of data.
platinum wire	Tritech research	PT9901	For making worm picks. 99.5% Platinum, 0.5% Iridium. This comes as 3 ft/pack, which is sufficient for making 36 worm picks (~1 inch platinum wire per pick).
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-745	Diascopic base with focus mount, integrated LED module, power cord, 6.7x to 50x Zoom range [WD 115 mm], Widefield Eyepiece C-15x/17 (Note: equivalent stereomicroscopes are available from other manufacturers.)
worm pick handle	Tritech research	TWPH1	For making worm picks. Mount ~1 in platinum wire into worm pick handle. Alternatively, worm picks can be made by mounting platinum wire in a glass Pasteur pipette.