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Biology

ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा अंतर्जात एलसी 3 का अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65067
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Summary

यहां, हम सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के संबंध में दुर्लभ प्रोटीन के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में अंतर्जात, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आधार पर अनुकूलित ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस दृष्टिकोण की शक्ति को बेफिलोमाइसिन उपचार के बिना भूखे कोशिकाओं में अंतर्जात एलसी 3 के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।

Abstract

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल का विज़ुअलाइज़ेशन उनकी पहचान स्थापित करने और उन विवरणों को प्रकट करने के लिए आवश्यक है जो ऑटोफैजिक प्रक्रिया को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, ईएम विधियों में अक्सर आणविक जानकारी की कमी होती है, जो ईएम द्वारा प्राप्त अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी के सहसंबंध को विशिष्ट ऑटोफैगी प्रोटीन के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी-आधारित स्थानीयकरण में बाधा डालती है। इसके अलावा, अपरिवर्तित सेलुलर स्थितियों में ऑटोफैगोसोम की दुर्लभता ईएम द्वारा जांच में बाधा डालती है, जिसके लिए उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है, और इसलिए दृश्य का एक सीमित क्षेत्र प्रदान करता है।

दोनों चुनौतियों के जवाब में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर आधारित एक ऑन-सेक्शन कोररिलेटिव लाइट-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (सीएलईएम) विधि को ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए एक सामान्य ऑटोफैगोसोमल मार्कर, एलसी 3 को सहसंबंधित करने के लिए लागू किया गया था। विधि का उपयोग अन्य प्रासंगिक मार्करों के साथ संयोजन में एलसी 3 लेबलिंग के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में कोशिकाओं को तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया गया था। इसके बाद, सीएलईएम द्वारा चयनित एलसी 3-लेबल स्पॉट की अंतर्निहित अल्ट्रास्ट्रक्चरल विशेषताओं की पहचान की गई। विधि को लाइसोसोमल अम्लीकरण के अवरोधकों को जोड़ने के बिना भूखे कोशिकाओं पर लागू किया गया था।

इन स्थितियों में, एलसी 3 मुख्य रूप से ऑटोफैगोसोम पर पाया गया था और शायद ही कभी ऑटोलाइसोसोम में, जिसमें एलसी 3 तेजी से खराब हो जाता है। ये डेटा इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता और संवेदनशीलता दोनों को दिखाते हैं, यह दर्शाते हुए कि सीएलईएम का उपयोग दवा उपचार या आनुवंशिक परिवर्तन के बिना देशी स्थितियों में एलसी 3-मध्यस्थता ऑटोफैगी पर अल्ट्रास्ट्रक्चरल अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यह विधि ईएम डेटा के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी को पुल करके ऑटोफैगी प्रोटीन और अन्य दुर्लभ एंटीजन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रस्तुत करती है।

Introduction

ऑटोफैगी साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन और ऑर्गेनेल की निकासी और रीसाइक्लिंग के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। मैक्रो-ऑटोफैगी (इसके बाद ऑटोफैगी कहा जाता है) की प्रक्रिया में डबल-झिल्ली ऑर्गेनेल, ऑटोफैगोसोम का गठन शामिल है, जो कोशिकाओं को लाइसोसोमल गिरावट के लिए साइटोप्लाज्मिक अणुओं और ऑर्गेनेल को संलग्न करने की अनुमति देता है। ऑटोफैगी अधिकांश कोशिकाओं में बेसल स्तर पर होता है और सेलुलर स्थितियों, जैसे भुखमरी या सेलुलर तनाव के जवाब में अनियंत्रित होता है। ऑटोफैगी या तो सब्सट्रेट-विशिष्ट तरीके से होती है, जो गिरावट के लिए विशिष्ट संरचनाओं या प्रोटीन को लक्षित करती है, या साइटोसोल के कुछ हिस्सों को शामिल करने वाली एक गैर-चयनात्मक थोक प्रक्रिया के रूप में होती है। चयनात्मक ऑटोफैगी में, ऑटोफैगोसोम का निर्माण एटीजी 8-परिवार प्रोटीन (सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 1 ए / बी प्रकाश श्रृंखला 3 ए / बी / सी [एलसी 3] और जीएआरएएपी) के संयुग्मन से एंडोसोम, गोल्गी और / या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) 1 रीसाइक्लिंग से प्राप्त झिल्ली में होता है। एलसी 3 साइटोसोल में ऑटोफैजिक कार्गो को सीधे या चुनिंदा ऑटोफैगी एडाप्टर जैसे पी 62 / एसक्यूएसटीएम के माध्यम से पहचानता है। नए ऑटोफैजिक झिल्ली को तब एलसी 3 में संयुग्मित किया जा सकता है, विस्तार किया जा सकता है, और कार्गो को घेरने वाली एक पूर्ण डबल झिल्ली बनाने के लिए फ्यूज किया जा सकता है- जिसे ऑटोफैगोसोम कहा जाता है। ऑटोफैगोसोम परिपक्व होता है और अंततः एंडोसोम या लाइसोसोम के साथ फ्यूज हो जाता है, जिसके बाद ऑटोफैजिक कार्गो और एडाप्टरखराब हो जाते हैं।

ऑटोफैगोसोम गठन, परिपक्वता और संलयन पर अध्ययन अक्सर प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों का उपयोग करते हैं। एलसी 3 की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग आमतौर पर विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैगोसोम की संख्या और सेलुलर स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, तथाकथित अग्रानुक्रम जांच में एलसी 3 को पीएच-संवेदनशील जीएफपी और पीएच-स्थिर आरएफपी में जोड़कर, जीएफपी फ्लोरेसेंस लॉस3 के कार्य के रूप में जीवित कोशिकाओं में ऑटोफैगी के समग्र प्रवाह को मापा जा सकता है। ये दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैगी की भूमिका और तंत्र को समझने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं। एक अन्य अमूल्य उपकरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) है, जो ऑटोफैगी 4,5,6,7,8 के विभिन्न चरणों में ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर का खुलासा करता है। आज तक, ईएम अभी भी आकृति विज्ञान द्वारा विभिन्न ऑटोफैजिक झिल्ली को भेदभाव करके ऑटोफैगोसोम गठन के सटीक चरणों की पहचान करने के लिए पसंद की विधि है: फागोफोर (डबल झिल्ली पूरी तरह से बंद नहीं), ऑटोफैगोसोम (साइटोसोलिक कार्गो के चारों ओर बंद डबल झिल्ली), और ऑटोलिसोसोम (आंतरिक ऑटोफैजिक झिल्ली का आंशिक] नुकसान)। आणविक जानकारी के बिना आकृति विज्ञान, हालांकि, गलत पहचान या अस्पष्टता से ग्रस्त हो सकता है। इम्यूनो-ईएम ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल के एक साथ आणविक लक्षण वर्णन और रूपात्मक वर्गीकरण के लिए सबसे व्यापक तरीका है। उदाहरण के लिए, पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर एलसी 3 का इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग एलसी 3 के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण और एलसी 3-चिह्नित ऑर्गेनेल9 की सटीक पहचान की अनुमति देता है।

ईएम का एक दोष दृश्य का एक छोटा सा क्षेत्र है जो ऑटोफैजिक झिल्ली के ठीक अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक उच्च आवर्धन के साथ आता है और, इम्यूनो-ईएम के मामले में, उस लेबल का पता लगाने के लिए जो रुचि के प्रोटीन को चिह्नित करता है। उनकी कमी और कम प्रोटीन के स्तर के कारण, यह आम तौर पर ऑटोफैगोसोम के मात्रात्मक ईएम विश्लेषण में बाधा डालता है। ऑटोफैगोसोम की संख्या बढ़ाने के लिए, कोशिकाओं को अक्सर भूखा रखा जाता है और बेफिलोमाइसिन ए 1 (बाफा 1) के साथ इलाज किया जाता है, जो लाइसोसोमल अम्लीकरण और गिरावट का अवरोधक है। बाफा 1 उपचार के बिना, ईएम द्वारा ऑटोफैगोसोम की खोज समय-गहन है, इन ऑर्गेनेल की कमी के कारण। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि ईएम के लिए आगे की तैयारी से पहले फ्लोरोसेंट लेबलिंग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर अंतर्जात एलसी 3 की इमेजिंग के माध्यम से इस मुद्दे को संबोधित करती है। फ्लोरोसेंट छवियां तब ईएम में एलसी 3-लेबल संरचनाओं की खोज का मार्गदर्शन करती हैं। संग्रह के बाद, ईएम छवियों को कोशिका की अल्ट्रास्ट्रक्चर में आणविक जानकारी-एलसी 3 की उपस्थिति जोड़ने के लिए प्रतिदीप्ति छवियों के साथ सहसंबद्ध किया जाता है। यह 'ऑन-सेक्शन सीएलईएम' विधि एलसी 3-लेबल संरचनाओं को खोजने की क्षमता को बढ़ाती है, विशेष रूप से अनुपचारित परिस्थितियों में, ईएम द्वारा बाद में पहचान और वर्गीकरण के लिए।

इस विधि को भूखे हेपेटोब्लास्टोमा-व्युत्पन्न एचईपीजी 210 कोशिकाओं पर लागू किया गया था ताकि अपरिवर्तित (यानी, कोई बाफा 1 का उपयोग नहीं किया गया था) स्थितियों में ऑटोफैगोसोम का पता लगाया जा सके। अपेक्षाकृत कम फ्लोरोसेंट पंक्टा (90 एनएम खंड में प्रति सेल प्रोफाइल एक से कम) पाए गए, जो एलसी 311 के उच्च कारोबार के साथ समझौते में है। एलसी 3-पंक्टा की इस स्पर्शता ने सीएलईएम के मूल्य पर जोर दिया; ईएम में इमेजिंग के लिए कई फ्लोरोसेंट पंक्टा वाले क्षेत्रों का चयन करके, एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल पाए गए और पारंपरिक इम्यूनो-ईएम की तुलना में बहुत अधिक प्रभावी तरीके से विशेषता दी गई। इससे पता चला कि एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल के बहुमत ऑटोफैगोसोम थे, जैसा कि उनकी आकृति विज्ञान द्वारा परिभाषित किया गया है, जो बाफा 1-उपचारित कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों के विपरीत है, जहां ऑटोलाइसोसोमअधिक सामान्य हैं। इन आंकड़ों से पता चलता है कि ऑन-सेक्शन सीएलईएम के साथ, ऑटोफैगी का अध्ययन ऑटोफैजिक प्रवाह को बाधित करने की आवश्यकता के बिना अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर किया जा सकता है।

Protocol

1. उपकरण और अभिकर्मकों की तैयारी

नोट: आवश्यक अभिकर्मकों, बफर, और समाधान के लिए, अधिक जानकारी के लिए पूरक फ़ाइल 1 या 12 देखें। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें।

  1. फिक्सेटिव
    1. 0.2 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) या 0.2 एम पाइप, एचईपीईएस, ईजीटीए, एमजीएसओ4 (पीएचईएम) बफर तैयार करें, जैसा कि पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित है, फिक्सेटिव समाधान के लिए आधार के रूप में उपयोग करने के लिए।
      नोट: जैविक सामग्री के साथ एल्डिहाइड प्रतिक्रिया के कारण अम्लीकरण के खिलाफ बफर करने के लिए फिक्सेटिव को नियमित रूप से 0.1 एम पीबी या पीएचईएम बफर में बफर किया जाता है।
    2. चूंकि पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की गुणवत्ता नमूने की अल्ट्रास्ट्रक्चर के विश्वसनीय निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है, ईएम-ग्रेड पीएफए का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, उच्च गुणवत्ता वाले पीएफए प्रिल्स से तैयार 16% स्टॉक समाधानों का उपयोग करें ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
      सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड एक खतरनाक रसायन है (खतरे के कथन H228, H301, H302, H311, H314, H315, H317, H318, H331, H332, H335, H341, H350)। पीएफए के साथ काम करते समय, सुरक्षात्मक उपकरण (दस्ताने, लैब कोट और सुरक्षात्मक चश्मा) पहनें और रासायनिक हुड में काम करें। पीएफए युक्त कचरे को संस्थानों के दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार एकत्र और निपटान किया जाना चाहिए।
    3. 0.2 एमपीबी के 10 एमएल, 16% पीएफए के 5 एमएल (डीमिनरलाइज्ड पानी [डीएच 2 ओ] में), और 5 एमएलडीएच2ओ को मिलाकर 4% पीएफए का फिक्सेटिव घोल तैयार करें।
    4. वैकल्पिक: चरण 1.1.3 से फिक्सेटिव समाधान में 0.02% -0.5% ग्लूटार्ल्डिहाइड (जीए) जोड़ने से अल्ट्रास्ट्रक्चर के संरक्षण में सुधार होता है, लेकिन कई एंटीबॉडी की ओर नमूने की एंटीजेनेसिटी कम हो जाती है।
      नोट: जब जीए निर्धारण वांछित है, तो उपयुक्त आपूर्तिकर्ता से ईएम-ग्रेड जीए का उपयोग करें।
      सावधानी: ग्लूटाराल्डिहाइड एक खतरनाक रसायन है (खतरे के बयान एच 301, एच 302, एच 314, एच 317, एच 330, एच 332, एच 334, एच 335, एच 400, एच 411)। जीए में हेरफेर करते समय रासायनिक हुड में काम करें और सुरक्षात्मक उपकरण (दस्ताने, लैब कोट और सुरक्षात्मक चश्मा) पहनें। जीए युक्त कचरे को संस्थानों के दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार एकत्र और निपटाया जाना चाहिए।
  2. उपकरण और सामग्री
    1. एल्यूमीनियम नमूना धारक पिन की सतह को खरोंचें और धातु के अवशेषों को हटाने के लिए उन्हें इथेनॉल 3 x 10 मिनट में सोनिक करें और जब जिलेटिन-एम्बेडेड सेल ब्लॉक पिन पर लगाए जाते हैं तो इष्टतम पालन सुनिश्चित करें।
    2. तरल नाइट्रोजन (एलएन2) में अपने नमूनों के साथ एल्यूमीनियम नमूना धारक पिन को स्टोर करने के लिए उपयुक्त भंडारण कनस्तर का उपयोग करें।
    3. नेल पॉलिश का उपयोग करके लकड़ी के कटार के अंत में एक बाल या आईलैश चिपकाकर एक मैनिपुलेटर बनाएं।
    4. एक पिकअप लूप बनाएं। 3 मिमी व्यास की गोल पट्टी के चारों ओर 0.3 मिमी मोटी स्टेनलेस-स्टील के तार को मोड़ें और सिरों को एक साथ मोड़ें, जिससे एक छोर पर एक लूप बन जाए। मुड़े हुए सिरों को पिपेट टिप में डालें। दूसरे छोर से एक लकड़ी का कटार डालें और गोंद या राल के साथ चिपकाएं।
      नोट: एक पिकअप लूप व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. ग्रिड-सुखाने वाले लूप तैयार करने के लिए, पिकअप लूप बनाने के लिए समान चरणों का पालन करें: 4 मिमी लूप में एक स्टेनलेस-स्टील तार बनाएं और गोंद या राल के साथ एक बड़े पिपेट टिप पर चिपकाएं।
    6. एक पतली सहायक फिल्म का उपयोग करके ग्रिड को कोट करें जैसे कि फॉर्मवर ( पूरक फ़ाइल 1 में प्रोटोकॉल)। उपयोग करने से पहले, कार्बन की एक पतली परत के साथ ग्रिड को कोट करें।
      नोट: उपयोग के लिए तैयार ग्रिड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। फॉर्मवर-लेपित ग्रिड को कमरे के तापमान (आरटी) पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है; कार्बन-लेपित ग्रिड को आरटी में कई महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. स्वच्छ ग्लास स्लाइड और बड़े कवरलिप्स तैयार करें (24 मिमी x 24 मिमी 25 मिमी चौड़ी ग्लास स्लाइड के साथ आदर्श है), जैसा कि 13 में है।

2. निर्धारण और नमूना तैयारी

  1. ग्रस्तता
    1. चरण 1.1.3 (0.1 एमपीबी में 4% पीएफए) में तैयार किए गए फिक्सेटिव का उपयोग करें। अनुयायी सेल लाइनों के लिए, 6 सेमी व्यंजनों में 1-5 × 106 कोशिकाओं को कल्चर करें। 1: 1 अनुपात में कल्चर माध्यम में फिक्सेटिव जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें। फिर, मध्यम-फिक्सेटिव मिश्रण को केवल फिक्सेटिव के साथ बदलें और आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: सटीक सेल गणना, संगम, और संस्कृति की स्थिति उपयोग किए गए मॉडल सिस्टम के अनुसार भिन्न हो सकती है।
    2. नमूने को रात भर या 3-4 सप्ताह तक 0.5% पीएफए में 0.1 एमपीबी में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: जीए को निर्धारण में जोड़ा जा सकता है (चरण 1.1.4 देखें) और आकृति विज्ञान और एंटीजेनिसिटी के संरक्षण के बीच एक इष्टतम संतुलन खोजने के लिए निर्धारण लंबाई को बदला जा सकता है, जो प्रति नमूना और लेबलिंग में भिन्न होता है। अधिक जानकारी के लिए,14 देखें।
  2. नमूना एम्बेडिंग
    1. आरटी पर पीबीएस के साथ 3x फिक्स्ड सेल के साथ डिश धोएं। फिर, 0.15% ग्लाइसिन युक्त पीबीएस के साथ बदलें और आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. 0.15% ग्लाइसिन युक्त पीबीएस को पीबीएस में 1% जिलेटिन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, और 1% जिलेटिन में कोशिकाओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्क्रैप और स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में आरटी पर 1 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर गोली दें। फिर, गोली को परेशान किए बिना 1% जिलेटिन निकालें और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म 12% जिलेटिन जोड़ें। पिपेट टिप्स या ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके सेल पेलेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके फिर से निलंबित करें।
    3. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें; फिर, 1 मिनट के लिए 6,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को गोली दें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर जिलेटिन को ठोस करें।
    4. ट्यूब से जिलेटिन-एम्बेडेड कोशिकाओं को हटाने के लिए, पेलेट युक्त ट्यूब के अंत को रेजर ब्लेड से ट्यूब के बाकी हिस्सों से काट लें। फिर, पहले कट के लंबवत, सेल गोली के साथ ट्यूब के अंत को आधे में काट लें।
    5. जिलेटिन-एम्बेडेड सेल पेलेट युक्त दो ट्यूब-एंड हिस्सों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2.3 एम सुक्रोज में इनक्यूबेट करें। इससे जिलेटिन-एम्बेडेड सेल पेलेट आधे हिस्से थोड़े सिकुड़ जाते हैं और प्लास्टिक ट्यूब से हट जाते हैं।
      नोट: जिलेटिन-एम्बेडेड सेल छर्रों को 2.3 एम सुक्रोज को बहुत चिपचिपा होने और जिलेटिन को बहुत नरम होने से बचने के लिए जितना संभव हो सके 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ-ठंडा रखा जाना चाहिए। अगले चरणों में जिलेटिन-एम्बेडेड सेल छर्रों के हेरफेर के दौरान, एक समय में केवल एक नमूने के साथ काम करें और दूसरों को बर्फ पर रखें, या ठंडे (~ 4 डिग्री सेल्सियस) कमरे में काम करें। सूरज की रोशनी, गर्म माइक्रोस्कोप लैंप, या गर्मी के अन्य स्रोतों द्वारा जिलेटिन-एम्बेडेड सेल छर्रों के अतिताप से बचें।
    6. 2.3 एम सुक्रोज से जिलेटिन-एम्बेडेड सेल गोली के साथ ट्यूब हिस्सों को हटा दें। फिर, चिमटी के साथ प्लास्टिक ट्यूब हाफ से जिलेटिन-एम्बेडेड सेल पेलेट हाफ को हटा दें। रेजर ब्लेड के साथ गोली को उचित आकार (~ 1 मिमी3) के ब्लॉक में मैन्युअल रूप से काटें। काटने के दौरान विषय को बढ़ाने के लिए एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    7. जिलेटिन-एम्बेडेड सेल ब्लॉक को 3-16 घंटे के लिए 2.3 एम सुक्रोज के साथ इंजेक्ट करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटर में एंड-ओवर-एंड बदल दें।
    8. एल्यूमीनियम नमूना धारक पिन पर जिलेटिन-एम्बेडेड सेल ब्लॉक रखें (चरण 1.2.1 देखें)। ब्लॉक के किनारों के चारों ओर पर्याप्त 2.3 एम सुक्रोज छोड़ दें ताकि यह ब्लॉक और पिन के बीच एक पतला 'कॉलर' बना सके। ब्लॉक के शीर्ष को कवर करने वाले बहुत अधिक 2.3 एम सुक्रोज से बचें। स्नैप-फ्रीज करें और एलएन2 में स्टोर करें।

3. सेक्शनिंग

  1. ट्रिमिंग (यह भी देखें12)।
    1. एलएन2 भंडारण से जिलेटिन-एम्बेडेड कोशिकाओं के एक ब्लॉक के साथ एक पिन लें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर सेट क्रायोमाइक्रोटोम के अंदर रखें।
    2. इसकी सतह को समतल करने और ~ 250 एनएम अनुभाग प्राप्त करने के लिए ब्लॉक के सामने के हिस्से को ट्रिम करें। पिकअप समाधान (1: 1 2.3 एम सुक्रोज और 2% मिथाइलसेल्यूलोज) में 3 मिमी लूप डुबोएं, लूप को माइक्रोटोम के क्रायोचैंबर में डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि बूंद (आमतौर पर 5-7 एस) में बर्फ बनना शुरू न हो जाए। फिर, तुरंत जल्दी से लेकिन धीरे से बूंद को उनके खिलाफ दबाकर अनुभाग उठाएं। क्रायोचैंबर से लूप निकालें, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक बूंद पूरी तरह से पिघल न जाए, और बूंद को ग्लास स्लाइड पर दबाएं।
    3. अनुभागों के टोलुइडाइन ब्लू धुंधला करके सेल अभिविन्यास की जांच करें।
      1. एक ग्लास स्लाइड पर अनुभागों के शीर्ष पर टोलुइडाइन ब्लू समाधान ( पूरक फ़ाइल 1 देखें) की एक बूंद रखें और 80 डिग्री सेल्सियस हीटिंग प्लेट पर तब तक सुखाएं जब तक कि बूंद के किनारे सूख न जाएं।
      2. हीटिंग प्लेट से ग्लास स्लाइड को हटा दें और धीरे-धीरे डीएच2ओ के साथ टोलुडीन ब्लू को धो लें, इसे एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में इकट्ठा करें।
      3. ग्लास स्लाइड को सुखाएं और एक सरल, बेंचटॉप लाइट माइक्रोस्कोप के माध्यम से अनुभागों में सेल अभिविन्यास की जांच करें।
    4. चाकू के कोने के साथ नमूना ब्लॉक चेहरे के किनारे में 50-100 μm को विभाजित करके ब्लॉक के किनारों को ट्रिम करें। नमूना ब्लॉक के चार किनारों को प्रत्येक पक्ष को ट्रिम करने के बाद नमूना धारक को 90 ° घुमाकर ~ 250 μm x 375 μm आयत बनाने के लिए ट्रिम करें। पिछले चरण में निर्धारित सेल अभिविन्यास के आधार पर उभरे हुए क्षेत्र का चयन करें।
  2. सेक्शनिंग और पिकअप
    1. क्रायोमाइक्रोटोम को -100 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। उभरे हुए आयत से एक रिबन का खंड, खंड 70-90 एनएम मोटा और चांदी-सुनहरी चमक के साथ है। एक लंबा (2-5 मिमी) रिबन बनाने के लिए एक छड़ी पर बालों के साथ हीरे के चाकू के किनारे से दूर अनुभागों का मार्गदर्शन करें (अनुभाग 1.2.3 देखें)।
    2. एक बार एक उपयुक्त रिबन बन जाने के बाद, रिबन लेने के लिए सेक्शनिंग बंद करें। 3 मिमी पिकअप लूप को 2.3 एम सुक्रोज और 2% मिथाइलसेल्यूलोज मिश्रित 1: 1 में डुबोएं, लूप को माइक्रोटोम के क्रायोचैंबर में डालें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक बूंद जमने न लगे (आमतौर पर 5-7 एस)। फिर, तुरंत जल्दी से लेकिन धीरे से बूंद को दबाकर अनुभागों को उठाएं। क्रायोचैंबर से लूप निकालें, तब तक प्रतीक्षा करें जब तक बूंद पूरी तरह से पिघल न जाए, और बूंद को तैयार ग्रिड (चरण 1.2.6) पर दबाएं।
      नोट: अनुभागों के साथ ग्रिड को कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. लेबलिंग और प्रकाश माइक्रोस्कोपी

  1. लेबल
    1. एक छोटे डिश या मल्टी-वेल प्लेट में पीबीएस के ~ 1 एमएल पर अनुभाग (चित्रा 1 ए) अनुभाग-साइड के साथ ग्रिड रखें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम जिलेटिन को हटा देता है जो कोशिकाओं के बीच होता है; सेक्शनिंग के बाद जिलेटिन की आवश्यकता नहीं होती है और शेष प्रोटोकॉल में हस्तक्षेप करता है।
    2. पैराफिल्म पर ~ 75 μL बूंदों पर ग्रिड अनुभाग-साइड को नीचे संसाधित करें ( चित्रा 1 बी देखें)। आरटी पर पीबीएस + 0.15% ग्लाइसिन वॉश (3 x 2 मिनट) के साथ शुरू करें। फिर, ब्लॉकिंग स्टेप के रूप में आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए)-सी + 0.5% फिश स्किन जिलेटिन (एफएसजी) के साथ ग्रिड को इनक्यूबेट करें। पीबीएस में 0.1% बीएसए-सी + 0.5% एफएसजी में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें और आरटी (चित्रा 1 सी) पर 1 घंटे के लिए इस समाधान की ~ 10 μL बूंदों पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें।
    3. आरटी पर पीबीएस 5 एक्स में 0.1% बीएसए में ग्रिड धोएं। फिर, पीबीएस में 0.1% बीएसए-सी + 0.5% एफएसजी में द्वितीयक एंटीबॉडी और 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई; 10 μg / एमएल) को पतला करें और आरटी (चित्रा 1 सी) में 30+ मिनट के लिए इस समाधान की ~ 10 μL बूंदों पर ग्रिड को इनक्यूबेट करें। आरटी पर पीबीएस 5 एक्स में ग्रिड धोएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ईएम में रुचि के प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए प्रोटीन ए (पीएजी) के साथ संयुग्मित 5, 10, 15, या 20 एनएम कोलाइडल सोने के कणों के साथ एक द्वितीयक एंटीबॉडी को लेबल किया जा सकता है। यदि यह वांछित है, तो चरण 4.1.3 के बाद आरटी पर 20 मिनट के लिए पीएजी के साथ ग्रिड को इनक्यूबेट करें। कई प्राथमिक एंटीबॉडी के एक साथ उपयोग से बचें और अवांछित क्रॉस-प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए विभिन्न प्रजातियों के आईजीजी के लिए पीएजी की प्रतिक्रिया पर ध्यान दें। अधिक जानकारी के लिए,12 देखें।
  2. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने बढ़ाना।
    1. ग्रिड को 50% ग्लिसरॉल में डीएच 2 ओ2x 5 मिनट आरटी में डुबोएं। ग्रिड को ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप के बीच 50% ग्लिसरॉल में सैंडविच करें, प्रति कवरस्लिप एक ग्रिड, जिसमें कवरस्लिप के सामने अनुभाग हों (चित्रा 1 डी)।
      नोट: लेबलिंग की गुणवत्ता बिगड़ सकती है जब ग्रिड को 30 मिनट से अधिक समय तक 50% ग्लिसरॉल में रखा जाता है। इसलिए एक समय में दो या तीन ग्रिड को माउंट और छवि बनाने और दूसरों को द्वितीयक लेबलिंग समाधान पर छोड़ने की सिफारिश की जाती है।
  3. प्रकाश माइक्रोस्कोपी
    1. एक स्वचालित चरण के साथ एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप में सैंडविच ग्रिड के साथ एक ग्लास स्लाइड लें। एक उच्च-आवर्धन (63x या 100x) तेल उद्देश्य का चयन करें। अनुभागों के रिबन (चित्रा 1 ई) का एक छवि टाइलसेट (का हिस्सा) बनाएं।
      नोट: कुछ द्वितीयक एंटीबॉडी ग्रिड पर फ्लोरोसेंट समुच्चय बना सकते हैं, विशेष रूप से वर्गों में सिलवटों या आँसू के आसपास। इसके अतिरिक्त, कुछ सेल प्रकारों और ऊतकों में ऑटोफ्लोरोसेंट संरचनाएं होती हैं। यदि इस तरह के मुद्दों की उम्मीद है, तो यह सलाह दी जाती है कि एक नकारात्मक नियंत्रण ग्रिड को शामिल किया जाए जो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट नहीं किया गया है।
  4. अनमाउंटिंग और ईएम कंट्रास्टिंग
    1. ग्लास स्लाइड-कवरस्लिप सैंडविच के किनारे पर डीएच2ओ के 10 μL जोड़ें और ग्लास-कवरस्लिप सैंडविच इंटरफ़ेस को भरने के लिए केशिका कार्रवाई की प्रतीक्षा करें। ग्लिसरॉल में विसर्जन तेल को मिश्रित किए बिना कवरस्लिप को सावधानीपूर्वक हटा दें। चिमटी के साथ ग्रिड को पुनः प्राप्त करें और 50% ग्लिसरॉल को धोने के लिए आरटी पर डीएच2ओ 3 एक्स में डुबोएं।
      नोट: तेल यूरिनल धुंधला होने में हस्तक्षेप कर सकता है और ईएम कंट्रास्ट को खराब कर सकता है।
    2. लिंट-मुक्त टिशू पेपर के साथ ग्रिड के पिछले हिस्से को सावधानीपूर्वक सुखाएं।
      नोट: यदि नमूने को कोलाइडल सोने के कणों के साथ भी लेबल किया गया था, तो निम्नलिखित चरणों का पालन करें: पीबीएस बूंदों पर अनुभाग अनुभाग-साइड के साथ ग्रिड रखें और आरटी पर 2x धोएं। आरटी पर पीबीएस 2 एक्स में धोएं।
    3. ग्रिड सेक्शन-साइड को डीएच2ओ बूंदों पर नीचे रखें और आरटी पर 8 गुना धो लें।
    4. ईएम में कंट्रास्ट के लिए अनुभागों को दागने के लिए, आरटी (चित्रा 1 एफ) पर 5 मिनट के लिए यूरिनिल एसीटेट (यूए), पीएच 7 के साथ इनक्यूबेट करें।
    5. ग्रिड रखने से पहले, बर्फ पर धातु की प्लेट पर पैराफिल्म पर बूंदों को रखकर यूए: मिथाइलसेल्यूलोज, पीएच 4 को ठंडा करें। फिर, बर्फ-ठंडे यूए: मिथाइलसेल्यूलोज, पीएच 4, 2 एक्स के साथ ग्रिड धोएं और 10 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे यूए: मिथाइलसेल्यूलोज, पीएच 4 के साथ इनक्यूबेट करें (चित्रा 1 एफ)।
      चेतावनी: यूरिनाइल एसीटेट एक खतरनाक रसायन है (खतरा कथन एच 300, एच 330, एच 373, एच 411)। उन चरणों में जिन्हें यूए की आवश्यकता होती है, एक रासायनिक हुड में काम करें और सुरक्षात्मक उपकरण (लैब कोट, दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मा) पहनें। संस्थानों के दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार यूए युक्त कचरे को इकट्ठा और निपटान करें।
    6. ग्रिड के नीचे यूए: मिथाइलसेल्यूलोज बूंद में ग्रिड-सुखाने वाले लूप को डालकर ग्रिड को लूप करें और धीरे से इसे तब तक उठाएं जब तक कि ग्रिड को ड्रॉपलेट12 से खींच नहीं लिया जाता। अतिरिक्त यूए: मिथाइलसेल्यूलोज को लिंट-फ्री फिल्टर पेपर ( सामग्री की तालिका देखें) पर ~ 60 ° कोण (नीचे की ओर वाले खंड) पर लूप को छूकर दूर करें और इसे धीरे-धीरे कागज के साथ खींचें जब तक कि कोई और यूए: मिथाइलसेल्यूलोज अवशोषित न हो जाए। फिर, लूप को ग्रिड के साथ एक उपयुक्त रैक में रखें और आरटी (चित्रा 1 जी) पर >10 मिनट के लिए सूखने दें।

5. ईएम

  1. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) में इमेजिंग के लिए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) का पता लगाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त अवलोकन का उपयोग करें; चित्रा 1 एच)। प्रकाश माइक्रोस्कोपी डेटासेट पर आरओआई को एनोटेट करें। एक बार एक क्षेत्र का चयन हो जाने के बाद, TEM में 20,000x-50,000x आवर्धन पर एक छवि टाइलसेट प्राप्त करें। पोस्टप्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर15,16 में छवि टाइलसेट का पुनर्निर्माण करें।

6. सहसंबंध और विश्लेषण

  1. उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में प्रकाश माइक्रोस्कोपी और ईएम डेटासेट लोड करें, जैसे कि इमेजजे / फिजी17, आईसीई18 में ईसी-सीएलईएम प्लग-इन, या फ़ोटोशॉप। ईएम टाइलसेट से मेल खाने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी डेटासेट को क्रॉप और घुमाएं।
    1. ईएम में प्रतिदीप्ति और परमाणु रूपरेखा में डीएपीआई सिग्नल के आधार पर सहसंबंध निष्पादित करें (चित्रा 1 आई)। छवियों को ठीक से ओवरले करने के लिए स्थानांतरित करें और मैन्युअल सहसंबंध को सटीक रूप से निष्पादित करें। दृष्टिकोण को अधिक सटीक बनाने के लिए, उदाहरण के लिए, बर्फीले में ईसी-सीएलईएम प्लगइन या इमेजजे में बिगवार्प प्लगइन के माध्यम से लैंडमार्क-आधारित सहसंबंध लागू करें, ताकि संबंधित बिंदुओं के मैन्युअल चयन के माध्यम से छवियों को सहसंबंधित किया जा सके। ईसी-सीएलईएम के साथ सहसंबंध के लिए एक विस्तृत, चरण-दर-चरणप्रोटोकॉल उपलब्ध है।
      नोट: यह दृष्टिकोण भी बाइमोडल फिड्यूशियल प्रोब्स20,21 के उपयोग के साथ अच्छी तरह से काम करता है।
  2. एक उपयुक्त कार्यक्रम (जैसे, इमेजजे) में फ्लोरोसेंट सिग्नल के आधार पर आरओआई का चयन करके सहसंबद्ध छवियों का विश्लेषण करें। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, सभी लेबल किए गए ऑर्गेनेल के लिए आरओआई का एक संग्रह बनाएं। फिर, व्यक्तिगत आरओआई के संबंधित अल्ट्रास्ट्रक्चर का निरीक्षण करें और उन्हें रूपात्मक तत्वों के आधार पर वर्गीकृत करें।

Representative Results

अल्ट्राथिन क्रायोसेक्शन पर एलसी 3 के इम्यूनो-गोल्ड लेबलिंग के लिए एक अनुकूलित इम्यूनो-ईएम प्रोटोकॉल हाल ही में डी माजियर एट अल.9 द्वारा प्रकाशित किया गया था। इस अध्ययन में बाफा 1 के बिना भूखे हालात शामिल थे, जिसमें एलसी 3 मौजूद था लेकिन ईएम द्वारा अपेक्षाकृत दुर्लभ और ढूंढना मुश्किल था। एक अलग अध्ययन में एक ऑन-सेक्शन सीएलईएम विधि पेश की गई थी, जो अपेक्षाकृत दुर्लभ और कम व्यक्त अंतर्जात प्रोटीन की कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति लेबलिंग की संवेदनशीलता का उपयोग करती है और इसे ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर14 से सहसंबंधित करती है। यहां, इन दो दृष्टिकोणों को सीएलईएम दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में अनुकूलित एलसी 3 लेबलिंग प्रोटोकॉल के उपयोग से जोड़ा जाता है।

एचईपीजी 2 कोशिकाएं, बेसल ऑटोफैगी22 के अपेक्षाकृत उच्च स्तर के साथ यकृत-व्युत्पन्न कोशिकाएं, 4% पीएफए में निर्धारण से पहले 2 घंटे के लिए न्यूनतम माध्यम (अर्ल के संतुलित नमक समाधान [ईबीएसएस]) में भूखी थीं। इसके बाद अल्ट्राथिन क्रायोसेक्शनिंग (अनुभाग 1-3; स्लॉट और ग्यूज़12 देखें) की टोकुयासु विधि द्वारा नमूना तैयार किया गया था, जो ऑन-सेक्शन सीएलईएम 14,23 के साथ अत्यधिक संगत है। माउस एंटी-एलसी 3 प्राथमिक एंटीबॉडी9 का उपयोग करके पिघले हुए क्रायोसेक्शन को फ्लोरोसेंटली लेबल (प्रोटोकॉल सेक्शन 4 और चित्रा 1) किया गया था। इसके अतिरिक्त, खरगोश एंटी-एलएएमपी 1 का उपयोग एंडो-लाइसोसोम को इंगित करने के लिए किया गया था, इसके बाद एंटी-माउस एलेक्साफ्लुर 488 और एंटी-खरगोश एलेक्साफ्लुर 568 द्वितीयक एंटीबॉडी थे। ग्रिड को एक कवरस्लिप और ग्लास स्लाइड के बीच सैंडविच किया गया था और एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप (100x 1.47 एनए तेल उद्देश्य, एससीएमओएस कैमरा) पर आरटी पर चित्रित किया गया था।

पारंपरिक पूरे सेल आईएफ पर पतले वर्गों के प्रतिदीप्ति लेबलिंग का एक लाभ जेड में बढ़ा हुआ रिज़ॉल्यूशन है, क्योंकि अनुभाग की भौतिक मोटाई 60-90 एनएम है। इस बेहतर जेड रिज़ॉल्यूशन के साथ, पतले वर्गों पर एलसी 3 और एलएएमपी 1 की प्रतिदीप्ति लेबलिंग बहुत कम कोलोकलाइजेशन (चित्रा 2 ए) का खुलासा करती है। लाइसोसोमल इनहिबिटर के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं में, जैसे कि बाफा 1, उच्च कोलोकलाइजेशन होता है, क्योंकि लाइसोसोमल-संलग्न एलसी 3अनिम्नीकृत रहता है। अनुपचारित कोशिकाओं में, एलसी 3 एंजाइमेटिक रूप से सक्रिय, एलएएमपी 1-पॉजिटिव लाइसोसोम के संपर्क में आने पर तेजी से खराब हो जाता है, और इसलिए इन स्थितियों में सह-स्थानीयकरण दुर्लभ है। आम तौर पर, प्रति सेल प्रोफाइल में एक से कम एलसी 3 पंक्टम देखा गया था। यह इंगित करता है कि भूखे परिस्थितियों में भी, ऑटोफैगोसोम का कारोबार तेजी से होता है, जिससे ऑटोफैगोसोम संख्या कम होती है। यह प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किए गए दृश्य के बड़े क्षेत्र का उपयोग करके दुर्लभ एलसी 3-लेबल संरचनाओं को खोजने के लिए सीएलईएम का उपयोग करने के महत्व पर भी प्रकाश डालता है। इसके अलावा, सोने के लेबलिंग की तुलना में प्रतिदीप्ति लेबलिंग की उच्च संवेदनशीलता पारंपरिक इम्यूनो-ईएम की तुलना में अधिक एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल की पहचान करने में सक्षम बनाती है, जिससे उनके लक्षण वर्णन में सहायता मिलती है।

अनुभागों के रिबन का एक पूर्ण टाइलसेट प्राप्त करने के बाद, ग्रिड को माइक्रोस्कोप से पुनर्प्राप्त किया गया और यूए और लूप-आउट विधि (प्रोटोकॉल चरण 4.4-4.6; प्रोटोकॉल चरण 4.4-4.6) का उपयोग करके ईएम के लिए पोस्ट-दाग लगाया गया। चित्रा 1 एफ, जी)। यह 'लूप-आउट' विधि यह सुनिश्चित करती है कि यूए: मिथाइलसेल्यूलोज की एक पतली परत ग्रिड पर बनी रहे, जो ईएम में वांछित विपरीत बनाता है। परत की मोटाई उस गति और कोण पर निर्भर करती है जिसके साथ यूए: मिथाइलसेल्यूलोज को फिल्टर पेपर पर धब्बा लगाया जाता है। लूप को बहुत जल्दी खींचने से ग्रिड पर बहुत अधिक यूए: मिथाइलसेल्यूलोज छोड़ सकता है और ईएम में अनुभागों की उपस्थिति को गहरा कर सकता है। बहुत धीरे-धीरे खींचने से बहुत अधिक यूए: मिथाइलसेल्यूलोज दूर हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत कम धुंधलापन और खराब आकृति विज्ञान होता है, और ग्रिड के लूप से बाहर गिरने का खतरा होता है। शुष्क ग्रिड पर 'तेल की परत' रंग (चित्रा 1 जी) एक उपयुक्त यूए: मिथाइलसेल्यूलोज परत मोटाई को इंगित करता है।

लूप-आउट और सुखाने के बाद, ग्रिड को प्रतिदीप्ति द्वारा चुने गए आरओआई पर एक टीईएम में चित्रित किया गया था। आईएफ और ईएम डेटासेट को ईएम में दिखाई देने वाले नाभिक की रूपरेखा के लिए डीएपीआई सिग्नल को ओवरलेकर सहसंबद्ध किया गया था, जिससे दोनों तौर-तरीकों की जानकारी वाली एक एकीकृत छवि उत्पन्न हुई।

आईएफ में चयनित ईएम में उसी क्षेत्र को ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए ईएम में खोज करते समय आईएफ टाइलसेट की एक अवलोकन छवि रखने की सिफारिश की जाती है। उपयोगकर्ताओं को दोनों तौर-तरीकों में पहचानने योग्य सुविधाओं की तलाश करनी चाहिए, जैसे कि अनुभागों में सिलवटों या आँसू, ग्रिड बार, या नाभिक की व्यवस्था। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नमूना ईएम में घुमाया और प्रतिबिंबित दिखाई दे सकता है। क्षेत्रों की पहचान करने के लिए विशिष्ट विशेषताओं के साथ 'फाइंडर ग्रिड' का उपयोग सहसंबंध को कम करने के लिए किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।

एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल के ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर से सहसंबंध से पता चला है कि अलग-अलग पंक्टा ऑटोफैगी के अलग-अलग चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं (चित्रा 2 बी)। यद्यपि क्रायोसेक्शन में ऑटोफैगोसोमल अल्ट्रास्ट्रक्चर का संरक्षण चुनौतीपूर्ण है, साइटोप्लाज्मिक सामग्री और डबल झिल्ली वाले ऑर्गेनेल अक्सर देखे गए थे (चित्रा 2 सी, ऑर्गेनेल 1-5 में तीर; पूरक चित्रा एस 1), जो ऑटोफैगोसोम की रूपात्मक विशेषताओं को परिभाषित कर रहे हैं। दिलचस्प बात यह है कि कमजोर फ्लोरोसेंट स्पॉट को ईएम द्वारा एलसी 3-पॉजिटिव ऑटोलाइसोसोम (चित्रा 2 सी, ऑर्गेनेल 6; ऑटोफैजिक सामग्री को चिह्नित किया गया है*) के रूप में पहचाना गया था, जो घने सामग्री और इंट्राल्यूमिनल पुटिकाओं की विशेषता है। इससे पता चला कि अल्ट्राथिन क्रायोसेक्शन के आईएफ में एलसी 3 की बहुत कम मात्रा दिखाई देती है, और संकेत दिया कि विघटनकारी वातावरण के बावजूद, कुछ एलसी 3 स्थिर-राज्य ऑटोलाइसोसोम में पता लगाने योग्य है। हालांकि, एलसी 3-पॉजिटिव पंक्टा के बहुमत ने ऑटोफैगोसोम का प्रतिनिधित्व किया, जबकि ऑटोलाइसोसोम बहुत दुर्लभ थे। यह बाफा 1-उपचारित कोशिकाओं के विपरीत है, जो मुख्य रूप से ऑटोलाइसोसोम जमा करते हैं और ऑटोफैगोसोम9 नहीं।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त आणविक जानकारी को ईएम की अल्ट्रास्ट्रक्चर से जोड़ने के लिए एक ऑन-सेक्शन सीएलईएम विधि का वर्णन करता है। यह विधि इम्यूनो-ईएम की संवेदनशीलता को बढ़ाती है, क्योंकि लेबलिंग के लिए केवल फ्लोरोफोरे का उपयोग किया जाता है और ये आम तौर पर ईएम जांच की तुलना में अधिक संकेत देते हैं। विधि विशेष रूप से अल्ट्राथिन क्रायोसेक्शन का उपयोग करने के लिए अनुकूल है, जिसमें नगण्य पृष्ठभूमि धुंधला होने पर विशिष्ट प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर प्राप्त किए जा सकते हैं। दुर्लभ संरचनाओं या घटनाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए प्रतिदीप्ति का उपयोग करके और चयनित आरओआई को ईएम से सहसंबंधित करके, ईएम ऑपरेशन समय और संबंधित लागतों को बहुत कम किया जा सकता है। विधि की संवेदनशीलता और व्यवहार्यता अनुपचारित, भूखे कोशिकाओं में एलसी 3 के विज़ुअलाइज़ेशन द्वारा प्रदर्शित की जाती है, यह दिखाते हुए कि एलसी 3 मुख्य रूप से इन स्थितियों में ऑटोफैगोसोम से जुड़ा हुआ है, जिसमें ऑटोलाइसोसोम में बहुत कम स्तर दिखाई देते हैं।

Figure 1
चित्र 1: ऑन-सेक्शन सीएलईएम का योजनाबद्ध अवलोकन । (ए) जिलेटिन-एम्बेडेड कोशिकाओं से क्रायोसेक्शन को फॉर्मवर-लेपित तांबा ग्रिड पर एकत्र किया जाता है। (बी) ग्रिडों को उपयुक्त समाधानों की बूंदों पर सेक्शन-डाउन संसाधित किया जाता है। (सी) ग्रिड को प्राथमिक और फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है। (डी) ग्रिड 50% ग्लिसरॉल में कवरस्लिप और ग्लास स्लाइड के बीच सैंडविच होते हैं। (ई) प्रतिदीप्ति छवियों को एक वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप में एकत्र किया जाता है। (च) ग्रिड ों को ग्लास स्लाइड से पुनः प्राप्त किया जाता है और ईएम के लिए यूरिनल स्टेनिंग द्वारा आगे संसाधित किया जाता है। (जी) सूखने के बाद, ग्रिड को टीईएम द्वारा चित्रित किया जा सकता है। (एच) उच्च आवर्धन टीईएम छवि टाइलसेट प्रतिदीप्ति डेटा से चयनित क्षेत्र से प्राप्त किया जाता है। (I) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और ईएम से छवियां सहसंबद्ध और अतिरंजित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: भूखे एचईपीजी 2 कोशिकाओं में एलसी 3 और एलएएमपी 1 का सीएलईएम। (A) अनुभागों पर LC3 (हरा) और LAMP1 (लाल) की आईएफ इमेजिंग से अपेक्षाकृत कम LC3 पंक्टा और LAMP1 के साथ थोड़ा सह-स्थानीयकरण का पता चलता है। (बी) आईएफ (बाएं पैनल) से आणविक जानकारी को ईएम (मध्य पैनल) में प्राप्त अल्ट्रास्ट्रक्चरल जानकारी से जोड़ना डीएपीआई और परमाणु रूपरेखा (डैश लाइन, दाएं पैनल) के आधार पर दो इमेजिंग तौर-तरीकों को समाप्त करके। अलग-अलग एलसी 3-लेबल डिब्बों की अल्ट्रास्ट्रक्चर, जैसा कि बॉक्स 1 (दाएं पैनल) द्वारा उदाहरण दिया गया है, सी में दिखाया गया है। (सी) एलसी 3-पॉजिटिव डिब्बों की अल्ट्रास्ट्रक्चर। सीएलईएम छवियों को बाईं ओर और छद्म रंगीन (बेज) ईएम छवियों को दाईं ओर दिखाया गया है (बिना रंग के ईएम छवियां पूरक चित्रा एस 1 में दिखाई गई हैं)। आंतरिक और बाहरी ऑटोफैगोसोमल झिल्ली को क्रमशः सफेद और काले तीर के तीर द्वारा इंगित किया जाता है। उदाहरण 6 में ऑटोलिसोसोम के अंदर ऑटोफैजिक सामग्री * द्वारा इंगित की गई है। स्केल बार = 10 μm (A), 1 μm (B), 200 nm (C)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल की अनकलर्ड ईएम छवियां। (ए-एफ) छद्म रंगीन उदाहरणों की बिना रंगीन ईएम छवियां 1-6 चित्रा 2 सी में दिखाए गए हैं। ऑर्गेनेल को एलसी 3 फ्लोरेसेंस द्वारा चुना गया था, जैसा कि चित्रा 2 के लिए वर्णित है। आंतरिक और बाहरी ऑटोफैगोसोमल झिल्ली को क्रमशः सफेद और काले तीर के तीर द्वारा इंगित किया जाता है। उदाहरण 6 में ऑटोलिसोसोम के अंदर ऑटोफैजिक सामग्री * द्वारा इंगित की गई है। स्केल बार = 200 एनएम। संक्षेप: एएल = ऑटोलाइसोसोम; एपी = ऑटोफैगोसोम; एम = माइटोकॉन्ड्रियन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधान। इस पूरक फ़ाइल में इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफर और समाधान बनाने के लिए आवश्यक व्यंजनों और प्रोटोकॉल शामिल हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां प्रस्तुत विधि क्रायोसेक्शन-आधारित ऑन-सेक्शन सीएलईएम में हालिया प्रगति का लाभ उठाती है - एफएम और ईएम 14,24 के बीच आईएफ लेबलिंग और सटीक (<100 एनएम त्रुटि) सहसंबंध की उच्च संवेदनशीलता। इसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंटली लेबल दुर्लभ, अंतर्जात प्रोटीन की संवेदनशीलता और ईएम अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ इसे ओवरले करने की क्षमता के साथ एक विधि होती है। इस प्रकार, यह विधि बहिर्जात रूप से टैग किए गए प्रोटीन की (अधिक) अभिव्यक्ति और कम संवेदनशील ईएम लेबल के उपयोग की आवश्यकता से बचती है। विधि की व्यवहार्यता लाइसोसोमल अवरोधकों के उपयोग के बिना, भूखे कोशिकाओं में अंतर्जात एलसी 3 पर सीएलईएम के उदाहरणों द्वारा दिखाई गई है।

टोकुयासु विधि के साथ प्राप्त पिघले हुए क्रायोसेक्शन इम्यूनो-ईएम के लिए आदर्श नमूने हैं, क्योंकि राल वर्गों के विपरीत, वे एंटीबॉडी के लिए पारगम्य हैं। हल्के निर्धारण और विपरीत प्रक्रियाओं के साथ संयुक्त, यह आम तौर पर विस्तृत अल्ट्रास्ट्रक्चर से समझौता किए बिना अन्य तरीकों पर शानदार लेबलिंग दक्षता उत्पन्न करता है, और उत्कृष्ट रूप से सेलुलर झिल्ली 12,25,26 की कल्पना करता है। इसके अलावा, क्रायोसेक्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ अत्यधिक संगत हैं, जो उन्हें सीएलईएम के लिए मूल्यवान सब्सट्रेट बनाते हैं। क्रायोसेक्शन पर क्लासिक इम्यूनोगोल्ड लेबलिंग और सीएलईएम दोनों ने उपकोशिकीय संगठन 14,27,28,29,30 को समझने में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

वर्तमान में, पिघले हुए क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम के अनुप्रयोग अधिक प्रचलित हो रहे हैं, निरंतर विकास और अनुकूलन 14,20,24,31,32,33,34 के परिणामस्वरूप जिसने दृष्टिकोण की गुणवत्ता, प्रयोज्यता और सटीकता में सुधार किया है। अब, बड़े आईएफ और ईएम छवि टाइलसेट के सटीक सहसंबंध से, तकनीक फ्लोरोसेंटली-लेबल अंतर्जात सेलुलर घटकों 14,32,33 के अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करती है। यह क्लासिक इम्यूनो-ईएम पर एक फायदा है, जहां सोने के लेबल वाली संरचनाओं की खोज के लिए आमतौर पर उच्च आवर्धन की आवश्यकता होती है और इसलिए, अधिक श्रमसाध्य और समय-गहन है। यह इस कारण से है कि अल्ट्रास्ट्रक्चर के लिए एलसी 3 का स्थानीयकरण सीएलईएम से बहुत लाभान्वित होता है। एलसी 3-पॉजिटिव ऑर्गेनेल आम हैं जब ऑटोफैजिक क्लीयरेंस अवरुद्ध हो जाता है (यानी, जब कोशिकाओं को बाफा 1 या पीएच-बढ़ाने वाले एजेंटों के साथ इलाज किया जाता है), जबकि ऑटोफैजिक ऑर्गेनेल को अपरिवर्तित या भूखे कोशिकाओं में तेजी से साफ किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत कम स्थिर-राज्य स्तर होते हैं। ऐसी स्थितियों में, शास्त्रीय इम्यूनो-ईएम का उपयोग करके एलसी 3-लेबल ऑर्गेनेल ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और सीएलईएम एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है।

इससे पहले, राल वर्गों पर सीएलईएम को एलसी 3-जीएफपी या एलसी 3-जीएफपी-आरएफपी टेंडम जांच35,36,37,38,39 की एक्टोपिक अभिव्यक्ति का उपयोग करके अध्ययनों में लागू किया गया था। इन अध्ययनों में, एक्रिलिक राल अनुभाग40 में एम्बेड करने से पहले या सीधे प्रतिदीप्ति इमेजिंग की गई थी, और नमूने बाद में ईएम द्वारा जांच किए गए थे। राल एम्बेडिंग के कई फायदे हैं; ऑटोफैगोसोमल अल्ट्रास्ट्रक्चर आम तौर पर अच्छी तरह से संरक्षित होता है, खासकर अगर सामग्री उच्च दबाव जमे हुए40 है। इसके अलावा, भारी धातु से सना राल-एम्बेडेड सामग्री का विपरीत आम तौर पर मूत्र-दाग वाले क्रायोसेक्शन की तुलना में अधिक स्पष्ट होता है। राल-एम्बेडेड अनुभाग वॉल्यूमेट्रिक ईएम विधियों के साथ संगत हैं, जैसे कि सरणी टोमोग्राफी, एफआईबी-एसईएम, या सीरियल ब्लॉकफेस एसईएम, जबकि क्रायोसेक्शन नहीं हैं। एम्बेड करने से पहले इमेजिंग करने वाले दृष्टिकोणों में, लाइव-सेल इमेजिंग एक विकल्प41 है जो क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम में उपलब्ध नहीं है। इन विकल्पों पर क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम का मुख्य लाभ उच्च आईएफ सिग्नल है, जो झिल्ली परमेबिलाइजेशन या ओवरएक्प्रेशन की आवश्यकता के बिना दुर्लभ प्रोटीन के इम्यूनो-स्थानीयकरण की अनुमति देता है। यह संभावित झिल्ली निष्कर्षण, ओवरएक्प्रेशन कलाकृतियों और विषय के आनुवंशिक संशोधन से बचता है, जो आईएफ और ईएम में बड़े क्षेत्रों को सहसंबंधित करने की संभावना के साथ मिलकर, एलसी3 और ऑटोफैगी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाता है।

यहां, भूखे एचईपीजी 2 कोशिकाओं के लिए ऑन-सेक्शन सीएलईएम के आवेदन से पता चला कि एलसी 3 मुख्य रूप से ऑटोफैगोसोम के रूप में पहचाने जाने वाले संरचनाओं के लिए स्थानीयकृत है। इसके अतिरिक्त, ऑटोलाइसोसोम में कुछ कमजोर फ्लोरोसेंट स्पॉट पाए गए। यह बाफा 19 के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं के विपरीत है और लाइसोसोम के साथ ऑटोफैगोसोम फ्यूज होने के बाद ऑटोफैगोसोमल प्रोटीन के तेजी से क्षरण को दर्शाता है। कुल मिलाकर, डेटा से पता चला है कि पिघले हुए क्रायोसेक्शन का सीएलईएम मूल परिस्थितियों में एलसी 3-मध्यस्थता ऑटोफैगी पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। डेटा प्रौद्योगिकी की संवेदनशीलता को भी उजागर करता है, क्योंकि एलसी 3 को ऑटोलाइसोसोम में भी पाया गया था जिसमें बरकरार एलसी 3 एपिटोप्स के केवल निम्न स्तर होते हैं। विभिन्न मॉडलों और स्थितियों में एलसी 3 इमेजिंग द्वारा इस तकनीक के आगे के अनुप्रयोग से ऑटोफैगी और अन्य एलसी 3-मध्यस्थता जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ में सुधार होगा, जैसे कि एलसी 3 से जुड़े फागोसाइटोसिस या एटीजी 8 के एकल झिल्ली के संयुग्मन।

ऑटोफैगी से परे, ऑन-सेक्शन सीएलईएम को अन्य दुर्लभ घटनाओं या संरचनाओं पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि कोशिका विभाजन, संक्रमण, ऊतकों में दुर्लभ कोशिका प्रकार, किनेटोकाम, प्राथमिक सिलिया, या सेल प्रकार-विशिष्ट ऑर्गेनेल। आईएफ द्वारा रुचि के विषय के लिए प्रभावी स्क्रीनिंग इन दुर्लभताओं के अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन को बहुत सुविधाजनक बना सकती है। इसके अलावा,यह दिखाया गया था कि तकनीक का उपयोग शास्त्रीय इम्यूनो-ईएम की तुलना में अधिक संवेदनशील तरीके से प्रोटीन को स्थानीयकृत करने के लिए किया जा सकता है। निर्धारण लंबाई को समायोजित करने से इस संवेदनशीलता को और बढ़ाया जा सकता है, जिससे बहुत कम-प्रचुर मात्रा में या खराब एंटीजेनिक प्रोटीन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्थानीयकरण की अनुमति मिलती है। अंत में, ऑन-सेक्शन सीएलईएम विधि ऑर्गेनेल की मात्रात्मक संख्या के तेजी से चयन को आसान बनाती है, जिससे किसी दिए गए प्रोटीन के अल्ट्रास्ट्रक्चरल वितरण का अधिक मजबूत विश्लेषण होता है।

क्रायोसेक्शन पर सीएलईएम को क्रायोसेक्शनिंग के लिए उपकरण और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इन उपकरणों (जैसे, क्रायोमाइक्रोटोम) तक पहुंच वाले समूहों में, ऑन-सेक्शन सीएलईएम का कार्यान्वयन सीधा है और केवल एक स्वचालित वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप की उपलब्धता की आवश्यकता होती है, एक सेटअप जो अधिकांश प्रयोगशालाओं तक पहुंच है। इसके अलावा, विधि दुनिया भर में ईएम सुविधाओं में उपलब्ध है। चूंकि ऑन-सेक्शन सीएलईएम स्थापित आईएफ और ईएम विधियों के आवेदन को जोड़ती है, इसलिए विधि को आसानी से अनुकूलित किया जाता है और इसे जोड़ा जा सकता है, उदाहरण के लिए, टोमोग्राफी 20,33,43, सीमित संख्या में सेक्शन 44 के सीरियल सेक्शन वॉल्यूम ईएम, या सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी 45। विधि की यह बहुमुखी प्रतिभा जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुप्रयोगों का समर्थन करती है।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी चर्चा ओं और प्रतिक्रिया के लिए यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर यूट्रेक्ट के आणविक चिकित्सा केंद्र में हमारे सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। हम अपनी माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों में निरंतर सुधार करने के लिए क्लंपरमैन प्रयोगशाला के पिछले और वर्तमान सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम के लिए उपयोग किया जाने वाला ईएम बुनियादी ढांचा डच रिसर्च काउंसिल (एनडब्ल्यूओ) द्वारा वित्तपोषित अनुसंधान कार्यक्रम नेशनल रोडमैप फॉर लार्ज स्केल रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर (एनईएमआई) का हिस्सा है, परियोजना संख्या 184.034.014 जेके है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and reagents
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 Life Technologies #A21202 use 1:250
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life Technologies A#10042 use 1:250
Antibody mouse anti-LC3 Cosmo Bio CTB-LC3-2-IC use 1:100
Antibody rabbit anti-LAMP1 Cell Signaling 9091 use 1:250
Bovine serum Albumin, fraction V Sigma-Aldrich A-9647
BSA-c Aurion 900.099
BSA-conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht BSAG 5 nm
Water-free Chloroform Merck 1.02447.0500
DAPI Invitrogen 10184322 Use at end concentration of 10 µg/ml
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fish-skin Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Food-grade gelatin Merck G1890
Formvar, Vinylec E SPI 02492-RA
Gluteraldehyde Serva 23115.01 See CAUTION note
Glycerol Boom MBAK 7044.1000
Glycine Merck 1042010250
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Methylcellulose, 25 centipoises Sigma-Aldrich M-6385
MgSO4 Riedel-de Haen 12142
Na2HPO4 (PB component A) Merck 106580-0500
NaBH4 Merck 806373
NaH2PO4 (PB component B) Merck 106346
NH4OH Sigma-Aldrich 221228-0025
Oxalic acid Merck 100495
Paraformaldehyde prills Sigma-Aldrich 441244 See CAUTION note
PIPES Merck 110220
Protein-A conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht PAG 5, 10, 15 or 20 nm
Sucrose D(+) VWR 27483294
Uranyl acetate SPI 020624-AB See CAUTION note
Tools and consumables
Pick-up loop Electron Microscopy Sciences 70944
Filter paper, qualitative, medium-fast LLG 6.242 668
Finder grids Ted Pella G100F1
Grids Cell Microscopy Core, UMC Utrecht CU 100 mesh
Microscopes
Leica Thunder widefield microscope Leica Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;
Leica UC7 ultracryomicrotome Leica
Tecnai T12 FEI Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software
Software
ec-CLEM in icy open source Paul-Gilloteaux et al., 2017
Fiji open source Schindelin et al., 2012
IMOD open source Mastronarde et al., 2017
Photoshop Adobe
SerialEM open source Mastronarde et al., 2018

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van der Beek, J., Veenendaal, T., de … More

van der Beek, J., Veenendaal, T., de Heus, C., van Dijk, S., ten Brink, C., Liv, N., Klumperman, J. Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (193), e65067, doi:10.3791/65067 (2023).

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