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Biology

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

Published: March 31, 2023 doi: 10.3791/65067
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Summary

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。

Abstract

電子顕微鏡(EM)によるオートファジーオルガネラの超微細構造レベルでの可視化は、オートファジープロセスの同一性を確立し、オートファジープロセスを理解する上で重要な詳細を明らかにするために不可欠です。しかし、EM法は分子情報が不足していることが多く、EMで得られる超微細構造情報と、特定のオートファジータンパク質の蛍光顕微鏡による局在との相関関係を妨げています。さらに、オートファゴソームは細胞内が変化していない状態では稀少であるため、高倍率を必要とするEMによる研究は困難であり、視野が限られています。

この2つの課題に対して、蛍光標識に基づくオンセクション相関光電子顕微鏡(CLEM)法を適用し、一般的なオートファゴソームマーカーであるLC3をEM超微細構造に相関させました。この分析法は、蛍光顕微鏡で細胞を迅速にスクリーニングし、他の関連マーカーと組み合わせてLC3標識を行うために使用されました。その後、選択されたLC3標識スポットの根底にある超微細構造の特徴がCLEMによって同定されました。この方法は、リソソーム酸性化の阻害剤を添加せずに飢餓細胞に適用しました。

これらの条件下では、LC3は主にオートファゴソームに見られ、LC3が急速に分解されるオートリソソームではまれに見られました。これらのデータは、このアプローチの実現可能性と感度の両方を示しており、CLEMを使用して、薬物治療や遺伝子変異を伴わない天然条件でのLC3を介したオートファジーに関する超微細構造の洞察を提供できることを実証しています。全体として、この方法は、光学顕微鏡とEMデータをつなぐことにより、オートファジータンパク質やその他の希少な抗原の超微細構造局在研究のための貴重なツールを提供します。

Introduction

オートファジーは、細胞質タンパク質と細胞小器官のクリアランスとリサイクルのための重要なプロセスです。マクロオートファジー(以下、オートファジーと呼ぶ)のプロセスには、二重膜オルガネラであるオートファゴソームの形成が含まれ、これにより細胞は細胞質分子と細胞小器官を囲い込み、リソソーム分解を行うことができます。オートファジーは、ほとんどの細胞で基底レベルで発生し、飢餓や細胞ストレスなどの細胞の状態に応じてアップレギュレーションされます。オートファジーは、特定の構造やタンパク質を標的とする基質特異的な方法で分解されるか、細胞質の一部を含む非選択的なバルクプロセスとして発生します。選択的オートファジーでは、オートファゴソームは、Atg8ファミリータンパク質(微小管関連タンパク質1A/B軽鎖3A/B/C [LC3]およびGABARAP)が、リサイクルエンドソーム、ゴルジ体、および/または小胞体(ER)に由来する膜に結合することによって形成されます1。LC3は、細胞質内のオートファジーカーゴを直接、またはP62/SQSTMなどの選択的オートファジーアダプター を介して 認識します。その後、新しいオートファジー膜をLC3に結合させ、膨張させ、融合させて、オートファゴソームと呼ばれるカーゴを包む完全な二重膜を形成します。オートファゴソームは成熟し、最終的にエンドソームまたはリソソームと融合し、その後、オートファジーカーゴとアダプターが分解されます2。

オートファゴソームの形成、成熟、融合に関する研究には、光学顕微鏡技術が利用されることがよくあります。LC3の蛍光顕微鏡法は、一般に、さまざまな条件下でのオートファゴソームの数と細胞局在を評価するために使用されます。さらに、いわゆるタンデムプローブでLC3をpH感受性GFPおよびpH安定RFPに結合させることにより、オートファジーの全体的なフラックスをGFP蛍光損失の関数として生細胞で測定することができます3。これらのアプローチは、研究者がさまざまな条件下でのオートファジーの役割とメカニズムを理解するための貴重なツールです。もう一つの貴重なツールは電子顕微鏡(EM)で、オートファジーのさまざまな段階におけるオートファジーオルガネラの微細構造を明らかにします4,5,6,7,8。今日まで、EMは、形態によって異なるオートファジー膜を識別することにより、オートファゴソーム形成の正確な段階を特定するための選択方法であり、ファゴフォア(完全に閉じていない二重膜)、オートファゴソーム(細胞質カーゴの周りの閉じた二重膜)、およびオートリソソーム(内側のオートファジー膜の[部分的な]喪失)。しかし、分子情報のない形態は、誤認や曖昧さを招きやすい。イムノ電子顕微鏡は、オートファジーオルガネラの分子特性評価と形態学的分類を同時に行うための最も包括的な方法です。例えば、融解した凍結切片でLC3を免疫金標識すると、LC3の超微細構造局在とLC3標識細胞小器官の正確な同定が可能になります9。

EMの欠点は、オートファジー膜の微細な超微細構造を観察し、免疫電子顕微鏡の場合は目的のタンパク質をマークする標識を見つけるために高倍率で視野が狭いことです。オートファゴソームは希少でタンパク質レベルが低いため、一般的にオートファゴソームの定量的EM分析の妨げになります。オートファゴソームの数を増やすために、細胞はしばしば飢餓状態になり、リソソームの酸性化と分解の阻害剤であるバフィロマイシンA1(BafA1)で処理されます。BafA1処理を行わないと、これらの細胞小器官が不足しているため、EMによるオートファゴソームの探索に時間がかかります。この原稿で紹介する方法は、EMのさらなる準備を行う前に、蛍光顕微鏡で解凍した凍結切片上の内因性LC3の蛍光標識とイメージングを通じてこの問題に対処します。蛍光画像は、EM中のLC3標識構造の探索をガイドします。採取後、EM画像と蛍光画像を相関させて、細胞の微細構造に分子情報(LC3の存在)を追加します。この「オンセクションCLEM」法により、特に未処理条件でLC3標識構造を見つける能力が大幅に向上し、その後のEMによる同定と分類が可能になります。

この方法を飢餓肝芽腫由来HEPG210 細胞に適用し、変化していない(すなわち、BafA1を使用しない)条件でオートファゴソームを見出した。比較的少数の蛍光点(90 nm切片の細胞プロファイルあたり1つ未満)が見られ、これはLC311の高い代謝回転と一致しています。LC3-punctaのこの疎性は、CLEMの価値を強調しました。EMでイメージングするためにいくつかの蛍光点を持つ領域を選択することにより、LC3陽性オルガネラが従来の免疫EMよりもはるかに効果的な方法で見つかり、特性評価されました。これにより、LC3陽性細胞小器官の大部分は、その形態によって定義されるオートファゴソームであることが明らかになり、オートリソソームがより一般的であるBafA1処理細胞で得られた結果とは対照的であることが明らかになった9。これらのデータは、オンセクションCLEMでは、オートファジーの流れを阻害することなく、超微細構造レベルでオートファジーを研究できることを示しています。

Protocol

1. ツールと試薬の準備

注:必要な試薬、バッファー、および溶液の詳細については、 補足ファイル 1 または 12 を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関する詳細については、 材料表を参照してください。

  1. 固定剤
    1. 補足ファイル1に記載されているように、0.2 Mリン酸緩衝液(PB)または0.2 Mパイプ、HEPES、EGTAおよびMgSO4(PHEM)緩衝液を調製し、固定液のベースとして使用します。
      注:固定剤は、生体物質とのアルデヒド反応によって引き起こされる酸性化を防ぐために、0.1 M PBまたはPHEM緩衝液に日常的に緩衝されています。
    2. パラホルムアルデヒド(PFA)の品質は、サンプルの超微細構造を確実に固定するための鍵となるため、EM グレードの PFA を使用してください。このプロトコールに従うには、高品質の PFA プリルから調製した 16% ストック溶液を使用します( 補足ファイル 1 を参照)。
      注意:パラホルムアルデヒドは危険な化学物質です(危険有害性情報H228、H301、H302、H311、H314、H315、H317、H318、H331、H332、H335、H341、H350)。PFAを扱うときは、保護具(手袋、白衣、保護メガネ)を着用し、化学フードで作業してください。PFAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインと規制に従って収集および処分する必要があります。
    3. 10 mL の 0.2 M PB、5 mL の 16% PFA(脱塩水 [dH 2 O])、および 5 mLの dH2O を混合して、4% PFA の固定液を調製します。
    4. オプション:ステップ1.1.3の固定液に0.02%〜0.5%のグルタルアルデヒド(GA)を添加すると、超微細構造の保存は改善されますが、多くの抗体に対するサンプルの抗原性が低下します。
      注:GA固定が必要な場合は、適切なサプライヤーのEMグレードGAを使用してください。
      注意: グルタルアルデヒドは危険な化学物質です(危険有害性情報H301、H302、H314、H317、H330、H332、H334、H335、H400、H411)。GAを操作するときは、化学フードで作業し、保護具(手袋、白衣、保護メガネ)を着用してください。 GAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインと規制に従って収集および処分する必要があります。
  2. ツールと材料
    1. アルミニウム製サンプルホルダーピンの表面を引っ掻き、エタノールで3 x 10分間超音波処理して金属の残留物を除去し、ゼラチン包埋セルブロックをピンに取り付けたときに最適な接着性を確保します。
    2. アルミニウム製サンプルホルダーピンとサンプルを液体窒素(LN2)で保管するのに適した保管キャニスターを使用してください。
    3. マニキュアを使って木の串の先に髪の毛やまつげを1本貼ってマニピュレーターを作ります。
    4. ピックアップループを作成します。直径0.3mmの丸棒に0.3mmの太さのステンレス鋼線を巻き付け、両端をねじり合わせて、一方の端にループを形成します。ねじれた端をピペットチップに挿入します。もう一方の端から木の串を差し込み、接着剤または樹脂で貼り付けます。
      注意: ピックアップループも市販されています( 材料表を参照)。
    5. グリッド乾燥ループを準備するには、ピックアップループを作るのと同じ手順で、4mmのループ状にステンレス製のワイヤーを作り、接着剤または樹脂で大きなピペットチップに貼り付けます。
    6. formvarなどの薄い支持フィルムを使用してグリッドをコーティングします( 補足ファイル1のプロトコル)。使用する前に、グリッドをカーボンの薄層でコーティングします。
      注意: すぐに使用できるグリッドは市販されています( 材料表を参照)。Formvarでコーティングされたグリッドは、室温(RT)で無期限に保存できます。カーボンコーティングされたグリッドは、RTで数ヶ月間保管することができます。
    7. 13のように、清潔なスライドガラスと大きなカバーガラス(24 mm x 24 mmが幅25 mmのスライドガラスに最適です)を準備します。

2. 固定とサンプル調製

  1. 固定
    1. ステップ 1.1.3 で調製した固定液(0.1 M PB 中に 4% PFA)を使用します。接着細胞株の場合、6cmの皿で1〜5×106 細胞を培養します。固定液を培地に1:1の比率で添加し、サンプルを室温で5分間インキュベートします。次に、培地固定剤混合物を固定液のみに交換し、室温で2時間インキュベートします。
      注:正確な細胞数、コンフルエンス、および培養条件は、使用するモデルシステムによって異なる場合があります。
    2. サンプルを0.5% PFA中、0.1 M PB中、4°Cで一晩または最大3〜4週間保存します。
      注:GAを固定に追加し(ステップ1.1.4を参照)、固定長さを変更して、標本や標識ごとに異なる形態の保存と抗原性の最適なバランスを見つけることができます。詳細については、「14」を参照してください。
  2. サンプル埋め込み
    1. 固定セルで皿をRTでPBSで3回洗浄します。その後、0.15%グリシンを含むPBSと交換し、室温で10分間インキュベートします。
    2. 37°Cに予熱したPBS中の0.15%グリシンを含むPBSを1%ゼラチンに置き換え、1%ゼラチン中の細胞をこすり落として微量遠心チューブに移します。細胞を6,000 × g で1分間、室温で微量遠心分離機でペレット化します。次に、ペレットを乱さずに1%ゼラチンを除去し、37°Cに加温した12%ゼラチンを加えます。 37°Cに予熱したピペットチップまたはガラス製のパスツールピペットで静かにピペッティングして、細胞ペレットを再懸濁します。
    3. 37°Cで10分間インキュベートします。次に、細胞を6,000 × g で1分間ペレット化します。ゼラチンを氷上で30分間固化させます。
    4. ゼラチンが埋め込まれた細胞をチューブから取り除くには、ペレットを含むチューブの端をカミソリの刃でチューブの残りの部分から切り取ります。次に、最初のカットに対して垂直に、セルペレットでチューブの端を半分にカットします。
    5. ゼラチン包埋細胞ペレットを含む2本のチューブ末端半分を2.3 Mスクロース中で4°Cで10分間インキュベートします。 これにより、ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットの半分がわずかに収縮し、プラスチックチューブから外れます。
      注:ゼラチン包埋細胞ペレットは、2.3 Mスクロースが粘性になりすぎたり、ゼラチンが柔らかくなりすぎたりしないように、できるだけ4°Cまたは氷冷に保つ必要があります。次のステップでゼラチン包埋細胞ペレットを操作する際には、一度に1つのサンプルのみで作業し、他のサンプルは氷上に置いておくか、低温(~4°C)の部屋で作業してください。ゼラチン包埋細胞ペレットは、日光、高温の顕微鏡ランプ、またはその他の熱源による過熱を避けてください。
    6. ゼラチンを包埋した細胞ペレットでチューブの半分を2.3 Mスクロースから取り出します。次に、ゼラチンが埋め込まれた細胞ペレットの半分をピンセットでプラスチックチューブの半分から取り除きます。カミソリの刃でペレットを適切なサイズ(~1 mm3)のブロックに手動で切断します。実体解剖顕微鏡を使用して、切断中に被写体を拡大します。
    7. ゼラチン包埋細胞ブロックに2.3 Mスクロースを3〜16時間注入し、4°Cのローター内で端から端まで回転させます。
    8. ゼラチン包埋セルブロックをアルミニウム製サンプルホルダーピンに取り付けます(ステップ1.2.1参照)。ブロックとピンの間に薄い「カラー」を形成するように、ブロックの端の周りに十分な2.3 Mのスクロースを残します。ブロックの上部を覆う2.3 Mスクロースが多すぎないようにします。スナップ凍結して LN2 に保管します。

3. セクショニング

  1. トリミング (12 も参照)
    1. ゼラチン包埋細胞のブロックが入ったピンをLN2 ストレージから取り出し、-80°Cに設定したクライオミクロトーム内に置きます。
    2. ブロックの前面をトリミングして表面を平らにし、~250 nmの断面を取得します。3 mmのループをピックアップ溶液(1:1 2.3 Mスクロースと2%メチルセルロース)に浸し、ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴に氷が形成され始めるまで待ちます(通常は5〜7秒)。次に、液滴をすばやく、しかしそっと押し付けて、すぐに切片を拾います。クライオチャンバーからループを取り外し、液滴が完全に解凍するまで待ってから、スライドガラス上で液滴を押します。
    3. 切片のトルイジン青色染色により細胞の配向を確認します。
      1. トルイジンブルー溶液( 補足ファイル1参照)をスライドガラスの切片の上に一滴置き、滴の端が乾くまで80°Cの加熱プレートで乾かします。
      2. スライドガラスを加熱プレートから取り外し、トルイジンブルーをdH2Oで静かに洗い流し、適切な廃棄物容器に集めます。
      3. スライドガラスを乾燥させ、シンプルな卓上型光学顕微鏡で切片の細胞配向を確認します。
    4. ナイフの角でサンプルブロック面の側面に50〜100μmを切断することにより、ブロックの側面をトリミングします。サンプルブロック面の4辺をトリミングした後、サンプルホルダーを90°回転させて、突き出た~250 μm x 375 μmの長方形を作成します。前の手順で決定したセルの向きに基づいて、突出領域を選択します。
  2. セクショニングとピックアップ
    1. クライオミクロトームを-100°Cに冷却します。 突き出た長方形からリボンを切断し、断面は厚さ70〜90 nmで、銀色がかった金色の光沢があります。スティックに髪の毛を付けて、ダイヤモンドナイフの端からセクションを離してガイドし(セクション1.2.3を参照)、長い(2〜5 mm)リボンを作成します。
    2. 適切なリボンが形成されたら、切片化を停止してリボンを拾います。3 mmピックアップループを2.3 Mスクロースと2%メチルセルロースを1:1で混合したものに浸し、ループをミクロトームのクライオチャンバーに挿入し、液滴が凍結し始めるまで待ちます(通常は5〜7秒)。次に、液滴をすばやく、しかしそっと押し付けて、すぐに切片を拾います。クライオチャンバーからループを取り外し、液滴が完全に解凍するまで待ってから、準備したグリッドに液滴を押します(ステップ1.2.6)。
      注:セクションのあるグリッドは、4°Cで数か月間保存できます。

4. ラベリングと光学顕微鏡

  1. ラベリング
    1. 切片(図1A)を下にして、小皿またはマルチウェルプレートに~1 mLのPBSを置きます。37°Cで30分間インキュベートします。
      注意: このステップでは、セルの間にあるゼラチンを取り除きます。ゼラチンは切片化後には不要で、残りのプロトコルに干渉します。
    2. パラフィルム上の~75 μLの液滴でグリッドを断面側を下にして処理します( 図1Bを参照)。室温でPBS + 0.15%グリシン洗浄(3 x 2分)から開始します。次に、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)-c + 0.5%魚皮ゼラチン(FSG)をPBS中でブロッキングステップとしてRTで10分間インキュベートします。一次抗体を PBS に 0.1% BSA-c + 0.5% FSG で希釈し、この溶液の ~10 μL 液滴上でグリッドを 1 時間 RT でインキュベートします(図 1C)。
    3. 0.1% BSA in PBS 5x at RTでグリッドを洗浄します。次に、二次抗体と4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI;10 μg/mL)をPBS中の0.1% BSA-c + 0.5% FSGで希釈し、この溶液の~10 μLの液滴上でグリッドを室温で30+分間インキュベートします(図1C)。RTでPBSでグリッドを5回洗浄します。
      注:オプションで、二次抗体をプロテインA(PAG)に結合した5、10、15、または20 nmの金コロイド粒子で標識して、EMで目的のタンパク質を局在化させることができます。これが必要な場合は、ステップ4.1.3の後にRTで20分間、グリッドをPAGとインキュベートします。その後、RTでPBSで5回洗浄します。 複数の一次抗体の同時使用を避け、望ましくない交差反応を防ぐために、異なる動物のIgGに対するPAGの反応性に注意してください。詳細については、「12.
  2. 光学顕微鏡用埋込サンプル
    1. グリッドを 50% グリセロール (dH 2 O2x 5 min) に室温で浸し、スライドガラスとカバーガラスの間にグリッドを 50% グリセロールで挟み、カバーガラスごとに 1 グリッドを挟み、切片をカバーガラスに面させます (図 1D)。
      注:グリッドを50%グリセロールに30分以上取り付けたままにしておくと、ラベリングの品質が低下する可能性があります。そのため、一度に2つまたは3つのグリッドを取り付けてイメージングし、それ以外は二次ラベリング溶液に残しておくことをお勧めします。
  3. 光学顕微鏡
    1. グリッドを挟んだスライドガラスを、自動ステージを備えた広視野顕微鏡に持っていきます。高倍率(63倍または100倍)のオイル対物レンズを選択します。セクションのリボン(の一部)の画像タイルセットを作成します(図1E)。
      注:一部の二次抗体は、グリッド上、特に切片のひだや裂け目の周囲に蛍光凝集体を形成することがあります。さらに、一部の細胞タイプや組織には自家蛍光構造が含まれています。このような問題が予想される場合は、一次抗体とインキュベートしていないネガティブコントロールグリッドを含めることをお勧めします。
  4. アンマウントとEMコントラスト
    1. スライドガラスカバーガラスサンドイッチの側面に10 μLの精製水(dH2O)を加え、毛細管現象がガラススライドサンドイッチ界面を満たすのを待ちます。グリセロールに浸漬油を混ぜずにカバーガラスを慎重に取り除きます。ピンセットでグリッドを回収し、室温でdH2O 3xに浸して50%グリセロールを洗い流します。
      注意: 油はウラニル染色を妨げ、EMコントラストを悪化させる可能性があります。
    2. グリッドの裏側を糸くずの出ないティッシュペーパーで慎重に乾かします。
      注:サンプルに金コロイド粒子も標識されている場合は、次の手順を実行します:切片を下にしてグリッドをPBS液滴上に置き、室温で2回洗浄します。 室温で5分間、1%GAに後付けします(1.1.4の注意を参照)。室温でPBS 2xで洗浄します。
    3. グリッドを切片側を下にしてdH2O液滴の上に置き、室温で8回洗浄します。
    4. EMで造影剤として切片を染色するには、酢酸ウラニル(UA)、pH 7、室温で5分間インキュベートします(図1F)。
    5. グリッドを配置する前に、氷上の金属板上のパラフィルムに液滴を置いて、UA:メチルセルロース(pH 4)を冷却します。次に、グリッドを氷冷 UA:メチルセルロース、pH 4、2x で洗浄し、氷冷 UA:メチルセルロース、pH 4 で 10 分間インキュベートします(図 1F)。
      注意: 酢酸ウラニルは危険な化学物質です(危険有害性情報H300、H330、H373、H411)。UAが必要なステップでは、化学フードで作業し、保護具(白衣、手袋、保護メガネ)を着用してください。UAを含む廃棄物は、研究所のガイドラインおよび規制に従って収集および処分します。
    6. グリッド乾燥ループをグリッドの下のUA:メチルセルロース液滴に挿入し、グリッドが液滴12から引き離されるまでゆっくりと持ち上げることにより、グリッドをループアウトします。糸くずの出ない濾紙( 材料表を参照)に~60°の角度(下を向いた部分)でループに触れ、UA:メチルセルロースが吸収されなくなるまで紙に沿ってゆっくりとドラッグして、余分なUA:メチルセルロースを拭き取ります。次に、グリッド付きのループを適切なラックに置き、室温で>10分間乾燥させます(図1G)。

5. エマージング

  1. 光学顕微鏡で得られた概要を使用して、透過型電子顕微鏡(TEM;図1H)。光学顕微鏡データセットのROIに注釈を付けます。領域を選択したら、TEMで20,000x-50,000xの倍率で画像タイルセットを取得します。後処理ソフトウェア15,16で画像タイルセットを再構築する。

6. 相関と分析

  1. 光学顕微鏡とEMデータセットを、ImageJ/Fiji17、Icy18のec-CLEMプラグイン、Photoshopなどの適切な画像処理ソフトウェアにロードします。光学顕微鏡データセットをトリミングして回転させ、EMタイルセットに合わせます。
    1. 蛍光のDAPIシグナルとEMの核外形に基づいて相関を実行します(図1I)。画像をシフトして正確に重ね合わせ、手動の相関関係を正確に実行します。このアプローチをより正確にするには、たとえば、Icy の ec-CLEM プラグインや ImageJ の BigWarp プラグインを使用してランドマークベースの相関を適用し、対応するポイントを手動で選択して画像を関連付けます。ec-CLEMとの相関関係に関する詳細なステップバイステップのプロトコルが利用可能です19。
      注:このアプローチは、バイモーダル基準プローブ20,21の使用でもうまく機能します。
  2. 適切なプログラム(ImageJなど)で蛍光シグナルに基づいてROIを選択することにより、相関画像を解析します。定量分析では、すべての標識オルガネラの ROI のコレクションを作成します。次に、個々のROIの対応する超微細構造を検査し、形態学的要素に基づいて分類します。

Representative Results

極薄凍結切片でのLC3の免疫金標識のための最適化された免疫EMプロトコルが、De Maziereらによって最近発表されました9。この研究には、LC3が存在するが比較的まれでEMによる発見が困難なBafA1のない飢餓状態が含まれていました。別の研究では、蛍光標識の感度を利用して、比較的まれで発現の少ない内因性タンパク質を可視化し、これをEM超微細構造と相関させるオンセクションCLEM法が導入されました14。ここでは、これら 2 つのアプローチを、CLEM アプローチの一部として最適化された LC3 標識プロトコルの使用によって組み合わせます。

基底オートファジーのレベルが比較的高い肝臓由来の細胞であるHEPG2細胞22を、4%PFAに固定する前に、最小限の培地(アール平衡塩溶液[EBSS])で2時間飢餓状態にしました。これに続いて、超薄型凍結切片の徳安法(セクション1-3;Slot and Geuze12参照)によるサンプル調製が行われ、これはオンセクションCLEM 14,23と高い親和性があります。融解した凍結切片を、マウス抗LC3一次抗体を用いて蛍光標識した(プロトコルセクション4および図1)。さらに、ウサギ抗LAMP1をエンドリソソームの指示に用い、次に抗マウスAlexaFluor488および抗ウサギAlexaFluor568二次抗体を用いました。グリッドをカバーガラスとスライドガラスの間に挟み込み、広視野顕微鏡(100x 1.47 NAオイル対物レンズ、sCMOSカメラ)でRTで画像化しました。

従来の全細胞IFに対する薄切片の蛍光標識の利点は、切片の物理的な厚さが60〜90 nmであるため、Zの分解能が向上することです。このZ分解能の向上により、薄切片上のLC3とLAMP1の蛍光標識では、共局在がほとんど見られません(図2A)。BafA1などのリソソーム阻害剤で処理された細胞では、リソソームで封入されたLC3が分解されないままであるため、高い共局在が起こります9。未処理の細胞では、LC3は酵素活性のLAMP1陽性リソソームと接触すると急速に分解されるため、これらの条件では共局在はまれです。一般に、細胞プロファイルごとに1つのLC3句点未満が観察されました。これは、飢餓状態でもオートファゴソームの代謝回転が速く、オートファゴソームの数を低く抑えていることを示しています。また、CLEMを使用して、光学顕微鏡による広い視野を使用して、まれなLC3標識構造を見つけることの重要性も強調しています。さらに、蛍光標識は金標識よりも感度が高いため、従来の免疫電子顕微鏡よりも多くのLC3陽性細胞小器官を同定でき、その特性評価がさらに容易になります。

切片のリボンの完全なタイルセットを取得した後、グリッドを顕微鏡から取り出し、UAおよびループアウト法を使用してEM用に後染色しました(プロトコルステップ4.4-4.6;図1F、G)。この「ループアウト」方式により、UA:メチルセルロースの薄層がグリッド上に残り、EMに望ましいコントラストが生まれます。層の厚さは、UA:メチルセルロースがろ紙に吸い取られる速度と角度によって異なります。ループのドラッグが速すぎると、グリッドにUA:methylcelluloseが残りすぎて、EMのセクションの外観が暗くなる可能性があります。ドラッグが遅すぎると、UA:メチルセルロースが引き離されすぎて、染色が少なすぎて形態が悪くなり、グリッドがループから外れる危険性があります。ドライグリッド上の「油膜」着色(図1G)は、適切なUA:メチルセルロース層の厚さを示します。

ループアウトと乾燥の後、グリッドをTEMで蛍光によって選択されたROIでイメージングしました。IFデータセットとEMデータセットは、DAPIシグナルをEMで見える核の輪郭に重ね合わせることによって相関し、両方のモダリティの情報を含む統合画像を生成しました。

IFで選択したのと同じ領域をEMで見つけるのは困難な場合があります。したがって、EMで検索している間は、IFタイルセットの概要画像を手元に置いておくことをお勧めします。ユーザーは、切片の折り目や裂け目、グリッドバー、核の配置など、両方のモダリティで認識可能な特徴を探す必要があります。また、EMではサンプルが回転して鏡面化して見える可能性があることに留意することも重要です。領域を識別するための特定の機能を備えた「ファインダーグリッド」を使用して、相関関係を容易にすることができます(材料表を参照)。

LC3陽性オルガネラとEM超微細構造の相関関係から、異なる点状がオートファジーの異なる段階を表すことが明らかになりました(図2B)。凍結切片ではオートファゴソームの超微細構造の保存が困難であるが、細胞質内容物と二重膜を有するオルガネラが頻繁に観察された(図2C、オルガネラ1-5の矢印; 補足図S1)は、オートファゴソームの形態学的特徴を定義しています。興味深いことに、やや弱い蛍光斑は、濃い内容物と管腔内小胞を特徴とするLC3陽性のオートリソソーム(図2C、オルガネラ6、オートファジー含量は*とマークされています)としてEMによって同定されました。このことは、極薄凍結切片のIFにおいてごく少量のLC3が見られることを示し、分解環境にもかかわらず、定常状態の自己リソソームでは一部のLC3が検出可能であることを示しました。しかし、LC3陽性の点状の大部分はオートファゴソームであり、オートリソソームは非常にまれでした。これは、BafA1で処理された細胞が主にオートファゴソームを蓄積し、オートファゴソームを蓄積しないのとは対照的である9。

要約すると、このプロトコルはEMの微細構造に蛍光性の顕微鏡検査によって得られる分子情報をつなぐためのセクションCLEM方法を記述する。この方法では、標識に蛍光色素のみが使用され、一般にEMプローブよりも多くのシグナルが得られるため、免疫電子顕微鏡の感度が向上します。この方法は、無視できるバックグラウンド染色で高レベルの比蛍光を得ることができる極薄凍結切片の使用に特に適しています。蛍光を使用して希少な構造や事象をスクリーニングし、選択したROIをEMに相関させることで、EM操作時間と関連コストを大幅に削減できます。この方法の感度と実現可能性は、未処理の飢餓細胞におけるLC3の可視化によって実証され、LC3はこれらの条件で主にオートファゴソームに会合し、オートリソソームでは非常に低いレベルが見られることを示しています。

Figure 1
図1:オンセクションCLEMの概略図 。 (A)ゼラチン包埋細胞からの凍結切片は、formvarでコーティングされた銅グリッド上に収集されます。(B)グリッドは、適切な溶液の液滴上でセクションダウンで処理されます。(C)グリッドは、一次抗体および蛍光二次抗体で標識されています。(D)グリッドは、50%グリセロールでカバーガラスとスライドガラスの間に挟まれています。(E)広視野顕微鏡で蛍光画像を収集します。(F)スライドガラスからグリッドを取り出し、EM用のウラニル染色でさらに処理します。(G)乾燥後、TEMでグリッドを画像化できます。(H)高倍率TEM画像タイルセットは、蛍光データから選択された領域から取得されます。(I)蛍光顕微鏡とEMの画像を相関させ、重ね合わせます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:飢餓状態のHEPG2細胞におけるLC3とLAMP1のCLEM。 HEPG2細胞をEBSSで2時間飢餓状態にした後、4% PFAで2時間固定した。 (A)切片上のLC3(緑)とLAMP1(赤)のIFイメージングでは、LC3点が比較的少なく、LAMP1との共局在がほとんどないことがわかります。(B)DAPIと核外形に基づく2つのイメージングモダリティ(破線、右パネル)を重ね合わせ、IF(左パネル)の分子情報とEMで得られた超微細構造情報(中パネル)をリンクさせる。ボックス 1(右パネル)に例示されているように、個々の LC3 標識コンパートメントの超微細構造を C に示します。(C)LC3陽性コンパートメントの微細構造。CLEM画像を左側に、疑似カラー(ベージュ)EM画像を右側に示します(無色のEM画像を 補足図S1に示します)。内側と外側のオートファゴソーム膜は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。実施例6におけるオートリソソーム内部のオートファジー含量を*で示す。スケールバー = 10 μm (A)、1 μm (B)、200 nm (C)。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

補足図S1:LC3陽性細胞小器官の無着色EM画像。 (A-F)擬似着色例1〜6の無着色EM画像を 図2Cに示す。細胞小器官は、 図 2 に示したように、LC3 蛍光によって選択されました。内側と外側のオートファゴソーム膜は、それぞれ白と黒の矢印で示されています。実施例6におけるオートリソソーム内部のオートファジー含量を*で示す。スケールバー = 200 nm。略語:AL =オートリソソーム;AP = オートファゴソーム;M =ミトコンドリア。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:この研究で使用した緩衝液と溶液。 この補足ファイルには、この研究で使用したバッファーと溶液を作製するために必要なレシピとプロトコルが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここで紹介する方法は、凍結切片に基づくオンセクションCLEMの最近の進歩、つまりIF標識の高感度とFMとEM14,24の間の正確な(<100 nmエラー)相関を利用しています。これにより、希少な内因性タンパク質を蛍光標識する感度と、これをEM超微細構造に高精度で重ね合わせる能力を備えた方法が得られます。したがって、この方法では、外因性にタグ付けされたタンパク質の(過剰)発現や、感度の低いEM標識の使用が不要になります。この方法の実現可能性は、リソソーム阻害剤を使用せずに、飢餓細胞の内因性LC3に対するCLEMの例によって示されています。

徳安法で得られた凍結切片は、樹脂切片と異なり抗体を透過性があるため、免疫電子顕微鏡に最適なサンプルです。穏やかな固定および造影手順と組み合わせることで、これは一般に、詳細な超微細構造を損なうことなく、他の方法よりも優れた標識効率をもたらし、細胞膜を見事に視覚化します12,25,26。さらに、クライオ切片は蛍光顕微鏡との親和性が高く、CLEMの貴重な基質となっています。凍結切除における古典的なイムノゴールド標識とCLEMの両方が、細胞内組織を理解する上で独創的な洞察を提供しました14,27,28,29,30。

現在、融解凍結切片へのCLEMの適用は、アプローチの品質、適用性、および精度を向上させた継続的な開発と最適化14、20、24、31、32、33、34の結果として、より普及しています。現在、この技術は、大きなIF画像タイルセットとEM画像タイルセットの正確な相関により、蛍光標識された内因性細胞成分の超微細構造のスクリーニングを容易にします14,32,33。これは、金標識構造の探索に通常高倍率を必要とするため、より手間と時間がかかる従来の免疫電子顕微鏡よりも優れています。このため、LC3の超微細構造への局在化はCLEMから大きな恩恵を受けます。LC3陽性の細胞小器官は、オートファジークリアランスがブロックされている場合(すなわち、細胞がBafA1またはpH上昇剤で処理されている場合)に一般的ですが、オートファジー細胞小器官は、変化していない細胞または飢餓状態の細胞で急速に除去されるため、定常状態レベルが非常に低くなります。このような状況では、従来のイムノ電子顕微鏡を用いてLC3標識細胞小器官を見つけることは困難な場合があり、CLEMには明らかな利点があります。

以前は、LC3-GFPまたはLC3-GFP-RFPタンデムプローブの異所性発現を用いた研究で、樹脂切片にCLEMを適用していました35,36,37,38,39。これらの研究では、蛍光イメージングは、包埋前に、またはアクリル樹脂切片40に直接実施され、その後、サンプルをEMによってスクリーニングした。樹脂包埋にはいくつかの利点があります。オートファゴソームの超微細構造は、特に材料が高圧凍結されている場合、一般的によく保存されています40。さらに、重金属染色された樹脂包埋材料のコントラストは、一般にウラニル染色された凍結切片のコントラストよりも顕著です。樹脂包埋切片は、アレイトモグラフィー、FIB-SEM、シリアルブロックフェースSEMなどの体積EM法と互換性がありますが、クライオ切片は互換性がありません。包埋前にイメージングを行うアプローチでは、生細胞イメージングは、クライオ切片のCLEMでは利用できないオプション41です。凍結切除におけるCLEMの主な利点は、IFシグナルが高いため、膜透過処理や過剰発現を必要とせずに希少タンパク質の免疫局在化が可能であることです。これにより、膜抽出、過剰発現アーチファクト42、および被験者の遺伝子改変の可能性が回避され、IFとEMの広い領域を相関させる可能性と相まって、LC3とオートファジーを研究するための優れたツールになります。

ここでは、飢餓状態のHEPG2細胞にオンセクションCLEMを適用したところ、LC3は主にオートファゴソームとして同定された構造に局在していることが明らかになりました。さらに、オートリソソームにいくつかの弱い蛍光スポットが見つかりました。これは、BafA19 で処理された細胞とは正反対であり、オートファゴソームがリソソームと融合すると、オートファゴソームタンパク質が急速に分解されることを反映しています。全体として、このデータは、融解した凍結切片のCLEMが、天然条件におけるLC3を介したオートファジーに関する洞察を提供できることを実証しました。また、このデータは、低レベルのインタクトなLC3エピトープしか含まないオートリソソームでもLC3が検出されたため、この技術の感度を強調しています。異なるモデルや条件でLC3をイメージングすることにより、この技術をさらに応用することで、オートファジーや、LC3関連食作用やATG8の単膜への結合など、LC3を介した他の生物学的プロセスの理解が深まります。

オートファジー以外にも、オンセクションCLEMは、細胞分裂、感染、組織内の希少細胞タイプ、動原体、一次繊毛、細胞タイプ特異的細胞小器官など、他のまれなイベントや構造にも適用できます。IFによる対象の効果的なスクリーニングは、これらの希少性の超微細構造研究を大幅に促進することができます。さらに、この技術は、従来の免疫電子顕微鏡よりも高感度な方法でタンパク質を局在化するために使用できることが示されました14 。固定長を調整することで、この感度をさらに拡張し、非常に少量のタンパク質や抗原性の低いタンパク質の超微細構造局在化が可能になります。最後に、オンセクションCLEM法は、定量的な数の細胞小器官の迅速な選択を容易にし、特定のタンパク質の超微細構造分布のより堅牢な分析を容易にします。

凍結切片のCLEMには、凍結切片作成のための機器と専門知識が必要です。これらのツール(クライオミクロトームなど)にアクセスできるグループでは、オンセクションCLEMの実装は簡単で、ほとんどのラボがアクセスできるセットアップである自動広視野顕微鏡のみが必要です。さらに、この方法は世界中のEM施設で利用可能です。オンセクションCLEMは、確立されたIF法とEM法の適用を組み合わせたものであるため、この方法は容易に適合し、例えば、断層撮影20、33、43、限られた数のセクション44のシリアルセクションボリュームEM、または超解像顕微鏡45と組み合わせることができる。この分析法の汎用性は、幅広い生物学的問題への応用をサポートします。

Disclosures

著者らは、利益相反はないと宣言しています。

Acknowledgments

実りある議論とフィードバックをしてくれたユトレヒト大学医療センターの分子医学センターの同僚に感謝します。私たちは、顕微鏡技術の継続的な改善を行ってくれたKlumpermanラボの過去と現在の同僚に感謝します。本研究に用いるEMインフラは、オランダ研究評議会(NWO)がJKに資金提供する研究プログラム「National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure (NEMI)」(プロジェクト番号184.034.014)の一部です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and reagents
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 Life Technologies #A21202 use 1:250
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 Life Technologies A#10042 use 1:250
Antibody mouse anti-LC3 Cosmo Bio CTB-LC3-2-IC use 1:100
Antibody rabbit anti-LAMP1 Cell Signaling 9091 use 1:250
Bovine serum Albumin, fraction V Sigma-Aldrich A-9647
BSA-c Aurion 900.099
BSA-conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht BSAG 5 nm
Water-free Chloroform Merck 1.02447.0500
DAPI Invitrogen 10184322 Use at end concentration of 10 µg/ml
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fish-skin Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Food-grade gelatin Merck G1890
Formvar, Vinylec E SPI 02492-RA
Gluteraldehyde Serva 23115.01 See CAUTION note
Glycerol Boom MBAK 7044.1000
Glycine Merck 1042010250
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Methylcellulose, 25 centipoises Sigma-Aldrich M-6385
MgSO4 Riedel-de Haen 12142
Na2HPO4 (PB component A) Merck 106580-0500
NaBH4 Merck 806373
NaH2PO4 (PB component B) Merck 106346
NH4OH Sigma-Aldrich 221228-0025
Oxalic acid Merck 100495
Paraformaldehyde prills Sigma-Aldrich 441244 See CAUTION note
PIPES Merck 110220
Protein-A conjugated gold Cell Microscopy Core, UMC Utrecht PAG 5, 10, 15 or 20 nm
Sucrose D(+) VWR 27483294
Uranyl acetate SPI 020624-AB See CAUTION note
Tools and consumables
Pick-up loop Electron Microscopy Sciences 70944
Filter paper, qualitative, medium-fast LLG 6.242 668
Finder grids Ted Pella G100F1
Grids Cell Microscopy Core, UMC Utrecht CU 100 mesh
Microscopes
Leica Thunder widefield microscope Leica Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software;
Leica UC7 ultracryomicrotome Leica
Tecnai T12 FEI Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software
Software
ec-CLEM in icy open source Paul-Gilloteaux et al., 2017
Fiji open source Schindelin et al., 2012
IMOD open source Mastronarde et al., 2017
Photoshop Adobe
SerialEM open source Mastronarde et al., 2018

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生物学、第193号、相関光電子顕微鏡、オートファジーオルガネラ、電子顕微鏡、蛍光顕微鏡、オートファジータンパク質、オートファゴソーム、オンセクションCLEM、LC3標識、リソソーム酸性化、オートリソソーム
オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在
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