Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

Michael Scott Davis; Montana Renae Barrett

doi:10.3791/65075

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Article de méthode

Fluoro-respirométrie à haute résolution du muscle squelettique équin

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DOI :

10.3791/65075

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3 février 2023

Michael Scott Davis¹ , Montana Renae Barrett¹

¹Department of Physiological Sciences, Oklahoma State University

Dans cet article

Résumé

Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.

Résumé

La fonction mitochondriale - la phosphorylation oxydative et la génération d’espèces réactives de l’oxygène - est essentielle à la fois pour la santé et la maladie. Ainsi, la mesure de la fonction mitochondriale est fondamentale dans la recherche biomédicale. Le muscle squelettique est une source robuste de mitochondries, en particulier chez les animaux ayant une capacité aérobie très élevée, comme les chevaux, ce qui en fait des sujets idéaux pour étudier la physiologie mitochondriale. Cet article démontre l’utilisation de la respirométrie à haute résolution avec fluorométrie simultanée, avec des mitochondries musculaires squelettiques fraîchement récoltées, pour quantifier la capacité d’oxyder les substrats sous différents états mitochondriaux et déterminer les capacités relatives d’éléments distincts de la respiration mitochondriale. L’ester méthylique de tétraméthylrhodamine est utilisé pour démontrer la production du potentiel membranaire mitochondrial résultant de l’oxydation du substrat, y compris le calcul de l’efficacité relative des mitochondries en calculant le potentiel membranaire relatif généré par unité de flux d’oxygène simultané. La conversion de l’ADP en ATP entraîne une modification de la concentration de magnésium dans la chambre de réaction, en raison des différentes affinités des adénylates pour le magnésium. Par conséquent, le vert de magnésium peut être utilisé pour mesurer le taux de synthèse de l’ATP, ce qui permet de calculer davantage l’efficacité de phosphorylation oxydative (rapport de la phosphorylation à l’oxydation [P/O]). Enfin, l’utilisation d’Amplex UltraRed, qui produit un produit fluorescent (résorufine) lorsqu’il est combiné avec du peroxyde d’hydrogène, permet de quantifier la production d’espèces réactives de l’oxygène pendant la respiration mitochondriale, ainsi que la relation entre la production de ROS et la respiration concomitante. Ces techniques permettent la quantification robuste de la physiologie mitochondriale dans une variété de conditions simulées différentes, mettant ainsi en lumière la contribution de cette composante cellulaire critique à la santé et à la maladie.

Introduction

Les mitochondries des cellules eucaryotes produisent la majorité de l’ATP utilisé par les cellules pour le travail et l’entretien¹. Une étape clé dans la production mitochondriale d’ATP est la conversion de l’oxygène en eau, et donc la capacité métabolique des mitochondries et des cellules associées est fréquemment quantifiée par la mesure de la consommation d’oxygène². Cependant, la physiologie mitochondriale est plus complexe que le simple processus de consommation d’oxygène, et la dépendance à ce paramètre fournit exclusivement une évaluation incomplète de l’impact de la fonction mitochondriale et du dysfonctionnement....