Summary
Les chevaux ont une capacité d’exercice aérobique exceptionnelle, faisant du muscle squelettique équin un tissu important pour l’étude de la physiologie de l’exercice équin ainsi que de la physiologie mitochondriale des mammifères. Cet article décrit des techniques pour l’évaluation complète de la fonction mitochondriale dans le muscle squelettique équin.
Abstract
La fonction mitochondriale - la phosphorylation oxydative et la génération d’espèces réactives de l’oxygène - est essentielle à la fois pour la santé et la maladie. Ainsi, la mesure de la fonction mitochondriale est fondamentale dans la recherche biomédicale. Le muscle squelettique est une source robuste de mitochondries, en particulier chez les animaux ayant une capacité aérobie très élevée, comme les chevaux, ce qui en fait des sujets idéaux pour étudier la physiologie mitochondriale. Cet article démontre l’utilisation de la respirométrie à haute résolution avec fluorométrie simultanée, avec des mitochondries musculaires squelettiques fraîchement récoltées, pour quantifier la capacité d’oxyder les substrats sous différents états mitochondriaux et déterminer les capacités relatives d’éléments distincts de la respiration mitochondriale. L’ester méthylique de tétraméthylrhodamine est utilisé pour démontrer la production du potentiel membranaire mitochondrial résultant de l’oxydation du substrat, y compris le calcul de l’efficacité relative des mitochondries en calculant le potentiel membranaire relatif généré par unité de flux d’oxygène simultané. La conversion de l’ADP en ATP entraîne une modification de la concentration de magnésium dans la chambre de réaction, en raison des différentes affinités des adénylates pour le magnésium. Par conséquent, le vert de magnésium peut être utilisé pour mesurer le taux de synthèse de l’ATP, ce qui permet de calculer davantage l’efficacité de phosphorylation oxydative (rapport de la phosphorylation à l’oxydation [P/O]). Enfin, l’utilisation d’Amplex UltraRed, qui produit un produit fluorescent (résorufine) lorsqu’il est combiné avec du peroxyde d’hydrogène, permet de quantifier la production d’espèces réactives de l’oxygène pendant la respiration mitochondriale, ainsi que la relation entre la production de ROS et la respiration concomitante. Ces techniques permettent la quantification robuste de la physiologie mitochondriale dans une variété de conditions simulées différentes, mettant ainsi en lumière la contribution de cette composante cellulaire critique à la santé et à la maladie.
Introduction
Les mitochondries des cellules eucaryotes produisent la majorité de l’ATP utilisé par les cellules pour le travail et l’entretien1. Une étape clé dans la production mitochondriale d’ATP est la conversion de l’oxygène en eau, et donc la capacité métabolique des mitochondries et des cellules associées est fréquemment quantifiée par la mesure de la consommation d’oxygène2. Cependant, la physiologie mitochondriale est plus complexe que le simple processus de consommation d’oxygène, et la dépendance à ce paramètre fournit exclusivement une évaluation incomplète de l’impact de la fonction mitochondriale et du dysfonctionnement sur la santé cellulaire. La caractérisation complète de la fonction mitochondriale nécessite l’évaluation non seulement de la consommation d’oxygène, mais aussi de la production d’ATP ainsi que des espèces réactives de l’oxygène (ROS).
Des mesures supplémentaires des fonctions mitochondriales clés peuvent être accomplies en même temps que la mesure de la respiration grâce à l’utilisation de fluorophores spécifiques. L’ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM) est un fluorophore cationique qui s’accumule dans la matrice mitochondriale proportionnellement au potentiel de tension transmembranaire mitochondriale, entraînant une diminution de l’intensité fluorescente due à cette accumulation3. TMRM peut être utilisé comme indicateur des changements relatifs dans le potentiel de la membrane mitochondriale, ou peut être utilisé pour quantifier les changements précis de la tension transmembranaire avec des expériences supplémentaires pour déterminer les constantes qui permettent la conversion du signal fluorescent en mV. Le vert de magnésium (MgG) est un fluorophore qui devient fluorescent lorsqu’il est lié à Mg2+ et est utilisé pour mesurer la synthèse de l’ATP en fonction de l’affinité différentielle de l’ADP et de l’ATP pour le cation divalentde magnésium 4. Les chercheurs doivent déterminer les constantes d’affinité/dissociation (Kd) spécifiques pour l’ADP et l’ATP dans des conditions analytiques spécifiques afin de convertir les changements de fluorescence MgG en un changement de la concentration d’ATP. Amplex UltraRed (AmR) est le fluorophore utilisé pour mesurer la production de peroxyde d’hydrogène et d’autres ROS au cours de la respiration mitochondriale5. La réaction entreH2O2et AmR (catalysée par la peroxydase de raifort) produit de la résorufine, détectable par fluorescence à 530 nM. Chacun de ces tests peut être ajouté individuellement aux tests de respiration mitochondriale en temps réel, afin de fournir des mesures simultanées des aspects respectifs de la physiologie mitochondriale, fournissant ainsi un lien direct entre la respiration et le rendement mitochondrial.
Les chevaux sont capables de taux très élevés de consommation d’oxygène spécifique à la masse, en partie à cause de la teneur mitochondriale très élevée du muscle squelettique équin, ce qui rend ce tissu très pertinent pour l’étude de la physiologie mitochondriale. Avec le développement de la respirométrie à haute résolution, les études utilisant cette nouvelle technologie ont permis de définir les contributions des mitochondries du muscle squelettique équin à la fois à la remarquable capacité d’exercice des chevaux et à la physiopathologie des maladies musculaires squelettiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Les études de la fonction mitochondriale du muscle squelettique équin sont particulièrement avantageuses, car l’obtention de grandes quantités de ce tissu n’est pas terminale. Ainsi, les sujets équins peuvent non seulement fournir suffisamment de tissu pour la caractérisation complète de la fonction mitochondriale, mais aussi servir de contrôles longitudinaux pour des études mécanistiques de haute qualité sur la physiologie mitochondriale. Pour cette raison, des tests supplémentaires pour quantifier le potentiel de la membrane mitochondriale, la synthèse de l’ATP et la production de ROS qui complètent la mesure de la consommation d’oxygène dans ce tissu ont été développés, afin de fournir une caractérisation plus robuste de la physiologie mitochondriale dans le muscle squelettique équin.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Oklahoma State University. Quatre hongres pur-sang (17,5 ± 1,3 ans, 593 ± 45 kg) ont été utilisés dans cette étude pour générer les résultats représentatifs.
1. Obtention d’un échantillon de biopsie des muscles squelettiques
- Obtenir des biopsies des muscles squelettiques (suivre une technique stérile) à partir du centre du muscle semi-tendineux (ou d’un autre muscle d’intérêt), à l’aide d’une aiguille de biopsie de 12 G du University College Hospital (UCH) (voir le tableau des matériaux) sous sédation légère et en utilisant une anesthésie locale à la suite d’un rapport publié précédemment11.
- Transférer immédiatement les échantillons de biopsie dans des flacons avec une solution de milieu de transport de biopsie glacée (2,77 mM CaK 2-EGTA, 7,23 mM K 2-EGTA, 20 mM imidazole, 20 mM de taurine, 50 mM de k-mes, 0,5 mM de dithiothréitol, 6,56 mM de MgCl2, 5,77 mM d’ATP et 15 mM de phosphocréatine, ajustées à pH 7,1; voir le tableau des matériaux). Transport au laboratoire pour analyse.
REMARQUE : Consulter Doerrier et coll.15 pour obtenir des instructions précises sur la préparation des milieux de transport de la biopsie. - Isoler les mitochondries des échantillons de biopsie à l’aide d’une trousse commerciale, conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Le tampon de stockage final ne doit pas contenir de substrats tels que l’ADP, l’ATP et le succinate, qui font partie de l’essai de spirométrie.
- Resuspendre la pastille finale des mitochondries isolées en utilisant 80 μL de milieu en suspension (225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose et 1 mM d’EGTA; voir le tableau des matériaux) par 100 mg de muscle utilisé pour l’isolement des mitochondries.
- Minimiser l’intervalle entre le moment de la procédure de biopsie et l’isolement des mitochondries et conserver les échantillons à 0-4 °C tout au long des étapes de traitement jusqu’à ce qu’ils soient ajoutés aux respiromètres à haute résolution.
NOTE: Des études préliminaires ont montré que les suspensions de mitochondries isolées commencent à perdre leur capacité fonctionnelle après environ 2 heures lorsqu’elles sont maintenues à 0-4 ° C.
2. Mise en place du respiromètre haute résolution
- Les respiromètres à haute résolution sont utilisés pour quantifier la respiration mitochondriale et les processus associés. Utilisez le logiciel de contrôle fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux) pour contrôler le respiromètre, étalonner les capteurs et recueillir des données brutes. Analyser les échantillons en double pour chaque condition d’essai.
REMARQUE : Dans tous les cas, les titrages recommandés et les concentrations finales de réactifs décrits dans le présent protocole sont basés sur une chambre de pneumométrie de 2 mL. - Déterminer le fluxO2 de fond et le point zéro du capteur O 2 toutes les2 à 4 semaines par titrage série de dithionite, en suivant les instructions du fabricant. Conservez ces constantes d’étalonnage pour les essais suivants jusqu’à ce que l’étalonnage soit répété.
NOTE: Contrairement aux procédures précédemment publiées utilisant des fibres musculaires perméabilisées11,12,13,16, dans lesquelles une hyperoxie (250-500 μM) est nécessaire pour éviter la limitation de la diffusion de O 2 vers les mitochondries, les mitochondries isolées peuvent être évaluées en utilisant une plage de 50-200 μM O 2. Cela peut être réalisé simplement en permettant au milieu respiratoire de s’équilibrer avec l’air ambiant avant d’ajouter la suspension mitochondriale (c’est-à-dire après un étalonnage quotidien en un seul point). De même, la réoxygénation de la chambre respiratoire peut être accomplie en ouvrant simplement la chambre jusqu’à ce qu’une quantité suffisante d’oxygène ambiant se soit dissoute dans le milieu de respirométrie pour élever la concentration d’oxygène au niveau souhaité. - Remplir les chambres du respiromètre avec des milieux sans magnésium (0,5 mM d’EGTA, 60 mM de K-lactobionate, 20 mM de taurine, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM de saccharose et 1 g/L d’albumine sérique bovine [BSA] essentiellement sans acides gras, ajustée à pH 7,1; voir le tableau des matières).
REMARQUE : Consulter Komlodi et coll.17 pour obtenir des instructions précises sur la préparation des milieux respiratoires.- Réglez la température d’incubation de l’instrument à 38 °C pour représenter la température basale du muscle squelettique équin et réglez le mélange du milieu respiratoire à 800 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique tournant dans le fond de la chambre du respiromètre.
- Éteignez l’éclairage de la chambre pour éviter les interférences avec les capteurs fluorescents.
- Mettez l’électrode d’oxygène sous tension avec une tension de polarisation de 800 mV et amplifiez le signal résultant avec un réglage de gain de 1.
- Enregistrer la concentration d’oxygène toutes les 2 s, calculer le flux d’oxygène comme la pente négative de la mesure de l’oxygène au cours des 40 s précédentes (20 points de données) et indiquer sous forme de pmol x s-1 x mL de solution d’incubation.
- Calibrez le capteur d’oxygène en permettant au fluide de s’équilibrer avec l’air ambiant. Calculer la pression partielle d’oxygène de référence, sur la base de la pression barométrique mesurée par le respiromètre haute résolution et de la concentration atmosphérique standard d’oxygène.
3. Mesure du potentiel de la membrane mitochondriale à l’aide de TMRM
- Utilisez des capteurs fluorescents « verts » (longueur d’onde dominante de 530 nm) pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire. Alimenter les capteurs à 400-500 mV; Le signal résultant est amplifié avec un gain de 1:1 000.
REMARQUE: Les paramètres spécifiques doivent être optimisés pour les instruments individuels afin de capturer le signal attendu dans la plage linéaire du capteur. - Ajouter TMRM (4 μL de solution de 1 mM pour une concentration finale de 2 μM; voir le tableau des matériaux) avant l’ajout de mitochondries.
- Calibrer le signal fluorescent en utilisant un simple étalonnage en deux points du signal fluorescent (tension) par rapport à la quantité de fluorophore ajouté (mM), avant l’ajout des mitochondries.
REMARQUE: Utilisez la fonction d’étalonnage du signal fluorescent dans le logiciel de commande de la machine pour étalonner ce signal. Le signal brut de la sonde fluorescente peut nécessiter 30 minutes ou plus pour se stabiliser afin d’enregistrer le deuxième point de l’étalonnage. - Effectuer l’étalonnage final du signal TMRM après l’achèvement du protocole de titrage de la respirométrie en délivrant plusieurs titrages d’agent de découplage (cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone; 2 μL par titrage) jusqu’à ce qu’aucune autre augmentation du signal fluorescent TMRM ne soit observée, indiquant l’effondrement complet du potentiel de membrane mitochondriale (Figure 1).
REMARQUE : Cette valeur de signal fluorescent est considérée comme égale au potentiel transmembranaire de 0 mV et utilisée comme point de référence pour les valeurs relatives du potentiel membranaire enregistrées pendant le protocole de titrage de la spirométrie.
4. Mesure de la production d’ATP à l’aide de vert de magnésium (MgG)
- Utilisez des capteurs fluorescents « bleus » (longueur d’onde dominante de 465 nm) pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire. Mettez ces capteurs sous tension pour que des instruments individuels capturent le signal attendu dans la plage linéaire du capteur.
- Effectuer la configuration chimique et l’étalonnage du signal fluorescent MgG après l’ajout des mitochondries, mais avant l’ajout de tout substrat. Ajouter 8 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 2 mM à la chambre de pneumométrie pour chélater les cations (en particulier Ca 2+) qui entreraient en compétition avec Mg2+ pour se lier à MgG, puis ajouter 4 μL de 1 mM MgG (1,1 μM) à la chambre respiratoire.
- Calibrer le signal de fluorescence brut avec des titrages séquentiels de 100 mM MgCl 2de 10 x 2 μL, en laissant 1 min entre les titrages pour stabiliser le signal fluorescent (Figure 2).
REMARQUE : Ce processus, qui est achevé hors ligne après l’achèvement de l’essai et à l’aide de gabarits fournis par le fabricant de la machine et le logiciel associé, produit une courbe de second ordre de concentration de magnésium au signal fluorescent (r2 attendu > 0,98), qui sera utilisée avec une quantité connue de TAD ajoutée à la chambre de pneumométrie et les valeurs K d précédemment déterminées pour déterminer la concentration correspondanted’ATP 11. - Déterminer le taux de synthèse de l’ATP, qui est la pente de la concentration d’ATP au fil du temps tout au long du protocole (Figure 3).
5. Mesure de la production mitochondriale de ROS à l’aide d’Amplex UltraRed (AmR)
- Utilisez des capteurs fluorescents « verts » (longueur d’onde dominante de 530 nm) pour quantifier le signal fluorescent de la chambre respiratoire. Alimenter les capteurs à 300-400 mV; Le signal résultant est amplifié avec un gain de 1:1 000. Optimisez les paramètres spécifiques pour les instruments individuels afin de capturer le signal attendu dans la plage linéaire du capteur.
REMARQUE: Si vous utilisez des milieux respiratoires sans MgCl 2, il faut les ajouter (20-60 μL de 100 mM MgCl 2 pour produire 1-3 μM MgCl2) avant d’ajouter des réactifs pour le test AmR. - Effectuer la configuration chimique et l’étalonnage initial du test AmR avant l’ajout des mitochondries. Ajouter 30 μmoles de DTPA (6 μL de solution de 5 mM) aux cations chélatés qui pourraient interférer avec la réaction, puis ajouter la superoxyde dismutase (2 μL d’une solution mère de 5 000 U/mL pour convertir les anions superoxydes enH2O2pour une détection plus complète de la production réactive d’oxygène), la peroxydase de raifort (5 μL d’une solution mère de 500 U/mL), et Amplex UltraRed (2 μL d’une solution mère de 10 mM) (voir le tableau des matériaux) pour produire 5 U/mL, 1 U/mL et 10 μM dans la chambre de pneumométrie, respectivement.
- Laissez le signal fluorescent se stabiliser, puis ajoutez 0,2 μmole de peroxyde d’hydrogène (5 μL d’une solution de 40 μM fraîche quotidiennement) deux fois, à environ 5 minutes d’intervalle.
NOTE: Le signal fluorescent avant et après les deux titrages de H 2O 2 fournit une courbe d’étalonnage linéaire en trois points du système (r2 attendu > 0,95), dont la pente reflète la réactivité globale du système pour signaler la relation entre le signal fluorescent et la production (ou l’addition) deH2O2. Utilisez la fonction d’étalonnage du signal fluorescent dans le logiciel de commande de la machine pour calibrer ce signal. - Effectuer des étalonnages supplémentaires en deux points (5 μL d’une solution de 40 μM fraîche quotidiennement) tout au long de l’essai, afin de permettre l’ajustement de la réactivité de l’essai à mesure que la chimie de la respirométrie change tout au long de l’essai, le moment précis de ces points d’étalonnage étant laissé à la discrétion de l’investigateur (figure 4).
6. Mesure de la respiration mitochondriale
- Ajouter 15 μL de suspension mitochondriale isolée (étape 1.4) à chaque chambre d’incubation de 2 mL, de sorte que les résultats représentent le rendement mitochondrial de 18,75 mg de muscle. Scellez la chambre d’incubation. Vortex de l’échantillon entre chaque titrage pour maintenir une suspension uniforme de l’échantillon.
- Mesurer la consommation d’oxygène résiduel (ROX) avant l’ajout de substrats. Soustrayez cette valeur (généralement inférieure à 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) des valeurs de consommation d’oxygène de chaque étape du protocole de titrage substrat/découpleur/inhibiteur (SUIT)11 après la fin du protocole.
REMARQUE: Il est essentiel que les signaux du capteur d’oxygène et du capteur de fluorescence puissent se stabiliser pendant au moins 1 minute (telle qu’évaluée par la pente calculée stable des signaux du capteur primaire), car l’état général de la respiration est modifié par les titrages afin d’obtenir des résultats fiables. Cela s’applique à toutes les étapes de titrage. - Utilisez un SUIT à usage général qui permet la caractérisation initiale de la fonction mitochondriale du muscle squelettique équin. Commencer par des titrages séquentiels de pyruvate (5 μL de solution aqueuse 2 M), de glutamate (10 μL de solution aqueuse 2 M) et de malate (10 μL de solution aqueuse 0,4 M) (voir le tableau des matériaux) dans chaque chambre pour produire du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et stimuler la respiration non phosphorylante (fuite) soutenue par le NADH oxydé par le complexe I (LN) (Figure 1, Figure 3 et Figure 4).
- Ajouter de l’ADP (20 μL de solution aqueuse de 500 mM; voir le tableau des matériaux) pour stimuler la respiration phosphorylante à travers le complexe I (PN).
- Ajouter du succinate (20 μL de solution aqueuse 1 M; voir le tableau des matières) pour produire une respiration phosphorylante par la combinaison du complexe I et du complexe II (PN+S).
REMARQUE: Avec la combinaison de la respiration à travers le complexe I et le complexe II, la consommation d’oxygène peut être suffisamment élevée pour consommer la majeure partie de l’oxygène dissous dans le milieu d’incubation. Si la concentration d’O2 diminue en dessous de 50 μM, réoxygéner le milieu d’incubation en descellant la chambre d’incubation jusqu’à ce que la concentration d’O2 mesurée ait augmenté au-dessus de 150 μM. Répéter cette étape si nécessaire pour maintenir une quantité suffisante d’O2 pour la respiration mitochondriale. - Ajouter la roténone (2 μL de solution d’éthanol 0,1 mM; voir le tableau des matières) pour bloquer le complexe I. Le flux d’oxygène résultant représente la capacité du complexe II à soutenir la consommation d’oxygène mitochondrial via l’oxydation du succinate seul (PS).
ATTENTION : La roténone est une substance toxique. Utilisez la sécurité standard en laboratoire et évitez l’ingestion ou l’inhalation. - Calculer la valeur moyenne pour une condition expérimentale donnée dans des chambres de pneumométrie individuelles contenant des aliquotes d’une seule biopsie.
REMARQUE : Les calculs dérivés, tels que les rapports de contrôle du flux (FCR), sont utiles pour identifier les changements relatifs dans différentes voies et incluent lafuite de FCR (L N/P N), la FCR N (p N/P N+S) et la FCR S (P S/P N+S). L’efficacité de phosphorylation oxydative calculée (1L N/PN+S) fournit une estimation de l’impact global de la respiration par fuite ajustée en fonction de la capacité respiratoire totale.
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Representative Results
L’état de référence proposé est celui d’un pur-sang sédentaire en bonne santé (pas d’amélioration de la condition physique due à l’exercice obligatoire) et d’un échantillon de muscle frais prélevé au centre d’un muscle postural, contenant un pourcentage élevé de fibres musculaires squelettiques de type I riches en mitochondries et incubé dans des conditions proches du métabolisme au repos (c.-à-d. 38 °C et pH 7,0). Dans ces conditions, l’investigateur peut s’attendre à des valeurs L N de 2,71 ± 0,90, des valeurs PN de 62,40 ± 26,22, des valeurs PN+S de 93,67 ± 34,76 et des valeursP S de 46,93 ± 14,58 pmol O2 x s-1 x mL-1 (Figure 3 et Figure 4). Les valeurs respiratoires des mitochondries incubées avec TMRM sont plus faibles en raison d’un effet inhibiteur de ce fluorophore (Figure 1). FCRLeak, FCRN et FCRS sont respectivement 0,05 ± 0,01, 0,66 ± 0,07 et 0,51 ± 0,07. L’efficacité de phosphorylation oxydative calculée est de 0,97 ± 0,01. Les valeurs absolues pour ces états respiratoires varient en fonction de la capacité oxydative individuelle du sujet et des tissus, mais le profil relatif de ces valeurs est cohérent avec les résultats publiés des fibres musculaires squelettiques équines perméabilisées (c.-à-d. augmentation de la respiration avec l’ajout de substrats spécifiques, la combinaison de la respiration à travers le complexe I et le complexe II étant inférieure à chacune de ces sources d’électrons individuellement en raison de la saturation du système de transfert d’électrons [ETS] capacité en aval). L’efficacité calculée des mitochondries isolées du muscle squelettique équin est cohérente avec les valeurs correspondantes rapportées pour les fibres musculaires squelettiques équines perméabilisées11.
Le taux de synthèse de l’ATP devrait être de 438,59 ± 397,10 pM x s-1 pour la respiration P N, 383,18 ± 397,19 pour la respiration PN + S et 172,07 ± 125,60 pour la respiration PS, par mg de tissu source utilisé pour isoler les mitochondries. La diminution de la synthèse de l’ATP avec l’ajout de succinate est probablement due à la compétition à la jonction de la quinone de l’ETS par les deux alimentations d’électrons, l’alimentation du complexe II (qui ne contribue pas directement au potentiel de membrane mitochondriale) réduisant le flux d’électrons à travers le complexe I (qui contribue directement au potentiel de membrane mitochondriale par le pompage de protons à travers la membrane mitochondriale interne).
Le taux de production de H2O2 devrait être de 0,079 ± 0,095 nmol.s-1 pour la respiration L N, de 0,021 ± 0,043 pour la respiration PN, de 0,026 ± 0,056 pour la respiration PN+S et de 0,237 ± 0,248 pour la respirationP S, par mg de tissu source utilisé pour isoler les mitochondries (Figure 4). Le taux relatif de production de ROS est cohérent avec l’ampleur prévue du potentiel de membrane mitochondriale et l’association entre le potentiel membranaire élevé et la production de ROS. L’exception à cette relation est la production très élevée de ROS lorsque la respiration se produit uniquement par le complexe II, en raison du flux arrière des électrons de la jonction quinone vers le complexe I lorsqu’elle est bloquée par la roténone.
Figure 1 : Trace représentative de respirométrie à haute résolution de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et du potentiel membranaire relatif. La fenêtre supérieure représente la concentration d’oxygène dans la chambre (axe Y gauche) et le flux d’oxygène (axe Y droit) au fil du temps (axe X); la fenêtre inférieure représente la fluorescence TMRM de la chambre (axe Y gauche) et le taux de changement du signal de fluorescence (axe Y droit) au fil du temps (axe X). Les marques verticales indiquent l’ajout de substrats spécifiques à la chambre (mt: suspension mitochondriale; P: pyruvate; G : glutamate ; M: malate; D : ADP; S : succiné; R: roténone; CCCP : Cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Trace représentative de respirométrie à haute résolution de l’étalonnage du signal de fluorescence de la chambre pour le vert de magnésium et détermination de Kd pour le magnésium et les adénylates. Fluorescence MgG de la chambre (axe Y gauche) et taux de changement du signal de fluorescence (axe Y droit) au fil du temps (axe X). Les marques verticales initiales indiquent l’ajout de substrats spécifiques à la chambre (MgG: vert de magnésium; mt: suspension mitochondriale; P: pyruvate; G : glutamate ; M: malate; S : succiné; EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique). Ceci est suivi par le titrage en série de MgCl2 à l’aide d’une pompe de titrage automatisée (TIP) qui augmente le signal fluorescent, puis le titrage en série d’un adénylate (dans ce cas ATP) qui diminue le signal fluorescent. Le titrage de MgCl2 est également utilisé au début de chaque essai pour calibrer le signal MgG, mais est effectué avant l’ajout de mitochondries et de substrats de pneumométrie tels que P, G, M et S. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Trace représentative de respirométrie à haute résolution de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et de la synthèse de l’ATP. La fenêtre supérieure représente la concentration d’oxygène dans la chambre (axe Y gauche) et le flux d’oxygène (axe Y droit) au fil du temps (axe X); la fenêtre inférieure est la fluorescence MgG de la chambre (axe Y gauche) et le taux de changement du signal de fluorescence (axe Y droit) au fil du temps (axe X). Les marques verticales indiquent l’ajout de substrats spécifiques à la chambre (mt: suspension mitochondriale; P: pyruvate; G : glutamate ; M: malate; D : ADP; S : succiné; R : roténone). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Trace représentative de respirométrie à haute résolution de la respiration mitochondriale du muscle squelettique équin et production deH2O2. La fenêtre supérieure représente la concentration d’oxygène dans la chambre (axe Y gauche) et le flux d’oxygène (axe Y droit) au fil du temps (axe X); la fenêtre inférieure est la fluorescence de la résorunine de la chambre (axe Y gauche) et le taux de variation du signal de fluorescence (axe Y droit) au fil du temps (axe X). Les marques verticales indiquent l’ajout de substrats spécifiques à la chambre (mt: suspension mitochondriale; P: pyruvate; G : glutamate ; M: malate; D : ADP; S : succiné; R : roténone). Sont également inclus trois étalonnages intra-essais en deux points du signal fluorescent à l’aide deH 2 O2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’ajout de signaux fluorescents à la sortie standard du respiromètre haute résolution fournit des informations précieuses sur la physiologie mitochondriale, mais un étalonnage méticuleux du signal fluorescent est essentiel pour des données de qualité. Les protocoles originaux pour l’utilisation de MgG suggèrent que les courbes d’étalonnage générées lors du calcul des constantes de dissociation magnésium-adénylate pourraient être appliquées aux essais ultérieurs4; cependant, le signal fluorescent du MgG peut ne pas être suffisamment reproductible d’un essai à l’autre pour cette approche. Par conséquent, chaque essai est étalonné avec un titrage automatisé MgCl2 et la courbe d’étalonnage résultante pour calculer la synthèse de l’ATP pour ce test individuel. En outre, le K d (constantes de dissociation) pour le magnésium et l’ADP et l’ATP doit être calculé pour les conditions spécifiques de l’essai, y compris le tissu spécifique, les conditions d’incubation et les substrats produisant la respiration phosphorylante, afin de s’assurer que la dérivation du taux de synthèsede l’ATP est exacte. La variabilité du test AmR est plus largement reconnue15,17, et il est courant d’insérer plusieurs points de réétalonnage discrets dans le protocole à la discrétion de l’investigateur pendant le protocole. Les données historiques utilisant le muscle squelettique équin indiquent que la réactivité typique du test est d’environ 0,646 V/mM deH2O2au premier point d’étalonnage (avant l’ajout de l’échantillon) et peut diminuer de 8 % à 15 % pendant la durée de l’essai. Par conséquent, un réétalonnage fréquent du test AmR est nécessaire pour détecter des changements relativement faibles dans la production de ROS, et le moment des étalonnages ponctuels dans le protocole doit être déterminé pour chaque protocole de titrage.
Les chercheurs doivent faire preuve de discernement tout au long de la performance de l’essai pour déterminer quand passer à l’étape suivante du titrage. Idéalement, les signaux pertinents générés en temps réel (flux O2 , fluorescence de TMRM et taux de variation du signal fluorescent MgG et résorunine) devraient être stables, indiquant un état stable dans la chambre, mais c’est une question de jugement de la part de l’enquêteur quant à ce qui constitue une stabilité acceptable. À l’heure actuelle, il n’existe pas de norme largement répandue pour cette décision; Cependant, les chercheurs doivent être très conscients des risques liés à la fois au fait de ne pas attendre assez longtemps pour qu’un état stable soit établi (ce qui entraîne des données qui caractérisent imparfaitement l’état respiratoire prévu) et d’attendre si longtemps que les substrats s’épuisent et que le test n’est plus fiable. Selon l’expérience de l’auteur, le fait de ne pas atteindre un signal stable dans les 30 minutes suivant tout titrage du substrat est la preuve qu’un échantillon (ou une machine) se comporte de manière non biologique, et le test doit être jeté.
Les résultats utilisant cette approche pour quantifier la physiologie mitochondriale démontrent une variabilité intersujette considérable, avec un coefficient de variation (CV) typique de 30% à 40%. En revanche, l’analyse des fibres musculaires squelettiques équines perméabilisées donne un CV de 19 % à 20 %11, ce qui suggère que le processus d’isolement des mitochondries impose une variabilité substantielle à l’analyse ultérieure en plus de la variabilité intersujet marquée. Bien que l’effet de ce dernier puisse être atténué en utilisant des sujets comme leurs propres témoins lorsque cela est possible, le premier ne peut être minimisé que par une attention particulière à la technique d’isolement. Si le plan expérimental ne permet pas de répétitions expérimentales à partir d’une seule biopsie, le chercheur peut choisir d’exprimer les données de respirométrie par rapport à un facteur de correction qui reflète les différences de contenu mitochondrial dans différents échantillons. Les facteurs de correction les plus courants sont la teneur en protéines de l’échantillon et l’activité de la citrate synthase de l’échantillon. Cependant, comme l’indique une récente déclaration de consensus de scientifiques actifs dans ce domaine, il n’existe pas de méthode unique pour effectuer cet ajustement qui soit universellement acceptée18. La correction de la teneur en protéines et/ou de l’activité de la citrate synthase sont les deux approches les plus couramment utilisées pour le tissu musculaire squelettique équin12,13, mais les deux ont leurs lacunes. Il peut être nécessaire pour différents modèles expérimentaux d’exprimer les données à la fois par le biais interne (c.-à-d. rapports de contrôle du flux) et externe (protéine, activité enzymatique, autres marqueurs mitochondriaux) afin d’interpréter la fonction mitochondriale.
Le protocole décrit s’appuie sur l’utilisation de fibres musculaires perméabilisées, avec plusieurs différences importantes. Les tests de fibres perméabilisées nécessitent des biopsies plus petites, car la respirométrie à haute résolution des fibres perméabilisées du muscle squelettique équin est généralement effectuée avec seulement ~ 2 mg de masse d’échantillon dans chaque chambre 6,7,8,9,10,11. En revanche, le protocole décrit ici a l’équivalent de près de 10 fois cette masse de fibres dans chaque chambre. Cette différence met en évidence l’inefficacité de l’isolement mitochondrial des tissus frais. Une raison possible de cette inefficacité est la difficulté à récupérer les mitochondries du muscle squelettique qui sont situées dans le réseau de protéines contractiles. Le kit commercial pour l’isolation mitochondriale utilisé dans ce protocole comprend un traitement avec une protéase et l’utilisation de milieux ioniques pour aider à décomposer les fibres contractiles, mais il est probable qu’une partie substantielle des mitochondries intermyofibrillaires ne soit pas récupérée. Cette caractéristique du protocole est non seulement pertinente pour déterminer la quantité de matériel de biopsie nécessaire, mais aussi en ce qui concerne l’interprétation des résultats. Les mitochondries isolées sont moins sensibles à la dépendance à l’oxygène, en raison de la limitation de la diffusion par rapport aux fibres perméabilisées15 ; Ainsi, l’hyperoxie n’est pas nécessaire avec les mitochondries isolées, et le milieu respiratoire peut être suffisamment oxygéné (et réoxygéné pendant le test) en ouvrant simplement la chambre à l’air ambiant. Cet aspect de l’apport d’oxygène est particulièrement utile pour mesurer la production deH2O2et d’autres ROS, car la production de ROS est augmentée de manière non physiologique pendant l’incubation hyperoxique 19. Enfin, l’utilisation de mitochondries isolées fournit un signal fluorescent plus stable et reproductible, en raison de la diminution de la liaison protéique non spécifique des fluorophores par rapport à l’utilisation de fluorophores avec des fibres musculaires perméabilisées. Chaque préparation d’échantillon présente des avantages et des inconvénients, et la maîtrise des fibres perméabilisées et des mitochondries isolées fournit à l’investigateur un ensemble robuste de tests pour répondre à une variété de questions liées à la physiologie mitochondriale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce manuscrit.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner le généreux soutien de la Chaire John et Debbie Oxley en médecine sportive équine et de la Fondation de recherche du Grayson Jockey Club.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A5285 | |
| Amplex UltraRed | Life Technologies | A36006 | |
| ATP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A2383 | |
| BSA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | A6003 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C4830 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | C2759 | |
| DatLab 7.0 | Oroboros Inc | Software to operate O2K fluororespirometer | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D0632 | |
| DTPA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | D1133 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | E4378 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | G1626 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | H7523 | |
| Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P8250 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 516813 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Imidazole | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | I2399 | |
| K-MES | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M8250 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9272 | |
| Magnesium Green | Thermo Fisher Scientific | M3733 | |
| Malate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M1000 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | M9647 | |
| Mitochondrial isolation kit | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | MITOISO1 | |
| O2K fluororespirometer | Oroboros Inc | Multiple units required to run full spectrum of assays concurrently. | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P7936 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P1767 | |
| Potassium lactobionate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | L2398 | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P0662 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | P2256 | Must be made fresh daily prior to assay |
| Rotenone | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | R8875 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | 84097 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | S8160 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T0625 | |
| Titration pump | Oroboros Inc | ||
| Titration syringes | Oroboros Inc | ||
| TMRM | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | T5428 | |
| UCH biopsy needle | Millenium Surgical Corp | 72-238067 | Available in a range of sizes |
References
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