Summary
Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Erzeugung von Wunden im Epithel einer lebenden Clytia hemisphaerica medusa und zur Abbildung der Wundheilung mit hoher Auflösung in vivo. Darüber hinaus wird eine Technik vorgestellt, mit der Farbstoffe und Medikamente eingesetzt werden können, um Signalprozesse in den Epithelzellen und der extrazellulären Matrix während der Wundheilung zu stören.
Abstract
Alle tierischen Organe, von der Haut über die Augen bis hin zum Darm, sind mit Epithelschichten bedeckt, die es ihnen ermöglichen, die Homöostase aufrechtzuerhalten und sie gleichzeitig vor Infektionen zu schützen. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Fähigkeit, Epithelwunden zu reparieren, für alle Metazoen von entscheidender Bedeutung ist. Die epitheliale Wundheilung bei Wirbeltieren beinhaltet überlappende Prozesse, einschließlich Entzündungsreaktionen, Vaskularisierung und Reepithelialisierung. Die Regulation dieser Prozesse beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen Epithelzellen, Nachbarzellen und der extrazellulären Matrix (EZM); Die EZM enthält Strukturproteine, regulatorische Proteine und aktive kleine Moleküle. Diese Komplexität, zusammen mit der Tatsache, dass die meisten Tiere undurchsichtiges Gewebe und unzugängliche EZMs haben, macht es schwierig, die Wundheilung an lebenden Tieren zu untersuchen. Viele Arbeiten zur epithelialen Wundheilung werden daher in Gewebekultursystemen durchgeführt, wobei ein einzelner Epithelzelltyp als Monoschicht auf einer künstlichen Matrix plattiert wird. Clytia hemisphaerica (Clytia) bietet eine einzigartige und spannende Ergänzung zu diesen Studien, die es ermöglicht, die epitheliale Wundheilung an einem intakten Tier mit einer authentischen EZM zu untersuchen. Das ektodermale Epithel von Clytia besteht aus einer einzigen Schicht großer Plattenepithelzellen, die eine hochauflösende Bildgebung mittels Differential Interfering Contrast (DIC)-Mikroskopie an lebenden Tieren ermöglichen. Das Fehlen von migratorischen Fibroblasten, Gefäßen oder Entzündungsreaktionen ermöglicht es, die kritischen Ereignisse bei der Reepithelialisierung in vivo zu analysieren. Die Heilung verschiedener Arten von Wunden kann analysiert werden, darunter einzellige Mikrowunden, kleine und große Epithelwunden sowie Wunden, die die Basalmembran schädigen. In diesem System können die Bildung von Lamellipodien, die Kontraktion der Geldbeutel, die Zelldehnung und die kollektive Zellmigration beobachtet werden. Darüber hinaus können pharmakologische Wirkstoffe über die EZM eingebracht werden, um Zell:EZM-Interaktionen und zelluläre Prozesse in vivo zu modifizieren. Diese Arbeit zeigt Methoden zur Erzeugung von Wunden in lebenden Klytien, zur Aufnahme von Heilungsfilmen und zur Untersuchung von Heilungsmechanismen durch Mikroinjektion von Reagenzien in die EZM.
Introduction
Schichten von Epithelzellen bedecken die äußere Oberfläche aller Metazoen, kleiden innere Organe aus und unterteilen den tierischen Körper in diskrete Kompartimente. Das Epithel trennt auch das Körperinnere von der äußeren Umgebung und schützt es vor Schäden und Infektionen. Daher war das Aufkommen von Epithelschichten ein wesentlicher Bestandteil der Evolution vielzelliger Tiere, und Epithelschichten sind bei allen Tieren von Wirbeltieren bis zu den basalsten Metazoen zu sehen1. Das Epithel einiger Organe ist eine einzige Monoschicht, wie z. B. in den Lungenluftsäcken, Blutgefäßen und Darm2 sowie in der Epidermis von wirbellosen Tieren wie Planarien und Nesseltieren3. In anderen Geweben, wie z. B. der Haut4 und der Hornhaut5 von Wirbeltieren, ist das Epithel geschichtet, was bedeutet, dass es mehrere Epithelzellschichten2 gibt. In allen Fällen ist die basalste Epithelschicht an der Basalmembran befestigt, einem Proteinblatt, das eine spezialisierte Region der extrazellulären Matrix (EZM) bildet6,7,8.
Brüche im Epithel müssen schnell repariert werden, um eine durchgehende Epithelschicht wiederherzustellen. Die Schädigung des Epithels tritt bei natürlichen Prozessen auf, z. B. bei der Ablösung von Epithelzellen im Darm,9,10 und als Folge von Entzündungen oder körperlichen Traumata. Wenn eine einzelne Epithelzelle beschädigt ist, muss sie sich entweder selbst reparieren oder eliminiert werden, damit sich die umgebenden Zellen aneinander anheften und das Loch11,12 schließen können. In Wunden, die größer als die Größe einer einzelnen Zelle sind, müssen sich Epithelzellen bewegen, um sich gegenseitig zu erreichen und das Blatt13 zu reparieren. Dies kann durch Zellausbreitung erreicht werden, wenn die Lücken klein sind, oder kann die Migration von Epithelzellen von den Rändern einer Wunde erfordern, um die Wundlücke zu schließen; Letzteres wird als Reepithelialisierung bezeichnet14,15. In embryonalen Geweben breiten sich Epithelzellen aus und wandern, um Wunden zu schließen, oder werden durch die Kontraktion von Aktomyosinkabeln, die sich zwischen den Zellen am Wundrand bilden, in einem Mechanismus, der einer Geldbeutelschnurähnelt 16, über die Lücke gezogen. In vielen adulten Geweben beinhaltet die Reepithelialisierung die Migration kohärenter Zellschichten, wobei die Zellen ihre Verbindungen zu benachbarten Zellen beibehalten14,17,18. In anderen Geweben werden Zell-Zell-Verbindungen abgebaut und Epithelzellen verhalten sich eher wie mesenchymale Zellen, die sich während der Reepithelialisierung koordiniert, aber unabhängig in die Wundregion bewegen 14,19,20,21.
Die Bewegungen der Epithelzellen werden durch komplexe Wechselwirkungen zwischen den migrierenden Zellen und zwischen den Zellen und der EZM reguliert. Obwohl es eine enorme Menge an experimenteller Literatur gibt, die sich mit den Mechanismen der Wundaktivierung von Epithelzellen und der anschließenden Migration befasst, bleibt noch viel zu entdecken. So ist beispielsweise das anfängliche Signal, das Epithelzellen dazu anregt, als Reaktion auf eine Wunde zu migrieren, nicht eindeutig identifiziert22, und es ist auch nicht vollständig verstanden, wie Aktin wieder eingesetzt wird, um Lamellipodien auf der Seite der Epithelzellen zu erzeugen, die der Wunde am nächsten liegt 22,23,24,25,26,27. Die kollektive Zellmigration erfordert, dass Informationen von Zellen an der Wunde mit Zellen distal der Wunde geteilt werden, und der Kommunikationsweg ist noch unklar28. Zell:Zell-Verbindungen und Zell:ECM-Anhänge müssen zerlegt und neu gebildet werden, wenn sich die Zellen in der Folie neu anordnen, aber die Regulation dieses Prozesses ist nur unzureichend verstanden14,29. Fortschritte bei diesen und anderen verwandten Fragen sind nicht nur als grundlegendes biologisches Problem wichtig, sondern auch wegen der klinischen Bedeutung der korrekten Wundheilung. Krankheiten, die die Fähigkeit der Epithelzellen, korrekt zu migrieren, beeinträchtigen, führen zu chronischen Wunden. Ein Beispiel ist die Erbkrankheit Epidermolysis bullosa, bei der Gene, die an der Anheftung der Epithelzellen an die EZM beteiligt sind, mutiert sind, was zu empfindlicher Haut führt, die sich schält und Blasen bildet. Die Reepithelialisierung ist auch in natürlich alternden Geweben beeinträchtigt30,31. Ein besseres Verständnis ist daher unerlässlich, um Interventionen zur Verbesserung der Wundheilungsergebnisse zu entwickeln.
Die Migration von Epithelzellen in der Wundheilung wurde sowohl mit In-vitro-Ansätzen als auch mit Modellorganismen untersucht. Die meisten Studien zur Wundheilung und zu den Mechanismen der Zellmigration wurden in Gewebekulturen durchgeführt, bei denen Monoschichten eines einzelnen Epithelzelltyps auf einem Substrat gezüchtet werden, das die EZM ersetzt. Zellmonoschichten werden entweder zerkratzt oder mit Schablonen gezüchtet, um Lücken in bestimmten Formen und Größen zu erzeugen, und dann beobachtet32,33,34. Das In-vitro-Modell ermöglicht eine ideale Visualisierung des Zellverhaltens sowie die Möglichkeit, die Eigenschaften des Substrats zu verändern, Zellen Medikamenten und abiotischen und biotischen Faktoren auszusetzen und Zellen mit Konstrukten zu transfizieren, die verschiedene Gene von Interesse exprimieren oder unterdrücken. Dieser reduktionistische Ansatz kann jedoch einige der wichtigen Parameter, die am Verhalten von Epithelzellen in einem In-vivo-Kontext beteiligt sind, nicht erfassen, einschließlich der Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen und Signalereignissen, die in der EZM auftreten11. In-vivo-Modelle liefern den authentischen Kontext einer Wunde mit mehreren Zelltypen, überlappenden Signalwegen und einer komplexen EZM35. Ein solches Modell für Wundheilungsstudien ist die Maus19, bei der die jüngsten Fortschritte es den Forschern ermöglicht haben, Epidermiszellen während der Heilung von Wunden in voller Dicke bei lebenden Tieren zu beobachten36. Die Maus und andere In-vivo-Systeme stellen jedoch eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, die Reepithelialisierung zu untersuchen. Erstens wird der große Vorteil der Beobachtung des Zellverhaltens in einem natürlichen Kontext durch die Komplexität der zeitlich überlappenden Ereignisse ausgeglichen, die während der Wundheilung von Wirbeltieren auftreten, einschließlich Blutgerinnung, Rekrutierung von Immunzellen und Entzündungen, Rekrutierung von Fibroblasten und Zelldedifferenzierung, Revaskularisierung und Remodellierung der EZM. Darüber hinaus erschweren undurchsichtige Gewebe die Bildgebung. Die Epidermissysteme der Drosophila-Larven und Zebrafische 37,38 haben einige dieser Schwierigkeiten aufgrund ihrer relativen Einfachheit überwunden 39.
Unser Labor hat kürzlich ein neues Modell zur Untersuchung der epithelialen Wundheilung vorgestellt: die Medusa-Form (Quallen) des Hydrozoen-Nesseltiers Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia ist ein aufstrebender Modellorganismus mit einem vollständig sequenzierten und annotierten Genom41, einem Einzelzell-RNAseq-Transkriptom 42 und Protokollen für die Genommodifikation (Mutagenese und Transgenese)43,44,45. Nesseltiere sind eine der ältesten erhaltenen Abstammungslinien mit Epithelschichten, so dass das Verständnis der Wundheilung von Nesseltieren Einblicke in die Ahnenwege bietet, die die Integrität des Epithels gewährleisteten. Für die Pfade, die im gesamten Baum des Lebens konserviert wurden, bietet Clytia ein aufregendes neues System zur Untersuchung der Epithelzelldynamik und der funktionellen Regulation der Wundheilung in vivo.
Das Epithel, das die Oberseite der Clytia medusa (Exumbrella) bedeckt, ist eine Monoschicht aus transparenten, plattenepithelialen Zellen, die etwa 50 μm breit und 1-2 μm dick sind (Abbildung 1). Sie sind an einer ECM befestigt, die Mesoglea genannt wird – das "Gelee" der Qualle. Die Mesoglea ähnelt in ihrer Zusammensetzung der EZM, die bei anderen Tieren46, 47, 48 einschließlich Wirbeltieren zu finden ist, hat eine Basalmembran 40 und ist vollständig transparent. Die Epithelschicht der Clytia medusa kann leicht zerkratzt oder verwundet werden (siehe unten). Die Einfachheit und Transparenz des Epithels und der EZM ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung der Zellen und ihrer Bewegungen während der Heilung. Kürzlich haben Kamran et al. die Heilung kleiner Wunden im Clytia-Epithel detailliert charakterisiert40. Es konnte gezeigt werden, dass die Heilung bei Clytia durch Lamellipodien-basiertes Zellkrabbeln, Zellausbreitung und kollektive Zellmigration sowie durch den Verschluss der Geldbeutelschnur erfolgt, der eher für embryonale Systeme typisch ist (obwohl er zuvor bei erwachsenen Tierstrukturen wie der Hornhaut beobachtet wurde49). Die Wundheilung von Clytia ist extrem schnell, wie bei anderen Systemen beobachtet wurde, denen eine Entzündungsreaktion fehlt40,50. Die Heilung im Clytia exumbrella hängt vollständig von den Bewegungen der vorhandenen Epithelzellen ab – keine Zellen proliferieren oder wandern durch die EZM zur Wundstelle (Supplemental Movie 1). All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Clytia ein nützliches Modellsystem ist, um die epitheliale Wundheilung zu untersuchen. In der Tat führte die einfache Bildgebung von Epithelzellen in Clytia während der Wundheilung zu der Entdeckung, dass sich Epithelzelllamellipodien über Bereiche exponierter EZM ausdehnen und ausbreiten, solange eine intakte Basalmembran vorhanden ist. Wenn die Basalmembran geschädigt ist, schaltet die Epithelheilung auf einen Geldbeutel-String-Mechanismus40 um. Dies war die erste Demonstration eines Mechanismus, der der Entscheidung zugrunde lag, durch Lamellipodien-basiertes Krabbeln im Vergleich zum Verschluss der Geldbörse zu schließen, was die Bedeutung spezifischer Zell-EZM-Interaktionen für die Heilung und der Beobachtung von Zellen in ihrem natürlichen Kontext unterstreicht.
Im Folgenden werden Protokolle für die Erzeugung und Bildgebung einzelliger Mikrowunden beschrieben, kleine Wunden, die sich hauptsächlich durch Zellausbreitung schließen, und große Wunden, die eine kollektive Zellmigration erfordern, um sich zu schließen. Des Weiteren wird ein Protokoll für die Einschleusung kleiner Moleküle in die EZM und Epithelzellen beschrieben, das experimentelle Störungen von mutmaßlichen Regulationswegen der Wundheilung ermöglicht.
Protocol
1. Tierkultur
- Pflegen Sie Clytia-Polypenkolonien auf Objektträgern und Medusen in künstlichem Meerwasser (ASW) bei 18 °C in einem Zebrafischsystem mit 2-Liter-Zebrafischbecken für Polypenkolonien und maßgefertigten 5-Liter-Pseudokreiselbecken für Medusen (ergänzende Abbildung 1)51. ASW besteht zu 4 % aus Instant Ocean in deionisiertem (DI)H2O.
- Füttern Sie die Tiere täglich mit 2-3 Tage alten Artemia wie beschrieben51.
HINWEIS: Die Wundheilungsbildgebung ist einfacher, wenn die Tiere nicht kürzlich gefüttert wurden, da weniger Schmutz aus dem Darm in das Sichtfeld abgegeben wird. - Sammeln Sie bei Bedarf Babymedusen aus den etablierten Polypenkolonien, indem Sie die Kolonien über Nacht in ein 2-Liter-Becherglas geben, das mit 1 Liter ASW gefüllt ist. Verwenden Sie 2-3 Wochen alte weibliche Medusen für alle Wundheilungsexperimente. Die Vermehrung von Clytia wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben51.
2. Verwundung
- Erzeugung von Mikrowunden innerhalb und zwischen Zellen (20-500μm2)
- Erstellen Sie eine modifizierte Transferpipette, indem Sie die Spitze mit einer Schere abschneiden, um eine größere Öffnung (0,5-0,7 cm Durchmesser) zu erhalten.
Anmerkungen: Die Öffnung in der Pipette sollte breit genug sein, um Schäden am Tier zu vermeiden. - Legen Sie die Medusa mit der modifizierten Transferpipette mit dem Medusa-Schirm nach oben auf einen Vertiefungsobjektträger, wobei gerade genug ASW vorhanden ist, um das Tier zu bedecken.
- Legen Sie sofort ein Deckglas über das Tier und das Bild (siehe unten für eine Beschreibung der Bildgebung). Das Deckglas drückt die Mesoglea zusammen, und der Rückprall des komprimierten Gewebes erzeugt eine Kraft, die die Zellen leicht auseinander drückt52. Dies zeigt sich sofort in Form von Lücken zwischen den einzelnen Zellen und Schäden innerhalb einiger Zellen (Abbildung 1B, B', Abbildung 2 und Abbildung 3A-C).
- Erstellen Sie eine modifizierte Transferpipette, indem Sie die Spitze mit einer Schere abschneiden, um eine größere Öffnung (0,5-0,7 cm Durchmesser) zu erhalten.
- Erzeugung kleiner Epithelwunden (0,02-0,125 mm2)
- Legen Sie die Medusa mit einer modifizierten Transferpipette (wie oben) mit dem Medusenschirm nach oben auf einen Vertiefungsobjektträger.
- Kratzen Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig die Oberfläche der Medusa. Durch leichtes Kratzen können auch Risse in der Basalmembran entstehen, die leicht erkennbar sind22. Decken Sie das Tier zur Bildgebung mit einem Deckglas ab. Alternativ reicht manchmal die Platzierung des Deckglases aus, um auch ohne Kratzen kleine Epithelwunden zu erzeugen (Abbildung 1C, C', Abbildung 2 und Abbildung 3A-C).
HINWEIS: Drücken Sie nicht nach unten, wenn Sie die Oberfläche der Medusa zerkratzen, da dies die ECM beschädigt und eine unregelmäßige Oberfläche erzeugt – Epithelzellen, die auf einer unregelmäßigen Oberfläche wandern, sind schwieriger im Fokus zu halten.
- Entstehung großer Epithelwunden (0,5-0,9 mm2)
- Stellen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einem Mikropipettenabzieher und einem Glaskapillarröhrchen her (Schritt 5.2). Setzen Sie die leere Mikroinjektionsnadel in einen Mikroinjektorhalter ein, der an einem Mikromanipulator befestigt ist. Schneiden Sie die Nadelspitze so ab, dass die Öffnung ca. 20-40 μm beträgt.
HINWEIS: Schnittnadeln für große Epithelwunden können aufbewahrt und wiederverwendet werden, um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu erhöhen. - Stellen Sie den Nachdruck am Mikroinjektor auf Null und den Ausstoßdruck auf ca. 20 PSI. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass er einen Luftimpuls von 2 s abgibt.
Anmerkungen: Der Auswurfdruck muss möglicherweise basierend auf dem Durchmesser der Nadelöffnung angepasst werden (d. h. kleinere Spitzen verwenden einen höheren Druck, während größere Spitzen einen niedrigeren Druck verwenden). - Platzieren Sie die Medusa mit dem Regenschirm nach oben auf einer Vertiefungsrutsche auf der Bühne eines Sezierfernrohrs, mit gerade genug ASW, um das Tier zu bedecken. Stellen Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Mikroinjektionsnadel so ein, dass sie sich knapp über dem Wasser befindet. Tauchen Sie dazu die Spitze vorsichtig in Wasser (Wasser kann in die Pipettenspitze eindringen) und ziehen Sie sie dann so zurück, dass sie sich nahe an der Epitheloberfläche der Medusa befindet.
HINWEIS: Die Spitze sollte über einem Quadranten der Medusa positioniert werden. Die radialen Kanäle der Medusa unterteilen die Medusenglocke in vier verschiedene Quadranten. Das Anvisieren eines Quadranten führt zu einer saubereren Bildgebung, da die Keimdrüsen und die Radialkanäle aus dem Wundbereich ausgeschlossen werden. - Pulsieren Sie Luft, indem Sie Start am Injektor drücken. Wiederholen Sie den Impuls an derselben Stelle zwei- bis viermal, je nach Breite der Spitze. Größere Spitzen erfordern weniger Impulse.
HINWEIS: Eine Vertiefung im Wasser/der Medusa, die durch den Luftimpuls verursacht wird, sollte sichtbar sein. - Decken Sie das verwundete Tier mit einem Deckglas ab, um große Wunden darzustellen (Abbildung 1D,D').
- Befolgen Sie die folgenden Schritte (Abschnitt 3), um die epitheliale Wundheilung abzubilden.
- Stellen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit einem Mikropipettenabzieher und einem Glaskapillarröhrchen her (Schritt 5.2). Setzen Sie die leere Mikroinjektionsnadel in einen Mikroinjektorhalter ein, der an einem Mikromanipulator befestigt ist. Schneiden Sie die Nadelspitze so ab, dass die Öffnung ca. 20-40 μm beträgt.
Abbildung 1: Intakte und verwundete Exumbrella-Epithelschicht in Clytia medusa. (A) Karikaturgrafik des Körpers von Clytia medusa. (A') Intaktes Medusa-Exumbrella-Epithel von oben gesehen. (B) Karikatur von einzelligen Mikrowunden (rote, gezackte Formen) mit Epithelzellen in Blau. (B') Einzellige Mikrowunden. (C) Karikatur einer kleinen Epithelwunde (rote gezackte Form). (C') Kleine Epithelwunde. (D) Karikatur einer großen Epithelwunde (rote gezackte Form). (D') Große Epithelwunde. Die Bilder wurden alle mit DIC-Mikroskopie aufgenommen. Maßstabsbalken in (A'-C'): 50 μm. Maßstabsbalken in (D'): 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mehrfach große Wunden und eine beschädigte Basalmembran. Dargestellt ist eine typische kleine Exumbrella-Epithelwunde, deren Markierungen auf Lamellipodien hinweisen, die sich aus marginalen Zellen bilden. Darüber hinaus sind Mikrowunden innerhalb und zwischen Epithelzellen zu sehen. Man beachte den kleinen Riss der Basalmembran im oberen Teil der Wunde. Film 4 zeigt die Heilung dieser Wunde. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Bildgebung der epithelialen Wundheilung
- Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop für die Köhler-Beleuchtung53 ausgerichtet und für die Differential-Interfering-Contrast-Mikroskopie (DIC)54 richtig eingerichtet ist. Epithelzellen sind mit Standardoptiken nahezu unsichtbar (Abbildung 3D,E).
- Stellen Sie den Fokus auf den Schirm ein. Obwohl es sich um eine dünne Schicht handelt, sollten hexagonale Zellen klar sein.
Anmerkungen: Der Außen- und Unterschirm sind durch eine dicke Mesoglea getrennt, die von vertikalen Fasern getragen wird. Die subumbrellaren Zellen befinden sich in der gleichen Fokusebene wie die Radialkanäle. Wenn Sie sich zunächst auf die Unterschirmschicht konzentrieren, stellen Sie den Fokus langsam durch die Mesoglea und die vertikalen Fasern ein, bis Sie den Außenschirm finden. - Identifizieren Sie eine Wunde manuell auf dem Bild. Verwenden Sie für große Wunden ein 10-faches Objektiv. Verwenden Sie für kleinere Wunden und einzellige Wunden ein 20-faches Objektiv.
- Starten Sie ein Programm, das Bilder als Film in Echtzeit sammelt oder das in regelmäßigen Abständen eine Reihe von Bildern sammelt. Überwachen Sie den Fortschritt, um sicherzustellen, dass der Wundbereich nicht aus dem Sichtfeld driftet und die interessierenden Zellen im Fokus bleiben.
- Einzellige Wunden schließen sich innerhalb einer Minute; Stellen Sie sich daher ihren Abschluss mit einem Film vor.
- Um Details der Zelldynamik bei kleinen Wunden zu erfassen, nehmen Sie etwa alle 10 s Bilder auf. Der Verschluss von kleinen Wunden dauert je nach Größe 20-50 Minuten.
- Bildgeben Sie die unversiegelten Objektträger nicht länger als 45 Minuten ab, da die Verdunstung von Wasser aus dem Objektträger im Laufe der Zeit zum Tod der Tiere und zum Reißen der Zellen führt.
- Für eine längere Beobachtung versiegeln Sie das Deckglas mit Vaseline, um die Verdunstung zu reduzieren.
Anmerkungen: Einige Medusen können auf dem Objektträger pulsieren, was die Bildgebung beeinträchtigt. In diesem Fall dient das Einbetten von Tieren in einer 1:10-Verdünnung von 1% Ethyl-3-aminobenzoatmethansulfonat (Tricain), eingestellt auf pH 7,5, in ASW als wirksames Anästhetikum und hat keinen offensichtlichen Einfluss auf die Heilung in einem Zeitrahmen von 1 h. Die Tiere sterben jedoch, wenn sie mehrere Stunden in Tricaine gelassen werden.
Abbildung 3: Entstehung einer kleinen Wunde im Exumbrellarepithel. (A) Sanftes Kratzen des Exumbrellas mit einer 200-μl-Pipettenspitze, um eine kleine Epithelwunde zu erzeugen. (B) Das Platzieren des Deckglases reicht manchmal aus, um kleine Epithelwunden zu erzeugen. (C) Medusa auf einer Vertiefungsrutsche montiert. (D ) Kleines epitheliales Wundbild ohne DIC-Optik und (E) mit DIC-Optik. Maßstabsbalken: 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Würdigung
- Vorbereiten von Bilddateien
HINWEIS: Um die Bilddateien zu verarbeiten, verwenden Sie FIJI/ImageJ mit aktualisierten BioFormat-Plugins.- Stellen Sie die Skalierung auf das richtige Pixel-pro-Mikrometer-Verhältnis ein, bevor Sie den Bildstapel registrieren. Analysieren > Legen Sie die Skalierung fest. Dies ist notwendig, um Ist-Größenmessungen in nachgelagerten Analysen zu extrahieren.
- Oft driftet das Tier leicht auf dem Objektträger; Um Drift in Filmen zu vermeiden, registrieren Sie die Bilder daher mit dem FIJI-Plugin Linear Stack Alignment mit SIFT. Plugins > Registrierung > Linear Stack Alignment mit SIFT.
- Speichern Sie den registrierten Stack als .avi Datei. Datei > Speichern als > AVI... Stellen Sie im Popup-Fenster die Bildrate ein (animierte Figuren sind hier auf 10 fps eingestellt) und klicken Sie auf OK. Verwenden Sie diese Ausgabe, um eine Wundheilungsanalyse durchzuführen.
- Analyse der Wundfläche
- Skizzieren Sie mit dem Lasso-Werkzeug in FIJI/ImageJ die Wunde, indem Sie die Zellränder nachzeichnen. Messen Sie den gerade umrissenen Wundbereich mit Befehl +M oder STRG+M.
- Wiederholen Sie die Messung der Wundfläche alle 10 Bilder. Die Messungen von FIJI/ImageJ können dann mit Prism 9 aufgetragen werden (Abbildung 4).
Abbildung 4: Analyse der Wundfläche in kleinen Epithelwunden. (A ) Beispiel einer kleinen epithelialen Wundheilung über 10 min. (B) Beispiel einer anderen epithelialen Wundheilung über 21 min. Die violetten Umrisse in A,B sind vergleichbar mit den Messungen von Wundbereichen mit dem Lasso-Werkzeug in FIJI/ImageJ. (C) Normalisierte Verkleinerung der Wundfläche im Laufe der Zeit bei A. (D) Normalisierte Verkleinerung der Wundfläche im Laufe der Zeit bei B. (E) Durchschnittliche Verkleinerung der Wundfläche im Laufe der Zeit bei 14 kleinen Wunden. n = 14. Fehlerbalken, die sich auf den Mittelwert ± SEM konzentrieren. Maßstabsbalken: 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Mesogleale Injektionen
- Injektionsschale erstellen
- Bereiten Sie Polydimethylsiloxan (PDMS) vor, indem Sie eine PDMS-Basis und einen Härter in einem Verhältnis von 10 Gewichtsteilen Basis zu 1 Teil Härter kombinieren. Kräftig umrühren, um die Basis und den Härter vollständig zu vermischen.
- Um Blasen zu entfernen, geben Sie die Mischung für 15 Minuten in eine Vakuumkammer. Gießen Sie die Mischung in eine 60-mm-Petrischale mit Mikrozentrifugenröhrchenkappen, um die Form an Ort und Stelle zu halten. Setzen Sie die Form sofort in einer Neigung von 45° auf die Tubenkappen und kleben Sie sie fest. Die Form besteht aus drei gestapelten, versetzten Glasobjektträgern, die zusammengeklebt sind, um Grate in der endgültigen Spritzschale zu erzeugen.
- Stellen Sie die gesamte Schüssel, Form und Mischung für 2 h bei 60 °C in einen Ofen, um das Elastomer auszuhärten. Entfernen Sie die Form für eine fertige Spritzgussschale.
- Ziehen der Mikropipette
- Entwerfen Sie mit einem Mikroelektrodenabzieher ein Zugprogramm. Verwenden Sie ein einstufiges Programm mit hoher Geschwindigkeit. Die Hitze entspricht in etwa dem Glas-RAMP-Testergebnis55,56. Überprüfen Sie die resultierenden Mikropipetten auf lange, gleichmäßige Verjüngungen.
Anmerkungen: Verwenden Sie dünnwandige Glasborosilikatkapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,0 mm, einem Innendurchmesser von 0,75 mm und einer Länge von 10 cm.
- Entwerfen Sie mit einem Mikroelektrodenabzieher ein Zugprogramm. Verwenden Sie ein einstufiges Programm mit hoher Geschwindigkeit. Die Hitze entspricht in etwa dem Glas-RAMP-Testergebnis55,56. Überprüfen Sie die resultierenden Mikropipetten auf lange, gleichmäßige Verjüngungen.
- Injektion von Farbstoffen und Medikamenten
- Machen Sie eine Mikroinjektionsnadel (wie oben).
- Füllen Sie die Mikroinjektionsnadel mit einer langen Pipettenspitze mit einer überschüssigen Menge an Farbstoff oder Medikament zur Injektion in die Medusa.
HINWEIS: Bei Klytien sollte Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einer Verdünnung von <1:100 mit ASW gehalten werden, da höhere DMSO-Konzentrationen die Wundheilung behindern. Bei der Injektion einer klaren Lösung kann Fast Green FCF-Lösung (1:100 Verdünnung von 0,1 % Fast Green FCF in ASW) hinzugefügt werden, um die injizierte Flüssigkeit sichtbar zu machen. - Legen Sie mit einer modifizierten Transferpipette wie oben beschrieben eine Medusa mit dem Unterschirm nach oben in eine PDMS-Injektionsschale mit gerade genug ASW, um das Tier zu bedecken (Abbildung 5C). Stellen Sie die Schüssel auf die Bühne eines Präparierfernrohrs.
HINWEIS: Die Begrenzung des Überschusses an ASW verhindert, dass die Medusa in der Schale schwimmt, und ermöglicht erfolgreichere Injektionen. - Konzentriere dich auf die Spitze der Mikroinjektionsnadel und schiebe sie in der Nähe der Medusa ins Wasser. Drücken Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in die Schale, bis sie sich verbiegt und bricht. Diese Spitzenöffnung beträgt ca. 10-20 μm.
Anmerkungen: Diese Nadel kann an diesem Tag wiederholt für die gleichen Farbstoff-/Medikamenteninjektionen verwendet werden. Es wird empfohlen, jeden Tag und für separate Farbstoffe/Medikamente eine frische Spitze zu verwenden. - Führen Sie mit dem Mikromanipulator die Nadelspitze durch den Unterschirm in die Mesoglea ein, ohne den Außenschirm zu durchstechen.
HINWEIS: Eine Knick-/Faltung des Epithels macht sich bemerkbar. Sobald die Nadel in die Medusa eingeführt ist, hört das Knittern/Falten auf. - Stellen Sie am Mikroinjektor den Haltedruck auf Null und den Auswurfdruck auf ≤20 PSI ein. Injizieren Sie in einen oder zwei Quadranten und füllen Sie jeden mit einem Fleck Farbstoff oder Droge, der etwa 1/4 der Fläche dieses Quadranten ausmacht.
HINWEIS: Je nach Größe der Medusa sind größere oder kleinere Volumina an einzelnen Injektionsstellen angebracht. Eine Überfüllung der Medusa führt zu einer extremen Schädigung des Epithels und sogar zum Tod des Tieres. - Je nachdem, welcher Farbstoff oder welches Medikament injiziert wird, werden die Tiere in ein Becherglas mit frischem ASW gegeben, um die Diffusion und Inkubation von Farbstoffen oder Medikamenten zu ermöglichen.
- Für die Bildgebung wird die Medusa mit einer modifizierten Transferpipette auf einen Objektträger montiert und das Tier so positioniert, dass der Schirm nach oben zeigt (Abbildung 5). Tiere können in diesem Stadium verwundet werden, um die Wirkung eines injizierten Reagenzes zu testen.
Abbildung 5: Injektionsaufbau zum Einbringen von Farbstoffen oder Medikamenten in die ECM. (A) Aufbau der Einspritzung. (B) Nahaufnahme des Injektionsaufbaus, der die Ausrichtung der Mikroinjektionsnadel zeigt (ca. 45° Winkel zum Tier in der Schale). (C) Nahaufnahme der Silikon-Injektionsschale mit der Medusa in einer kleinen Menge ASW zur Injektion. (D) Eine Mikroinjektionsnadel, die mit Fast Green FCF beladen ist und durch den Unterschirm in die Mesoglea der Medusa eindringt. (E) Nachinjektion von Fast Green FCF in eine montierte Medusa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Representative Results
Nach den oben genannten Protokollen wurden einzellige Mikrowunden, kleine Wunden und große Wunden abgebildet. Registrierte Stapel von Bilddateien wurden als .avi Dateien gespeichert.
In Film 1 ist zu sehen, wie sich Mikrowunden zwischen und innerhalb von Zellen schließen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Kleine Lamellipodien werden während des Verschlusses beobachtet, gefolgt von Kontraktion und Heilung. Schmutz wird ausgeschlossen und ins Wasser abgegeben. Die Heilung ist in einer Minute oder weniger abgeschlossen.
In Film 2 und 3 heilen kleine Wunden unterschiedlicher Form durch die Bildung von Lamellipodien, die Verlängerung von Lamellipodienkontakten und die Ausbreitung von Zellen am Wundrand, wie zuvor beschrieben40 (Abbildung 1 und Abbildung 2). Zellen in Schichten hinter den Randzellen beteiligen sich weder an der Heilung von Wunden dieser Größe, noch findet eine kollektive Zellmigration statt. Dem raschen und fortschreitenden Verschluss der Epithellücken folgt eine Gewebekontraktion entlang der neu gebildeten Wundnaht40. Die normalisierte Heilungsrate dieser beiden Wunden, ausgedrückt als Prozentsatz der ursprünglichen Fläche über die Zeit, ist dargestellt (Abbildung 4C,D). Zwar gibt es eine gewisse Variabilität in der Dynamik des Wundverschlusses, aber die Mittelung des prozentualen Flächenverschlusses über die Zeit für 14 Wunden unterschiedlicher Form im Bereich von 0,02 bis 0,125mm2 ermöglicht die Erstellung einer durchschnittlichen Kurve für die Wundheilung bei unbehandelten Tieren (Abbildung 4E).
Eine Schädigung der Basalmembran ist deutlich zu erkennen, wenn sie auftritt (Abbildung 2). In Film 4 breiten sich Zellen am Rand einer kleinen Wunde, in der die Basalmembran beschädigt ist, um den geschädigten Bereich herum aus, und der Lückenschluss wird mit einer Kontraktion des Geldbeutelstrangs abgeschlossen.
Wenn das Gewebe dehydriert oder zu geschädigt ist, um es zu reparieren, können die Zellbewegungen zum Stillstand kommen oder die gesamte Zellschicht platzen (Film 5 und Film 6). Dies geschieht in der Regel nach längerer Bildgebung (45 Minuten oder länger). Wenn es zu einem frühen Zeitpunkt in der Bildgebung zum Aufplatzen der Zellen kommt, wird die Probe verworfen.
Wie in Film 7 gezeigt, heilen große Wunden in mehreren Stadien. Erstens wird der Wundrand durch Kontraktionen am Rand glatt und regelmäßig, wie bereits berichtetwurde 57. Dann bilden sich Lamellipodien aus den Zellen am Wundrand, wobei sich Lamellipodien nach vorne bewegen, um den Kontakt mit benachbarten Lamellipodien zu maximieren. Die Verfolgung der Zellkerne in Zellen am Wundrand und mehrere Ebenen hinter den marginalen Zellen zeigt, dass sich große Lücken durch kollektive Zellmigration schließen40. Zellen lösen sich nie, sondern bewegen sich zusammen wie ein Blatt.
Die Einführung von Farbstoffen und pharmakologischen Wirkstoffen kann ein mächtiges Werkzeug sein, um biologische Mechanismen zu analysieren. Viele Substanzen sind von Clytia ausgeschlossen (nicht abgebildet), wahrscheinlich wegen der Schleimschicht, die die Oberfläche des Tieres bedeckt. Die Mikroinjektion kann jedoch verwendet werden, um Moleküle direkt in die EZM einzuschleusen, wodurch die Struktur der EZM gestört oder die regulatorischen Aktivitäten in der EZM gestört werden. Darüber hinaus sind Farbstoffe und andere Moleküle in der Lage, von der Basalseite in Epithelzellen einzudringen. Abbildung 6 zeigt beispielsweise die Kernfärbung mit Hoechst, die Membranfärbung mit FM1-43 und die Hemmung der Lamellipodienbildung durch Cytochalasin B, nachdem diese Reagenzien in die EZM mikroinjiziert wurden. Die Einführung dieser Moleküle in die EZM und Epithelzellen vor der Verwundung ermöglicht Experimente, die die Wirkung pharmakologischer Werkzeuge auf den Heilungsprozess testen.
Abbildung 6: Epithelzellen der Medusa nach Mikroinjektion von Farbstoffen oder pharmakologischen Wirkstoffen. (A) Epithelzellen im oberen Bild 5 min nach der Injektion mit 20 μM Hoechst (Kerne) und 50 μM FM1-43 (Membranen). (B,C) Wundheilung nach Injektion mit 1:1.000 DMSO-Kontrolle (B) oder 100 μM Cytochalasin B (C). Die Wunden wurden 15 Minuten nach der Injektion hergestellt. Die Bilder wurden 5 Minuten nach der Verwundung aufgenommen. Die Bildung von Lamellipodien wird durch Cytochalasin B gehemmt. Es wird angenommen, dass die scheinbaren "Fasern", die häufig zwischen den Zellen im Wundbereich zu sehen sind, das Ergebnis einer Spannung sind, die die Basalmembran dehnt – sie färben sich nicht mit Phalloidin (nicht gezeigt). Maßstabsbalken: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Film 1: Zeitrafferfilm der Einzelzell-Mikrowundheilung. Verstrichene Zeit: 20 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 2: Zeitrafferfilm einer kleinen epithelialen Wundheilung. Verstrichene Zeit: 9 min 54 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 3: Zeitrafferfilm einer kleinen epithelialen Wundheilung. Diese Wunde ist größer und unregelmäßiger geformt als die Wunde in Film 2. Verstrichene Zeit: 20 min 54 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 4: Zeitrafferfilm einer kleinen Wunde und einer Mikrowundheilung mit einem Riss der Basalmembran. Die Lamellipodien breiten sich um den Riss der Basalmembran aus, können sich aber auch über den Rest der EZM ausbreiten. Sobald der Bereich der Wunde mit der Schädigung der Basalmembran umgeben ist, zieht eine Kontraktion des Geldbeutelstrangs Zellen über die Region. Verstrichene Zeit: 19 min 4 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 5: Zellen, die in einer kleinen Epithelwunde absterben. Der Zelltod ist wahrscheinlich auf eine Dehydrierung des Tieres zurückzuführen. Verstrichene Zeit: 4 min 24 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 6: Eine kleine Epithelwunde heilt nicht ab. Verstrichene Zeit: 42 min 32 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Film 7: Wundheilung mit großem Epithel. Verstrichene Zeit: 25 min 29 s. Bildrate: 10 fps. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 1: Schaltpläne der Clytia-Tankabmessungen. 3D-Visualisierung der maßgefertigten Clytia-Tanks. (A) Vorder- und Rückansicht. (B) Seitenansicht. Der Ausschnitt in dem grün gezeigten Teil ist mit Nylonnetz überzogen. Das Wasser tritt direkt über das Gitter in den Tank ein, fegt über das Gitter und erzeugt eine kreisförmige Strömung. Das Wasser tritt durch das blau dargestellte Loch im Endstück aus dem System aus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzender Film 1: Azelluläre extrazelluläre Matrix in Klytien. Z-Stapel von Clytia, aufgenommen mittels konfokaler Mikroskopie. Der Stack konzentriert sich zunächst auf den Exumbrella und scannt dann alle 10 μm durch das ECM zum Plattenendoderm und Subumbrella. Bilder mit DIC (links) und Hoechst-Kernfärbung (rechts) zeigen das Fehlen von Zellen in der EZM. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
In dieser Arbeit wird die Methodik zur Bildgebung von Wunden in vivo in Klytien, einem relativ neuen wirbellosen Modellorganismus, vorgestellt40,43,58. Es gibt mehrere Faktoren, die dieses System zu einem einzigartigen und leistungsstarken Forschungsinstrument machen, das sich von anderen Modellen unterscheidet, die zur Untersuchung der Wundheilung und Reepithelialisierung verwendet werden. Zuerst wird das Monolayer-Epithel an eine transparente EZM gebunden, wodurch es In-vitro-Gewebekultur-Assays ähnelt (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Wie bei In-vitro-Assays können Zellen mit hoher Auflösung abgebildet werden. Anders als in der Gewebekultur gibt es jedoch ein authentisches zelluläres Milieu und eine EZM, so dass die Wundheilung im Kontext der komplexen Signalereignisse betrachtet werden kann, die bei einem lebenden verletzten Tier auftreten. Zweitens fehlen Clytia Entzündungsreaktionen, wandernde Fibroblasten, Gefäße und Blut. Auf diese Weise kann der Reepithelialisierungsprozess in vivo untersucht werden, ohne dass sich die Ereignisse überschneiden, die bei komplexeren erwachsenen Tieren während der Wundheilung auftreten59. Drittens ist die EZM azellulär (Supplemental Movie 1) und groß, so dass sie mit einer Mikroinjektionsnadel leicht zugänglich ist (Abbildung 5 und Abbildung 6). Mit diesem Ansatz können Forscher die Wirkung pharmakologischer Reagenzien, die die Struktur oder Signalübertragung der EZM stören, auf die Wundheilung in vivo testen. Reagenzien können auch in Epithelzellen eingebracht und ihre Auswirkungen auf die Wundheilung in vivo beurteilt werden. Viertens gibt es Protokolle für die Erzeugung von Mutanten und transgenen Tieren im Clytia-System42,43,44,45. In vivo kann die Wundheilung daher bei Tieren mit erhöhter/verminderter Expression von Genen beobachtet werden.
Bei dieser Technik gibt es mehrere kritische Schritte. Zunächst ist es, wie in Abbildung 3 gezeigt, notwendig, ein Mikroskop zu verwenden, das für die DIC-Mikroskopie korrekt konfiguriert ist, da die flachen, transparenten Epithelzellen mit der Standardlichtmikroskopie nahezu unsichtbar sind. Es ist auch wichtig, die Fähigkeit zu entwickeln, Tiere sanft zu wickeln, damit das Epithel beschädigt wird, ohne die EZM auszuhöhlen. Eine ähnlich sanfte Berührung ist für die Mikroinjektion von Materialien in die EZM erforderlich, da eine starke Schädigung des Tieres während der Injektion eine anschließende Analyse der Wundheilung beeinträchtigen kann. Obwohl es eine Lernkurve für diese Techniken gibt, haben selbst Anfänger sie im Malamy-Labor schnell gemeistert. Tatsächlich wurden diese Protokolle verwendet, um die Zellmigration in Laborkursen an der University of Chicago zu demonstrieren.
Für eine optimale Bildgebung ist es wichtig, dass sich das Tier nicht bewegt und der gewählte Wundbereich nicht aus dem Sichtfeld driftet. Wenn die Tiere pulsieren, ist die Behandlung mit Tricain wie beschrieben sehr effektiv. Zum Driften ist es oft notwendig, die Probe manuell neu zu positionieren. Diese Bewegungen können über die Registrierungsfunktion in FIJI/ImageJ aus dem endgültigen Film eliminiert werden.
Eine Einschränkung bei diesem System besteht darin, dass es nicht möglich ist, identische Wunden zu erzeugen, da Wunden mit den hier beschriebenen Methoden sowohl in Form als auch Größe variieren. Daher kann es schwierig sein, die genaue Rate des Wundverschlusses oder der Zellmigration zu quantifizieren. Positionsmarker wie Kohlenstoffkörner haften bei einem verwundeten Tier an der exponierten EZM und können verwendet werden, um die Rate der kollektiven Zellmigration in großen Wunden zu messen (nicht gezeigt). Für die Analyse kleiner Wundverschlüsse gibt es selbst bei variabler Wundgröße und -form einen begrenzten Bereich der Verschlussraten bei Wunden dieser Größe (Abbildung 4). Es ist daher möglich, die Wirkung von fördernden oder repressiven pharmakologischen Reagenzien quantitativ nachzuweisen.
Während diese Arbeit die Charakterisierung der Wundheilung nur mit der DIC-Mikroskopie beschreibt, können die gleichen Ansätze auch für die Darstellung der Wundheilung mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Mikroskopie verwendet werden. Um dies zu unterstützen, gibt es Protokolle zur Erzeugung transgener Tiere, in denen verschiedene zelluläre und extrazelluläre Proteine fluoreszenzmarkiert sind. Die gleichzeitige Bildgebung mit DIC und Fluoreszenz, kombiniert mit einer Störung der Wundheilung mit pharmakologischen Wirkstoffen oder Mutantenlinien, wird ein leistungsfähiger Ansatz zum Verständnis der Mechanismen sein, die dem Wundheilungsprozess im Epithel zugrunde liegen.
Disclosures
Nichts zu verraten.
Acknowledgments
E.E.L.L. wird durch ein Stipendium der National Science Foundation PRFB 2011010 unterstützt. Wir bedanken uns bei Tsuyoshi Momose und Evelyn Houliston für die Hilfe beim Aufbau unserer Clytia-Kolonien, bei Jean-Baptiste Reynier für die Sammlung der Mikrowundheilungsbilder, bei Harry Kyriazes für den Bau der Pseudo-Kreisel-Tanks und bei Elizabeth Baldo für die Erhaltung des Clytia-Lebensraums. Abbildung 1B wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
| AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
| Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
| Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
| DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
| FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
| Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
| imageJ | NIH | ||
| Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
| Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
| PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
| SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Z-Hab mini system | Pentair | ||
| ZEN Microscopy software | Zeiss |
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