Summary
本論文では、生きた Clytia hemisphaerica medusa の上皮に創傷を作製し、 in vivoで高解像度で創傷治癒を画像化する方法について説明します。さらに、創傷治癒中に上皮細胞および細胞外マトリックスにおけるシグナル伝達プロセスを混乱させるために色素および薬物を導入する技術が提示される。
Abstract
皮膚から目、腸まで、すべての動物の臓器は上皮細胞のシートで覆われているため、感染から保護しながら恒常性を維持できます。したがって、上皮創傷を修復する能力がすべての後生動物にとって重要であることは驚くべきことではありません。脊椎動物の上皮創傷治癒には、炎症反応、血管新生、再上皮化などの重複するプロセスが含まれます。これらのプロセスの調節には、上皮細胞、隣接細胞、および細胞外マトリックス(ECM)間の複雑な相互作用が含まれます。ECMには、構造タンパク質、調節タンパク質、および活性低分子が含まれています。この複雑さは、ほとんどの動物が不透明な組織とアクセスできないECMを持っているという事実とともに、生きている動物で創傷治癒を研究することを困難にします。したがって、上皮創傷治癒に関する多くの作業は、人工マトリックス上に単層として播種された単一の上皮細胞タイプで組織培養システムで実行されます。 Clytia hemisphaerica (Clytia)は、これらの研究をユニークでエキサイティングな補完物を提供し、本物のECMを備えた無傷の動物で上皮創傷治癒を研究することを可能にします。Clytiaの外胚葉上皮は、大きな扁平上皮細胞の単層であり、生きている動物における微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用した高解像度イメージングを可能にします。遊走性線維芽細胞、血管系、または炎症反応がないため、 in vivoでの再上皮化における重要な事象を解剖することができます。単細胞微小創傷、大小の上皮創傷、基底膜を損傷する創傷など、さまざまな種類の創傷の治癒を解析できます。ラメリポディアの形成、巾着糸の収縮、細胞の伸張、および集団的な細胞移動はすべて、このシステムで観察できます。さらに、薬理学的物質をECM を介して 導入して、細胞:ECM相互作用およびin vivoでの細胞プロセスを改変することができる。この研究は、生きているClytiaに傷を作り、治癒の動画をキャプチャし、ECMに試薬をマイクロ注入することによって治癒メカニズムを調べる方法を示しています。
Introduction
上皮細胞のシートは、すべての後生動物の外面を覆い、内臓を裏打ちし、動物の体を個別の区画に分割します。上皮はまた、内部体を外部環境から分離し、損傷や感染から保護します。したがって、上皮層の出現は多細胞動物の進化の重要な部分であり、上皮層は脊椎動物から最も基底的な後生動物までのすべての動物に見られます1。一部の臓器の上皮は、肺気嚢、血管、腸2、およびプラナリアや刺胞動物3などの無脊椎動物の表皮などの単一の単層です。脊椎動物の皮膚4や角膜5などの他の組織では、上皮が重層化しており、複数の上皮細胞層2が存在することを意味する。すべての場合において、最も基底上皮層は、細胞外マトリックス(ECM)の特殊な領域を形成するタンパク質シートである基底膜に貼り付けられています6、7、8。
上皮の破れは、連続した上皮シートを再現するために迅速に修復する必要があります。上皮の損傷は、腸内の上皮細胞の脱落などの自然のプロセス中に発生します9,10、および炎症または身体的外傷の結果として発生します。単一の上皮細胞が損傷を受けた場合、周囲の細胞が互いに付着して穴を閉じることを可能にするために、それ自体を修復するか、または排除されなければならない11,12。単一細胞のサイズよりも大きい創傷では、上皮細胞は、シート13を修復するために互いに到達するために移動しなければならない。これは、ギャップが小さい場合、または創傷ギャップを閉じるために創傷の縁から上皮細胞の移動を必要とする場合、細胞拡散によって達成され得る。この後者のプロセスは、再上皮化14,15と呼ばれます。胚組織において、上皮細胞は、巾着紐16に似た機構において、創傷縁部で細胞間に形成されるアクトミオシンケーブルの収縮によって、接近創傷に広がって遊走するか、または隙間を横切って引っ張られる。多くの成体組織において、再上皮化はコヒーレント細胞シートの移動を伴い、そこでは細胞は隣接する細胞との接合を維持する14、17、18。他の組織では、細胞:細胞結合が解体され、上皮細胞は間葉系細胞のように振る舞い、再上皮化中に協調しているが独立した方法で創傷領域に移動する14、19、20、21。
上皮細胞の動きは、移動する細胞間および細胞とECMの間の複雑な相互作用によって調節されています。上皮細胞の創傷活性化とその後の移動のメカニズムを扱った膨大な量の実験文献がありますが、まだ多くの発見が残されています。例えば、創傷に応答して上皮細胞を活性化して遊走させる初期シグナルは、決定的に同定されておらず22、創傷に最も近い上皮細胞の側にラメリポディアを作成するためにアクチンがどのように再展開されるかも完全には理解されていない22、23、24、25、26、27.集団的な細胞遊走は、創傷の細胞からの情報を創傷の遠位の細胞と共有することを必要とし、コミュニケーション経路はまだ不明である28。セル:セル接合部とセル:ECMアタッチメントは、シート内のセルが再配置されるにつれて分解および再形成する必要がありますが、このプロセスの制御はあまり理解されていません14,29。これらの問題やその他の関連する質問を進めることは、基本的な生物学的問題としてだけでなく、正しい創傷治癒の臨床的意義のためにも重要です。上皮細胞が正しく移動する能力を損なう疾患は、慢性創傷をもたらす。一例は遺伝病表皮水疱症であり、ECMへの上皮細胞の付着に関与する遺伝子が変異し、剥離して水疱ができた脆弱な皮膚をもたらす。再上皮化は、自然に老化した組織においても損なわれる30、31。したがって、創傷治癒の結果を改善するための介入を開発するには、より良い理解が不可欠です。
創傷治癒における上皮細胞遊走は、in vitroアプローチおよびモデル生物の両方を用いて研究されている。創傷治癒および細胞移動のメカニズムに関する研究の大部分は、単一の上皮細胞タイプの単層がECMに代わる基質上で増殖する組織培養で行われている。細胞単層は、特定の形状およびサイズのギャップを作成するためにステンシルで引っかかれるか成長され、次いで観察される32、33、34。in vitroモデルにより、細胞の挙動を理想的に可視化できるだけでなく、基質の質を変えたり、細胞を薬物や非生物的因子にさらしたり、目的のさまざまな遺伝子を発現または抑制するコンストラクトを細胞にトランスフェクトしたりすることができます。しかしながら、この還元主義的アプローチは、様々な細胞型間の通信およびECM11において生じるシグナル伝達事象を含む、インビボの状況における上皮細胞挙動に関与する重要なパラメータのいくつかを捕捉することができない可能性がある。in vivoモデルは、複数の細胞型、重複するシグナル伝達経路、および複雑なECM35を備えた創傷の本物のコンテキストを提供します。創傷治癒研究のためのそのようなモデルの1つはマウス19であり、最近の進歩により、研究者は生きた動物における全層創傷の治癒中に表皮細胞を観察することができるようになった36。しかし、マウスやその他のin vivoシステムは、再上皮化の研究に課題を提示します。第一に、自然な状況で細胞の挙動を観察することの大きな利点は、血液凝固、免疫細胞の動員および炎症、線維芽細胞の動員、および細胞の脱分化、血管再形成、およびECMのリモデリングを含む、脊椎動物の創傷治癒中に発生する時間的に重複するイベントの複雑さによってバランスが取れています。さらに、不透明な組織はイメージングを困難にします。ショウジョウバエの幼虫とゼブラフィッシュの表皮システム37,38は、比較的単純であるため、これらの困難のいくつかを克服しました39。
私たちの研究室は最近、上皮創傷治癒を研究するための新しいモデルを導入しました:ヒドロ虫刺胞動物Clytia hemisphaerica(Clytia)40のメデューサ(クラゲ)型。Clytiaは、完全に配列決定され注釈が付けられたゲノム41、シングルセルRNAseqトランスクリプトーム42、およびゲノム改変(突然変異誘発および導入)のためのプロトコルを備えた新興モデル生物です43,44,45。刺胞動物は上皮層を持つ最も古い現存する系統の1つであるため、刺胞動物の創傷治癒を理解することで、上皮の完全性を確保した祖先経路への洞察が得られます。生命の木を通して保存されている経路のために、Clytiaは上皮細胞のダイナミクスとin vivoでの創傷治癒の機能調節を研究するためのエキサイティングな新しいシステムを提供します。
Clytia medusa(exumbrella)の上面を覆う上皮は、幅約50μm、厚さ1〜2μmの透明な扁平上皮細胞の単層です(図1)。それらは、クラゲの「ゼリー」であるメソグレアと呼ばれるECMに取り付けられています。メソグレアは、脊椎動物を含む他の動物46、47、48に見られるECMと組成的に類似しており、基底膜40を有し、完全に透明である。Clytia medusaの上皮層は、簡単に引っかいたり傷ついたりする可能性があります(以下を参照)。上皮とECMのシンプルさと透明性により、治癒中の細胞とその動きの高解像度イメージングが可能になります。最近、Kamranらは、Clytia上皮における小さな創傷の治癒を詳細に特徴づけた40。Clytiaでの治癒は、ラメリポジアベースの細胞クロール、細胞拡散、および集団細胞移動、および胚系に典型的な巾着ストリング閉鎖によって行われることが実証されました(ただし、以前は角膜49などの成体動物の構造で見られました)。Clytia創傷治癒は、炎症反応を欠く他のシステムで見られるように、非常に速いです40,50。Clytia exumbrellaの治癒は、既存の上皮細胞の動きに完全に依存しており、細胞が増殖したり、ECMを介して創傷部位に移動したりすることはありません(補足動画1)。これらの発見はすべて、Clytiaが上皮創傷治癒を研究するための有用なモデルシステムであることを示唆しています。実際、創傷治癒中にClytiaの上皮細胞を画像化する容易さは、無傷の基底膜がある限り、上皮細胞の層状突起が露出したECMの領域に広がり、広がることを発見しました。基底膜が損傷すると、上皮治癒は巾着紐機構40に切り替わる。これは、ラメリポディアベースのクロールと財布のひも閉鎖による閉鎖の決定の根底にあるメカニズムの最初のデモンストレーションであり、治癒における特定の細胞:ECM相互作用と自然な状況での細胞の観察の重要性を強調しました。
以下では、単一細胞の微小創傷、主に細胞の広がりによって閉じる小さな創傷、および閉じるために集団的な細胞遊走を必要とする大きな創傷を作成およびイメージングするためのプロトコルについて説明します。さらに、ECMおよび上皮細胞への小分子の導入のためのプロトコルが記載されており、創傷治癒の推定調節経路の実験的摂動を可能にする。
Protocol
1.動物文化
- ゼブラフィッシュシステムでは、顕微鏡スライド上のClytiaポリープコロニーと人工海水(ASW)中のメデューサを18°Cに維持し、ポリープコロニー用の2 Lゼブラフィッシュタンクとメデューサエ用のカスタムメイド5 L疑似クライゼルタンクを使用します(補足図1)51。ASWは、脱イオン化(DI)H2O中の4%インスタントオーシャンからなる。
- 51に記載のように、2〜3日齢のアルテミアを動物に毎日給餌する。
注:腸から視野に放出される破片が少ないため、動物に最近給餌されていない場合、創傷治癒のイメージングが容易になります。 - 必要に応じて、1 LのASWで満たされた2 Lのビーカーにコロニーを一晩入れて、確立されたポリープコロニーから赤ちゃんメデューサを収集します。すべての創傷治癒実験に2〜3週齢のメスのメデューサを使用してください。Clytiaの繁殖は、他の場所で詳細に説明されています51。
2.傷
- 細胞内および細胞間に微小創傷を作成する(20-500μm2)
- 先端をハサミで切断して、より大きな開口部(直径0.5〜0.7 cm)を作成して、修正されたトランスファーピペットを作成します。
注意: ピペットの開口部は、動物への損傷を避けるために十分な幅でなければなりません。 - 改造したトランスファーピペットを使用して、メデューサを窪みのスライドに置き、メデューサの傘を上に向けて、動物を覆うのに十分なASWを使用します。
- すぐに動物と画像の上にカバーガラスを置きます(画像の説明については以下を参照してください)。カバーガラスはメソグレアを圧迫し、圧縮された組織のリバウンドは細胞をわずかに離す力を生み出します52。これは、各細胞間のギャップと一部の細胞内の損傷としてすぐに現れます(図1B、B'、図2、および図3A-C)。
- 先端をハサミで切断して、より大きな開口部(直径0.5〜0.7 cm)を作成して、修正されたトランスファーピペットを作成します。
- 小さな上皮創傷の作成 (0.02-0.125 mm2)
- 改造トランスファーピペット(上記)を使用して、メデューサ外傘を上に向けてメデューサをくぼみスライドに置きます。
- 200 μLのピペットチップを使用して、メデューサの表面をそっと引っ掻きます。穏やかな引っかき傷はまた、基底膜に裂け目を作成する可能性があり、それはすぐに明らかになります22。イメージング用のカバーガラスで動物を覆います。あるいは、カバーガラスの配置は、引っかき傷がなくても小さな上皮創傷を作成するのに十分な場合があります(図1C、C '、図2、および図3A-C)。
注:メデューサの表面を傷つけるときは、ECMが損傷し、不規則な表面を作成するため、押し下げないでください—不規則な表面を移動する上皮細胞は焦点を合わせるのがより困難です。
- 大きな上皮創傷を作成する(0.5-0.9 mm2)
- マイクロピペットプラーとガラス毛細管を使用してマイクロ注射針を作ります(ステップ5.2)。空のマイクロインジェクションニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクターホルダーに入れます。開口部が約20〜40μmになるように針の先端を切ります。
注:大きな上皮創傷用の切断針は、実験間の一貫性を高めるために保管および再利用できます。 - マイクロインジェクターのホールド圧力をゼロに設定し、排出圧力を約20PSIに設定します。マイクロインジェクターを2秒の空気パルスを供給するように設定します。
注意: 排出圧力は、針の開口部の直径に基づいて調整する必要がある場合があります(つまり、小さいチップはより高い圧力を使用し、大きなチップはより低い圧力を使用します)。 - 解剖スコープのステージ上のくぼみスライドに傘を上に向けてメデューサを置き、動物を覆うのに十分なASWを使用します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロインジェクションの針先を水面のすぐ上になるように調整します。これを行うには、チップを慎重に水に浸し(水がピペットチップに入る場合があります)、メデューサの上皮表面に近づくように引っ込めます。
注意: 先端は、メデューサの1つの象限に配置する必要があります。メデューサの放射状運河は、メデューサベルを4つの異なる象限に分割します。象限をターゲットにすると、生殖腺と橈骨管が創傷領域から除外されるため、よりクリーンなイメージングが得られます。 - インジェクターのスタートを押して空気をパルスします。先端の幅に応じて、同じ場所でパルスを2〜4回繰り返します。チップが大きいほど、必要なパルスは少なくなります。
注意: 空気の脈動によって引き起こされる水/メデューサのくぼみが見えるはずです。 - 大きな傷を画像化するために、負傷した動物をカバーガラスで覆います(図1D、D ')。
- 上皮創傷治癒を画像化するために、以下のステップ(セクション3)に従ってください。
- マイクロピペットプラーとガラス毛細管を使用してマイクロ注射針を作ります(ステップ5.2)。空のマイクロインジェクションニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクターホルダーに入れます。開口部が約20〜40μmになるように針の先端を切ります。
図1:Clytia medusaの無傷で傷ついた外傘上皮層。(A)クリティアメデューサの体の漫画のグラフィック。(A')上から見た無傷のメデューサ外傘上皮。(B)青の上皮細胞を持つ単一細胞の微小創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(B') 単一細胞の微小創傷。(C)小さな上皮創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(C') 小さな上皮創傷。(D)大きな上皮創傷(赤いギザギザの形)の漫画。(D') 大きな上皮創傷。画像はすべてDIC顕微鏡を用いて得られた。スケールバー (A'-C'): 50 μm.スケールバー(D'):100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:複数のサイズの傷と損傷した基底膜。 典型的な小さな傘上皮創傷が示され、辺縁細胞から形成されるラメリポディアを示す標識が示されている。さらに、上皮細胞内および上皮細胞間の微小創傷が見られる。創傷の上部にある小さな基底膜の裂け目に注意してください。 動画4 は、この傷の治癒を示しています。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.上皮創傷治癒のイメージング
- 顕微鏡がケーラー照明53用に位置合わせされていること、および微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡54用に正しく設定されていることを確認してください。上皮細胞は、標準的な光学系ではほとんど見えません(図3D、E)。
- フォーカスを傘に合わせます。これは薄い層ですが、六角形のセルは透明でなければなりません。
注:外傘とサブ傘は、垂直繊維で支えられた厚いメソグレアで区切られています。サブアンブレラ細胞は、放射状管と同じ焦点面にあります。最初にサブアンブレラ層に焦点を合わせた場合は、外傘が見つかるまでメソグレアと垂直繊維を通してゆっくりとフォーカスを調整します。 - 画像化する傷を手動で識別します。大きな傷の場合は、10倍の対物レンズを使用してください。小さな創傷や単細胞創傷の場合は、20倍の対物レンズを使用してください。
- 画像をムービーとしてリアルタイムで収集するプログラム、または一定の間隔で一連の画像を収集するプログラムを起動します。進行状況を監視して、創傷領域が視野から外れていないこと、および目的の細胞に焦点が合っていることを確認します。
- 単細胞創傷は1分以内に閉じる。したがって、映画で彼らの閉鎖をイメージしてください。
- 小さな傷の細胞動態の詳細をキャプチャするには、約10秒ごとに画像を収集します。小さな傷の閉鎖は、サイズに応じて20〜50分かかります。
- 時間の経過とともにスライドから水分が蒸発すると動物の死や細胞の破裂につながるため、密封されていないスライドを45分以上画像化しないでください。
- より長い観察のために、蒸発を減らすためにワセリンでカバーガラスの周りを密封してください。
注意: 一部のメデューサはスライド上で脈動し、イメージングを妨げる場合があります。この場合、ASWでpH 7.5に調整された1%エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(トリカイン)の1:10希釈に動物をマウントすることは、効果的な麻酔薬として機能し、1時間の時間枠での治癒に明らかな効果はありません。しかし、トリカインに数時間放置すると動物は死にます。
図3:外傘上皮に小さな傷を作る。(A) 200μLのピペットチップで傘をやさしく引っ掻き、小さな上皮創を作ります。 (B) カバーガラスを配置するだけで、小さな上皮創傷を作成するのに十分な場合があります。 (C) うつ病スライドに取り付けられたメデューサ。( D )DIC光学系を使用しない小さな上皮創傷画像および (E) DIC光学系を使用。スケールバー:50 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 分析
- 画像ファイルの準備
注: 画像ファイルを処理するには、更新された BioFormat プラグインで FIJI/ImageJ を使用します。- 画像スタックを登録する前に、スケールを正しいピクセル/ミクロンの比率に設定します。 解析>縮尺を設定します。これは、下流の解析で実際のサイズ測定値を抽出するために必要です。
- 多くの場合、動物は顕微鏡のスライド上でわずかに漂います。したがって、動画のドリフトをなくすには、FIJIプラグインのSIFTとのリニアスタックアライメントを使用して画像を登録します。 SIFTによる線形スタックアライメント>登録>プラグイン。
- 登録したスタックを.aviファイルとして保存します。 ファイル>AVI>保存... ポップアップで、フレームレートを設定し(ここではアニメーション化された数字は10 fpsに設定されています)、[ OK]をクリックします。この出力を使用して、創傷治癒分析を実行します。
- 創傷領域の分析
- FIJI / ImageJのなげなわツールを使用して、セルの端をトレースして傷の輪郭を描きます。 コマンド +Mまたは CTRL +Mで輪郭を描いた傷の領域を測定します。
- 10フレームごとに創傷面積測定を繰り返します。次に、FIJI / ImageJからの測定値をPrism 9を使用してプロットできます(図4)。
図4:小さな上皮創傷の創傷領域の分析。(A)10分にわたる小さな上皮創傷治癒の例。 (B)21分にわたる異なる上皮創傷治癒の例。A、Bの紫色の輪郭は、FIJI / ImageJのなげなわツールを使用した創傷領域の測定値に匹敵します。(C)Aにおける創傷面積の経時的な正規化された減少。(D)Bにおける創傷面積の経時的な正規化された減少。(E)14の小さな創傷の経時的な創傷面積の平均減少。n = 14。SEMの平均±を中心としたエラーバー。 スケールバー:50 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5.メソグレア注射
- 注射皿の作成
- PDMS基剤と硬化剤とを組み合わせてポリジメチルシロキサン(PDMS)を、硬化剤1重量部に対して塩基10部の割合で調製する。激しくかき混ぜて、ベースと硬化剤を完全に混合します。
- 気泡を除去するには、混合物を真空チャンバーに15分間入れます。マイクロ遠心チューブキャップ付きの60mmペトリ皿に混合物を注ぎ、金型を所定の位置に保持します。すぐに金型をチューブキャップに45°傾けて置き、所定の位置にテープを貼ります。金型は、3つの積み重ねられたオフセットガラススライドを接着して、最終的な射出皿に隆起を作成します。
- 皿全体、型、および混合物を60°Cのオーブンに2時間入れて、エラストマーを硬化させます。完成した射出皿の型を取り外します。
- マイクロピペット牽引
- 微小電極プーラーを使用して、引っ張りプログラムを設計します。高速でワンステッププログラムを使用します。熱はガラスRAMPテスト結果55、56とほぼ同じです。得られたマイクロピペットに、長く一貫したテーパーがないか確認してください。
注意: 外径1.0mm、内径0.75mm、長さ10cmの薄肉ガラスホウケイ酸キャピラリーを使用してください。
- 微小電極プーラーを使用して、引っ張りプログラムを設計します。高速でワンステッププログラムを使用します。熱はガラスRAMPテスト結果55、56とほぼ同じです。得られたマイクロピペットに、長く一貫したテーパーがないか確認してください。
- 染料や薬の注射
- マイクロインジェクションニードルを作ります(上記のように)。
- メデューサに注射するための過剰量の染料または薬物を入れた長いピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルを埋め戻します。
注:Clytiaの場合、 DMSO濃度が高いと創傷治癒が妨げられるため、ジメチルスルホキシド(DMSO)をASWで<1:100希釈に保つ必要があります。.透明な溶液を注入する場合は、ファストグリーンFCF溶液(ASW中の0.1%ファストグリーンFCFの1:100希釈)を加えて、注入された液体を視覚化できます。 - 上記のように改造されたトランスファーピペットを使用して、サブアンブレラを上に向けてメデューサを、動物を覆うのに十分なASWを備えたPDMS注射皿に入れます(図5C)。解剖スコープのステージに皿を置きます。
注:過剰なASWを制限すると、メデューサが皿の中を泳ぐのを防ぎ、より成功した注射を可能にします。 - マイクロインジェクションの針先に焦点を合わせ、メデューサ近くの水中に進めます。マイクロマニピュレーターを使用して、針が曲がって折れるまで皿に押し込みます。この先端開口部は約10〜20μmです。
注意: この針は、その日の同じ染料/薬物注射に繰り返し使用できます。毎日新鮮なチップを使用し、別々の染料/薬に使用することをお勧めします。 - マイクロマニピュレーターを使用して、外傘に穴を開けることなく、針の先端をサブアンブレラを通してメソグレアに挿入します。
注意: 上皮のしわ/折り畳みが目立ちます。針がメデューサに挿入されると、折り目/折り畳みは停止します。 - マイクロインジェクターで、保持圧力をゼロに設定し、吐出圧力を≤20PSIに設定します。1つまたは2つの象限に注入し、それぞれにその象限の領域の約1/4の染料または薬物のスポットを充填します。
注:メデューサのサイズに応じて、シングルインジェクションスポットでは大容量または少量が適切です。メデューサをいっぱいにすると、上皮に極度の損傷を与え、さらには動物を死に至らしめます。 - 注入される染料または薬物に応じて、動物は新鮮なASWのビーカーに入れられ、染料または薬物の拡散とインキュベーションが可能になります。
- イメージングを行うには、改造トランスファーピペットを使用してメデューサをうつ病スライドに取り付け、傘が上を向くように動物を配置します(図5)。注射された試薬の効果をテストするために、この段階で動物を負傷させることができます。
図5:ECMに染料または薬物を導入するための注射セットアップ。(A) インジェクションのセットアップ。( B) マイクロインジェクション針の向きを示す注射セットアップのクローズアップ(皿内の動物に対して約45°の角度)。 (C) 注射用の少量のASW中のメデューサによるシリコーン注射皿のクローズアップ。 (D) ファストグリーンFCFを搭載したマイクロインジェクションニードルが、サブアンブレラを通ってメデューサの中層に入ります。 (E) マウントされたメデューサへのファストグリーンFCFのポストインジェクション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
上記のプロトコルに従って、単一細胞の微小創傷、小さな創傷、および大きな創傷を画像化した。登録された画像ファイルのスタックは、.aviファイルとして保存されました。
動画1では、細胞間および細胞内の微小創傷が閉じているのが見られます(図1 および 図2)。閉鎖中に小さなラメリポディアが観察され、その後収縮と治癒が続きます。破片は排除され、水中に放出されます。癒しは1分以内に完了します。
動画2および3では、異なる形状の小さな創傷は、前述のように、ラメリポディアの形成、ラメリポジアル接触の伸展、および創傷縁での細胞の拡散によって治癒する40(図1および図2)。辺縁細胞の後ろの層の細胞は、このサイズの創傷の治癒に参加せず、集団的な細胞移動もありません。上皮間隙の急速かつ漸進的な閉鎖に続いて、新たに形成された創傷縫い目40に沿った組織収縮が続く。これら2つの創傷の正規化された治癒率を、経時的な元の領域のパーセンテージとして表して示します(図4C、D)。創傷閉鎖のダイナミクスにはいくらかのばらつきがあるが、0.02〜0.125mm2の範囲の様々な形状の14創傷について経時的なパーセント面積閉鎖を平均すると、未処置動物における創傷治癒の平均曲線を確立することができる(図4E)。
基底膜の損傷は、それが発生するとはっきりと見ることができます(図2)。 動画4では、基底膜損傷のある小さな傷の縁の細胞が損傷部位の周囲に広がり、巾着紐収縮で隙間閉鎖が完了します。
組織が脱水状態または損傷しすぎて修復できない場合、細胞の動きが止まるか、細胞のシート全体が破裂する可能性があります(ムービー5 および ムービー6)。これは通常、長時間のイメージング(45分以上)後に発生します。イメージングの早い段階で細胞バーストが発生した場合、サンプルは廃棄されます。
動画7のように、大きな傷はいくつかの段階で治ります。第一に、創傷の縁は、以前に報告されたように、縁での収縮のために滑らかで規則的になる57。次に、ラメリポディアが創傷縁の細胞から形成されるのが見られ、ラメリポディアは隣接するラメリポディアとの接触を最大化するために前進します。創傷縁および辺縁細胞の背後にある数層における細胞内の核の追跡は、集団細胞移動によって大きな間隙が閉じることを示している40。細胞は決して切り離されませんが、シートとして一緒に移動します。
染料および薬理学的物質の導入は、生物学的メカニズムを解剖するための強力なツールとなり得る。多くの物質がClytia(図示せず)から除外されていますが、これはおそらく動物の表面を覆う粘液層が原因です。ただし、マイクロインジェクションを使用して、ECMに分子を直接導入し、ECM構造を破壊したり、ECMの規制活動を混乱させたりすることができます。さらに、染料および他の分子は基底側から上皮細胞に入ることができる。例えば、 図6 は、Hoechstによる核染色、FM1-43による膜染色、およびこれらの試薬をECMにマイクロ注入した後のサイトカラシンBによるラメリポディア形成の阻害を示す。創傷前にこれらの分子をECMおよび上皮細胞に導入することで、治癒過程に対する薬理学的ツールの効果を試験する実験が可能になります。
図6:色素または薬理学的物質のマイクロインジェクション後のメデューサの上皮細胞。(A)20 μM Hoechst(核)および50 μM FM1-43(膜)を注入してから5分後にトップパネルに示す上皮細胞。(B,C)1:1,000 DMSOコントロール(B)または100 μMサイトカラシンB(C)による注射後の創傷治癒。注射の15分後に創傷を作製した。画像は負傷後5分で撮影した。ラメリポディアの形成は、サイトカラシンBによって阻害される。創傷領域の細胞間によく見られる明らかな「繊維」は、基底膜を伸ばす張力の結果であると考えられています—それらはファロイジンで染色しません(図示せず)。スケールバー:50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:シングルセル微小創傷治癒のタイムラプス動画。経過時間:20秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:小さな上皮創傷治癒のタイムラプス動画。経過時間:9分54秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:小さな上皮創傷治癒のタイムラプス動画。この傷は、映画2の傷よりも大きく、不規則な形をしています。経過時間:20分54秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画4:基底膜裂傷による小さな傷と微小創傷治癒のタイムラプス動画。 ラメリポディアは基底膜の裂け目の周りに広がっていますが、ECMの残りの部分に進む可能性があります。基底膜損傷を伴う創傷の領域が囲まれると、財布のひも収縮がその領域の上に細胞を引っ張る。経過時間:19分4秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画5:小さな上皮創傷で死滅する細胞。 細胞死は動物の脱水による可能性があります。経過時間:4分24秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:100μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画6:小さな上皮創傷が治癒を完了できない。 経過時間:42分32秒。フレームレート:10 fps。スケールバー:50μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画7:大きな上皮創傷治癒。 経過時間:25分29秒フレームレート:10 fps。スケールバー:100μm。 この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:クリティアタンクの寸法概略図。 カスタムメイドのクリティア戦車の3Dビジュアライゼーション。 (A) 正面図と背面図。 (B) 側面図。緑色で示されている作品の切り欠きはナイロンメッシュで覆われています。水はメッシュの真上をタンクに入り、メッシュ上を掃引して円形の流れを作り出します。水は、青色で示されているエンドピースの穴からシステムから排出されます。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画1:クリチアの無細胞細胞外マトリックス。 共焦点顕微鏡を使用して撮影されたクリティアのZスタック。スタックは最初に外傘に焦点を合わせ、次にECMを介してプレート内胚葉とサブ傘まで10μmごとにスキャンします。DIC(左)とヘキスト核染色(右)を使用した画像は、ECMに細胞がないことを示しています。スケールバー:100μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここでは、比較的新しい無脊椎動物モデル生物であるClytiaにおけるインビボで創傷を画像化するための方法論が提示される40、43、58。このシステムをユニークで強力な研究ツールにするいくつかの要因があり、創傷治癒と再上皮化の研究に使用される他のモデルとは異なります。まず、単層上皮は透明なECMに付着しているため、in vitro組織培養アッセイに似ています(図1、図2、図3、図4)。in vitroアッセイと同様に、細胞を高解像度でイメージングすることができます。しかし、組織培養とは異なり、本物の細胞環境とECMが存在するため、創傷治癒は、生きた傷害動物で発生する複雑なシグナル伝達イベントのコンテキストで見ることができます。第二に、クリティアは炎症反応、移動性線維芽細胞、血管系、および血液を欠いています。これにより、創傷治癒中により複雑な成体動物において起こる重複事象がない場合に、インビボで再上皮化プロセスを研究することができる59。第三に、ECMは無細胞(補足動画1)で大きく、マイクロインジェクションニードルで簡単にアクセスできます(図5および図6)。このアプローチを使用して、研究者は、ECM構造またはシグナル伝達を乱す薬理学的試薬がin vivoでの創傷治癒に及ぼす影響をテストできます。試薬は上皮細胞に導入することもでき、in vivo創傷治癒に対するそれらの効果を評価することができます。第四に、Clytiaシステム42、43、44、45において突然変異体およびトランスジェニック動物を作成するために存在するプロトコルがある。したがって、in vivo創傷治癒は、目的の遺伝子の発現が増加/減少した動物で観察できます。
この手法にはいくつかの重要な手順があります。まず、 図3に示すように、扁平で透明な上皮細胞は標準的な光学顕微鏡ではほぼ見えないため、DIC顕微鏡用に正しく構成された顕微鏡を使用する必要があります。また、ECMをえぐらずに上皮が損傷するように動物を優しく傷つけるスキルを開発することも重要です。注射中に動物に広範囲の損傷を与えると、その後の創傷治癒の分析が損なわれる可能性があるため、ECMに材料をマイクロ注入する場合も同様に穏やかなタッチが必要です。これらのテクニックには学習曲線がありますが、初心者の学生でもマラミーラボですぐに習得しています。実際、これらのプロトコルは、シカゴ大学の学部ラボコースで細胞移動を実証するために使用されています。
最適なイメージングのためには、動物が動かず、選択された創傷領域が視野から外れないことが重要です。動物が脈動している場合、記載されているトリカインによる治療は非常に効果的です。.ドリフトの場合、多くの場合、サンプルを手動で再配置する必要があります。これらの動きは、FIJI / ImageJの登録機能を使用して、最終的なムービーから排除できます。
このシステムの制限は、ここで説明する方法を使用して傷の形状とサイズの両方が異なるため、同一の傷を作成できないことです。したがって、創傷閉鎖または細胞移動の正確な速度を定量化することは困難な場合があります。炭素粒子などの位置マーカーは、負傷した動物において露出したECMに付着し、大きな創傷における集団細胞移動の速度を測定するために使用することができる(図示せず)。小さな創傷閉鎖分析では、創傷のサイズと形状が変動しても、このサイズの創傷の閉鎖率の範囲は限られています(図4)。したがって、促進的または抑制的な薬理学的試薬の効果を定量的に検出することが可能です。
この研究では、DIC顕微鏡のみを使用した創傷治癒の特性評価について説明していますが、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用した画像治癒にも同じアプローチを使用できます。これを支援するために、さまざまな細胞および細胞外タンパク質が蛍光標識されたトランスジェニック動物を生成するためのプロトコルが実施されています。DICと蛍光による同時イメージングと、薬理学的薬剤または変異株を使用した創傷治癒の摂動を組み合わせることは、上皮の創傷治癒過程の根底にあるメカニズムを理解するための強力なアプローチになります。
Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
E.E.L.L.は、全米科学財団PRFB 2011010からの助成金によってサポートされています。クリティアコロニーの設立に協力してくれた百瀬剛さんとエブリン・フーリストンさん、微小創傷治癒画像の収集をしてくれたジャン・バティスト・レイニエさん、疑似クライゼルタンクを建設してくださったハリー・キリアゼスさん、クリティアの生息地を維持してくれたエリザベス・バルドさんに感謝します。図1Bは BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20500 ACE EKE Microscope Fiber Optic Light Source | Kramer Scientific Corporation | ||
| AxioCam 506 mono | ZEISS | 426557-0000-000-MA285 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | TW1004 | |
| Cytochalasin B | Abcam | ab143482 | |
| Depression slides | Amscope | BS-C12 | |
| DMR with DIC options and fluorescence halogen lamp | Leica | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521-10G | |
| Fast Green FCF | Thermo Scientific | A16520-06 | |
| FM1-43 | Biotium | 70022 | Excitation/Emission: 480/598 nm |
| Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | Excitation/Emission: 361/497 nm |
| imageJ | NIH | ||
| Microloader tips (0.5-10 μL /2-20 μL) | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | 3301R / M3301L | |
| Microscope Cover Glass (22X40-1.5) | Fisherbrand | 12-544-BP | |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB085713A | |
| PicoNozzle v2 | World Precision Instruments | 5430-ALL | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Polycarbonate vacuum, desiccator | Bel-art | F42025-0000 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| STEMI Sv11 Dissection scope | ZEISS | STEMI SV11 | |
| SYLGARD 184 | Dow Silicones | 1024001 | |
| Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Z-Hab mini system | Pentair | ||
| ZEN Microscopy software | Zeiss |
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