Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

पौधों में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के चयापचय को स्पष्ट करना

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/65089
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2, 1
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology, 3Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल पौधों में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल मेटाबोलाइट्स की पहचान के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करता है।

Abstract

फसलों को बड़े पैमाने पर कार्बनिक प्रदूषकों के संपर्क में लाया जा सकता है, क्योंकि मिट्टी पर्यावरण में छोड़े जाने वाले प्रदूषकों के लिए एक प्रमुख सिंक है। यह प्रदूषक-संचित खाद्य पदार्थों की खपत के माध्यम से संभावित मानव जोखिम पैदा करता है। फसलों में ज़ेनोबायोटिक्स के उत्थान और चयापचय को स्पष्ट करना मनुष्यों में आहार जोखिम जोखिम के आकलन के लिए आवश्यक है। हालांकि, ऐसे प्रयोगों के लिए, बरकरार पौधों के उपयोग के लिए दीर्घकालिक प्रयोगों और जटिल नमूना तैयारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो विभिन्न कारकों से प्रभावित हो सकते हैं। उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचआरएमएस) के साथ संयुक्त प्लांट कैलस संस्कृतियां पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स के मेटाबोलाइट्स की सटीक और समय-बचत पहचान के लिए एक समाधान प्रदान कर सकती हैं, क्योंकि यह माइक्रोबियल या फंगल माइक्रोएन्वायरमेंट से हस्तक्षेप से बच सकती है, उपचार की अवधि को कम कर सकती है, और बरकरार पौधों के मैट्रिक्स प्रभाव को सरल बना सकती है। 2,4-डिब्रोमोफेनॉल, एक विशिष्ट लौ रोधी और अंतःस्रावी विघटनकारी, को मिट्टी में इसकी व्यापक घटना और पौधों द्वारा इसकी उत्थान क्षमता के कारण मॉडल पदार्थ के रूप में चुना गया था। इसमें, प्लांट कैलस को एसेप्सिस के बीजों से उत्पन्न किया गया था और बाँझ 2,4-डिब्रोमोफेनॉल युक्त संस्कृति माध्यम के संपर्क में लाया गया था। परिणामों से पता चला कि 120 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद प्लांट कैलस ऊतकों में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के आठ मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई थी। यह इंगित करता है कि 2,4-डिब्रोमोफेनॉल को प्लांट कैलस ऊतकों में तेजी से चयापचय किया गया था। इस प्रकार, प्लांट कैलस कल्चर प्लेटफॉर्म पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स के उत्थान और चयापचय का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।

Introduction

मानवजनितगतिविधियों 1,2 के कारण पर्यावरण में कार्बनिक प्रदूषकों की बढ़ती संख्या को त्याग दिया गया है, और मिट्टी को इन दूषित पदार्थों के लिए एक प्रमुख सिंक माना जाता है 3,4. मिट्टी में दूषित पदार्थों को पौधों द्वारा लिया जा सकता है और संभावित रूप से फसल की खपत के माध्यम से सीधे मानव शरीर में प्रवेश करके खाद्य श्रृंखलाओं के साथ उच्च ट्रॉफिक-स्तर के जीवों में स्थानांतरित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अनपेक्षित जोखिम 5,6 होता है। पौधेविषहरण के लिए ज़ेनोबायोटिक्स को चयापचय करने के लिए विभिन्न मार्गों का उपयोग करते हैं; ज़ेनोबायोटिक्स के चयापचय को स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह पौधों में दूषित पदार्थों के वास्तविक भाग्य को नियंत्रित करता है। चूंकि मेटाबोलाइट्स को पत्तियों (वायुमंडल) या जड़ों द्वारा उत्सर्जित किया जा सकता है, इसलिए एक्सपोजर के शुरुआती चरणों में मेटाबोलाइट्स का निर्धारण करनामेटाबोलाइट्स की विस्तारित संख्या का परीक्षण करने की संभावना प्रदान करता है। हालांकि, बरकरार पौधों का उपयोग करने वाले अध्ययनों के लिए दीर्घकालिक प्रयोगों और जटिल नमूना तैयारी प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो विभिन्न कारकों से प्रभावित हो सकते हैं।

इसलिए, प्लांट कैलस संस्कृतियां, प्लांटा में ज़ेनोबायोटिक्स के चयापचय का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा विकल्प हैं, क्योंकि वे उपचार के समय को बहुत कम कर सकते हैं। ये संस्कृतियां माइक्रोबियल हस्तक्षेप और फोटोकैमिकल गिरावट को बाहर करती हैं, बरकरार पौधों के मैट्रिक्स प्रभाव को सरल बनाती हैं, खेती की स्थितियों को मानकीकृत करती हैं, और कम प्रयोगात्मक प्रयास की आवश्यकता होती है। प्लांट कैलस संस्कृतियों को ट्राइक्लोसन9, नोनिलफेनॉल10 और टेबुकोनाज़ोल8 के चयापचय अध्ययन में एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इन अध्ययनों से पता चला है कि कैलस संस्कृतियों में चयापचय पैटर्न बरकरार पौधों के समान थे। यह अध्ययन जटिल और समय लेने वाले प्रोटोकॉल के बिना पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स के मेटाबोलाइट्स की कुशल और सटीक पहचान के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है। यहां, हम कम तीव्रता वाले संकेतों11,12 के साथ मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में प्लांट कैलस संस्कृतियों का उपयोग करते हैं।

इसके लिए, गाजर (डौकस कैरोटा वर सैटिवस) कैलस सस्पेंशन को 130 आरपीएम और 26 डिग्री सेल्सियस पर शेकर में 120 घंटे के लिए 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के 100 μg / L के संपर्क में लाया गया था। मेटाबोलाइट्स को उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निकाला और विश्लेषण किया गया था। यहां प्रस्तावित प्रोटोकॉल अन्य प्रकार के कार्बनिक यौगिकों के इनप्लांटा चयापचय की जांच कर सकता है जिन्हें आयनित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. गाजर कैलस का भेदभाव

नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को आटोक्लेव करें और यूवी-स्टरलाइज्ड अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच में सभी ऑपरेशन करें।

  1. एक समान गाजर के बीज (डौकस कैरोटा वर सैटिवस) को 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर विआयनीकृत पानी में डुबोकर बीज को वर्नालाइज करें।
  2. 20 मिनट के लिए 75% इथेनॉल के साथ वर्नलाइज्ड बीजों को सतह-निष्फल करें, और फिर सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में बाँझ विआयनीकृत पानी से तीन बार कुल्ला करें।
  3. इसके अलावा 20 मिनट के लिए 20% एच2 ओ2 के साथ बीज को निष्फल करें, और उन्हें सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में छह बार निष्फल विआयनीकृत पानी से धो लें।
  4. एसेप्टिक रूप से बीजों को हार्मोन-मुक्त एमएस माध्यम (पीएच 5.8, 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव) पर बोकर अंकुरित करें, जिसमें 1% आगर-जेल हो, और 15 दिनों के लिए 16 घंटे की फोटोअवधि (350 μmol / m2s) के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्ट किया जाए।
  5. रोपाई के हाइपोकोटिल और कोटिलेडॉन को छोटे टुकड़ों (0.5 सेमी) में काटकर खोज प्राप्त करें।
  6. खोजों को पेट्री व्यंजनों (प्रति डिश दो से चार खोज) में बदलें, जिसमें 15-20 मिलीलीटर एसेप्टिक एमएस माध्यम होता है, जो ऑक्सिमोन (2,4-डाइक्लोरोफेनोक्सीएसेटिक एसिड; 1 मिलीग्राम / एल) और फाइटोकिनिन (6-बेंजाइलमिनोप्यूरिन; 0.5 मिलीग्राम / एल) के साथ पूरक होता है।
  7. कैलस को प्रेरित करने के लिए 3-4 सप्ताह के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में खोजों को इनक्यूबेट करें।
  8. एक बाँझ स्केलपेल और फोर्सप्स का उपयोग करके प्रारंभिक खोजों से बने कैलस ऊतकों (लगभग 1 सेमी व्यास) को अलग करें।
    नोट: नवगठित कैलस ऊतक सफेद से मलाईदार पीले रंग के होते हैं और प्रारंभिक खोजों से शिथिल रूप से जुड़े होते हैं।

2. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार

  1. 10 मिलीलीटर सड़न रोकनेवाला तरल एमएस माध्यम में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के 1 μg को घोलें (2,4-डिब्रोमोफेनॉल की अंतिम एकाग्रता 100 पीपीबी, पीएच 5.6-7.0 है)।
  2. सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में तैयार 2,4-डिब्रोमोफेनॉल समाधान (चरण 2.1 से) युक्त ग्लास फ्लास्क में ताजा गाजर कैलस (चरण 1.8) के 3 ग्राम जोड़ें। इसे 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार के रूप में देखें।
    नोट: ग्लास फ्लास्क को पैराफिन फिल्म का उपयोग करके आटोक्लेव और सील किया गया था।
  3. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के अजैविक क्षरण का मूल्यांकन करने के लिए केवल 2,4-डिब्रोमोफेनॉल समाधान (चरण 2.1 में तैयार) युक्त एक मध्यम नियंत्रण शामिल करें।
  4. किसी भी संभावित संदूषण की जांच के लिए केवल गाजर कैलस (2,4-डिब्रोमोफेनॉल समाधान) युक्त एक रिक्त नियंत्रण शामिल करें।
    1. केवल 10 मिलीलीटर बाँझ एमएस माध्यम में 3 ग्राम ताजा एकत्र गाजर कैलस जोड़कर गाजर युक्त रिक्त नियंत्रण तैयार करें।
  5. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार और मध्यम और रिक्त नियंत्रण को 120 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में अंधेरे में 130 आरपीएम और 26 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार से नमूने एकत्र करने के लिए इनक्यूबेटर से ग्लास फ्लास्क निकालें और 120 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद नियंत्रण करें।
    नोट: सभी नमूने तीन प्रतियों में तैयार किए गए थे।

3. नमूना तैयार करना

  1. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार और नियंत्रण के लिए ग्लास फाइबर फिल्टर (0.45 μm) के साथ निस्पंदन द्वारा कैलस को एमएस माध्यम से सावधानीपूर्वक अलग करें। तीन बार अल्ट्राप्योर पानी से धोने के बाद कैलस इकट्ठा करें।
  2. तरल नाइट्रोजन के साथ एकत्रित कैलस को फ्रीज-ड्राई करें, और बाद में एकत्र किए गए कैलस (0.2 ग्राम) को 3 मिनट के लिए 70 हर्ट्ज पर उच्च-थ्रूपुट ऊतक ग्राइंडर के साथ समरूप करें।
  3. एक ग्लास माइक्रोसिरिंज के साथ 25 मिलीग्राम / एल सरोगेट 4-एन-एनपी-डी4 के 50 μL जोड़कर होमोजिनाइज्ड कैलस को स्पाइक करें और बाद में 1 मिनट के लिए भंवर करें।
  4. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल और मेटाबोलाइट्स को निकालने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ के पानी से भरे अल्ट्रासोनिकेटर (150 डब्ल्यू, 40 किलोहर्ट्ज) में 5 मिलीलीटर मेथनॉल / पानी (1: 1, वी / वी) के साथ नमूनों को सोनिकेट करें।
  5. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और पाइपिंग द्वारा सुपरनैटेंट इकट्ठा करें।
    1. कैलस नमूने के लिए निष्कर्षण प्रक्रियाओं को तीन बार दोहराएं और अर्क को मिलाएं।
  6. हाइड्रोफिलिक लिपोफिलिक संतुलित ठोस चरण निष्कर्षण (एचएलबी एसपीई) कारतूस के माध्यम से अर्क को 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर के साथ पारित करें।
    नोट: एचएलबी एसपीई कारतूस को किसी भी हस्तक्षेप को दूर करने के लिए 6 एमएल मेथनॉल और 6 एमएल पानी के साथ क्रमिक रूप से प्रीट्रीट किया गया था।
  7. एचएलबी एसपीई कारतूस के माध्यम से 6 एमएल मेथनॉल पारित करके विश्लेषणों का विश्लेषण करें। फिर, वाद्य विश्लेषण के लिए नाइट्रोजन गैस की एक कोमल धारा के तहत प्राप्त एलुएंट्स को 1 एमएल तक केंद्रित करें।
  8. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल और उनके मेटाबोलाइट्स विश्लेषण 15 के लिए यूपीएलसी-क्यू-टीओएफ-एमएस में परिणामी एलुएंट्स के10 μL इंजेक्ट करें।
    1. वाद्य विश्लेषण से पहले 0.22 μm नायलॉन झिल्ली के साथ सभी नमूने फ़िल्टर करें।

4. वाद्य विश्लेषण

नोट: 2,4-डिब्रोमोफेनॉल और उनके मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण एक अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (यूपीएलसी) पर इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) से लैस माइक्रोटीओएफ-क्यूआईआई मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ संयोजन में किए गए थे, जो सकारात्मक और नकारात्मक आयन मोड में काम कर रहे थे।

  1. कॉलम हीटर दरवाजा खोलें और कॉलम इनलेट को इंजेक्शन वाल्व और कॉलम आउटलेट को मास स्पेक्ट्रोमीटर के इनलेट से जोड़कर यूपीएलसी कॉलम इंस्टॉल करें।
    नोट: एक C18 स्तंभ (50 मिमी x 2.1 मिमी; 1.7 μm कण आकार) का उपयोग 40 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषणों के पृथक्करण के लिए किया गया था।
  2. मोबाइल चरण ए (अल्ट्राप्योर पानी) और मोबाइल चरण बी (क्रोमैटोग्राफी-ग्रेड मेथनॉल) को क्रमशः विलायक ट्यूबों ए और बी के अंत को संबंधित विलायक बोतलों में डालकर उपकरण से कनेक्ट करें।
    1. 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से सभी मोबाइल चरणों (प्रत्येक के लिए 500 मिलीलीटर) को फ़िल्टर करें, और 30 मिनट से अधिक के लिए सोनिकेट करें।
  3. सॉफ्टवेयर विंडो में, उपकरण पर क्लिक करें | तरल क्रोमैटोग्राम के लिए शर्तों को संपादित करने के लिए इनलेट विधि।
    1. मोबाइल चरण बी की ढाल स्थितियों को निम्नानुसार सेट करें: 1.0 एमएल / मिनट की प्रवाह दर; 0-0.5 मिनट, 5%; 0.5-3.5 मिनट, 5% से 50%; 3.5-6.5 मिनट, 50% से 100%; 6.5-7 मिनट, 100%; 7-10 मिनट, 100% से 5%।
    2. यूपीएलसी-क्यू-टीओएफ-एमएस में नमूनों की इंजेक्शन दर 0.2 एमएल /
      नोट: नमूने का इंजेक्शन पूरी तरह से स्वचालित नमूने का उपयोग कर प्रोग्राम किया गया है।
  4. सॉफ्टवेयर विंडो में, एमएस विधि का चयन करें और फिर क्यू-टीओएफ-एमएस के पैरामीटर सेट करें: 8 एल / मिनट की सुखाने वाली गैस (एन2) प्रवाह दर, 300-350 डिग्री सेल्सियस का तापमान; 4,500 वी का एक केशिका वोल्टेज; 5-45 वी की टकराव ऊर्जा; और 40-800 डीए की एक पूर्ण स्कैन सीमा।
  5. नमूना शीशियों को सीरियल नंबर द्वारा नमूना ट्रे के संबंधित स्थानों में रखें, और नमूना ट्रे को नमूना कक्ष में फिर से डालें।
    नोट: नमूना ट्रे सपाट रखें और सुनिश्चित करें कि नमूना कक्ष का दरवाजा बंद है।
  6. सॉफ्टवेयर विंडो में, फ़ाइल का चयन करें | डेटाबेस बनाने के लिए नया. डेटाबेस को नाम दें।
  7. एमएस फाइल का चयन करके ऊपर बनाए गए नमूना प्रोग्राम को लोड करें | इनलेट फ़ाइल | मात्रा इंजेक्ट करें।
  8. फ़ाइल क्लिक करके प्रोजेक्ट के नमूना फ़ोल्डर में डेटाबेस सहेजें | सहेजें.
  9. रन का चयन करें | सॉफ़्टवेयर मुख्य विंडो में प्रारंभ करें, और उसके बाद नमूना डेटा प्राप्त करें का चयन करें और डेटा एकत्र करने के लिए चलाए गए प्रारंभ नमूना सूची की विंडो में ठीक क्लिक करें।
    नोट: क्रोमैटोग्राम पर क्लिक करके वास्तविक समय क्रोमैटोग्राम देखा जा सकता है डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान रीयल-टाइम अपडेट ।
  10. लक्ष्य डेटा पंक्ति का चयन करके और एमएस स्कैन क्रोमैटोग्राम देखने के लिए क्रोमैटोग्राम विंडो पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर में डेटा को संसाधित करें।
  11. क्रोमैटोग्राम विंडो में, प्रदर्शन क्लिक करें | टीआईसी | स्कैनवेवडीएस | ट्रेस जोड़ें | बेटी स्कैन मास स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए ठीक है।
  12. 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार और नियंत्रण के क्रोमैटोग्राम की तुलना करके मेटाबोलाइट्स की पहचान करें।
  13. प्रतिधारण समय, द्रव्यमान और विखंडन पैटर्न16,17 द्वारा मेटाबोलाइट उम्मीदवारों को स्पष्ट करें।
    नोट: मेटाबोलाइट उम्मीदवारों के मूल आयनों के प्रयोगात्मक एम / जेड मूल्यों के बीच द्रव्यमान सटीकता की त्रुटि उनके संबंधित सैद्धांतिक एम / जेड के लिए 10 पीपीएम से कम होनी चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्रोटोकॉल के चरणों को चित्र 1 में दर्शाया गया है। प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार से गाजर कैलस अर्क के क्रोमैटोग्राम की तुलना नियंत्रणों से की, और आठ अलग-अलग चोटियों को पाया जो 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार में मौजूद हैं लेकिन नियंत्रण में अनुपस्थित हैं (चित्रा 2)। यह इंगित करता है कि 2,4-डिब्रोमोफेनॉल (एम 562, एम 545, एम 661, एम 413, एम 33 9, एम 380, एम 424 और एम 187) के कुल आठ मेटाबोलाइट्स का सफलतापूर्वक 2,4-डिब्रोमोफेनॉल-उपचारित गाजर कैलस में पता लगाया गया था। इसके अतिरिक्त, मूल 2,4-डिब्रोमोफेनॉल (प्रतिधारण समय = 0.85 मिनट) का शिखर 2,4-डिब्रोमोफेनॉल उपचार (चित्रा 2) के क्रोमैटोग्राम में नहीं पाया गया था, यह दर्शाता है कि प्रयोगात्मक परिस्थितियों में गाजर कैलस में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल तेजी से चयापचय किया गया था।

गाजर कैलस में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली क्रोमैटोग्राफिक और द्रव्यमान जानकारी को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है। गाजर कैलस में इनक्यूबेट किए गए 2,4-डिब्रोमोफेनॉल ने ग्लूकोज (एम 562, एम 545, एम 661 और एम 413) और अमीनो एसिड (एम 33 9, एम 380 और एम 424) के साथ सीधे संयुग्मन द्वारा मेटाबोलाइट्स के गठन का नेतृत्व किया। उदाहरण के लिए, एम 413 ने एम / जेड 250.8954 और 163.1485 पर टुकड़े पैदा किए, जो डिब्यूटाइल थैलेट (डीबीपी) और ग्लूकोज (सी6एच11ओ5) के अनुरूप हैं। एम 413 को आगे पैंटोज़ या हेक्सोज़ को जोड़कर डिसैकराइड संयुग्मन मेटाबोलाइट्स एम 661, एम 545 और एम 562 बनाने के लिए चयापचय किया गया था। एम 339, एम 380, और एम 424 को 2,4-डिब्रोमोफेनॉल एलानिन, 2,4-डिब्रोमोफेनॉल एसिटाइलएलनिन और 2,4-डिब्रोमोफेनोल एसिटाइलएलिक एसिड होने का अनुमान लगाया गया था, क्योंकि उनके पास अमीनोएसिड (सी 3 एच 6 एनओ2), एसिटाइलएलनिन (सी 5 एच 8 एनओ3), और एसिटाइलस्पार्टिक एसिड (सी6एच8एनओ5) की विशेषता तटस्थ हानि है, जो एम / जेड 89.09 पर संबंधित टुकड़े पैदा करते हैं। 129.1140, और 173.1235, क्रमशः15. प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि फसलों में ज़ेनोबायोटिक्स के चयापचय को स्पष्ट करने के लिए प्लांट कैलस संस्कृतियों का उपयोग एक कुशल और विश्वसनीय उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: विधि योजनाबद्ध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 2,4-डिब्रोमोफेनॉल (सम्मिलित चित्र) और 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के मेटाबोलाइट्स के लिए क्रोमैटोग्राम। इस आंकड़े को सन एट अल.15 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कॉपीराइट (2018) अमेरिकन केमिकल सोसाइटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मेटाबोलाइट RT (min) ईएसआई मोड मनाया
m/z		 परिकलित
m/z		 निर्दिष्ट सूत्र टुकड़े (m/z) आत्मविश्वास का स्तर
M562 0.7 -H 562.201 562.201 C18H26Br2O10 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
170.9914 (-Br) एमएस, एमएस2
M545 1.6 -H 545.151 545.1506 C17H22Br2O10 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
170.9914 (-Br)
528.1433 (-OH) एमएस, एमएस2
M661 2.9 -H 661.222 661.2228 C21H26Br2O14 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
410.3274 (-C15H23O13) एमएस, एमएस2
M413 4.1 -H 413.036 413.036 C12H14Br2O6 250.8954 (-DBP) स्तर 1
163.1485(-C6H11O5)
207.8938(250-CO2) सिंथेटिक मानक, आरटी, एमएस, एमएस2
M339 5.2 +H 339.994 339.9886 C9 H9Br2NO3 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
87.0773 (-C3H6NO2) एमएस, एमएस2
M380 5.5 -H 380.01 380.0094 C 11 H11Br2NO4 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
129.1140 (-C5H8NO3) एमएस, एमएस2
M424 5.8 -H 424.012 424.0189 C12H11Br2NO6 250.8954 (-DBP) स्तर 2 बी
173.1235 (-C6H8NO5) एमएस, एमएस2
M187 6.1 -H 187.995 187.9988 C6H5BrO2 109.1027 (-Br) स्तर 1
170.9914 (-OH) प्रामाणिक मानक, आरटी, एमएस, एमएस2

तालिका 1: गाजर कैलस अर्क में खोजे गए 2,4-डिब्रोमोफेनॉल और इसके मेटाबोलाइट्स का सारांश। इस तालिका को सन एट अल.15 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कॉपीराइट (2018) अमेरिकन केमिकल सोसाइटी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स के बायोट्रांसफॉर्म की कुशलतापूर्वक पहचान करने के लिए विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम प्लांट कैलस की संस्कृति है। सबसे कठिन हिस्सा प्लांट कैलस का भेदभाव और रखरखाव है, क्योंकि प्लांट कैलस आसानी से संक्रमित होता है और पौधे के ऊतकों में विकसित होता है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरण आटोक्लेव हैं, और सभी ऑपरेशन सड़न रोकनेवाला परिस्थितियों में किए जाते हैं। ऑटोट्रोफिक विकास और अतिविकास से बचने के लिए पौधे कैलस का भेदभाव और रखरखाव अंधेरे में किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एमएस माध्यम में पूरक फाइटोहार्मोन की खुराक और प्रकार प्लांट कैलस के अंतर के लिए महत्वपूर्ण है, जिसे पौधे की प्रजातियों को ध्यान में रखना चाहिए। फाइटोहार्मोन का ओवरडोज कैलस को एक संवहनी प्रणाली विकसित करने का कारण बनता है, लेकिन अपर्याप्त फाइटोहार्मोन प्लांट कैलस18 के भेदभाव को सीमित करते हैं। एमएस मध्यम और फाइटोहार्मोन स्टॉक को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। फाइटोहार्मोन और सड़न रोकनेवाला हाइपोकोटिल की शुरूआत से पहले एमएस माध्यम को आटोक्लेव करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

बरकरार पौधों में क्लोरोफिल जैसे पिगमेंट एलसी-एचआरएमएस माप19,20 में एक सामान्य समस्या है। प्लांट कैलस सड़न रोकनेवाला हाइपोकोटाइल से प्राप्त होता है और क्लोरोफिल के बिना पारदर्शी होता है। इसका मतलब यह है कि प्लांट कैलस कल्चर बरकरार पौधे के मैट्रिक्स प्रभाव को अनुकूलित कर सकता है और वर्णक हटाने के चरणों के बिना एक आसान लेकिन कुशल नमूना तैयारी तकनीक प्रदान कर सकता है। प्लांट कैलस में ज़ेनोबायोटिक्स के मेटाबोलाइट्स का विश्लेषण एलसी-एचआरएमएस के साथ गैर-लक्षिततरीके से हासिल किया गया था। गैर-लक्षित विश्लेषण के साथ संयुक्त प्लांट कैलस कल्चर चयापचय यौगिकों के बड़े पैमाने पर प्रोफाइलिंग की प्रभावी पहचान की अनुमति देता है। ये फायदे पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स के चयापचय की यंत्रवत समझ के लिए विधि को आदर्श बनाते हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल के लिए अभी भी कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल को केवल जटिल पर्यावरणीय परिस्थितियों के कारण क्षेत्र में पौधों में होने वाली वास्तविक स्थिति के संदर्भ के रूप में लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि विभिन्न प्लांट कॉलस अलग-अलग चयापचय क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं, इसलिए ज़ेनोबायोटिक्स के पहचाने गए मेटाबोलाइट्स कैलस के प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं।

पौधों में रसायनों के चयापचय परिवर्तन को जानना उनके सुरक्षित विकास और आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है। यहां प्रस्तावित विधि पौधों में उत्पन्न मेटाबोलाइट्स की स्क्रीनिंग के लिए कुशल और विश्वसनीय है, और खाद्य श्रृंखला हस्तांतरण या फसलों के प्रत्यक्ष आहार सेवन के माध्यम से पारिस्थितिक तंत्र और मानव स्वास्थ्य के लिए संबंधित जोखिम के मूल्यांकन का समर्थन कर सकती है। यह प्रोटोकॉल पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स की दृढ़ता की जांच कर सकता है और उभरते दूषित पदार्थों को स्क्रीन करने में मदद कर सकता है। अपनी पूर्ण चयापचय क्षमता को ध्यान में रखते हुए, कम लागत और कम समय और प्रयास के साथ, प्लांट कैलस कल्चर कई यौगिकों के चयापचय व्यवहार की तुलना करने और ज़ेनोबायोटिक्स के संभावित मेटाबोलाइट्स की भविष्यवाणी के लिए एक डेटाबेस बनाने के लिए एक अच्छा उपकरण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21976160) और झेजियांग प्रांत लोक कल्याण प्रौद्योगिकी अनुप्रयोग अनुसंधान परियोजना (LGF21B070006) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 192
पौधों में 2,4-डिब्रोमोफेनॉल के चयापचय को स्पष्ट करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou,… More

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter