Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

توضيح استقلاب 2،4-ثنائي بروموفينول في النباتات

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/65089
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 2, 1
1Key Laboratory of Microbial Control Technology for Industrial Pollution in Zhejiang Province, College of Environment, Zhejiang University of Technology, 2International Joint Research Center for Persistent Toxic Substances (IJRC-PTS), College of Environment, Zhejiang University of Technology, 3Research and Teaching Center of Agriculture, Zhejiang Open University

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتحديد مستقلبات 2،4-ثنائي برومو فينول في النباتات.

Abstract

يمكن أن تتعرض المحاصيل على نطاق واسع للملوثات العضوية ، لأن التربة هي بالوعة رئيسية للملوثات التي يتم التخلص منها في البيئة. وهذا يخلق تعرضا بشريا محتملا من خلال استهلاك الأغذية المتراكمة الملوثات. إن توضيح امتصاص واستقلاب الزينوبيوتيك في المحاصيل أمر ضروري لتقييم مخاطر التعرض الغذائي لدى البشر. ومع ذلك ، بالنسبة لمثل هذه التجارب ، يتطلب استخدام النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة. قد توفر مزارع الكالس النباتية جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) حلا لتحديد دقيق وموفر للوقت لمستقلبات الكائنات الحية في النباتات ، حيث يمكن أن يتجنب التداخل من البيئة الدقيقة الميكروبية أو الفطرية ، وتقصير مدة العلاج ، وتبسيط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول ، وهو مثبط نموذجي للهب واضطراب الغدد الصماء ، كمادة نموذجية بسبب انتشاره على نطاق واسع في التربة وإمكانية امتصاصه من قبل النباتات. هنا ، تم إنشاء الكالس النباتي من بذور التعقيم وتعريضه لوسط استزراع معقم يحتوي على 2،4-ثنائي بروموفينول. أظهرت النتائج أنه تم تحديد ثمانية مستقلبات من 2،4-ثنائي بروموفينول في أنسجة الكالس النباتية بعد 120 ساعة من الحضانة. يشير هذا إلى أن 2،4-ثنائي بروموفينول تم استقلابه بسرعة في أنسجة الكالس النباتية. وبالتالي ، فإن منصة زراعة الكالس النباتية هي طريقة فعالة لتقييم امتصاص واستقلاب xenobiotics في النباتات.

Introduction

تم التخلص من عدد متزايد من الملوثات العضوية في البيئة بسبب الأنشطة البشريةالمنشأ 1,2 ، وتعتبر التربة بالوعة رئيسية لهذه الملوثات 3,4. يمكن أن تمتص النباتات الملوثات الموجودة في التربة ويحتمل أن تنتقل إلى كائنات ذات مستوى غذائي أعلى على طول سلاسل الغذاء ، عن طريق الدخول مباشرة إلى جسم الإنسان من خلال استهلاك المحاصيل ، مما يؤدي إلى التعرض غير المقصود 5,6. تستخدم النباتات مسارات مختلفة لاستقلاب xenobiotics لإزالة السموم7 ؛ من المهم توضيح عملية التمثيل الغذائي للأجانب ، لأنه يتحكم في المصير الفعلي للملوثات في النباتات. نظرا لأن المستقلبات يمكن أن تفرز عن طريق الأوراق (إلى الغلاف الجوي) أو الجذور ، فإن تحديد المستقلبات في المراحل المبكرة جدا من التعرض يوفر إمكانية اختبار عدد كبير من المستقلبات8. ومع ذلك ، تتطلب الدراسات التي تستخدم النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة.

لذلك ، تعد ثقافات الكالس النباتية بديلا جيدا لدراسة استقلاب الكائنات الحية في النبات ، حيث يمكنها تقصير وقت العلاج بشكل كبير. تستبعد هذه الثقافات التداخل الميكروبي والتحلل الكيميائي الضوئي ، وتبسط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة ، وتوحد ظروف الزراعة ، وتتطلب جهدا تجريبيا أقل. تم تطبيق مزارع الكالس النباتية بنجاح كنهج بديل في الدراسات الأيضية للتريكلوسان9 ونونيل فينول10 وتيبوكونازول8. أظهرت هذه الدراسات أن أنماط التمثيل الغذائي في مزارع الكالس كانت مماثلة لتلك الموجودة في النباتات السليمة. تقترح هذه الدراسة طريقة لتحديد فعال ودقيق لمستقلبات xenobiotics في النباتات التي لا تحتوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا ، نستخدم ثقافات الكالس النباتية مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة لتحليل المستقلبات ذات الإشارات منخفضة الكثافة11,12.

وتحقيقا لهذه الغاية، تعرضت معلقات الكالس للجزرة (Daucus carota var. sativus) إلى 100 ميكروغرام/لتر من 2،4-ثنائي برومو فينول لمدة 120 ساعة في شاكر عند 130 دورة في الدقيقة و 26 درجة مئوية. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول بسبب نشاطه الغدد الصماءالتخريبي 13 وحدوثه على نطاق واسع في التربة14. تم استخراج المستقلبات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. يمكن للبروتوكول المقترح هنا التحقيق في التمثيل الغذائي في النبات لأنواع أخرى من المركبات العضوية التي يمكن أن تتأين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تمايز الكالس الجزرة

ملاحظة: الأوتوكلاف جميع المعدات المستخدمة هنا وإجراء جميع العمليات في طاولة عمل فائقة النظافة معقمة بالأشعة فوق البنفسجية.

  1. قم بتكثيف البذور عن طريق غمر بذور الجزر الموحدة (Daucus carota var. sativus) في ماء منزوع الأيونات عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة.
  2. قم بتعقيم البذور الربيعية بنسبة 75٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة ، ثم اشطفها ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات المعقم في ظروف معقمة.
  3. قم بتعقيم البذور بنسبة 20٪ H 2 O2لمدة 20 دقيقة ، واغسلها بالماء منزوع الأيونات المعقم ست مرات في ظل ظروف معقمة.
  4. تنبت البذور بشكل معقم عن طريق زرعها على وسط MS خال من الهرمونات (درجة الحموضة 5.8 ، معقم عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) يحتوي على 1٪ أجار جل ، وحضنها عند 26 درجة مئوية مع فترة ضوئية 16 ساعة (350 ميكرومول / م2ثانية) لمدة 15 يوما.
  5. الحصول على explants عن طريق قطع hypocotyl والنبتة من الشتلات إلى قطع صغيرة (0.5 سم).
  6. قم بتحويل النباتات إلى أطباق بتري (من اثنين إلى أربعة نباتات لكل طبق) تحتوي على 15-20 مل من وسط MS المعقم المكمل بأوكسيمون (2،4-حمض ثنائي كلورو فينوكسي أسيتيك ؛ 1 مجم / لتر) وفيتوكينين (6-بنزيلامينوبورين ؛ 0.5 مجم / لتر) تحت ظروف معقمة.
  7. احتضان النباتات في الظلام عند 26 درجة مئوية لمدة 3-4 أسابيع للحث على الكالس.
  8. افصل أنسجة الكالس (قطرها حوالي 1 سم) المتكونة من النباتات الأولية باستخدام مشرط معقم وملقط.
    ملاحظة: أنسجة الكالس المشكلة حديثا بيضاء إلى صفراء كريمية اللون وترتبط بشكل فضفاض بالنباتات الأولية.

2. 2،4-معالجة ثنائي بروموفينول

  1. قم بإذابة 1 ميكروغرام من 2،4-ثنائي بروموفينول في 10 مل من وسط MS السائل المعقم (التركيز النهائي ل 2،4-ثنائي بروموفينول هو 100 جزء في البليون ، درجة الحموضة 5.6-7.0).
  2. أضف 3 جم من الكالس الجزري الطازج (الخطوة 1.8) إلى قوارير زجاجية تحتوي على محلول 2،4-ثنائي بروموفينول المحضر (من الخطوة 2.1) في ظل ظروف معقمة. اعتبر هذا هو العلاج 2،4-ثنائي بروموفينول.
    ملاحظة: تم تعقيم القوارير الزجاجية وإغلاقها باستخدام فيلم البارافين.
  3. أدرج وسيطا ضابطا يحتوي على محلول 2،4-ثنائي برومو فينول فقط (محضر في الخطوة 2-1) لتقييم التحلل اللاأحيائي لثنائي برومو فينول 2،4.
  4. قم بتضمين عنصر تحكم فارغ يحتوي على الكالس الجزري فقط (لا يوجد محلول 2،4-ثنائي بروموفينول) للتحقق من أي تلوث محتمل.
    1. قم بإعداد عنصر التحكم الفارغ الذي يحتوي على الجزر عن طريق إضافة 3 جم من الكالس الجزري الطازج الذي تم جمعه فقط إلى 10 مل من وسط MS المعقم.
  5. احتضان المعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط المتوسطة والفارغة عند 130 دورة في الدقيقة و 26 درجة مئوية في الظلام في حاضنة لمدة 120 ساعة.
  6. قم بإزالة القوارير الزجاجية من الحاضنة لجمع العينات من المعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط بعد 120 ساعة من الحضانة.
    ملاحظة: تم تحضير جميع العينات في ثلاث نسخ.

3. إعداد عينة

  1. افصل الكالس بعناية عن وسط MS عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات الألياف الزجاجية (0.45 ميكرومتر) لمعالجة 2،4-ثنائي بروموفينول والضوابط. جمع الكالس بعد الغسيل بالماء عالي النقاء ثلاث مرات.
  2. قم بتجميد الكالس الذي تم جمعه بالنيتروجين السائل ، ثم قم بتجانس الكالس الذي تم جمعه (0.2 جم) باستخدام مطحنة أنسجة عالية الإنتاجية عند 70 هرتز لمدة 3 دقائق.
  3. قم برفع الكالس المتجانس عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 25 مجم / لتر بديل 4-n-NP-d4 مع حقنة زجاجية مجهرية ثم دوامة لمدة 1 دقيقة.
  4. قم بتنشيط العينات ب 5 مل من الميثانول / الماء (1: 1 ، v / v) في جهاز الموجات فوق الصوتية (150 واط ، 40 كيلو هرتز) مملوء بالماء المثلج لمدة 30 دقيقة ، لاستخراج 2،4-ثنائي بروموفينول والمستقلبات.
  5. أجهزة الطرد المركزي المعلقات عند 8000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وجمع المواد الطافية عن طريق الماصة.
    1. كرر عمليات الاستخراج لعينة الكالس ثلاث مرات وادمج المستخلصات.
  6. مرر المستخلصات من خلال خراطيش استخراج الطور الصلب المتوازن المحب للماء (HLB SPE) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
    ملاحظة: تمت معالجة خراطيش HLB SPE بالتتابع باستخدام 6 مل من الميثانول و 6 مل من الماء لإزالة أي تداخلات.
  7. تخلص من المواد المراد تحليلها عن طريق تمرير 6 مل من الميثانول عبر خراطيش HLB SPE. بعد ذلك ، ركز المحلول الذي تم الحصول عليه إلى 1 مل تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين للتحليل الفعال.
  8. حقن 10 ميكرولتر من المزيلات الناتجة في UPLC-Q-TOF-MS لتحليل 2،4-ثنائي برومو فينول ومستقلباتها15.
    1. قم بتصفية جميع العينات بغشاء نايلون 0.22 ميكرومتر قبل التحليل الآلي.

4. التحليل الآلي

ملاحظة: أجريت تحليلات 2،4-ثنائي برومو فينول ومستقلباتها على كروماتوجراف سائل فائق الأداء (UPLC) بالاشتراك مع مطياف الكتلة micrOTOF-QII المجهز بالتأين بالرش الكهربائي (ESI) ، يعمل في وضع الأيونات الموجبة والسالبة.

  1. افتح باب سخان العمود وقم بتثبيت عمود UPLC عن طريق توصيل مدخل العمود بصمام الحقن ومخرج العمود بمدخل مطياف الكتلة.
    ملاحظة: استخدم عمود C18 (50 مم × 2.1 مم؛ حجم جسيمات 1.7 ميكرومتر) لفصل المواد المراد تحليلها عند 40 درجة مئوية.
  2. قم بتوصيل المرحلة المتنقلة A (الماء عالي النقاء) والمرحلة المتنقلة B (الميثانول من الدرجة اللونية) بالجهاز عن طريق إدخال نهاية أنابيب المذيبات A و B في زجاجات المذيبات المقابلة ، على التوالي.
    1. قم بتصفية جميع المراحل المتنقلة (500 مل لكل منها) من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وصوتنة لأكثر من 30 دقيقة.
  3. في نافذة البرنامج ، انقر فوق أداة | طريقة المدخل لتحرير شروط الكروماتوجرام السائل.
    1. اضبط شروط التدرج للمرحلة المتنقلة B على النحو التالي: معدل تدفق قدره 1.0 مل / دقيقة ؛ 0-0.5 دقيقة ، 5٪ ؛ 0.5-3.5 دقيقة ، 5٪ إلى 50٪ ؛ 3.5-6.5 دقيقة ، 50٪ إلى 100٪ ؛ 6.5-7 دقائق ، 100٪ ؛ 7-10 دقائق ، 100٪ إلى 5٪.
    2. اضبط معدل حقن العينات في UPLC-Q-TOF-MS على أنه 0.2 مل / دقيقة.
      ملاحظة: تتم برمجة حقن العينة باستخدام جهاز أخذ عينات أوتوماتيكي بالكامل.
  4. في نافذة البرنامج ، حدد طريقة MS ثم قم بإعداد معلمات Q-TOF-MS: معدل تدفق غاز التجفيف (N2) 8 لتر / دقيقة ، درجة حرارة 300-350 درجة مئوية ؛ جهد شعري يبلغ 4500 فولت ؛ طاقة تصادم من 5-45 فولت ؛ ومجموعة مسح كاملة من 40-800 دا.
  5. ضع قوارير العينة في المواقع المقابلة لصواني العينات حسب الرقم التسلسلي، وأعد إدخال صواني العينات في حجرة العينة.
    ملاحظة: حافظ على صواني العينات مسطحة وتأكد من إغلاق باب حجرة العينة.
  6. في نافذة البرنامج، حدد ملف | جديد لإنشاء قاعدة بيانات. قم بتسمية قاعدة البيانات.
  7. قم بتحميل نموذج البرنامج الذي تم إنشاؤه أعلاه عن طريق تحديد MS File | ملف مدخل | حجم الحقن.
  8. احفظ قاعدة البيانات في المجلد النموذجي للمشروع بالنقر فوق ملف | حفظ.
  9. حدد تشغيل | ابدأ في النافذة الرئيسية للبرنامج، ثم حدد الحصول على بيانات نموذجية وانقر فوق موافق في نافذة بدء تشغيل قائمة العينة لجمع البيانات.
    ملاحظة: يمكن عرض مخطط كروماتوجرام في الوقت الفعلي بالنقر فوق كروماتوجرام | التحديث في الوقت الفعلي أثناء عملية الحصول على البيانات.
  10. قم بمعالجة البيانات في البرنامج عن طريق تحديد صف البيانات الهدف والنقر فوق نافذة Chromatogram لعرض مخطط كروماتوجرام مسح MS.
  11. في نافذة Chromatogram ، انقر فوق العرض | تيك | ScanWaveDS | إضافة أثر | موافق للحصول على ابنة مسح أطياف الكتلة.
  12. حدد المستقلبات من خلال مقارنة الكروماتوجرامات الخاصة بمعالجة 2،4-ثنائي برومو فينول والشواهد.
  13. توضيح المرشحين الأيض من خلال وقت الاحتفاظ والكتلة وأنماط التجزئة16,17.
    ملاحظة: يجب أن يكون خطأ دقة الكتلة بين قيم m/z التجريبية للأيونات الأم للمرشحين الأيضيين إلى النظرية المقابلة لها m/z أقل من 10 جزء في المليون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 خطوات البروتوكول. باتباع البروتوكول ، قارنا الكروماتوجرام لمستخلص الكالس الجزري من معالجة 2،4-ثنائي برومو فينول بالشواهد ، ووجدنا ثماني قمم متميزة موجودة في معالجة 2،4-ثنائي برومو فينول ولكنها غائبة في الضوابط (الشكل 2). يشير هذا إلى أن ما مجموعه ثمانية مستقلبات من 2،4-ثنائي برومو فينول (M562 و M545 و M661 و M413 و M339 و M380 و M424 و M187) تم اكتشافها بنجاح في الكالس الجزري المعالج ب 2،4-ثنائي بروموفينول. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم العثور على قمة 2،4-ثنائي برومو فينول الأصل (وقت الاحتفاظ = 0.85 دقيقة) في مخطط كروماتوجرام المعالجة 2،4-ثنائي برومو فينول (الشكل 2)، مما يشير إلى أن 2،4-ثنائي برومو فينول تم استقلابه بسرعة في الكالس الجزري في ظل الظروف التجريبية.

يلخص الجدول 1 المعلومات الكروماتوغرافية والكتلية المستخدمة لتحديد مستقلبات 2،4-ثنائي برومو فينول في الكالس الجزري. أدى 2،4-ثنائي بروموفينول المحتضن في الكالس الجزري إلى تكوين المستقلبات عن طريق الاقتران المباشر مع الجلوكوز (M562 و M545 و M661 و M413) والأحماض الأمينية (M339 و M380 و M424). على سبيل المثال ، أنتج M413 شظايا عند m / z 250.8954 و 163.1485 ، والتي تتوافق مع ثنائي بوتيل الفثالات (DBP) والجلوكوز (C6H11O5). تم استقلاب M413 بشكل أكبر لتشكيل مستقلبات اقتران السكاريد M661 و M545 و M562 ، عن طريق إضافة البنتوز أو السداسي. تم التكهن بأن M339 و M380 و M424 هي 2،4-ثنائي بروموفينول ألانين ، 2،4-ثنائي بروموفينول أسيتيلالانين ، و 2،4-ثنائي بروموفينول حمض الأسيتيل سبارتيك ، حيث أن لديهم فقدان محايد مميز للأحماض الأمينية (C 3 H6NO2) ، والأسيتيلالانين (C 5 H 8 NO3) ، وحمض الأسيتيل سبارتيك (C6H8NO5) ، مما ينتج الشظايا المقابلة عندm / z 89.0932 ، 129.1140 و 173.1235 على التوالي15. تشير النتائج المقدمة إلى أنه يمكن استخدام مزارع الكالس النباتية كأداة فعالة وموثوقة لتوضيح استقلاب الزينوبيوتيك في المحاصيل.

Figure 1
الشكل 1: طريقة التخطيط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخططات كروماتوجرام لثنائي برومو فينول 2، 4 (الصورة المدرجة) ومستقلبات 2، 4-ثنائي برومو فينول. تم تكييف هذا الرقم بإذن من Sun et al.15. حقوق الطبع والنشر (2018) الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المستقلب RT (دقيقة) وضع ESI لاحظ
م / ي		 محسوب
م / ي		 الصيغة الأصلية شظايا (م / ض) مستوى الثقة
م562 0.7 -ح 562.201 562.201 ج18ح26ر2س10 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
170.9914(-Br) MS ، MS2
م545 1.6 -ح 545.151 545.1506 ج17ح22ر2س10 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
170.9914(-Br)
528.1433(-OH) MS ، MS2
م661 2.9 -ح 661.222 661.2228 ج21ح26ر2س14 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
410.3274 (-C15H23O13) MS ، MS2
م413 4.1 -ح 413.036 413.036 ج12ح14ر2س6 250.8954(-DBP) المستوى 1
163.1485(-C6H11O5)
207.8938 (250-CO2) المعيار الاصطناعي ، RT ، MS ،MS 2
م339 5.2 +H 339.994 339.9886 ج9 ح9فرع2رقم3 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
87.0773 (-C3H6NO2) MS ، MS2
م380 5.5 -ح 380.01 380.0094 ج 11 ح11فرع2رقم4 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
129.1140 (-C5H8NO3) MS ، MS2
م424 5.8 -ح 424.012 424.0189 ج12ح11فرع2رقم6 250.8954(-DBP) المستوى 2 ب
173.1235(-C6H8NO5) MS ، MS2
م187 6.1 -ح 187.995 187.9988 ج6ح5برو2 109.1027(-Br) المستوى 1
170.9914(-OH) معيار أصيل ، RT ، MS ،MS 2

الجدول 1: ملخص 2،4-ثنائي بروموفينول ومستقلباته المكتشفة في مستخلصات الكالس الجزري. تم تكييف هذا الجدول بإذن من Sun et al.15. حقوق الطبع والنشر (2018) الجمعية الكيميائية الأمريكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد التحول الحيوي للأجانب في النباتات بكفاءة. الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هي ثقافة الكالس النباتي. الجزء الأصعب هو تمايز وصيانة الكالس النباتي ، لأن الكالس النباتي يصاب بسهولة ويتطور إلى أنسجة نباتية. لذلك ، من المهم التأكد من تعقيم جميع المعدات المستخدمة ، وأن جميع العمليات تتم في ظل ظروف معقمة. يجب أن يتم تمايز وصيانة الكالس النباتي في الظلام لتجنب النمو الذاتي والتطور المفرط. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جرعة وأنواع الهرمونات النباتية المكملة في وسط MS أمر بالغ الأهمية لتفاضل الكالس النباتي ، والذي يجب أن يأخذ الأنواع النباتية في الاعتبار. تؤدي جرعة زائدة من الهرمونات النباتية إلى تطوير الكالس لنظام الأوعية الدموية ، لكن الهرمونات النباتية غير الكافية تحد من تمايز نبات الكالس18. يجب تحضير مخزون MS المتوسط والهرمونات النباتية طازجا. يوصى بشدة بتعقيم وسط MS قبل إدخال الهرمونات النباتية و hypocotyl العقيم.

تعتبر الأصباغ مثل الكلوروفيل في النباتات السليمة مشكلة عامة في قياسات LC-HRMS19,20. الكالس النبات مشتق من hypocotyl المعقم وهو شفاف بدون الكلوروفيل. هذا يعني أن زراعة الكالس النباتية يمكن أن تحسن تأثير المصفوفة للنبات السليم وتقدم تقنية تحضير عينة سهلة ولكنها فعالة دون خطوات إزالة الصباغ. تم تحقيق تحليل مستقلبات xenobiotics في الكالس النباتي باستخدام LC-HRMS بطريقة غير مستهدفة15. تسمح ثقافة الكالس النباتية جنبا إلى جنب مع التحليل غير المستهدف بالتحديد الفعال للتنميط واسع النطاق للمركبات الأيضية. هذه المزايا تجعل الطريقة مثالية للفهم الميكانيكي لعملية التمثيل الغذائي للأجانب في النباتات. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من القيود على البروتوكول. على سبيل المثال ، لا يمكن تطبيق البروتوكول إلا كمرجع للوضع الفعلي الذي يحدث في النباتات في الحقل ، بسبب الظروف البيئية المعقدة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن النسيج النباتي المختلف يظهر قدرات أيضية مختلفة ، فقد تختلف المستقلبات المحددة للأقوياء باختلاف نوع الكالس.

معرفة التحول الأيضي للمواد الكيميائية في النباتات أمر مهم لتنميتها وتطبيقها بشكل آمن. والطريقة المقترحة هنا فعالة وموثوقة لفحص المستقلبات المتولدة في النباتات، ويمكن أن تدعم تقييم المخاطر المرتبطة بالنظم الإيكولوجية وصحة الإنسان من خلال نقل السلسلة الغذائية أو المدخول الغذائي المباشر للمحاصيل. يمكن لهذا البروتوكول التحقيق في استمرار xenobiotics في النباتات والمساعدة في فحص الملوثات الناشئة. بالنظر إلى قدرتها الأيضية الكاملة ، مع تكاليف أقل وانخفاض الوقت والجهد ، فإن ثقافة الكالس النباتية هي أداة جيدة لمقارنة السلوكيات الأيضية للعديد من المركبات وبناء قاعدة بيانات للتنبؤ بالمستقلبات المحتملة لل xenobiotics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21976160) ومشروع أبحاث تطبيق تكنولوجيا الرفاهية العامة بمقاطعة تشجيانغ (LGF21B070006).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
  2. Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
  3. Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
  4. Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
  5. Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
  6. Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
  7. Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
  8. Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
  9. Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
  10. Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
  11. Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
  12. Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
  13. Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
  14. de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
  15. Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
  16. Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
  17. Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
  18. Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
  19. Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
  20. Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).

Tags

العلوم البيئية، العدد 192،
توضيح استقلاب 2،4-ثنائي بروموفينول في النباتات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou,… More

Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter