Summary
本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ の自発運動を評価し、高解像度ビデオ録画に基づいて各フレームのピクセルをセグメント化し、速度、距離などのパラメータを計算するプラグインと互換性があります。
Abstract
ショウジョウバエは 、高度な遺伝子操作技術が豊富で、多様な行動特徴があるため、さまざまな疾患を研究するための理想的なモデル生物です。動物モデルにおける行動不全の特定は、例えば、患者が運動機能の障害を経験することが多い神経変性疾患において、疾患の重症度の重要な尺度である。しかし、薬物治療やトランスジェニック個体など、ハエモデルの運動障害を追跡および評価するためのさまざまなシステムが利用できるため、複数の角度から正確に評価するための経済的でユーザーフレンドリーなシステムはまだ不足しています。ここでは、フィジーの画像処理プログラムと互換性のある AnimalTracker アプリケーションプログラミングインターフェース(API)に基づく手法を開発し、記録されたビデオから成虫と幼虫の両方の個体の移動活動を体系的に評価し、追跡行動の分析を可能にします。この方法は、行動を記録および分析するために高解像度カメラとコンピューター周辺機器の統合のみを必要とするため、トランスジェニックまたは環境行動障害のあるハエモデルをスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。薬理学的に処理されたハエを用いた行動試験の例を挙げて、成虫のハエと幼虫の両方の行動変化を再現性の高い方法で検出する方法を示します。
Introduction
ショウジョウバエメラノガスターは、遺伝子改変1、薬物治療2、老化3によって作成された神経疾患モデルにおける細胞および分子機能を調べるための優れたモデル生物を提供します。ヒトとショウジョウバエの間の生物学的経路、物理的特性、および疾患関連ホモログ遺伝子の高い保存により、ショウジョウバエは分子レベルから行動レベル4までの理想的な模倣になります。多くの疾患モデルにおいて、行動不全は重要な指標であり、さまざまなヒトニューロパシーに有用なモデルを提供します5,6。ショウジョウバエは現在、複数のヒト疾患、神経発達、およびパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の研究に使用されています7,8。疾患モデルの運動能力を検出することは、病原性の進行を理解するために重要であり、疾患プロセスの根底にある分子メカニズムとの表現型の相関関係を提供する可能性があります。
最近、市販のソフトウェアツールと費用対効果の高いプログラムが、グループ化されたハエ9,10でのハイスループットテストやリアルタイムでの移動の測定11,12など、ショウジョウバエの自発運動検出戦略のために開発されました。そのような従来のアプローチの1つは、クライミングアッセイとも呼ばれる迅速なインタラクティブネガティブジオタキシス(RING)であり、同じ性別と年齢の大規模なハエの個体群を封じ込めることを可能にする複数のチャネルを含み、データ収集中の変動を減らします9,13。自発運動挙動を分析するための別の事前試験方法は、TriKinetics ショウジョウバエ活動モニタ(DAM)であり、これは、薄いガラス管14内のハエ活動運動を検出するために複数のビームを使用する装置である。この装置は、位置を連続的に記録し、これは、より長い期間にわたるハエの活動および概日リズムを研究するためにビーム交差を計算することによって自動移動を表す15。これらの方法は、ショウジョウバエの行動欠陥を分析して行動移動の変化を決定する際に広く使用されてきましたが、常に特別な試験装置または複雑な分析プロセスが必要であり、限られた単純な装置で一部のモデルでは適用が制限されています。FlyGrAM11やショウジョウバエアイランドアッセイ10など、成虫のショウジョウバエをテストするための動物追跡グループベースの戦略は、事前定義された領域で社会的募集と個々の追跡を実装します。それにもかかわらず、反抗された地域での社会的個人的制限は、ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の識別に悪影響を与える可能性があります。TRex16、MARGO 12、FlyPi17などのオープンソースのマテリアルベースの方法には緊急事態がありますが、行動テストで柔軟に使用することで、ハエを迅速に追跡できます。これらのテストアプローチは、精巧な実験装置の設置、特別なソフトウェア要件、またはプロのコンピューター言語に関連しています。幼虫の場合、単位時間18あたりのグリッド境界線の数を横切って移動した総距離を測定するか、または個人の体壁収縮を手動で大まかに数えること19は、自発運動能力を評価するための主要な方法です。機器や装置、分析方法の精度が不足しているため、幼虫の行動移動が検出を逃れ、行動運動、特に微細な動きを正確に評価することが困難になる可能性があります15。
本開発手法は,画像処理プログラム「フィジー(ImageJ)」と互換性のあるアプリケーションプログラミングインターフェース(API) AnimalTracker を利用し,高精細(HD)映像からハエの追跡行動を解析し,成虫と仔魚の運動活動を系統的に評価する手法である.フィジーはオープンソースソフトウェアです ImageJディストリビューション 堅牢なソフトウェアライブラリと多数のスクリプト言語を組み合わせることができるため、画像処理アルゴリズムのラピッドプロトタイピングが可能になり、画像分析機能で生物学者の間で人気があります20。現在のアプローチでは、フィジーの AnimalTracker APIへの統合を利用して、パーソナライズされたアルゴリズム挿入を備えた独自の ショウジョウバエ 行動アッセイを開発し、自発運動行動の堅牢な分析機能をサポートするための詳細なドキュメントとチュートリアルの有用なステップを提供します(図1)。ハエの衝突または重なりによって引き起こされる画像内の客観的識別の複雑さを回避するために、各アリーナは1つのハエのみをホストするように制限されています。アプローチの追跡精度を評価した上で、パーキンソン病の動物モデルに一般的に使用されている毒性薬物ロテノンを投与された ショウジョウバエ の運動運動を追跡および定量化するために実施され、最終的に薬物治療における移動障害を発見した21。オープンソースでフリーなソフトウェアを採用したこの方法論は、高コストの計測を必要とせず、 ショウジョウバエ の行動運動を正確かつ再現性よく解析することができます。
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Protocol
W1118 成虫のハエと3齢幼虫を本研究に用いた。
1. 実験準備
注: ショウジョウバエ の移動追跡のためのオープンフィールドアリーナは、無色無臭のシリカゲルで作られています。
- 試薬Aと試薬Bを、シリカキットの製造元の説明書に従って1:10の比率で混合します( 材料表を参照)。色が白に変わるまで攪拌することにより、重炭酸ナトリウムが混合物に添加されていることを確認します。混合物をきれいなペトリ皿に移し、40°Cのオーブンに入れて48時間乾燥させます。
- HDカメラ( 材料表を参照)を三脚にセットし、カメラのレンズがシリカアリーナの表面に垂直になるように調整します。カメラの焦点距離と絞りを調整し、カメラがシリカの表面に焦点を合わせ、ディスプレイが適切に照らされていることを確認します。実験のセットアップを 図1に示します。
- フライをオープンフィールドアリーナに移して、少なくとも61秒の連続ビデオを録画します。
注:幼虫の鈍い性質を考慮すると、10分以上のビデオ録画時間をお勧めします。- フィジーでビデオを開き、進行状況バーを最初のフレームにドラッグして、暗黙のうちに承認します。「フリーハンド選択」ツールを使用してフライの全身を選択します(図2B、C)。
- 画像をクリックして>明るさとコントラスト>調整し、選択した領域のグレー値が広い背景に近づくまでホワイトバランスを調整します(図2D-F)。
注:最初のフレームの背景の均質化により、ソフトウェアはオブジェクトなしで背景を区別し、ハエが存在する場合にコントラストを作成できるため、ソフトウェアがそれを追跡できるようになります。
- 実験全体は、25°C、相対湿度60%に設定されたテスト環境で、静かで明るい光にさらされない場所で実行してください。
2.ビデオ録画と前処理
- を使用して短時間麻酔した後95%二酸化炭素(CO2)、オープンフィールドのアリーナにハエを移し、カメラアプリケーションの録画ボタンを押してビデオ録画を開始します。
注意: 移動に対する麻酔薬の影響を最小限に抑えるために、ビデオ録画を開始する前に、ハエが10分間回復するのを待ちます。冷やして冷やす麻酔もおすすめです。- ハエが麻酔から回復したら、ハエが入ったアリーナディッシュをカメラの下に置き、プレートを左右にすばやく振って、記録の開始時にハエが動いていることを確認します。
- 録画が完了したら、 停止 ボタンを押してビデオ録画を終了します。
注意: ビデオ録画時間が目的地の追跡時間をわずかに超えていることを確認してください。また、実験効率を向上させ、複数のハエを自発的に追跡することができる。これは、高品質のビデオトリミングを有効にするためのカメラの解像度に依存します。 - 録画したビデオをMJPEGエンコーディングのAVI形式に変換して、フィジーを使用して開いて分析できるようにします。一方、ビデオのフレーム/秒(fps)レートを、成虫のハエの場合は15 fps、幼虫の場合は12 fpsに設定します。
3.ビデオ分析
- フィジーでビデオを開くときに、ポップアップウィンドウの2つのオプションである「仮想スタックを使用する」と「グレースケールに変換」で変換されたビデオを開きます(図2A)。
- 上記のように、空白の最初のフレームを作成します。
- AnimalTrackerプラグインの「アクティブな画像の設定」ツールを使用して処理ウィンドウを取得し、「楕円形」ツールを使用して元のビデオウィンドウのアリーナを一周する追跡領域を作成します(図3A)。
- 処理ウィンドウの最初の空白フレームのフィルター(図3A,3)と2つのフィルターのパラメーター(図4A-G)を設定します。次に、元のビデオウィンドウの次のフレームを選択し、処理ウィンドウのフィルタリングされたサーフェスを選択します(図5A-C)。
注:フィルタリングステップは、画像ノイズを減らしたり、背景を削除したりするのに役立つため、フレームの二値化で前景を背景から分離するのが簡単になります。 - フィルタリングされた処理ウィンドウを選択したら、「しきい値の設定」ツールを使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルで追跡されたフライを回転させます(図3A、4、図5D-E、および図6A)。
- 「ブロブ検出器の設定」を使用して、処理ウィンドウで覆われた赤いプロファイルでコンピューターにハエを認識させます(図3A、5および図6B)。
- フレーム901を、ビデオの録画時間とfpsによって計算された大人のハエの最後のフレームとして設定します(図3A、6、図6C)。
注:幼虫を使用した次の実験は10分間追跡されているため、フレーム7200が最後のフレームとして設定されています。 - "show blobs" ツールを使用して、元のビデオ ウィンドウにトラッキング四角形を表示します (図 3A、7 および図 6D、E)。次に、追跡を開始し、監視が完了したら追跡ファイルをエクスポートします(図3A、8、9および図7A、B)。
4.追跡ファイル分析
- 動物トラッカー>トラッキングアナライザープラグインを使用して、トラックファイルとゾーンファイルをロードします(図8A)。
- ゾーン設定を使用して目的のインデックスを選択し、パラメータ設定を変更します(図8)。フレームレートを使用してフレーム間隔の時間を計算します。
メモ: この状態では、フレームレートは 15 fps で、フレーム間隔は約 0.067 秒で、これはデフォルト設定です(図 8D)。 - トラッキングアナライザーで分析した後、スプレッドシートソフトウェアとGraphPad Prismを使用して定量分析チャートを作成します(図9)。
5.フレームごとの分析
- フレーム間隔ごとに速度分析を実行します。より詳細な調査が必要な場合は、フィジーなしでトラックファイルを分析してください。
- トラック ファイルを開き、すべての座標を Microsoft Office Excel にコピーし、スペース キーを使用してセルを分割します。
注:たとえば、ファイルが「C」列と「D」列に分割されると、フレーム間隔あたりの ショウジョウバエ の速度は、「E」列に表示される式 SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2)によって計算されます(図10A)。列「E」のデータは、フライが2つのフレーム間を移動したピクセル数を示し、最初のフレームは考慮されません。すべての計算結果を選択し、折れ線グラフを挿入して、フレーム間隔ごとの直感的なフライ移動速度を示し、折れ線グラフにピークを示します(図10B)。
- トラック ファイルを開き、すべての座標を Microsoft Office Excel にコピーし、スペース キーを使用してセルを分割します。
- フレーム間隔ごとの不動時間を計算します。ファイルを「C」列と「D」列に分割した後、「E」列に表示される式IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)<20, 0, 1)を使用して、フレーム間隔ごとのショウジョウバエの不動状態を計算します。(図10C)。
注: 速度解析とは異なり、最初のフレームの結果が定義されています。20ピクセル未満しか移動しないハエは不動と見なされ、列「E」に「0」として記録されました。- すべての計算結果を選択し、縦棒グラフを挿入して、縦棒グラフ全体の余白で不動時間を視覚的に示します (図 10D)。
- 方向の角度が変わることを確認します。
注: 方向変化角度解析は、ハエの方向選択を表します。ファイルが "C" 列と "D" 列に分割されると、方向変化の角度は式 ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI()) によって計算され、"E" 列に表示されます (図 10E)。計算結果は、3つの座標間の角度を示します。- すべての計算結果を選択し、ハエの動きの方向変化の角度を示す散布図を挿入します(図10F)。
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Representative Results
本研究では、ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫の自発運動障害を調べ、薬物溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)を与えられた対照ハエの運動活動と比較しました。ショウジョウバエにおけるロテノンによる治療は、脳22においてドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こし、重大な自発運動障害23を引き起こすことが示されている。図11および図12に示すように、ロテノンで処理された成虫のハエおよび3齢幼虫は、DMSOを与えられた対照のハエと比較して有意な自発運動障害を有する。図11および図12B-Eは、ロテノンの有無にかかわらず処理されたハエ間の移動パラメータの距離、速度、および不動時間の相対的な変化を示しています。図11および図12F−Kは、成虫および幼虫におけるロテノン処理の有無にかかわらず、速度、不動時間、および方向選択のパラメータの代表的な分析を示す。フィジーのソフトウェアを使用して、薬物摂食グループの成虫のハエ(図11)と3齢幼虫(図12)での距離、不動時間、および速度のパラメーターの定量的分析は、ロテノンによる治療を使用して、神経変性状態を含むヒト疾患の自発運動障害を調査し、ヒトおよび哺乳類で観察された行動特性のいくつかを再現できることをさらに検証します。
図1: ショウジョウバエ の移動追跡解析のための装置のセットアップと実験手順を概説したフローチャート。 自発運動追跡アリーナは、コンピューターに組み込まれ、コンピューターによって制御されるオーバーヘッドHDカメラで画像化されます。 ショウジョウバエ の移動を解析する手順は、ビデオ録画、動きの追跡、追跡ファイル分析、データ処理、およびパラメトリック分析で構成されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:最初のフレームの背景の均質化。(A) 変換されたビデオを開くときに[グレースケールに変換]オプションをチェックして、ビデオをグレースケールに変換し、色の干渉を回避します。 (B) 赤いボックスに表示されている「フリーハンド選択」ツールを使用して ショウジョウバエ の輪郭を描きます。 (C) 分析の選択として、黄色の線を使用してハエの輪郭を描きました。黄色の線をハエの輪郭に近づけると、ハエが占めていない領域を選択する可能性が低くなります。スケールバー = 1 cm。 (D) 黄色で囲んだ領域が背景と同じグレースケールに変わるまで、最初のフレームの明るさとコントラストを調整します。 (E) 「スタック」ウィンドウの「いいえ」をクリックして、すべてのフレームではなく、最初のフレームの明るさとコントラストの調整を完了します。 (F) 最終的に、最初のフレームが調整され、均一で傷のない背景が作成されます。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:追跡ウィンドウと追跡ゾーンの設定。(A)動物追跡ウィンドウでマークされた順序でトラッカープラグインをクリックして、追跡分析を完了します。(B)図A,1でアクティブな画像を設定した後、現在のフレームのみを表示する処理ウィンドウが表示されます。プライマリビデオウィンドウと処理ウィンドウは明確に区別され、さまざまな状況で使用されます。現在のフレームを変更するには、変更がプライマリビデオウィンドウで実行されていることを確認してください。変更は両方のウィンドウに表示されます。スケールバー= 1 cm。 (C)コンピューター認識用の「楕円形」ツールを使用して、アリーナを一周する追跡領域を作成します。トラッキングゾーンの選択は、処理ウィンドウではなく、開いているビデオウィンドウの丸で囲まれたアリーナにある必要があります。(D)外光の乱れを最小限に抑えるために、アリーナに最大限に適合するように黄色の線で追跡エリアの輪郭を描きます。スケールバー= 1 cm。 (E)追跡エリアに関心領域(ROI)を設定するには、「ゾーンデザイナー」ウィンドウに表示されている番号でマークされた順序に従ってボタンをクリックします。このステップでは、選択したビデオウィンドウが開いた後に操作全体を完了する必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:最初のフレームのフィルター設定。(A) トラッキングエリアのROIの設定が完了すると、開いたビデオウィンドウと処理ウィンドウの両方でアリーナを囲む黄色の線が緑色に変わります。スケールバー= 1 cm。 (B) フィルターの目的を追加すると、黒い背景が設定され、処理ウィンドウの最初のフレームでターゲットオブジェクトがより明確になります。操作全体は、開いているビデオ ウィンドウではなく、処理ウィンドウ内で実行する必要があります。 (C,D) 「フィルター設定」ウィンドウに「背景減算器」フィルターと「ガウスぼかし」フィルターを追加すると、処理ウィンドウの最初のフレームが黒くなります。フィルター設定プロセス全体は、最初のフレームで完了する必要があります。 (E) パラメータは、「背景減算器」ウィンドウで数字と赤い長方形でマークされたボタンをクリックして段階的に設定されます。「画像の設定」ステップは、処理ウィンドウを選択した後に操作する必要があります。 (F) スケールバー= 1 cm。「E4」の「フィルターを表示」ボタンをクリックし、操作せずにウィンドウを直接閉じると、「中央値画像」ウィンドウが表示されます。 (G) ガウスぼかしのパラメータは、デフォルトのシグマ値2.0で設定されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2番目のフレームのしきい値設定。(A)下のプログレスバーをクリックして、ビデオウィンドウを2番目のフレームに進みます。ハエは画面の中央で再発し、フィジーによって識別されます。スケールバー = 1 cm。 (B,C) フィルタリングの前後に処理ウィンドウを表示します。(B)赤い長方形でマークされたモードを選択して、フィルタリングされた処理ウィンドウを表示します。(C)「フィルタリング」モードが選択された後の赤い長方形の処理ウィンドウの例。スケールバー= 1 cm。 (D)図3A,4の「しきい値の設定」ツールを選択した後、「しきい値」ウィンドウに表示されるデフォルトのしきい値方法「グレースケールしきい値」を選択してしきい値を設定します。(E)トラッキングフライが表示され、赤いプロファイルで覆われるまで、中央のプログレスバーボックスをスライドさせてパラメータを調整します。下の赤い長方形にボックス化されたパラメータのデフォルト設定を変更することはお勧めしません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ブロブ検出器、最後のフレーム設定、および動物追跡の選択。(A)図5Eに記載されているしきい値に達すると、処理ウィンドウは、2番目のフレームのフライに続いて、かなり大きな赤いプロファイルを表示します。フライを覆う赤いプロファイルをフライを追跡するように適合させます。スケールバー= 1 cm。 (B)デフォルトのブロブ検出器メソッドである「ベースブロブ検出器」を選択して、追跡のターゲットとして赤いプロファイルで覆われたフライを定義します。(C)図3A,6の「最後のフレームを設定」ツールを使用して、フレーム901を最後のフレームとして設定します。合計フレーム数は、「フレーム数=fps*記録時間」という式で計算されます。(D)トラッキングは、開いたビデオウィンドウ(左側のパネルセクション)にブロブを表示した後にボックス化された黄色の長方形で飛行します。拡大された左パネルでは、ショウジョウバエが赤で取り付けられています(右パネルセクション)。スケールバー= 1 cm。 (E)「D」(パネル上部セクション)で赤い長方形をクリックして選択した後、赤い長方形がボックス化されたトラッキングフライ。上部パネルの拡大では、ショウジョウバエが赤で取り付けられています(下部パネルセクション)。トラッキングフライの周りの黄色の長方形の選択が、開いたビデオウィンドウで完了していることを確認します。開いたビデオウィンドウで選択を完了すると、フライはすべてのフレームでフィジーによって識別されます。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: トレースの追跡結果。 追跡トレースは、開いたビデオ ウィンドウ ( A ) と処理ウィンドウ (B) に別々に表示されます。追跡トレース プロファイルを取得するには、元のビデオ ウィンドウの進行状況バーをクリックし、進行状況バーをスライドしてトレースの連続性を確認します。追跡トレースは、ハエのクロール距離を直感的に表示します。スケールバー= 1 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:アニマルトラッカープラグインを使用した追跡ファイル分析。(A)トラッキングアナライザーは、トラッキングファイルの詳細な分析を容易にします。赤い長方形でマークされた各ステップは、番号で示されます。(B) A,4で「ゾーン設定」パラメータを設定します。時間、距離、不動時間、速度ベクトルの 4 つのパラメーターが赤い四角形に表示されます。パラメータは、目的の結果に基づいて選択されます。(C-G)A,5の「パラメータの設定」ウィンドウで設定パラメータを個別に設定します。(C)「設定パラメータ設定」ウィンドウには、それぞれ「時間設定」、「不動時間設定」、「距離設定」、「速度ベクトル設定」ウィンドウを示す4つの調整可能なパラメータが示されています。パラメーター設定の既定値を変更することはお勧めしません。ただし、「フレーム間隔」については、ビデオのfpsが変更されたときに、「フレーム間隔= 1 / fps」という式を使用してパラメータを計算する必要があります。また、ハエの追跡で記録された画素を有形値に相関させることで、実際の距離や速度を把握するために既知のスケールを採用することができる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:トラッキングファイル分析の結果を表示します。(a)図8A、6の設定。データを表示するモードには、「ゾーンでグループ化」と「パラメータでグループ化」の2つのモードを使用できます。(B) トラッキングファイル解析の結果は、「A,6.1」に「ゾーン別にグループ化」して表示されます。(C-F)トラッキングファイル解析の結果は、A,6.2では「パラメータ別にグループ化」され、「不動時間」(C)、「速度ベクトル」(D)、「時間」(E)、「距離」(F)を別々に示しています。不動の時間と距離の結果は、「s」と「ピクセル」として定量化されます。速度ベクトルの単位は「ピクセル/秒」と定義し、「長さ」という注釈を付けて出力する必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:fpsあたりの速度に関するデータ分析の結果。(A、 C、および E) エクスポート データには、水平 (列 "C") と垂直 (列 "D") パーティションのピクセルの座標、および 2 フレーム間隔 (それぞれ A、 C、および E の列 " E ") 間のピクセルの移動、不動、および方向変更角度が含まれ、コンテキストで説明されている式によって自動的に計算されます。フィジーからエクスポートされた結果はテキストドキュメントであるため、Microsoft Office Excelでファイルを開き、データの間にスペースを追加して3つの列に分割することをお勧めします。 (B、 D、および F) 折れ線グラフには、ピクセルの移動データセットから計算された結果が表示されます(B)。グローバルピーク値は速度を表し、モーション検出機能を示します。縦棒グラフには、不動 (D) のデータ・セットから計算された結果が表示されます。縦棒グラフのスパースの程度は、ハエの運動能力の欠陥を示す不動性を表します。散布図には、方向転換角度(F)のデータセットから計算された結果が表示されます。散布図に示されている水しぶきの濃縮は、フライによって選択された方向を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:ロテノンの有無にかかわらず処理されたハエ間の移動の比較分析。(A)500μMのロテノン(対照用DMSO)を含む標準餌を与えられたW1118成虫のハエの追跡痕跡の代表的なグラフを示す。W1118ハエを採取し、500μMのロテノンまたはDMSO、25°C、湿度60%の標準食品からなる制御された環境に置きました。48時間後の各グループからの分析に6匹のハエを使用した。その結果、ロテノンを給餌した追跡ハエの移動距離は、対照に比べて有意に減少していることが明らかになった。結果は、ロテノンを与えられたハエの運動能力の欠陥を示しました。(B-E)フィジーを用いて,ロテノン処理の平均移動距離,無動時間,平均速度,最大速度の定量分析を行った。ロテノン処理の結果は、移動距離および平均速度の有意な減少、および不動時間の有意な増加を示した。(F-K)ロテノン(G,I,K)またはDMSO(F,H,J)で処理されたハエ間のフレームあたりのピクセル数(F,G)、フレームあたりの不動時間(H、I)、および方向変化角(J,K)の分析。移動速度に対するロテノンの影響を示す例のグラフは、ロテノン(G)を給餌したハエのフレーム間隔あたりの移動速度を表すピークが対照(F)のものと比較して少なく、自発運動障害(F、G)の重症度を示しています。フレームあたりの移動ピクセルの直観的不動列は低く、対照ハエ(H)と比較して、ロテノン給餌ハエ(I)の1分以内の動きが有意に少ないことを示しています。ロテノン給餌(K)動物とコントロール(J)動物における移動角度の変化のグラフ例は、ハエが選択した方向の変化を明らかにします。データは、1分間モニターした6匹のオス±バエのSEMの平均です。アスタリスクは、グループ間の有意差を示します(***p < 0.001;対応のないt検定、p = 0.05)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:ロテノンの有無にかかわらず処理された幼虫間の移動の比較分析。(A)ロテノンまたはDMSOを給餌したW1118齢幼虫の痕跡を追跡することにより、自発運動活性を比較した代表的な結果。簡単に説明すると、W1118齢幼虫を回収し、湿度60%の25°Cの環境で、10%スクロース、または500μMロテノンを含む10%スクロースで培養した。1群6匹の幼虫を解析に用いた。幼虫のゆっくりとした動きを考慮して、5分間にわたって記録されたデータが定量化および分析され、ロテノンが移動に及ぼす影響を評価しました。(B-E)フィジーで分析された2つのグループの平均距離、不動時間、平均速度、および最大速度を定量的に分析します。定量的結果は、ロテノンを与えられた幼虫の移動距離、平均速度、および最大速度は有意に減少し、ロテノンを与えられた幼虫では不動時間が有意に増加することを示しています。(F-K)成虫のハエと同様に、ロテノン(G,I,K)とロテノンなし(F,H,J)のフレームあたりのピクセル数,不動時間,方向角の変化を解析したところ,ロテノン投与の幼虫は移動速度が低く,不動時間が長く,方向が交互に変化した。その結果、ロテノンを給餌した幼虫を追跡する行動運動は、対照と比較して著しく損なわれていることが明らかになりました。結果は、ロテノンを与えられたハエの自発運動活性の欠陥を示しています。データは、5分間モニターした6匹の3日齢幼虫のSEM±平均です。アスタリスクは、グループ間の有意差を示します(*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; 対応のないt検定、p = 0.05)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ショウジョウバエの自発運動活動を定量化するための動物追跡ベースの方法論の比較。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
フィジーの画像処理プログラムと互換性のあるオープンソースの AnimalTracker APIに基づいて、研究者が成虫と個々の幼虫の両方のハエを追跡することにより、自発運動活動を体系的に評価できるようにする方法を設計しました。 AnimalTracke はJavaで書かれたツールであり、既存のデータベースや他のツールに簡単に統合して、アプリケーションで設計された動物の追跡行動の分析を容易にすることができます24。成虫と幼虫の運動活動を数値化するソフトウェア計算式によるフレームごとの分析により、移動速度、移動距離、不動、方向変化角度などのいくつかのパラメータを柔軟に分析できます。行動移動のさまざまな側面を表すこれらのパラメータは、時間の経過に伴う自発運動の変化を示すためにプロットできます。さらに、グラフィカルユーザーインターフェイスを作成し、その使用法に関する詳細なドキュメントを提供し、アプリケーションプログラミングインターフェイスを提供することにより、プログラミングの経験がない研究者やカスタム実験パラダイムを作成する経験豊富なユーザーがこの方法にアクセスできるようにすることを目指しています。
この方法が行動を正確に監視できることを確認するために、ロテノンで処理された成虫のハエと幼虫の自発運動試験、およびそれらの運動活動を薬物の溶媒を与えられた対照ハエの運動活動と比較することが実施されました。フィジーのソフトウェアは、そのプラグインを使用して、動きのビデオ録画の各フレームのピクセル座標を分析し、実験的なハエの速度、距離、およびその他のパラメータの計算を可能にします。我々は、ロテノン投与において経時的な移動距離の有意な減少を観察し(図11)、これは報告された結果23と一致している。一方、上昇する移動速度と選択された異常な方向は、ハエの行動不足の詳細を説明するのに役立つように、薬物給餌グループで観察されています。成虫のハエの自発運動の検出に成功したため、幼虫の移動性を評価しようとしました(図12)。対照と比較して、ロテノンを与えられた幼虫の追跡の結果は著しく損なわれ、薬物を与えられた成虫のハエの結果と同等であった。ロテノンを与えられた成虫と幼虫を用いた実験は、この方法が対照と比較して自発運動障害を引き起こしたハエの減少を正確に記録できることを示唆しています。本報告は、ショウジョウバエの自発運動能力などの行動欠陥の定量化・解析において、動物実験モデルや薬理学的研究に応用できることを実証した。
ビデオとトラッキングの分析で再現性のある結果が得られるようにするには、次のガイドラインに従うことをお勧めします。まず、ビデオフレームレートの選択については、録画したビデオを15フレーム/秒(fps)の形式に変換することをお勧めします。これにより、優れたモーショントラッキングを維持できるだけでなく、膨大な量のデータによって引き起こされるコンピューター分析の速度低下を回避できます。ビデオフレームレートを改善することで、モーション軌道分析がより詳細になります。第二に、式中のパラメータは、2フレームごとの静的運動を分析するときに、対応する実験スキームに合わせて調整することもできます。幼虫の運動モニタリングには、固化したシリカゲルがタイトで幼虫が入ることができないため、寒天ではなくシリカゲルを使用することが不可欠です。さらに、シリカゲルは透明であり、色物質を添加して最適な背景を生成することで染色することができ、画質を向上させる所望の光学効果を促進する。
動物追跡システムは、病因、神経科学、および行動遺伝学のコミュニティに包括的なソリューションを提供するために進歩しています。表1は、現在利用可能な複数の追跡プログラムの特徴の比較を提供する10、11、12、16、17、25、26。このアプローチは、非常に費用対効果が高く、習得が簡単で、高価なソフトウェアや機器を必要とせずに、自発運動の挙動を正確に測定できます。この方法は、他のショウジョウバエ様動物モデル、さらにはラットやマウスなどの大型動物にも便利に拡張できることは間違いありません。AnimalTracker APIの構造は、独立したImageJアプリケーションまたはプラグインを介して簡単に拡張でき、カスタム動作の調査と分析のための幅広い便利なツールキットを提供します24。それにもかかわらず、この研究には一定の制限があります。オープンフィールドのアリーナに1匹のフライを設置して画像記録を行い、ビデオトラッキングを個別に行うため、この方法は非効率的で時間がかかります。複数のアリーナを同時に録画する容量を拡大し、最大6つの個別のレコーディングを可能にしました。理論的には、より多くのショウジョウバエを同時に記録することが可能です。これは、アリーナのサイズとカメラの構成によって異なります。あるいは、ユーザーがグループ化されたショウジョウバエの記録に拡張したい場合は、限られた数の単一レコードと、ハエ間の衝突と重複を識別するのに十分な品質の構成を検討することをお勧めします。IDを視覚的に区別し、モデルを正確に追跡するために現在のシステムと統合できる手頃な価格で互換性のあるアプローチが理解されていないため、機械学習によるテスト効率の向上は調査では考慮されていません。
要約すると、ここで説明する方法は、時間の消費を削減し、幼虫および成虫期の ショウジョウバエ の移動を定量的に表示および分析するための実験技術を洗練するように設計された、無料のオープンソースソフトウェアに基づく効率的で簡単なアプローチを開発および検証します。この方法は、系統的な分析を通じて、移動中に動物の速度が時間とともにどのように変化するか、および方向選択の特性を理解するのに役立ちます。したがって、一般的に使用されるデジタルデバイスにオープンソースソフトウェアを組み込むことで、さまざまなハエモデルで自発運動をテストするための信頼できる方法が提供されます。これは、 ショウジョウバエ および他の動物における薬理学的治療およびトランスジェニック修飾に由来する神経変性疾患モデルの試験において、生理学的および病理学的自発運動出力を評価するのに役立つ可能性がある。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、東呉大学と中国国家科学財団(NSFC)(82171414)からの特別打ち上げ基金によって支援されました。Chunfeng Liu教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
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