Summary
O presente protocolo avalia a atividade locomotora de Drosophila rastreando e analisando o movimento de moscas em uma arena artesanal usando software de código aberto Fiji, compatível com plugins para segmentar pixels de cada quadro com base em gravação de vídeo de alta definição para calcular parâmetros de velocidade, distância, etc.
Abstract
Drosophila melanogaster é um organismo modelo ideal para o estudo de várias doenças devido à sua abundância de técnicas avançadas de manipulação genética e diversas características comportamentais. A identificação de deficiência comportamental em modelos animais é uma medida crucial da gravidade da doença, por exemplo, em doenças neurodegenerativas, onde os pacientes frequentemente experimentam prejuízos na função motora. No entanto, com a disponibilidade de vários sistemas para rastrear e avaliar déficits motores em modelos de moscas, como indivíduos tratados com drogas ou transgênicos, ainda falta um sistema econômico e fácil de usar para avaliação precisa de múltiplos ângulos. Desenvolve-se aqui um método baseado na interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, para avaliar sistematicamente as atividades de movimento de indivíduos adultos e larvais a partir de vídeos gravados, permitindo assim a análise de seu comportamento de rastreamento. Este método requer apenas uma câmera de alta definição e uma integração de hardware periférico de computador para gravar e analisar o comportamento, tornando-se uma abordagem acessível e eficaz para a triagem de modelos de moscas com deficiências comportamentais transgênicas ou ambientais. Exemplos de testes comportamentais usando moscas tratadas farmacologicamente são dados para mostrar como as técnicas podem detectar mudanças comportamentais em moscas adultas e larvas de maneira altamente repetível.
Introduction
Drosophila melanogaster fornece um excelente organismo modelo para investigar funções celulares e moleculares em modelos de doenças neuronais criadas por modificação gênica1, tratamento medicamentoso2 e senescência3. A alta conservação de vias biológicas, propriedades físicas e genes homólogos associados a doenças entre humanos e Drosophila torna a mosca-da-fruta uma mimética ideal desde o nível molecular até o comportamental4. Em muitos modelos de doenças, a deficiência comportamental é um índice importante, fornecendo um modelo útil para várias neuropatias humanas 5,6. Atualmente, a drosófila é utilizada no estudo de múltiplas doenças humanas, do neurodesenvolvimento e de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica7,8. A detecção da habilidade motora dos modelos de doença é crucial para a compreensão do progresso patogênico e pode fornecer uma correlação fenotípica com os mecanismos moleculares subjacentes ao processo da doença.
Recentemente, ferramentas de software disponíveis comercialmente e programas de baixo custo têm sido desenvolvidos para estratégias de detecção locomotora de Drosophila, tais como testes de alto rendimento em moscas agrupadas9,10 e mensuração da locomoção em tempo real11,12. Uma dessas abordagens convencionais é a geotáxi negativa interativa rápida (RING), também chamada de ensaio de escalada, que inclui múltiplos canais que permitem conter uma grande população de moscas com o mesmo sexo e idade, reduzindo a variação durante a coleta de dados 9,13. Outro método de pré-teste para análise do comportamento locomotor é o TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), um dispositivo que utiliza múltiplos feixes para detectar o movimento da atividade das moscas dentro de um tubo de vidro fino14. O aparelho registra a posição continuamente, o que representa a locomoção automatizada por meio do cálculo dos cruzamentos de feixes para estudar a atividade e o ritmo circadiano das moscas em um período maior de tempo15. Embora esses métodos tenham sido amplamente utilizados na análise de defeitos comportamentais em moscas-das-frutas para determinar mudanças na locomoção comportamental, eles sempre requerem equipamentos especiais de teste ou processos complexos de análise, e restringem sua aplicação em alguns modelos com um dispositivo limitado e simples. Estratégias baseadas em grupos de rastreamento animal para testar a Drosophila adulta, como o FlyGrAM11 e o ensaio da ilha de Drosophila 10, implementam o recrutamento social e o rastreamento individual em uma área predefinida. No entanto, a restrição social individual em áreas desafiadas pode ter um efeito negativo sobre as identificações nas imagens, causadas pela colisão ou sobreposição de moscas. Mesmo que alguns métodos baseados em materiais de código aberto, como TRex16, MARGO 12 e FlyPi17, tenham uma emergência, eles podem rastrear rapidamente as moscas com uso flexível em testes comportamentais. Essas abordagens de teste estão associadas a elaboradas instalações de aparelhos experimentais, requisitos especiais de software ou linguagens de computador profissionais. Para as larvas, a mensuração da distância total percorrida ao longo do número de linhas de borda da grade por unidade de tempo18, ou a contagem aproximada das contrações da parede corporal para os indivíduos manualmente19, são os métodos predominantes para avaliar sua capacidade locomotora. Devido à falta de precisão nos equipamentos ou dispositivos e métodos de análise, algumas locomoções comportamentais das larvas podem escapar à detecção, dificultando a avaliação precisa do movimento comportamental, especialmente o movimentofino15.
O presente método desenvolvido utiliza a interface de programação de aplicativos (API) AnimalTracker , compatível com o programa de processamento de imagens Fiji (ImageJ), para avaliar sistematicamente a atividade locomotora de moscas adultas e larvais, analisando seu comportamento de rastreamento a partir de vídeos de alta definição (HD). Fiji é um software de código aberto ImageJ distribuição que pode combinar bibliotecas de software robustas com inúmeras linguagens de script, resultando em prototipagem rápida de algoritmos de processamento de imagem, tornando-o popular entre os biólogos por suas capacidades de análise de imagem20. Na abordagem atual, a integração de Fiji na API AnimalTracker é explorada para desenvolver um ensaio comportamental exclusivo de Drosophila com inserção de algoritmo personalizado, e fornece uma etapa útil para documentação detalhada e tutoriais para apoiar capacidades analíticas robustas do comportamento locomotor (Figura 1). Para contornar a complicação de identificações objetivas nas imagens causadas pela colisão ou sobreposição de moscas, cada arena é restrita a hospedar apenas uma mosca. Ao avaliar a precisão do rastreamento da abordagem, implementou-se o rastreamento e quantificação dos movimentos locomotores de Drosophila que foram administrados com a droga tóxica rotenona, que geralmente é usada para modelos animais da doença de Parkinson, descobrindo o comprometimento da locomoção no tratamento medicamentoso21. Esta metodologia, que emprega software livre e de código aberto, não necessita de instrumentação de alto custo, podendo analisar de forma precisa e reprodutível a locomoção comportamental da Drosophila .
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Protocol
Foram utilizadas 1118 moscas adultas W 1118 e larvas de terceiro ínstar para o presente estudo.
1. Preparação experimental
NOTA: Uma arena de campo aberto para rastreamento de locomoção de Drosophila é feita com sílica gel incolor e inodora.
- Misture o reagente A e o reagente B na proporção de 1:10, de acordo com as instruções do fabricante para o kit de sílica (consulte a Tabela de Materiais). Certifique-se de que o bicarbonato de sódio é adicionado à mistura mexendo até que a cor mude para branco. Transfira a mistura para uma placa de Petri limpa e coloque-a em estufa a 40 °C para secagem por 48 h.
- Configure a câmera HD (consulte Tabela de Materiais) em um tripé, ajustando-a para que a lente da câmera fique perpendicular à superfície da arena de sílica. Ajustando a distância focal e as aberturas da câmera, certifique-se de que a câmera esteja focada na superfície da sílica e que a tela esteja adequadamente iluminada. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.
- Transfira uma mosca para a arena de campo aberto para gravar um vídeo contínuo de pelo menos 61 s.
NOTA: Considerando a natureza lenta das larvas, recomenda-se um tempo de gravação de vídeo de mais de 10 min.- Abra o vídeo com Fiji, arraste a barra de progresso para o quadro inicial e aprove tacitamente. Escolha todo o corpo da mosca usando a ferramenta "seleção à mão livre" (Figura 2B,C).
- Clique na imagem > ajustar > brilho e contraste para ajustar o balanço de branco até que o valor de cinza da área selecionada se aproxime do plano de fundo amplo (Figura 2D-F).
NOTA: A homogeneização de fundo do primeiro quadro permite que o software distinga o plano de fundo sem nenhum objeto e crie um contraste quando uma mosca está presente, permitindo assim que o software rastreiá-lo.
- Realizar todo o experimento em um ambiente de teste definido para 25 °C e 60% de umidade relativa, em uma área silenciosa e desprovida de exposição à luz brilhante.
2. Gravação e pré-processamento de vídeo
- Após um curto período de anestesia usando 95% de dióxido de carbono (CO2), transfira uma mosca para a arena aberta e pressione o botão de gravação no aplicativo da câmera para iniciar a gravação de vídeo.
NOTA: Para minimizar o efeito do anestésico na locomoção, permita que as moscas se recuperem por 10 min antes de iniciar a gravação do vídeo. A anestesia por resfriamento também é recomendada.- Assim que as moscas se recuperarem da anestesia, coloque o prato de arena contendo a mosca sob a câmera e agite a placa rapidamente de um lado para o outro para garantir que a mosca esteja em movimento quando a gravação começar.
- Após a conclusão da gravação, pressione o botão de parada para encerrar a gravação de vídeo.
NOTA: Certifique-se de que o tempo de gravação de vídeo exceda ligeiramente o tempo de rastreamento de destino por uma pequena margem. Além disso, para melhorar a eficiência experimental, é possível rastrear várias moscas espontaneamente. Isso depende da resolução da câmera para permitir um corte de vídeo de alta qualidade. - Converta os vídeos gravados em formato AVI com codificação MJPEG, para que possam ser abertos e analisados usando Fiji. Enquanto isso, defina a taxa de quadros por segundo (fps) do vídeo para 15 fps para moscas adultas e 12 fps para larvas.
3. Análise de vídeo
- Abra o vídeo que foi transformado com "use virtual stack" e "convert to grayscale", duas opções na janela pop-up ao abrir o vídeo com Fiji (Figura 2A).
- Faça um primeiro quadro em branco, como mencionado acima.
- Obtenha uma janela de processamento usando a ferramenta "set active image" do plugin AnimalTracker e crie uma área de rastreamento que circunda a arena na janela de vídeo original usando a ferramenta "oval" (Figura 3A).
- Defina os filtros (Figura 3A,3) e os parâmetros dos dois filtros (Figura 4A-G) para o primeiro quadro em branco na janela de processamento. Em seguida, selecione o próximo quadro na janela de vídeo original e escolha a superfície filtrada da janela de processamento (Figura 5A-C).
NOTA: A etapa de filtragem serve para diminuir o ruído da imagem e/ou remover o fundo, tornando assim mais simples separar o primeiro plano do plano de fundo na binarização dos quadros. - Uma vez selecionada uma janela de processamento filtrada, gire a mosca rastreada com um perfil vermelho coberto na janela de processamento usando a ferramenta "definir limite" (Figura 3A,4, Figura 5D-E e Figura 6A).
- Use o "set blob-detector" para permitir que o computador reconheça a mosca com um perfil vermelho coberto na janela de processamento (Figura 3A,5 e Figura 6B).
- Defina o quadro 901 como o último quadro para a mosca adulta, calculado pela duração da gravação do vídeo e fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
NOTA: O seguinte experimento com larvas foi rastreado por 10 min, portanto, o quadro 7200 é definido como o último quadro. - Use a ferramenta "show blobs" para apresentar um retângulo de rastreamento na janela de vídeo original (Figura 3A,7 e Figura 6D,E). Em seguida, inicie o rastreamento e exporte o arquivo de rastreamento após a conclusão do monitoramento (Figura 3A,8,9 e Figura 7A,B).
4. Análise de arquivos de rastreamento
- Carregue os arquivos de faixa e zona usando o plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
- Selecione o índice desejado usando as configurações de zona e altere as configurações de parâmetro (Figura 8). Calcule o tempo do intervalo de quadros usando a taxa de quadros.
Observação : nessa condição, a taxa de quadros é de 15 fps e o intervalo de quadros é de aproximadamente 0,067 s, que é a configuração padrão (Figura 8D). - Produzir os gráficos de análise quantitativa utilizando o software de planilhas eletrônicas e o GraphPad Prism após serem analisados no analisador de rastreamento (Figura 9).
5. Análise por quadro
- Execute a análise de velocidade por intervalo de quadros. Analise o arquivo de trilha sem Fiji se uma pesquisa mais detalhada for necessária.
- Abra o arquivo de controle, copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a chave de espaço.
Observação : por exemplo, uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", a velocidade de Drosophila por intervalo de quadro é calculada pela fórmula SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), que é mostrada na coluna "E" (Figura 10A). Os dados na coluna "E" indicam o número de pixels que a mosca moveu entre dois quadros, com o primeiro quadro não sendo considerado. Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de linhas para exibir uma velocidade de movimento de voo intuitiva por intervalo de quadros, com um pico no gráfico de linhas (Figura 10B).
- Abra o arquivo de controle, copie todas as coordenadas para o Microsoft Office Excel e divida as células usando a chave de espaço.
- Calcule o tempo de imobilidade por intervalo de quadros. Depois que o arquivo tiver sido dividido em colunas "C" e "D", calcule o status de imobilidade de Drosophila por intervalo de quadros usando a fórmula IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), que é mostrada na coluna "E". (Figura 10C).
NOTA: Ao contrário da análise de velocidade, os resultados do primeiro quadro foram definidos. As moscas que se moviam menos de 20 pixels foram consideradas imóveis e registradas como "0" na coluna "E".- Selecione todos os resultados calculados e insira um gráfico de colunas para exibir visualmente o tempo de imobilidade pela margem de todo o gráfico de colunas (Figura 10D).
- Certifique-se de que o ângulo de direção mude.
NOTA: A análise de mudança de ângulo de direção representa a escolha de direção das moscas. Uma vez que o arquivo foi dividido em colunas "C" e "D", o ângulo de mudança de direção é calculado pela fórmula ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2)) *(SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), que é apresentado na coluna "E" (Figura 10E). Os resultados calculados indicam o ângulo entre três coordenadas.- Selecione todos os resultados calculados e insira um diagrama de dispersão para ilustrar o ângulo de mudança de direção do movimento das moscas (Figura 10F).
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Representative Results
No presente estudo, déficits locomotores em moscas adultas e larvas de terceiro ínstar tratadas com rotenona foram examinados e comparados em sua atividade motora com a de uma mosca controle alimentada com o solvente dimetilsulfóxido (DMSO). Demonstrou-se que o tratamento com rotenona em Drosophila causa perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro22 e leva a déficits locomotores significativos23. Como mostrado na Figura 11 e na Figura 12, moscas adultas e larvas de terceiro ínstar tratadas com rotenona apresentam déficits locomotores significativos em comparação com moscas controle alimentadas com DMSO. A Figura 11 e a Figura 12B-E ilustram as mudanças relativas na distância, velocidade e tempo de imobilidade para os parâmetros de movimento entre moscas tratadas com ou sem rotenona. A Figura 11 e a Figura 12F-K ilustram uma análise representativa dos parâmetros de velocidade, tempo de imobilidade e seleção de direção, com ou sem tratamento com rotenona em adultos e larvas. A análise quantitativa dos parâmetros de distância, tempo de imobilidade e velocidade usando o software de Fiji em moscas adultas (Figura 11) e larvas de terceiro ínstar (Figura 12) dos grupos alimentados por drogas valida ainda que o tratamento com rotenona pode ser usado para investigar déficits locomotores em doenças humanas, incluindo condições neurodegenerativas, e replicar algumas das características comportamentais observadas em humanos e mamíferos.
Figura 1: Fluxograma descrevendo a configuração do equipamento e o procedimento experimental para análise do rastreamento de movimento de Drosophila . A arena de rastreamento locomotor é fotografada com uma câmera HD aérea que é incorporada e controlada por um computador. O procedimento para analisar a locomoção de Drosophila consiste em gravação de vídeo, rastreamento de movimento, análise de arquivo de rastreamento, processamento de dados e análise paramétrica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Homogeneização de fundo do primeiro quadro. (A) Marque a opção "converter para tons de cinza" ao abrir o vídeo transformado, para transformar o vídeo em tons de cinza e evitar a interferência da cor. (B) Esboce Drosophila usando a ferramenta "seleção à mão livre", mostrada na caixa vermelha. (C) Como seleção das análises, uma linha amarela foi utilizada para delinear os contornos das moscas. Manter a linha amarela perto dos contornos da mosca reduz a probabilidade de selecionar uma região que não é ocupada pela mosca. Barra de escala = 1 cm. (D) Ajuste o brilho e o contraste do primeiro quadro até que a área encaixotada em amarelo mude para a mesma escala de cinza do plano de fundo. (E) Complete o ajuste de brilho e contraste para o primeiro quadro, mas não para todos os quadros, clicando em "Não" na janela "pilha". (F) Em última análise, o primeiro quadro é ajustado para criar um fundo uniforme e imaculado. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configurações da janela de rastreamento e da zona de rastreamento. (A) Conclua a análise de rastreamento clicando nos plugins do rastreador na ordem marcada na janela de rastreamento de animais. (B) Após a configuração da imagem ativa na Figura A,1, é apresentada uma janela de processamento que mostra apenas o quadro atual. A janela de vídeo primária e a janela de processamento são claramente distinguidas e são usadas em diferentes situações. Para alterar o quadro atual, verifique se a alteração é executada na janela de vídeo principal; A alteração será visível em ambas as janelas. Barra de escala = 1 cm. (C) Crie uma área de rastreamento que circunda a arena, usando a ferramenta "oval" para reconhecimento de computador. A seleção da zona de rastreamento deve estar em uma arena circular em uma janela de vídeo aberta, em vez de em uma janela de processamento. (D) Delinear uma área de rastreamento com as linhas amarelas para se adequar ao máximo à arena, a fim de minimizar a perturbação da luz externa. Barra de escala = 1 cm. ( E ) Para definir a região de interesse (ROI) na área de rastreamento, clique nos botões seguindo a ordem marcada com os números mostrados na janela "designer de zona". Nesta etapa, toda a operação deve ser concluída após a abertura da janela de vídeo escolhida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Configuração do filtro para o primeiro quadro. (A) Ao completar a configuração do ROI para a área de rastreamento, a linha amarela que circunda a arena muda para verde na janela de vídeo aberta e na janela de processamento. Barra de escala = 1 cm. (B) Adicionar a finalidade dos filtros define um fundo preto para tornar o objeto de destino mais óbvio para o primeiro quadro na janela de processamento. Toda a operação deve ser conduzida dentro de uma janela de processamento, em vez de uma janela de vídeo aberta. (C,D) Adicionar os filtros "subtractor de fundo" e "Gaussian blur" à janela "filter settings" torna o primeiro quadro na janela de processamento preto. Todo o processo de configuração do filtro deve ser concluído no primeiro quadro. (E) Os parâmetros são definidos passo a passo, clicando em botões marcados com um número e um retângulo vermelho na janela "subtractor de fundo". A etapa "definir imagem" deve ser operada após a janela de processamento ser selecionada. (F) Barra de escala = 1 cm. A janela "imagem mediana" será apresentada após clicar no botão "mostrar filtro" no "E4" e fechar diretamente a janela sem qualquer operação. (G) O parâmetro do desfoque gaussiano é definido com um valor sigma padrão de 2,0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Configurações de limite do segundo quadro. (A) Ao clicar na barra de progresso inferior, faça com que a janela de vídeo avance para o segundo quadro. A mosca repete no meio da tela e é identificada por Fiji. Barra de escala = 1 cm. (B,C) Exibe a janela de processamento antes e depois da filtragem. (B) Mostre a janela de processamento filtrada selecionando o modo marcado com um retângulo vermelho. (C) Um exemplo de janela de processamento com um retângulo vermelho após a seleção do modo "filtrado". Barra de escala = 1 cm. (D) Defina o limite selecionando o método de limiar padrão, "limiar em escala de cinza", mostrado na janela "thresholders", depois de escolher a ferramenta "set threshold" na Figura 3A,4. (E) Ajuste os parâmetros deslizando a caixa da barra de progresso no meio até que a mosca de rastreamento seja vista e coberta pelo perfil vermelho. Não é recomendável alterar as configurações padrão para os parâmetros encaixotados no retângulo vermelho abaixo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Detector de blobs, configuração do último quadro e seleção de rastreamento de animais. (A) Ao atingir o limiar indicado na Figura 5E, a janela de processamento revela um perfil vermelho considerável após a mosca no segundo quadro. Faça com que o perfil vermelho que cobre a mosca se ajuste para rastrear a mosca. Barra de escala = 1 cm. (B) Defina a mosca coberta de perfil vermelho como o alvo para rastreamento selecionando o método padrão de detector de blob, "detector de blobs base". (C) Defina o quadro 901 como o último quadro usando a ferramenta "definir último quadro" na Figura 3A,6. O número total de quadros é calculado pela fórmula "número de quadros = fps * tempo de gravação". (D) O rastreamento voa com um retângulo amarelo encaixotado após mostrar blobs na janela de vídeo aberta (seção do painel esquerdo). No painel esquerdo ampliado, as moscas-das-frutas são fixadas em vermelho (seção do painel direito). Barra de escala = 1 cm. (E) O rastreamento voa com um retângulo vermelho encaixotado depois de clicar para selecionar o retângulo vermelho em "D" (seção do painel superior). Na ampliação do painel superior, as moscas-das-frutas são fixadas em vermelho (seção do painel inferior). Verifique se a seleção de um retângulo amarelo ao redor de uma mosca de rastreamento foi concluída na janela de vídeo aberta. Complete a seleção na janela de vídeo aberta, e a mosca será identificada por Fiji em todos os quadros. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Resultados do rastreamento de rastreamento. O rastreamento de rastreamento é mostrado separadamente na janela de vídeo aberta ( A) e na janela de processamento (B). Para obter o perfil de rastreamento de rastreamento, clique na barra de progresso na janela de vídeo original e deslize a barra de progresso para verificar a continuidade do rastreamento. O rastreamento apresenta a distância de rastreamento das moscas intuitivamente. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise de arquivos de rastreamento usando os plug-ins do AnimalTracker. (A) O analisador de rastreamento facilita uma análise detalhada do arquivo de rastreamento; Cada passo marcado com um retângulo vermelho é denotado por um número. (B) Defina os parâmetros "zone settings" em A,4. Quatro parâmetros, tempo, distância, tempo de imobilidade e vetor de velocidade, são mostrados no retângulo vermelho. O parâmetro é selecionado com base no resultado desejado. (C-G) Defina os parâmetros de configuração individualmente na janela "definir parâmetros" de A,5. (C) Quatro parâmetros ajustáveis são ilustrados na janela "config parameters settings", (D-G) exibindo as janelas "time settings", "immobility time setting", "distance settings" e "velocity vector setting", respectivamente. Não é recomendável modificar o valor padrão para as configurações de parâmetro. No entanto, para o "intervalo de quadros", o parâmetro deve ser calculado usando a fórmula "intervalo de quadros = 1/fps" quando o fps do vídeo é alterado. Além disso, é possível empregar uma escala conhecida para determinar a distância e a velocidade reais, correlacionando os pixels registrados com o rastreamento de uma mosca a um valor tangível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Resultado exibindo a análise do arquivo de rastreamento. (A) A configuração da Figura 8A,6. Dois modos de exibição dos dados estão disponíveis: "agrupados por zonas" e "agrupados por parâmetros". (B) Os resultados da análise do ficheiro de seguimento são apresentados como "agrupados por zonas" em "A,6.1". (C-F) Os resultados da análise dos arquivos de rastreamento são mostrados como "agrupados por parâmetros" em A,6.2, exibindo "tempo de imobilidade" (C), "vetor de velocidade" (D), "tempo" (E) e "distância" (F) separadamente. Os resultados do tempo e da distância de imobilidade são quantificados em "s" e "pixels". A unidade do vetor de velocidade deve ser definida como "pixel/s", e a saída com a anotação "comprimento". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Resultados da análise dos dados para velocidade por fps. (A, C e E) Os dados de exportação contêm coordenadas de pixels em partições horizontais (coluna "C") e verticais (coluna "D"), bem como o movimento de pixels, imobilidade e ângulo de mudança de direção entre intervalos de dois quadros (coluna "E" em A, C e E, respectivamente), que é calculado automaticamente pela fórmula descrita no contexto. Como os resultados exportados de Fiji são documentos de texto, é recomendável abrir o arquivo com o Microsoft Office Excel e dividir os dados em três colunas adicionando espaços entre elas. (B, D e F) Um gráfico de linhas exibe os resultados calculados do conjunto de dados do movimento dos pixels (B). O valor de pico global representa a velocidade, indicativo das capacidades de detecção de movimento; o gráfico de colunas exibe os resultados calculados do conjunto de dados de imobilidade (D). O grau de esparsidade no gráfico de colunas representa a imobilidade, que exibe o defeito da habilidade motora das moscas; um diagrama de dispersão exibe os resultados calculados do conjunto de dados do ângulo de mudança de direção (F). O enriquecimento de respingos mostrado no diagrama de dispersão representa a direção escolhida pela mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Análise comparativa do movimento entre moscas tratadas com ou sem rotenona. (A) São apresentados gráficos representativos do vestígio de rastreio de moscas adultas W1118 alimentadas com ração padrão contendo 500 μM de rotenona ou DMSO para controlo. As moscas W1118 foram coletadas e colocadas em ambiente controlado composto por ração padrão com 500 μM de rotenona ou DMSO, 25°C e 60% de umidade. Seis moscas foram utilizadas para análise de cada grupo após 48 h. O resultado revela que a distância de movimento das moscas rastreadoras alimentadas com rotenona é significativamente menor em comparação com a do controle. O resultado mostrou uma habilidade motora defeituosa em moscas alimentadas com rotenona. (B-E) A análise quantitativa do tratamento com rotenona sobre a distância média percorrida, tempo de imobilidade, velocidade média e velocidade máxima é realizada usando Fiji. Os resultados do tratamento com rotenona mostraram uma diminuição significativa na distância percorrida e na velocidade média, e um aumento significativo no tempo de imobilidade. (F-K) Análise de pixels por quadro (F,G), tempo de imobilidade por quadro (H,I) e mudança de ângulo de direção (J,K) entre moscas tratadas com rotenona (G,I,K) ou DMSO (F,H,J). Gráficos de exemplo ilustrando os efeitos da rotenona sobre a velocidade de movimento mostram menos picos representando a velocidade de movimento por intervalo de quadro em moscas alimentadas com rotenona (G) em comparação com aquelas no controle (F), indicando a gravidade do defeito da atividade locomotora (F,G). A coluna de imobilidade intuicionista de pixels movidos por quadro é menor, mostrando significativamente menos movimento dentro de 1 min para moscas alimentadas com rotenona (I) em comparação com as moscas controle (H). Gráficos de exemplo das mudanças de direção do ângulo de movimento em animais alimentados com rotenona (K) e controle (J) revelam alterações na direção escolhida pelas moscas. Os dados são a média ± EPM de seis moscas machos monitorados por 1 min. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre os grupos (***p < 0,001; teste t não pareado, p = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Análise comparativa do movimento entre larvas tratadas com ou sem rotenona. (A) Resultados representativos da comparação da atividade locomotora pelo rastreamento do traço de larvas de terceiro ínstar W1118 alimentadas com rotenona ou DMSO. Resumidamente, larvas de terceiro ínstar W1118 foram coletadas e cultivadas em sacarose a 10% ou sacarose a 10% contendo 500 μM de rotenona, em ambiente de 25 °C com 60% de umidade. Foram utilizadas seis larvas por grupo para análise. Levando-se em consideração o movimento lento das larvas, o registro de dados durante um período de 5 min foi quantificado e analisado para avaliar os efeitos da rotenona na locomoção. (B-E) A distância média, o tempo de imobilidade, a velocidade média e a velocidade máxima dos dois grupos analisados em Fiji são analisados quantitativamente. Os resultados quantitativos mostram que a distância de movimento, a velocidade média e a velocidade máxima diminuem significativamente nas larvas alimentadas com rotenona e o tempo de imobilidade aumenta significativamente nas larvas alimentadas com rotenona. (F-K) Semelhante às moscas adultas, a análise de pixels por quadro, tempo de imobilidade e mudanças de ângulo de direção entre moscas tratadas com rotenona (G,I,K) e sem rotenona (F,H,J) mostrou que as larvas tratadas com rotenona apresentaram menor velocidade de movimento, maior tempo de imobilidade e alternaram suas direções. Os resultados revelam que o movimento comportamental das larvas rastreadoras alimentadas com rotenona está significativamente prejudicado em relação ao controle. Os resultados mostram uma atividade locomotora defeituosa das moscas alimentadas com rotenona. Os dados são a média ± EPM de seis larvas de 3 dias de idade monitoradas por 5 min. Os asteriscos indicam diferença significativa entre os grupos (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; teste t não pareado, p = 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Comparação de metodologias baseadas em rastreamento animal para quantificação da atividade locomotora em Drosophila. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Projetamos um método, baseado no material de código aberto AnimalTracker API compatível com o programa de processamento de imagens de Fiji, que pode permitir que os pesquisadores avaliem sistematicamente a atividade locomotora rastreando larvas adultas e individuais. O AnimalTracke é uma ferramenta escrita em Java que pode ser facilmente integrada a bancos de dados existentes ou outras ferramentas para facilitar a análise do comportamento de rastreamento de animais projetado por aplicativos24. Após uma análise quadro a quadro por uma fórmula de cálculo de software que quantifica a atividade locomotora dos adultos e larvas, vários parâmetros, incluindo velocidade de movimento, distância percorrida, imobilidade e mudanças de ângulo de direção podem ser analisados de forma flexível. Esses parâmetros, que representam diferentes aspectos da locomoção comportamental, podem ser plotados para ilustrar as mudanças locomotoras ao longo do tempo. Além disso, através da criação de uma interface gráfica de usuário, fornecendo documentação detalhada sobre seu uso, e uma interface de programação de aplicativos, pretendemos tornar este método acessível a pesquisadores que não têm experiência em programação e usuários experientes criando paradigmas experimentais personalizados.
Para verificar se o método pode monitorar com precisão o comportamento, testes locomotores de moscas adultas e larvas tratadas com rotenona, bem como uma comparação de sua atividade motora com a de moscas controles alimentadas com o solvente da droga, foram realizados. O software Fiji, com seus plugins, é usado para analisar as coordenadas de pixel de cada quadro na gravação de vídeo do movimento, permitindo o cálculo da velocidade, distância e outros parâmetros das moscas experimentais. Observamos uma diminuição significativa na distância percorrida ao longo do tempo na administração de rotenona (Figura 11), o que é consistente com os resultados relatados23. Enquanto isso, a velocidade do movimento ascendente e a direção anormal escolhida foram observadas em grupos alimentados com drogas, para ajudar a ilustrar mais detalhes da deficiência comportamental em moscas. Dado o sucesso na detecção da atividade locomotora de moscas adultas, procurou-se, então, avaliar a mobilidade das larvas (Figura 12). Em comparação com o controle, os resultados das larvas rastreadoras alimentadas com rotenona foram significativamente prejudicados, em paralelo com os de moscas adultas alimentadas com drogas. Experimentos com adultos e larvas alimentados com rotenona sugerem que este método pode registrar com precisão a redução de moscas que produziram déficits locomotores em comparação com controles. Este relato demonstrou com sucesso aplicações do método atual na quantificação e análise da capacidade locomotora e outras facetas de defeitos de comportamento de moscas-das-frutas em modelos de teste ou pesquisa farmacológica em animais.
Para garantir que a análise de vídeo e rastreamento produza resultados bem-sucedidos e reproduzíveis, recomenda-se seguir as seguintes diretrizes. Primeiro, para a escolha da taxa de quadros de vídeo, recomendamos converter o vídeo gravado para um formato de 15 quadros por segundo (fps). Isso pode não apenas manter um bom rastreamento de movimento, mas também evitar a lentidão da análise do computador causada por grandes quantidades de dados. Ao melhorar a taxa de quadros do vídeo, a análise da trajetória de movimento fica mais detalhada. Em segundo lugar, os parâmetros na fórmula também podem ser ajustados para se adequar ao esquema experimental correspondente ao analisar o movimento estático entre cada dois quadros. Para o monitoramento locomotor das larvas, é essencial usar sílica gel em vez de ágar, pois a sílica gel solidificada é apertada e as larvas não podem entrar nela. Além disso, a sílica gel é transparente e pode ser tingida adicionando substância de cor para produzir o fundo ideal, facilitando os efeitos ópticos desejados que melhoram a qualidade da imagem.
Sistemas de rastreamento de animais estão sendo avançados para fornecer soluções abrangentes para as comunidades de etiologia, neurociência e genética comportamental. A Tabela 1 fornece uma comparação das características dos múltiplos programas de rastreamento atualmente disponíveis 10,11,12,16,17,25,26. Essa abordagem é extremamente econômica, simples de aprender e precisa na medição do comportamento locomotor, sem a necessidade de software e equipamentos dispendiosos. Não há dúvida de que este método pode ser convenientemente estendido a outros modelos animais semelhantes à Drosophila, e até mesmo a animais maiores, como ratos e camundongos. A estrutura da API AnimalTracker pode ser estendida com facilidade por meio de aplicativos ou plugins independentes do ImageJ, oferecendo uma ampla gama de kits de ferramentas úteis para pesquisa e análise de comportamento personalizadas24. No entanto, este estudo apresenta algumas restrições. Uma vez que uma única mosca é colocada em uma arena de campo aberto para gravação de imagens e o rastreamento de vídeo é realizado individualmente, esse método é ineficiente e demorado. Tentamos expandir a capacidade de gravar várias arenas simultaneamente, permitindo até seis gravações individuais. Teoricamente é possível registrar um maior número de Drosophila simultaneamente; Isso depende do tamanho da arena e da configuração da câmera. Alternativamente, se os usuários desejam estender a gravação de Drosophila agrupada, recomenda-se considerar o número limitado de registros únicos e uma configuração de qualidade suficiente para identificar colisões e sobreposições entre as moscas. Melhorias na eficiência do teste por aprendizado de máquina não foram consideradas no estudo, uma vez que não foi descoberta uma abordagem acessível e compatível que possa ser integrada ao sistema atual para distinguir visualmente identidades e rastrear modelos com precisão.
Em resumo, o método aqui descrito desenvolve e valida uma abordagem eficiente e direta baseada em software livre e de código aberto, projetado para reduzir o consumo de tempo e refinar técnicas experimentais para indicar e analisar quantitativamente a locomoção de Drosophila nas fases larval e adulta. Por meio de análises sistemáticas, esse método pode nos ajudar a entender como a velocidade do animal muda ao longo do tempo durante o movimento, bem como as características da seleção direcional. Assim, a incorporação de software de código aberto em dispositivos digitais comumente usados fornece uma maneira confiável de testar a atividade locomotora em vários modelos de moscas. Isso pode ser útil para avaliar os resultados locomotores fisiológicos e patológicos no teste de modelos de doenças neurodegenerativas derivadas do tratamento farmacológico e da modificação transgênica em Drosophila , bem como em outros animais.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um fundo de lançamento especial da Universidade Soochow e da Fundação Nacional de Ciência da China (NSFC) (82171414). Agradecemos aos membros do laboratório do Prof. Chunfeng Liu por sua discussão e comentários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal tracker | Hungarian Brain Research Program | version: 1.7 | pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads |
| Camera software | Microsoft | version: 2021.105.10.0 | built-in windows 10 system |
| Computer | DELL | Vostro-14-5480 | a comupter running win 10 system is available |
| Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation | Wu han Yihong technology | #YHDFPCO2-018 | official website: http://www.yhkjwh.com/ |
| Fiji software | Fiji team | version: 1.53v | official website: https://fiji.sc/ |
| Format factory software | Pcfreetime | version: X64 5.4.5 | official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html |
| Graph pad prism | GraphPad Software | version: 8.0.2 | official website: https://www.graphpad-prism.cn |
| Hight definition camera | TTQ | Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) | official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35 |
| Office software | Microsoft | version: office 2019 | official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office |
| Petri dish | Bkman | 110301003 | size: 60 mm |
| Silica gel | DOW | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Mix well according to the instructions |
| Sodium bicarbonate | Macklin | #144-55-8 | Mix well with silica gel |
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