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Behavior

Una técnica simple para evaluar la actividad locomotora en Drosophila

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/65092
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Institute of Neuroscience, Soochow University, 2Department of Neurology and Clinical Research Center of Neurological Disease, The Second Affiliated Hospital of Soochow University

Summary

El presente protocolo evalúa la actividad locomotora de Drosophila mediante el seguimiento y análisis del movimiento de las moscas en una arena hecha a mano utilizando el software de código abierto Fiji, compatible con plugins para segmentar píxeles de cada fotograma basado en grabación de vídeo de alta definición para calcular parámetros de velocidad, distancia, etc.

Abstract

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ideal para estudiar diversas enfermedades debido a su abundancia de técnicas avanzadas de manipulación genética y diversas características de comportamiento. La identificación de la deficiencia de comportamiento en modelos animales es una medida crucial de la gravedad de la enfermedad, por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas donde los pacientes a menudo experimentan deficiencias en la función motora. Sin embargo, con la disponibilidad de varios sistemas para rastrear y evaluar los déficits motores en modelos de moscas, como individuos tratados con drogas o transgénicos, todavía falta un sistema económico y fácil de usar para una evaluación precisa desde múltiples ángulos. Aquí se desarrolla un método basado en la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , que es compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, para evaluar sistemáticamente las actividades de movimiento de individuos adultos y larvales a partir de video grabado, lo que permite el análisis de su comportamiento de rastreo. Este método requiere solo una cámara de alta definición y una integración de hardware periférico de computadora para registrar y analizar el comportamiento, lo que lo convierte en un enfoque asequible y efectivo para detectar modelos de moscas con deficiencias de comportamiento transgénicas o ambientales. Se dan ejemplos de pruebas de comportamiento con moscas tratadas farmacológicamente para mostrar cómo las técnicas pueden detectar cambios de comportamiento tanto en moscas adultas como en larvas de una manera altamente repetible.

Introduction

Drosophila melanogaster proporciona un excelente organismo modelo para investigar las funciones celulares y moleculares en modelos de enfermedades neuronales creados por modificación génica1, tratamiento farmacológico2 y senescencia3. La alta conservación de las vías biológicas, las propiedades físicas y los genes homólogos asociados a enfermedades entre los humanos y Drosophila hacen que la mosca de la fruta sea una imitación ideal desde el nivel molecular hasta el nivel de comportamiento4. En muchos modelos de enfermedad, la deficiencia conductual es un índice importante, proporcionando un modelo útil para diversas neuropatías humanas 5,6. Drosophila ahora se utiliza para estudiar múltiples enfermedades humanas, neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica 7,8. La detección de la capacidad motora de los modelos de enfermedad es crucial para comprender el progreso patogénico y puede proporcionar una correlación fenotípica con los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de la enfermedad.

Recientemente, se han desarrollado herramientas de software disponibles comercialmente y programas rentables para las estrategias de detección locomotora de Drosophila, como las pruebas de alto rendimiento en moscas agrupadas9,10 y la medición de la locomoción en tiempo real11,12. Uno de estos enfoques convencionales es la geotaxis negativa interactiva rápida (RING), también llamada ensayo de escalada, que incluye múltiples canales que permiten contener una gran población de moscas con el mismo sexo y edad, reduciendo la variación mientras se recopilan datos 9,13. Otro método de prueba previa para analizar el comportamiento locomotor es el monitor de actividad TriKinetics Drosophila (DAM), un dispositivo que utiliza múltiples haces para detectar el movimiento de la actividad de la mosca dentro de un tubo de vidrio delgado14. El dispositivo registra la posición continuamente, lo que representa la locomoción automatizada mediante el cálculo de los cruces de haces para estudiar la actividad y el ritmo circadiano de las moscas durante un período de tiempo más largo15. Aunque estos métodos se han utilizado ampliamente en el análisis de defectos de comportamiento en moscas de la fruta para determinar cambios en la locomoción conductual, siempre requieren equipos de prueba especiales o procesos de análisis complejos, y restringen su aplicación en algunos modelos con un dispositivo limitado y simple. Las estrategias grupales de rastreo de animales para probar la Drosófila adulta, como FlyGrAM11 y el ensayo de la isla Drosophila 10, implementan el reclutamiento social y el seguimiento individual en un área predefinida. Sin embargo, la restricción social individual en áreas desafiadas podría tener un efecto negativo en las identificaciones en las imágenes, causado por la colisión o superposición de moscas. Aunque algunos métodos basados en materiales de código abierto, como TRex16, MARGO 12 y FlyPi17, tienen una emergencia, pueden rastrear rápidamente las moscas con un uso flexible en las pruebas de comportamiento. Estos enfoques de prueba están asociados con instalaciones de aparatos experimentales elaborados, requisitos especiales de software o lenguajes informáticos profesionales. Para las larvas, medir la distancia total recorrida a través del número de líneas de borde de cuadrícula por unidad de tiempo18, o contar las contracciones de la pared corporal para individuos manualmente19, son los métodos predominantes para evaluar su capacidad locomotora. Debido a la falta de precisión en equipos o dispositivos y métodos de análisis, alguna locomoción conductual de las larvas podría escapar a la detección, lo que dificulta la evaluación precisa del movimiento conductual, especialmente el movimiento fino15.

El presente método desarrollado utiliza la interfaz de programación de aplicaciones (API) AnimalTracker , compatible con el programa de procesamiento de imágenes Fiji (ImageJ), para evaluar sistemáticamente la actividad locomotora de moscas adultas y larvales mediante el análisis de su comportamiento de seguimiento a partir de videos de alta definición (HD). Fiji es una distribución de software de código abierto ImageJ que puede combinar bibliotecas de software robustas con numerosos lenguajes de scripting, lo que resulta en la creación rápida de prototipos de algoritmos de procesamiento de imágenes, lo que la hace popular entre los biólogos por sus capacidades de análisis de imágenes20. En el enfoque actual, la integración de Fiji en la API AnimalTracker se explota para desarrollar un ensayo de comportamiento único de Drosophila con inserción de algoritmo personalizado, y proporciona un paso útil para documentación detallada y tutoriales para respaldar capacidades analíticas sólidas del comportamiento locomotor (Figura 1). Para evitar la complicación de las identificaciones objetivas en las imágenes causadas por la colisión o superposición de moscas, cada arena está restringida a albergar solo una mosca. Al evaluar la precisión de seguimiento del enfoque, se implementó para rastrear y cuantificar los movimientos locomotores de Drosophila que fueron administrados con el fármaco tóxico rotenona, que generalmente se utiliza para modelos animales de la enfermedad de Parkinson, descubriendo finalmente el deterioro de la locomoción en el tratamiento farmacológico21. Esta metodología, que emplea software libre y de código abierto, no necesita instrumentación de alto costo y puede analizar de manera precisa y reproducible la locomoción conductual de Drosophila .

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Protocol

W1118 moscas adultas y larvas del tercer estadio se utilizaron para el presente estudio.

1. Preparación experimental

NOTA: Una arena de campo abierto para el seguimiento de locomoción de Drosophila está hecha con un gel de sílice incoloro e inodoro.

  1. Mezcle el reactivo A y el reactivo B en una proporción de 1:10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de sílice (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que se agregue bicarbonato de sodio a la mezcla revolviendo hasta que el color cambie a blanco. Transfiera la mezcla a una placa de Petri limpia y colóquela en un horno a 40 °C para secar durante 48 h.
  2. Coloque la cámara HD (consulte Tabla de materiales) en un trípode, ajustándola para que la lente de la cámara sea perpendicular a la superficie de la arena de sílice. Ajustando la distancia focal y las aperturas de la cámara, asegúrese de que la cámara esté enfocada en la superficie de la sílice y que la pantalla esté adecuadamente iluminada. La configuración experimental se ilustra en la figura 1.
  3. Transfiera una mosca a la arena de campo abierto para grabar un video continuo de al menos 61 s.
    NOTA: Teniendo en cuenta la naturaleza lenta de las larvas, se recomienda un tiempo de grabación de video de más de 10 minutos.
    1. Abra el video con Fiji, arrastre la barra de progreso al fotograma inicial y apruebe tácitamente. Elija todo el cuerpo de la mosca utilizando la herramienta "selección a mano alzada" (Figura 2B, C).
    2. Haga clic en la imagen > ajustar > brillo y contraste para ajustar el balance de blancos hasta que el valor de gris del área seleccionada se acerque al fondo amplio (Figura 2D-F).
      NOTA: La homogeneización del fondo del primer fotograma permite al software distinguir el fondo sin ningún objeto y crear un contraste cuando hay una mosca presente, lo que permite que el software la rastree.
  4. Realice todo el experimento en un entorno de prueba establecido a 25 ° C y 60% de humedad relativa, en un área tranquila y sin exposición a la luz brillante.

2. Grabación y preprocesamiento de video

  1. Después de un corto período de anestesia con 95% de dióxido de carbono (CO2), transfiera una mosca a la arena abierta y presione el botón de grabación en la aplicación de la cámara para iniciar la grabación de video.
    NOTA: Para minimizar el efecto de la anestesia en la locomoción, permita que las moscas se recuperen durante 10 minutos antes de iniciar la grabación de video. También se recomienda anestesiar en frío por enfriamiento.
    1. Una vez que las moscas se recuperen de la anestesia, coloque el plato de arena que contiene la mosca debajo de la cámara y agite el plato rápidamente de lado a lado para asegurarse de que la mosca esté en movimiento cuando comience la grabación.
  2. Al finalizar la grabación, presione el botón de parada para finalizar la grabación de video.
    NOTA: Asegúrese de que el tiempo de grabación de vídeo supere ligeramente el tiempo de seguimiento de destino por un pequeño margen. Además, para mejorar la eficiencia experimental, es posible rastrear múltiples moscas espontáneamente. Esto depende de la resolución de la cámara para permitir un recorte de video de alta calidad.
  3. Convierta los videos grabados en formato AVI con codificación MJPEG, para que puedan abrirse y analizarse usando Fiji. Mientras tanto, establezca la velocidad de fotogramas por segundo (fps) del video en 15 fps para moscas adultas y 12 fps para larvas.

3. Análisis de vídeo

  1. Abra el video que se ha transformado con "use virtual stack" y "convert to grayscale", dos opciones en la ventana emergente al abrir el video con Fiji (Figura 2A).
  2. Haga un primer fotograma en blanco, como se mencionó anteriormente.
  3. Obtenga una ventana de procesamiento utilizando la herramienta "establecer imagen activa" del complemento AnimalTracker y cree un área de seguimiento que rodee la arena en la ventana de video original usando la herramienta "ovalada" (Figura 3A).
  4. Establezca los filtros (Figura 3A,3) y los parámetros de los dos filtros (Figura 4A-G) para el primer fotograma en blanco de la ventana de procesamiento. A continuación, seleccione el siguiente fotograma en la ventana de vídeo original y elija la superficie filtrada de la ventana de procesamiento (Figura 5A-C).
    NOTA: El paso de filtrado sirve para disminuir el ruido de la imagen y/o eliminar el fondo, lo que facilita la separación del primer plano del fondo en la binarización de los fotogramas.
  5. Una vez seleccionada una ventana de procesamiento filtrada, gire la mosca rastreada con un perfil rojo cubierto en la ventana de procesamiento utilizando la herramienta "establecer umbral" (Figura 3A,4, Figura 5D-E y Figura 6A).
  6. Use el "set blob-detector" para permitir que la computadora reconozca la mosca con un perfil rojo cubierto en la ventana de procesamiento (Figura 3A,5 y Figura 6B).
  7. Establezca el fotograma 901 como el último fotograma para la mosca adulta, calculado por la duración de grabación del video y los fps (Figura 3A,6, Figura 6C).
    NOTA: El siguiente experimento con larvas se ha rastreado durante 10 minutos, por lo que el fotograma 7200 se establece como el último fotograma.
  8. Utilice la herramienta "mostrar blobs" para presentar un rectángulo de seguimiento en la ventana de vídeo original (Figura 3A,7 y Figura 6D,E). Luego, inicie el seguimiento y exporte el archivo de seguimiento después de que se complete el monitoreo (Figura 3A,8,9 y Figura 7A,B).

4. Análisis de archivos de seguimiento

  1. Cargue los archivos de seguimiento y zona utilizando el complemento Animal tracker > Tracking analyzer (Figura 8A).
  2. Seleccione el índice deseado utilizando la configuración de zona y modifique la configuración de los parámetros (Figura 8). Calcule el tiempo del intervalo de fotogramas utilizando la velocidad de fotogramas.
    NOTA: En esta condición, la velocidad de fotogramas es de 15 fps y el intervalo de fotogramas es de aproximadamente 0,067 s, que es la configuración predeterminada (Figura 8D).
  3. Produzca los gráficos de análisis cuantitativo utilizando el software de hoja de cálculo y GraphPad Prism después de ser analizados en el analizador de seguimiento (Figura 9).

5. Análisis por fotograma

  1. Realice análisis de velocidad por intervalo de fotogramas. Analice el archivo de seguimiento sin Fiji si se necesita una investigación más detallada.
    1. Abra el archivo de pista, copie todas las coordenadas en Microsoft Office Excel y divida las celdas con la tecla de espacio.
      NOTA: Por ejemplo, una vez que el archivo se ha dividido en columnas "C" y "D", la velocidad de Drosophila por intervalo de fotogramas se calcula mediante la fórmula SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), que se muestra en la columna "E" (Figura 10A). Los datos de la columna "E" indican el número de píxeles que la mosca movió entre dos fotogramas, sin tener en cuenta el primer fotograma. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un gráfico de líneas para mostrar una velocidad de movimiento de vuelo intuitiva por intervalo de cuadro, con un pico en el gráfico de líneas (Figura 10B).
  2. Calcule el tiempo de inmovilidad por intervalo de fotogramas. Después de dividir el archivo en columnas "C" y "D", calcule el estado de inmovilidad de Drosophila por intervalo de fotogramas utilizando la fórmula IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), que se muestra en la columna "E". (Figura 10C).
    NOTA: A diferencia del análisis de velocidad, se definieron los resultados del primer fotograma. Las moscas que se movían menos de 20 píxeles se consideraban inmóviles y se registraban como "0" en la columna "E".
    1. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un gráfico de columnas para mostrar visualmente el tiempo de inmovilidad por el margen de todo el gráfico de columnas (Figura 10D).
  3. Asegúrese de que el ángulo de dirección cambia.
    NOTA: El análisis de cambio de ángulo de dirección representa la elección de dirección de las moscas. Una vez que el archivo se ha dividido en columnas "C" y "D", el ángulo de cambio de dirección se calcula mediante la fórmula ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2)))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))))*180/PI(), que se presenta en la columna "E" (Figura 10E). Los resultados calculados indican el ángulo entre tres coordenadas.
    1. Seleccione todos los resultados calculados e inserte un diagrama de dispersión para ilustrar el ángulo de cambio de dirección del movimiento de las moscas (Figura 10F).

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Representative Results

En el presente estudio, se examinaron los déficits locomotores en moscas adultas y larvas de tercer estadio tratadas con rotenona y se compararon en su actividad motora con la de una mosca control alimentada con el disolvente dimetilsulfóxido (DMSO). Se ha demostrado que el tratamiento con rotenona en Drosophila causa pérdida de neuronas dopaminérgicas en el cerebro22 y conduce a déficits locomotores significativos23. Como se muestra en la Figura 11 y la Figura 12, las moscas adultas y las larvas del tercer estadio tratadas con rotenona tienen déficits locomotores significativos en comparación con las moscas control alimentadas con DMSO. La Figura 11 y la Figura 12B-E ilustran los cambios relativos en la distancia, velocidad y tiempo de inmovilidad para los parámetros de movimiento entre moscas tratadas con o sin rotenona. La Figura 11 y la Figura 12F-K ilustran un análisis representativo de los parámetros de velocidad, tiempo de inmovilidad y selección de dirección, con o sin tratamiento con rotenona en adultos y larvas. El análisis cuantitativo de los parámetros de distancia, tiempo de inmovilidad y velocidad utilizando el software de Fiji en moscas adultas (Figura 11) y larvas de tercer estadio (Figura 12) de los grupos de alimentación de drogas valida aún más que el tratamiento con rotenona se puede utilizar para investigar déficits locomotores en enfermedades humanas, incluidas las afecciones neurodegenerativas, y replicar algunas de las características de comportamiento observadas en humanos y mamíferos.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo que describe la configuración del equipo y el procedimiento experimental para el análisis de seguimiento del movimiento de Drosophila . La arena de seguimiento locomotor se visualiza con una cámara HD aérea que se incorpora y controla por una computadora. El procedimiento para analizar la locomoción de Drosophila consiste en grabación de video, seguimiento de movimiento, análisis de archivos de seguimiento, procesamiento de datos y análisis paramétrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Homogeneización de fondo del primer fotograma. (A) Marque la opción "convertir a escala de grises" al abrir el video transformado, para transformar el video a escala de grises y evitar la interferencia del color. (B) Delinee Drosophila usando la herramienta de "selección a mano alzada", que se muestra en el cuadro rojo. (C) Como selección del análisis, se utilizó una línea amarilla para delinear los contornos de las moscas. Mantener la línea amarilla cerca de los contornos de la mosca reduce la probabilidad de seleccionar una región que no está ocupada por la mosca. Barra de escala = 1 cm. (D) Ajuste el brillo y el contraste del primer fotograma hasta que el área encuadrada en amarillo cambie a la misma escala de grises que el fondo. (E) Complete el ajuste de brillo y contraste para el primer cuadro, pero no para todos los cuadros, haciendo clic en "No" en la ventana "pila". (F) En última instancia, el primer marco se ajusta para crear un fondo uniforme e inmaculado. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Configuración de la ventana de seguimiento y la zona de seguimiento. (A) Complete el análisis de seguimiento haciendo clic en los complementos de seguimiento en el orden marcado en la ventana Seguimiento de animales. (B) Después de configurar la imagen activa en la Figura A,1, se presenta una ventana de procesamiento que sólo muestra el fotograma actual. La ventana de vídeo principal y la ventana de procesamiento se distinguen claramente y se utilizan en diferentes situaciones. Para cambiar el fotograma actual, asegúrese de que la alteración se ejecuta en la ventana de vídeo principal; La alteración será visible en ambas ventanas. Barra de escala = 1 cm. (C) Cree un área de seguimiento que rodee la arena, utilizando la herramienta "ovalada" para el reconocimiento por computadora. La selección de la zona de seguimiento debe estar en una arena rodeada en un círculo en una ventana de vídeo abierta, en lugar de en una ventana de procesamiento. (D) Delinear un área de seguimiento con las líneas amarillas para adaptarse a la arena en la mayor medida, a fin de minimizar la perturbación de la luz externa. Barra de escala = 1 cm. (E) Para establecer la región de interés (ROI ) en el área de seguimiento, haga clic en los botones que siguen el orden marcado con los números que se muestran en la ventana "diseñador de zonas". En este paso, toda la operación debe completarse después de que se abra la ventana de video elegida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Configuración del filtro para el primer fotograma. (A) Al completar la configuración del ROI para el área de seguimiento, la línea amarilla que rodea la arena cambia a verde tanto en la ventana de video abierta como en la ventana de procesamiento. Barra de escala = 1 cm. (B) Al agregar el propósito de los filtros, se establece un fondo negro para que el objeto de destino sea más obvio para el primer fotograma de la ventana de procesamiento. Toda la operación debe realizarse dentro de una ventana de procesamiento, en lugar de una ventana de video abierta. (C,D) Al agregar los filtros "subtractor de fondo" y "desenfoque gaussiano" a la ventana "configuración de filtro" se convierte en negro el primer fotograma de la ventana de procesamiento. Todo el proceso de ajuste del filtro debe completarse en el primer fotograma. (E) Los parámetros se establecen paso a paso haciendo clic en los botones marcados con un número y un rectángulo rojo en la ventana "subtractor de fondo". El paso "establecer imagen" debe funcionar después de seleccionar la ventana de procesamiento. (F) Barra de escala = 1 cm. La ventana "imagen mediana" se presentará después de hacer clic en el botón "mostrar filtro" en "E4" y cerrar directamente la ventana sin ninguna operación. (G) El parámetro del desenfoque gaussiano se establece con un valor sigma predeterminado de 2.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Configuración del umbral del segundo fotograma. (A) Al hacer clic en la barra de progreso inferior, haga que la ventana de video avance al segundo cuadro. La mosca se repite en el centro de la pantalla y es identificada por Fiji. Barra de escala = 1 cm. (B,C) Mostrar la ventana de procesamiento antes y después del filtrado. (B) Muestre la ventana de procesamiento filtrada seleccionando el modo marcado con un rectángulo rojo. (C) Un ejemplo de una ventana de procesamiento con un rectángulo rojo después de seleccionar el modo "filtrado". Barra de escala = 1 cm. (D) Establezca el umbral seleccionando el método de umbral predeterminado, "umbral de escala de grises", que se muestra en la ventana "umbrales", después de elegir la herramienta "establecer umbral" en la Figura 3A,4. (E) Ajuste los parámetros deslizando el cuadro de la barra de progreso en el medio hasta que la mosca de seguimiento sea vista y cubierta por el perfil rojo. No se recomienda modificar la configuración predeterminada de los parámetros encuadrados en el rectángulo rojo a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Detector de blobs, ajuste del último fotograma y selección de seguimiento de animales. (A) Al alcanzar el umbral establecido en la Figura 5E, la ventana de procesamiento revela un perfil rojo considerable después de la mosca en el segundo cuadro. Haga que el perfil rojo que cubre la mosca se ajuste para rastrear la mosca. Barra de escala = 1 cm. (B) Defina la mosca cubierta de perfil rojo como destino para el seguimiento seleccionando el método predeterminado de detector de blobs, "detector de blobs base". (C) Establezca el fotograma 901 como último fotograma utilizando la herramienta "establecer último fotograma" de la figura 3A,6. El número total de fotogramas se calcula mediante la fórmula "número de fotogramas = fps * tiempo de grabación". (D) El seguimiento vuela con un rectángulo amarillo encajonado después de mostrar manchas en la ventana de video abierta (sección del panel izquierdo). En el panel izquierdo ampliado, las moscas de la fruta están unidas en rojo (sección del panel derecho). Barra de escala = 1 cm. (E) La mosca de seguimiento con un rectángulo rojo encasillado después de hacer clic para seleccionar el rectángulo rojo en "D" (sección del panel superior). En la ampliación del panel superior, las moscas de la fruta se unen en rojo (sección del panel inferior). Asegúrese de que la selección de un rectángulo amarillo alrededor de una mosca de seguimiento se complete en la ventana de video abierta. Complete la selección en la ventana de video abierta y Fiji identificará la mosca en todos los cuadros. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Resultados del seguimiento del seguimiento. El seguimiento se muestra por separado en la ventana de vídeo abierta ( A) y en la ventana de procesamiento (B). Para obtener el perfil de seguimiento de seguimiento, haga clic en la barra de progreso en la ventana de video original y deslice la barra de progreso para verificar la continuidad del seguimiento. El rastreo de seguimiento presenta la distancia de rastreo de las moscas intuitivamente. Barra de escala = 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Análisis de archivos de seguimiento utilizando los complementos AnimalTracker. (A) El analizador de seguimiento facilita un análisis detallado del archivo de seguimiento; Cada paso marcado con un rectángulo rojo se denota con un número. (B) Establezca los parámetros de "configuración de zona" en A,4. Cuatro parámetros, tiempo, distancia, tiempo de inmovilidad y vector velocidad, se muestran en el rectángulo rojo. El parámetro se selecciona en función del resultado deseado. (C-G) Establezca los parámetros de configuración individualmente en la ventana "establecer parámetros" de A,5. (C) Cuatro parámetros ajustables se ilustran en la ventana "configuración de parámetros de configuración", (D-G) que exhiben las ventanas "configuración de tiempo", "configuración de tiempo de inmovilidad", "configuración de distancia" y "configuración de vector de velocidad", respectivamente. No se recomienda modificar el valor predeterminado para la configuración de parámetros. Sin embargo, para el "intervalo de fotogramas", el parámetro debe calcularse utilizando la fórmula "intervalo de fotogramas = 1/fps" cuando se alteran los fps del vídeo. Además, es posible emplear una escala conocida para determinar la distancia y la velocidad reales correlacionando los píxeles registrados con el seguimiento de una mosca a un valor tangible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Resultado que muestra el análisis de archivos de seguimiento. (A) El ajuste de la figura 8A,6. Hay dos modos de visualización de los datos disponibles: "agrupados por zonas" y "agrupados por parámetros". (B) Los resultados del análisis del archivo de seguimiento se muestran como "agrupados por zonas" en "A,6.1". (C-F) Los resultados del análisis de archivos de seguimiento se muestran como "agrupados por parámetros" en A,6.2, exhibiendo "tiempo de inmovilidad" (C), "vector de velocidad" (D), "tiempo" (E) y "distancia" (F) por separado. Los resultados del tiempo y la distancia de inmovilidad se cuantifican como "s" y "píxeles". La unidad del vector velocidad debe definirse como "píxel/s", y la salida con la anotación "longitud". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Resultados del análisis de datos para la velocidad por fps. (A, C y E) Los datos de exportación contienen coordenadas de píxeles en particiones horizontales (columna "C") y verticales (columna "D"), así como el movimiento de píxeles, la inmovilidad y el ángulo de cambio de dirección entre intervalos de dos fotogramas (columna "E" en A, C y E respectivamente), que se calcula automáticamente mediante la fórmula que se describe en el contexto. Como los resultados exportados desde Fiji son documentos de texto, se recomienda abrir el archivo con Microsoft Office Excel y dividir los datos en tres columnas agregando espacios entre ellas. (B, D y F) Un gráfico de líneas muestra los resultados calculados del conjunto de datos del movimiento de píxeles (B). El valor máximo global representa la velocidad, indicativo de las capacidades de detección de movimiento; el gráfico de columnas muestra los resultados calculados del conjunto de datos de inmovilidad (D). El grado de escasez en el gráfico de columnas representa la inmovilidad, que exhibe el defecto de capacidad motora de las moscas; un diagrama de dispersión muestra los resultados calculados del conjunto de datos del ángulo de cambio de dirección (F). El enriquecimiento de salpicaduras que se muestra en el diagrama de dispersión representa la dirección elegida por la mosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Análisis comparativo del movimiento entre moscas tratadas con o sin rotenona. (A) Se muestran gráficos representativos de la traza de seguimiento de moscas adultas W1118 alimentadas con alimentos estándar que contienen 500 μM de rotenona, o DMSO para control. Las moscas W1118 se recolectaron y luego se colocaron en un ambiente controlado que consiste en alimentos estándar con rotenona de 500 μM o DMSO, 25 ° C y 60% de humedad. Se utilizaron seis moscas para el análisis de cada grupo después de 48 h. El resultado revela que la distancia de movimiento de las moscas de seguimiento alimentadas con rotenona disminuye significativamente en comparación con la del control. El resultado mostró una capacidad motora defectuosa en moscas alimentadas con rotenona. (B-E) El análisis cuantitativo del tratamiento con rotenona en la distancia media recorrida, el tiempo de inmovilidad, la velocidad media y la velocidad máxima se realiza utilizando Fiji. Los resultados del tratamiento con rotenona mostraron una disminución significativa en la distancia recorrida y la velocidad media, y un aumento significativo en el tiempo de inmovilidad. (F-K) Análisis de píxeles por fotograma (F,G), tiempo de inmovilidad por fotograma (H,I) y cambios de ángulo de dirección (J,K) entre moscas tratadas con rotenona (G,I,K) o DMSO (F,H,J). Los gráficos de ejemplo que ilustran los efectos de la rotenona en la velocidad de movimiento muestran menos picos que representan la velocidad de movimiento por intervalo de fotogramas en moscas alimentadas con rotenona (G) en comparación con las del control (F), lo que indica la gravedad del defecto de actividad locomotora (F, G). La columna de inmovilidad intuicionista de píxeles movidos por fotograma es menor, mostrando significativamente menos movimiento en 1 minuto para las moscas alimentadas con rotenona (I) en comparación con las moscas de control (H). Los gráficos de ejemplo de los cambios de ángulo de dirección en movimiento en animales alimentados con rotenona (K) y control (J) revelan alteraciones en la dirección elegida por las moscas. Los datos son la media ± SEM de seis moscas macho monitoreadas durante 1 min. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los grupos (***p < 0,001; prueba t no pareada, p = 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Análisis comparativo del movimiento entre larvas tratadas con o sin rotenona. (A) Resultados representativos de la comparación de la actividad locomotora mediante el seguimiento de la traza de larvas del tercer estadio W1118 alimentadas con rotenona o DMSO. Brevemente, las larvas del tercer estadio W1118 fueron recolectadas y cultivadas en sacarosa al 10%, o sacarosa al 10% que contenía 500 μM de rotenona, en un ambiente de 25 °C con 60% de humedad. Se utilizaron seis larvas por grupo para el análisis. Teniendo en cuenta el lento movimiento de las larvas, el registro de datos en un lapso de 5 min ha sido cuantificado y analizado para evaluar los efectos de la rotenona en la locomoción. (B-E) La distancia media, el tiempo de inmovilidad, la velocidad media y la velocidad máxima de los dos grupos analizados en Fiji se analizan cuantitativamente. Los resultados cuantitativos muestran que la distancia de movimiento, la velocidad media y la velocidad máxima disminuyen significativamente en las larvas alimentadas con rotenona, y el tiempo de inmovilidad aumenta significativamente en las larvas alimentadas con rotenona. (F-K) Al igual que con las moscas adultas, el análisis de píxeles por cuadro, el tiempo de inmovilidad y los cambios de ángulo de dirección entre las moscas tratadas con rotenona (G, I, K) y sin rotenona (F, H, J) mostró que las larvas tratadas con rotenona tenían menor velocidad de movimiento, más tiempo de inmovilidad y alternaban sus direcciones. Los resultados revelan que el movimiento conductual del seguimiento de larvas alimentadas con rotenona se ve significativamente afectado en comparación con el control. Los resultados muestran una actividad locomotora defectuosa de moscas alimentadas con rotenona. Los datos son la media ± SEM de seis larvas de 3 días monitoreadas durante 5 min. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre los grupos (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; prueba t no pareada, p = 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de metodologías basadas en el seguimiento animal para la cuantificación de la actividad locomotora en Drosophila. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Hemos diseñado un método, basado en el material de código abierto AnimalTracker API compatible con el programa de procesamiento de imágenes de Fiji, que puede permitir a los investigadores evaluar sistemáticamente la actividad locomotora mediante el seguimiento de larvas adultas e individuales. AnimalTracke es una herramienta escrita en Java que puede integrarse fácilmente en bases de datos existentes u otras herramientas para facilitar el análisis del comportamiento de seguimiento de animales diseñado por la aplicación24. Tras un análisis cuadro por cuadro mediante una fórmula de cálculo de software que cuantifica la actividad locomotora de los adultos y las larvas, se pueden analizar de manera flexible varios parámetros, incluida la velocidad de movimiento, la distancia recorrida, la inmovilidad y los cambios de ángulo de dirección. Estos parámetros, que representan diferentes aspectos de la locomoción conductual, se pueden trazar para ilustrar los cambios locomotores a lo largo del tiempo. Además, al crear una interfaz gráfica de usuario, proporcionar documentación detallada sobre su uso y una interfaz de programación de aplicaciones, nuestro objetivo es hacer que este método sea accesible para los investigadores que carecen de experiencia en programación y usuarios experimentados que crean paradigmas experimentales personalizados.

Para verificar que el método puede monitorear con precisión el comportamiento, se han llevado a cabo pruebas locomotoras de moscas adultas y larvas tratadas con rotenona, así como una comparación de su actividad motora con la de las moscas de control alimentadas con el solvente del medicamento. El software Fiji, con sus complementos, se utiliza para analizar las coordenadas de píxeles de cada fotograma en la grabación de video del movimiento, lo que permite calcular la velocidad, la distancia y otros parámetros de las moscas experimentales. Observamos una disminución significativa en la distancia recorrida a lo largo del tiempo en la administración de rotenona (Figura 11), lo que es consistente con los resultados reportados23. Mientras tanto, la velocidad de movimiento ascendente y la dirección anormal elegida se han observado en grupos alimentados con drogas, para ayudar a ilustrar más detalles de la deficiencia de comportamiento en moscas. Dado el éxito en la detección de la actividad locomotora de las moscas adultas, buscamos evaluar la movilidad de las larvas (Figura 12). En comparación con el control, los resultados del seguimiento de larvas alimentadas con rotenona se vieron significativamente afectados, en paralelo a los de las moscas adultas alimentadas con medicamentos. Los experimentos con adultos y larvas alimentadas con rotenona sugieren que este método puede registrar con precisión la reducción de moscas que produjeron déficits locomotores en comparación con los controles. Este informe ha demostrado con éxito las aplicaciones del método actual en la cuantificación y análisis de la capacidad locomotora y otras facetas de los defectos de comportamiento de las moscas de la fruta en modelos de prueba o investigación farmacológica en animales.

Para garantizar que el análisis de video y seguimiento produzca resultados exitosos y reproducibles, se recomienda cumplir con las siguientes pautas. Primero, para la elección de la velocidad de fotogramas de video, recomendamos convertir el video grabado a un formato de 15 cuadros por segundo (fps). Esto no solo puede mantener un buen seguimiento de movimiento, sino también evitar la lentitud del análisis informático causado por grandes cantidades de datos. Al mejorar la velocidad de fotogramas de video, el análisis de trayectoria de movimiento se vuelve más detallado. En segundo lugar, los parámetros de la fórmula también se pueden ajustar para adaptarse al esquema experimental correspondiente al analizar el movimiento estático entre cada dos fotogramas. Para el monitoreo locomotor de larvas, es esencial usar gel de sílice en lugar de agar, ya que el gel de sílice solidificado está apretado y las larvas no pueden entrar en él. Además, el gel de sílice es transparente y se puede teñir agregando sustancia de color para producir un fondo óptimo, lo que facilita los efectos ópticos deseados que mejoran la calidad de la imagen.

Los sistemas de seguimiento de animales están avanzando para proporcionar soluciones integrales para las comunidades de etiología, neurociencia y genética del comportamiento. La Tabla 1 proporciona una comparación de las características de múltiples programas de seguimiento actualmente disponibles 10,11,12,16,17,25,26. Este enfoque es extremadamente rentable, fácil de aprender y preciso en la medición del comportamiento locomotor, sin requerir software y equipos costosos. No hay duda de que este método se puede extender convenientemente a otros modelos animales similares a Drosophila, e incluso a animales más grandes como ratas y ratones. La estructura de la API de AnimalTracker se puede ampliar con facilidad a través de aplicaciones o complementos independientes de ImageJ, ofreciendo una amplia gama de kits de herramientas útiles para la investigación y el análisis de comportamientos personalizados24. Sin embargo, este estudio tiene ciertas restricciones. Dado que una sola mosca se coloca en una arena de campo abierto para la grabación de imágenes y el seguimiento de video se realiza individualmente, este método es ineficiente y requiere mucho tiempo. Hemos intentado ampliar la capacidad para grabar múltiples arenas simultáneamente, permitiendo hasta seis grabaciones individuales. Teóricamente es posible registrar un mayor número de Drosophila simultáneamente; Esto depende del tamaño de la arena y la configuración de la cámara. Alternativamente, si los usuarios desean ampliar la grabación de Drosophila agrupados, se recomienda considerar el número limitado de registros individuales y una configuración de calidad suficiente para identificar colisiones y superposiciones entre las moscas. Las mejoras en la eficiencia de las pruebas mediante el aprendizaje automático no se consideraron en el estudio, ya que no se ha descubierto un enfoque asequible y compatible que pueda integrarse con el sistema actual para distinguir visualmente las identidades y rastrear los modelos con precisión.

En resumen, el método descrito aquí desarrolla y valida un enfoque eficiente y directo basado en software libre y de código abierto, diseñado para reducir el consumo de tiempo y refinar las técnicas experimentales para indicar y analizar cuantitativamente la locomoción de Drosophila en las etapas larva y adulta. A través del análisis sistemático, este método puede ayudarnos a comprender cómo cambia la velocidad del animal con el tiempo durante el movimiento, así como las características de la selección direccional. Por lo tanto, la incorporación de software de código abierto en dispositivos digitales de uso común proporciona una forma confiable de probar la actividad locomotora en varios modelos de moscas. Esto podría ser útil para evaluar los resultados locomotores fisiológicos y patológicos en la prueba de modelos de enfermedades neurodegenerativas derivadas del tratamiento farmacológico y la modificación transgénica en Drosophila , así como en otros animales.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por un fondo de lanzamiento especial de la Universidad de Soochow y la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC) (82171414). Agradecemos a los miembros del laboratorio del Prof. Chunfeng Liu por su discusión y comentarios.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal tracker Hungarian Brain Research Program version: 1.7 pfficial website: http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
Camera software Microsoft version: 2021.105.10.0 built-in windows 10 system
Computer DELL Vostro-14-5480 a comupter running win 10 system is available
Drosophila carbon dioxide anesthesia workstation Wu han Yihong technology #YHDFPCO2-018 official website: http://www.yhkjwh.com/
Fiji software Fiji team version: 1.53v official website: https://fiji.sc/
Format factory software Pcfreetime version: X64 5.4.5 official website: http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
Graph pad prism GraphPad Software version: 8.0.2 official website: https://www.graphpad-prism.cn
Hight definition camera TTQ Jingwang2 (HD1080P F1.6 6-60mm) official website: http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Office software Microsoft version: office 2019 official website: https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
Petri dish Bkman 110301003 size: 60 mm
Silica gel DOW SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Mix well according to the instructions
Sodium bicarbonate Macklin #144-55-8 Mix well with silica gel

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References

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Long, X., Du, H., Jiang, M., Meng, H. A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (192), e65092, doi:10.3791/65092 (2023).

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