Summary
Här presenteras en reproducerbar, prisvärd och robust metod för isolering och expansion av primära bronkialepitelceller för långsiktig biobankning och generering av differentierade epitelceller genom odling vid luft-vätskegränssnittet.
Abstract
Luftvägsepitelcellskiktet utgör den första barriären mellan lungvävnad och den yttre miljön och exponeras därmed ständigt för inandade ämnen, inklusive smittämnen och luftföroreningar. Luftvägsepitelskiktet spelar en central roll i ett stort antal akuta och kroniska lungsjukdomar, och olika behandlingar riktade mot detta epitel administreras genom inandning. Att förstå epitelets roll i patogenes och hur det kan riktas mot terapi kräver robusta och representativa modeller. In vitro-epitelodlingsmodeller används alltmer och erbjuder fördelen att utföra experiment i en kontrollerad miljö, utsätta cellerna för olika typer av stimuli, toxiska ämnen eller smittämnen. Användningen av primära celler istället för odödliga eller tumörcellinjer har fördelen att dessa celler differentieras i kultur till ett pseudostratifierat polariserat epitelcellskikt med en bättre representation av epitelet jämfört med cellinjer.
Här presenteras ett robust protokoll, som har optimerats under de senaste decennierna, för isolering och odling av luftvägsepitelceller från lungvävnad. Denna procedur möjliggör framgångsrik isolering, expansion, odling och mukociliär differentiering av primära bronkialepitelceller (PBECs) genom odling vid luft-vätskegränssnittet (ALI) och inkluderar ett protokoll för biobankning. Vidare beskrivs karakteriseringen av dessa kulturer med hjälp av cellspecifika markörgener. Dessa ALI-PBEC-kulturer kan användas för en rad applikationer, inklusive exponering för hel cigarettrök eller inflammatoriska mediatorer och samkultur/infektion med virus eller bakterier.
Protokollet i detta manuskript, som illustrerar förfarandet steg för steg, förväntas ge en grund och/eller referens för dem som är intresserade av att implementera eller anpassa sådana odlingssystem i sitt laboratorium.
Introduction
Luftvägsepitelets roll i en mängd akuta och kroniska lungsjukdomar har beskrivits i olika recensioner 1,2,3,4,5,6,7. Väl differentierade kulturer av luftvägsepitelceller är ett viktigt verktyg för att avslöja luftvägsepitelets roll. Luft-vätskegränssnitt (ALI) luftvägsepitelcellodling används i stor utsträckning för att främja differentieringen av luftvägsbasala epitelceller och därigenom studera luftvägsepitelet på ett tillförlitligt sätt in vitro 8,9. Under de senaste åren har användningen av sådana modeller ökat ytterligare till följd av nya forskningsinitiativ relaterade till COVID-19-pandemin och en global övergång till djurfri forskning. Därför betonar den ökade användningen av denna modellcellinje behovet av att dela procedurer och erfarenheter för att få robusta resultat. Detta kommer också att göra det möjligt att jämföra resultat mellan forskargrupper. Förfarandets robusthet är den viktigaste egenskapen och måste därför genomgå kvalitetskontroll. Flera laboratorier har investerat i att utveckla protokoll för odling av primära luftvägsepitelceller vid ALI. Tiden, ansträngningen och den budget som krävs kan minskas när dessa procedurer delas i detalj. Dessa detaljer inkluderar till exempel valet av cellodlingsplast och media som tillhandahålls av olika tillverkare, eftersom detta visade sig påverka egenskaperna hos de erhållnakulturerna 10,11,12. Detta betonar vikten av att utbyta erfarenheter och detaljer om kulturförfaranden, eftersom resultaten kan påverkas och/eller valideringsinsatser i olika laboratorier kan hämmas i avsaknad av sådana insikter.
Det mänskliga lungepitelet består av olika celltyper, inklusive huvudtyper såsom basalceller, cilierade celler, bägarceller och klubbceller. För att på ett tillförlitligt sätt efterlikna epitelcellskiktet i luftvägarna in vitro måste dessa celltyper representeras i odlingsmodellerna, och deras polarisering och funktion bibehålls13,14,15,16. Insikten att donatoregenskaper (inklusive sjukdomstillstånd) och cellernas anatomiska ursprung (dvs. nasal, trakeal, stora och små luftvägar) kan påverka cellkulturens cellulära sammansättning och funktionella svar är lika viktigt. Relevant expertis och övning är en förutsättning för att framgångsrikt odla primära luftvägsepitelceller och bedöma kulturens kvalitet både intuitivt (genom visuell inspektion under odling) och kvantifierbart. Syftet med detta bidrag är att tillhandahålla en kostnads- och tidseffektiv metod för isolering och odling av primära humana bronkialepitelceller (PBECs) som också kan tillämpas på odling av trakealceller och små luftvägsepitelceller. Förutom att beskriva en metod för att isolera sådana celler från resekterad lungvävnad presenteras och diskuteras en metod för expansion och biobankning, och slutligen för etablering och karakterisering av en väl differentierad ALI-kultur inom rimlig kostnad och tidsperiod.
Protocol
Celler isolerades från makroskopiskt normal lungvävnad erhållen från patienter som genomgick resektionskirurgi för lungcancer vid Leiden University Medical Center, Nederländerna. Patienter från vilka denna lungvävnad härrörde inkluderades i biobanken via ett system utan invändningar för kodad anonym vidare användning av sådan vävnad (www.coreon.org). Sedan 2022-09-01 är patienter dock inskrivna i biobanken med aktivt informerat samtycke i enlighet med lokala bestämmelser från LUMC-biobanken med godkännande av den institutionella medicinska etiska kommittén (B20.042/Ab/ab och B20.042/Kb/kb).
OBS: Alla procedurer utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp, enligt lokala biologiska säkerhetsregler, och under sterila arbetsförhållanden medan du bär kirurgiska handskar och en labbrock, om inte annat anges. För alla medier, reagenser och andra lösningar som används i protokollet, se materialförteckningen och kompletterande tabell 1. Se figur 1 för detaljerade protokollsteg
1. Isolering av bronkialepitelceller från mänsklig lungvävnad
OBS: För att uppnå en optimal framgångsgrad för bronkial epitelcellsisolering bör den utskurna bronkialringen hållas nedsänkt vid 4 °C i högst 24 timmar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Primocin tillsatt.
- Förberedelser innan förfarandet inleds
- Bered en beläggningslösning i PBS, enligt beskrivningen i kompletterande tabell 1, och belägg ett lämpligt antal 6-brunnsplattor med 1,5 ml beläggningslösning per brunn. Inkubera i 2 timmar i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
OBS: Antalet brunnar som ska beläggas beror på storleken på den utskurna vävnaden. Som en grov riktlinje beläggs fyra 6-brunnsplattor när den utskurna bronkialringen är 10 mm i diameter och 4 mm i bredd. - Bered fullständigt serumfritt keratinocytmedium (c-KSFM) enligt beskrivningen i kompletterande tabell 1. använd 2 ml av mediet per brunn på en 6-brunnsplatta.
OBS: Denna c-KSFM kan förvaras vid 4 °C i 7 dagar. c-KSFM är ett kalciummedium som används för expansion av luftvägsepitelceller samtidigt som tillväxten av kontaminerande fibroblaster hämmas.
- Bered en beläggningslösning i PBS, enligt beskrivningen i kompletterande tabell 1, och belägg ett lämpligt antal 6-brunnsplattor med 1,5 ml beläggningslösning per brunn. Inkubera i 2 timmar i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Rengör bronkialringen genom att försiktigt skölja ringen i 10 ml steril PBS i en 10 cm petriskål. Använd pincett för att försiktigt hålla ringen (rör endast utanför) och en liten sax för att ta bort överflödig bindväv och blodrester. För vidare bearbetning, skär ringen i två.
OBS: Alla verktyg som används i processen ska steriliseras före användning. - Sänk ner de två halvorna av bronkialringen i 10 ml av en förvärmd lösning av proteas XIV (1,8 mg / ml) i Hanks balanserade saltlösning (HBSS), inklusive primocin i en sluten steril behållare, och inkubera i exakt 2 timmar vid 37 ° C i en cellodlingsinkubator.
HBSS används som spädningsmedel för proteas XIV för att lösgöra cellerna från vävnaden under en inkubationsperiod på 2 timmar. HBSS är en balanserad isoton lösning som möjliggör upprätthållande av cellviabilitet under kortvariga inkubationer. - Efter inkubationen, överför vävnadsbitarna till en petriskål med 10 ml varm PBS och skrapa insidan av ringen med böjd pincett för att erhålla en celllösning.
OBS: Vävnaden verkar mjukare och något expanderad. - Kassera ringen, överför celllösningen till ett 50 ml rör och tillsätt varm PBS för att erhålla en slutlig volym på 50 ml. Centrifugera i 7 min vid 230 x g och vid rumstemperatur (RT).
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 10 ml varm PBS. Fyll vidare volymen upp till 50 ml med varm PBS. Centrifugera i 7 min vid 230 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i en lämplig mängd varm c-KSFM innehållande Primocin.
OBS: Primocin används i minst 7 dagar för att eliminera bakterier, svampar eller (viktigare) mykoplasma som kan ha varit närvarande i vävnaden; Efter 7 dagar är tillsats av endast penicillin/streptomycin till mediet tillräckligt. - Aspirera beläggningslösningen från 6-brunnsplattorna och tillsätt 2 ml cellsuspension per brunn.
- Låt cellerna växa tills 80% till 90% sammanflöde uppnås och byt medium tre gånger per vecka (t.ex. varje måndag, onsdag och fredag). Den önskade graden av sammanflöde uppnås vanligtvis mellan 7 och 14 dagar; Om den tid som krävs för att nå önskad sammanflöde överstiger 14 dagar, kassera cellerna.
OBS: Under de första dagarna börjar endast ett litet antal celler föröka sig; Grupper av celler är märkbara efter några dagar.
2. Kryokonservering av humana primära bronkialepitelceller (PBECs)
OBS: Vid arbete med temperaturer på -80 ° C och -196 ° C används kryohandskar för skydd och pincett används för att överföra frysta flaskor. Vid arbete med flytande kväve används kryohandskar och ansiktsskydd för personligt skydd.
- Aspirera mediet och tvätta brunnarna en gång med 2 ml varm PBS per brunn.
- Trypsinisera cellerna genom att tillsätta 0,5 ml mjukt trypsin per brunn (se kompletterande tabell 1 för sammansättning av den mjuka trypsinlösningen). Inkubera cellerna i 5 till högst 10 minuter vid 37 °C. Snurra trypsinlösningen i plattan och släpp cellerna genom att försiktigt knacka på plattan.
- Överför de fristående cellerna till ett 50 ml centrifugrör innehållande 1,1 mg / ml sojaböntrypsinhämmare (SBTI; för att hämma trypsinaktivitet) upplöst i KSFM med penicillin / streptomycin. Volymen SBTI måste vara dubbelt så stor som den totala volymen mjukt trypsin (dvs 1 ml per brunn).
OBS: Lägg inte till SBTI direkt i brunnarna, eftersom cellerna kommer att fästa igen inom några minuter. - Centrifugera röret i 7 minuter vid 230 x g vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och suspendera de pelleterade cellerna igen i 10 ml RT KSFM innehållande penicillin/streptomycin men inga andra tillsatser. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Utför ett levande / dött cellantal genom att lägga till trypanblått i förhållandet 1: 1, eller använd en alternativ levande / död cellräkningsprocedur.
- Kryokonservera cellerna i en koncentration av 400 000 celler per ml frysmedium (se kompletterande tabell 1 för sammansättning) och tillsätt 1 ml av denna suspension per kryovial. Överför kryovialerna till en kylcellsbehållare och placera den vid -80 ° C. Efter 24 timmar, överför injektionsflaskorna till -196 °C flytande kväve för långtidsförvaring.
OBS: Två alternativ är möjliga för att överföra cellerna till frysmedium, som båda fungerar bra: 1) Pellet cellerna igen genom centrifugering och resuspendera i kallt frysmedium vid önskad cellkoncentration; eller 2) tillsätt kallt frysmedium och justera koncentrationen av kryokonserveringsmedlet (dimetylsulfoxid [DMSO]) baserat på volymen KSFM där cellerna finns.
3. Tina kryokonserverade PBEC och odla dem för odling på skär
- Belägg en T75-cellodlingskolv över natten med 10 ml beläggningslösning i PBS med locken tätt stängda. Inkubera kolven i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och 5 %CO2.
- Innan du tinar de kryokonserverade PBEC, ta bort beläggningslösningen från kolven och fyll den med 10 ml c-KSFM. Låt den värmas till 37 °C i en cellodlingsinkubator med lätt öppnade lock för att släppa in inkubatorluft.
- Tina cellerna snabbt i ett 37 °C vatten- eller pärlbad.
OBS: Ett pärlbad är att föredra framför ett vattenbad på grund av den lägre risken för kontaminering och lägre energiförbrukning. - Tillsätt hela kryovialinnehållet till den förvärmda T75-kolven med medium (steg 3.2) och fördela cellerna jämnt.
OBS: Centrifugera inte cellerna i detta skede, eftersom de inte kommer att överleva centrifugeringssteget. - Efter ca 4 timmar, se till att cellerna är tillräckligt fästa. Byt ut mediet mot 10 ml färsk, varm c-KSFM.
OBS: På detta sätt avlägsnas DMSO från frysmediet. Detta steg bör äga rum mellan 4 och 24 timmar efter sådd av cellerna i kolven. - Odla cellerna tills 80% till 90% sammanflöde uppnås, byt medium varje måndag, onsdag och fredag.
4. Upprättande av en gränskultur mellan luft och vätska med primära bronkialepitelceller (ALI-PBEC)
Anmärkning: Följande förfarande gäller för odling av PBEC på skär med 11,9 mm innerdiameter.
- Belägg ett lämpligt antal cellodlingsinsatser med 0,4 ml beläggningslösning per insats. Inkubera över natten vid 37 °C i en cellodlingsinkubator.
- Bered ett komplett BD-medium (cBD-medium) enligt beskrivningen i kompletterande tabell 1.
OBS: cBD-medium är ett sammansatt medium (se kompletterande tabell 1) formulerat för att stödja tillväxten av bronkialepitelceller under längre tidsperioder, samtidigt som deras differentiering tillåts efter en ökning av retinsyra (RA) (eller en analog av RA som används i detta protokoll) koncentration och odling vid ALI, som beskrivs i steg 4.10. - Trypsinisera PBEC-ämnena i T75-kolven med 2 ml mjukt trypsin per kolv. Inkubera cellerna i 5 till 10 minuter så att cellerna kan lossna (baserat på visuell inspektion). Efter 5 minuters inkubation, underlätta lossnandet av cellerna genom att virvla trypsinet i kolven och knacka försiktigt på kolven (upprepa vid behov).
- Tillsätt 4 ml SBTI till kolven och överför cellsuspensionen direkt till ett 25 ml centrifugrör.
OBS: Cellerna återfästs inom några minuter. Vid arbete med mer än en kolv måste därför cellsuspensionen som erhållits i steg 4.4 överföras direkt till ett centrifugrör innan SBTI tillsätts till en andra kolv. Vid förfarandet bearbetas högst fem kolvar samtidigt. - Centrifugera rören i 7 minuter vid 230 x g vid rumstemperatur.
- Resuspendera cellerna i 6 ml cBD-medium och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Utför en levande / död cellräkning genom att till exempel lägga till trypanblå i ett 1: 1-förhållande eller använda en annan levande / död cellräkningsprocedur.
- Ta bort beläggningslösningen från cellodlingsinsatserna.
- Späd cellsuspensionen, genererad i steg 4.6, med cBD-medium kompletterat med 1 nM EC 23 till en koncentration av 80 000 celler per ml och tillsätt 0,5 ml på toppen av membranet i skäret. Tillsätt 1,5 ml cBD-medium kompletterat med 1 nM EC 23 till brunnen under skäret.
- Byt medium med cBD-medium kompletterat med 1 nM EC 23 tre gånger i veckan tills kulturerna är redo för luftexponering (dvs 2 dagar efter att 100% sammanflöde har uppnåtts). Varje gång tillsätts 0,5 ml av mediet inuti insatsen (på cellerna) och 1,5 ml läggs till bottenfacket (brunnen).
OBS: I allmänhet når cellskiktet 100% sammanflöde ungefär 5 dagar efter sådd av PBEC: erna på insatserna. Baserat på den visuella inspektionen av cellernas sammanflöde fattas beslutet att överföra cellerna till ALI-stadiet 2 dagar senare. - När cellerna är klara för överföring till ALI (dvs. 2 dagar efter att ha nått 100% sammanflöde), ta bort mediet från insatserna och brunnen, lägg inte till nytt medium inuti insatsen och tillsätt nytt medium (1 ml cBD-medium kompletterat med 50 nM EC 23) endast till brunnen. Byt medium i brunnarna tre gånger i veckan.
- För att avlägsna överflödigt slem och cellulärt skräp, tillsätt försiktigt 200 μL varm PBS på den apikala sidan av cellskiktet inuti insatsen (helst via sidan av insatsen och inte genom direkt pipettering på cellerna) och inkubera i 10 minuter i en cellodlingsinkubator vid 37 °C. Aspirera sedan PBS för att ta bort överflödigt slem och cellulärt skräp.
OBS: Från denna punkt och framåt (början av ALI-kulturen), innan du byter medium i det nedre facket, tvätta den apikala sidan av cellerna med PBS varje gång. - Odla cellerna vid ALI i minst 2 veckor för att se till att alla större celltyper är representerade.
5. Etablera en ALI-PBEC-kultur från en blandad givarpopulation
- Använd celler från upp till fem enskilda donatorer för att starta PBE-kulturer från en blandad population.
- Blanda lika många celler per givare med hjälp av cellerna som genererades i steg 4.7 för att nå totalt 150 000 celler per insats (dvs. 30 000 celler per givare när du använder fem givare). Detta kommer att säkerställa att spridningen i insatsen hålls till ett minimum och lika många celler från de enskilda givarna finns i kulturen.
- Fortsätt ALI-PBEC-kulturen enligt beskrivningen i steg 4.9-4.12.
6. Kvalitetskontroll av ALI-PBEC-kulturen
- Övervakning av transepitelialt elektriskt motstånd (TEER) under cellodling
OBS: Den elektriska motståndsmätningen, baserad på användning av en voltohmmeter, kan utföras när som helst under ALI-PBEC-kulturen och utförs varje gång enligt samma protokoll under samma förhållanden, eftersom den elektriska motståndsmätningen påverkas av olika variabler, inklusive elektrodposition, temperatur, medium och hantering. TEER kan beräknas med hjälp av det uppmätta elektriska motståndet genom att tillämpa följande formel baserad på Ohms lag:
, där Rm är det uppmätta elektriska motståndet, Rb är baslinjen elektriskt motstånd för en insats utan beläggning och celler, och SA är ytan på membranet på insatsen17.- Tillsätt försiktigt 200 μL varm PBS till den apikala sidan av cellskiktet för att avlägsna slem och skräp på cellerna. Inkubera insatsen i 10 minuter i en cellodlingsinkubator vid 37 °C och avlägsna PBS igen.
- Tillsätt försiktigt 700 μl varm PBS till den apikala sidan av cellskiktet och inkubera insatsen i 10 minuter vid rumstemperatur för att möjliggöra stabilisering av temperaturen för mätningar.
- Kalibrera voltohmmetern med 1 000 Ω testmotstånd, ställ in voltohmmetern för att mäta ohm och använd en skruvmejsel för att justera kalibreringsskruven "R ADJ" tills den är inställd på 1 000 Ω.
- Skölj elektroden genom att flytta den upp och ner några gånger i sterilt vatten (RT) och sedan i steril PBS (RT).
- Mät det elektriska motståndet hos cellskiktet i insatserna. För detta ändamål, placera elektroden i vertikalt läge i brunnen med elektrodens långa arm som vidrör plattans botten. På så sätt är den korta armen ovanför cellskiktet inuti insatsen. Läs värdet som visas på voltohmmetern.
OBS: Det visade värdet stabiliseras inte helt; Läs värdet i det ögonblick som värdet är intermittent. - Mellan mätningarna, rengör elektroden genom att flytta den upp och ner några gånger i steril PBS (RT).
- Rengör elektroden när mätningarna är klara genom att flytta den upp och ner några gånger i sterilt vatten (RT), steril PBS (RT) och 70% etanol (RT). Förvara elektroden torr.
- Utför en baslinjemätning av ett skär (utan beläggning) och celler genom att tillsätta 700 μl varm PBS inuti skäret och 1 ml varm PBS i brunnen och mäta det elektriska motståndet tillsammans med de andra insatserna.
- Utvärdering av den cellulära sammansättningen av ALI-PBEC-kulturen
- Under ALI-stadiet, kontrollera differentieringen genom att visuellt bedöma att slå cilia. Dessa kan observeras via standard ljusfältmikroskopi så tidigt som 9 dagar efter luftexponering på den apikala sidan av cellerna.
OBS: Att slå cilia är bäst synliga direkt efter tvättning av apikalytan. Bägge celler producerar slem, och därför är närvaron av slem, som observerats under tvättning av den apikala ytan, ett tecken på att bägge celler bildas. Nivån av bägarceller och mängden slem som produceras är dock mycket givarberoende. Närvaron av slem kan ses vid aspirering av PBS efter tvättning av cellskiktets apikala yta i insatsen; i detta fall är den aspirerade PBS mer viskös och slemtrådar kan observeras vid aspirering. - Utvärdering av den cellulära kompositionen med hjälp av immunfärgningar och fluorescerande mikroskopi eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), eller genuttrycksanalys genom realtidskvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) ger viktig information om kulturens differentieringstillstånd, men dess beskrivning ligger utanför ramen för detta bidrag.
- Under ALI-stadiet, kontrollera differentieringen genom att visuellt bedöma att slå cilia. Dessa kan observeras via standard ljusfältmikroskopi så tidigt som 9 dagar efter luftexponering på den apikala sidan av cellerna.
Figur 1: Schematisk översikt över isolering, expansion och odlingsprocedur för primära bronkialepitelceller . (A) Lungvävnad erhålls under cancerresektionskirurgi och patologen exciserar bronkialringvävnad som är makroskopiskt normal och tumörfri. (B) Bronkialringen rengörs och utsätts för enzymatisk behandling för att lossna och dissociera cellskiktet. (C) Den hämtade cellsuspensionen tvättas och cellerna fördelas i brunnar på en 6-brunnsplatta för expansion. (D) Vid tillräcklig expansion av de isolerade cellerna i c-KSFM med Primocin dissocieras cellskikten genom trypsinisering och cellerna återsuspenderas i frysmedium för kryokonservering. Vid behov tinas kryokonserverade celler och expanderas igen med c-KSFM med penicillin/streptomycin i cellodlingskolvar. Efter expansion såddes de i cBD-medium på cellodlingsinsatser; (Ea) ALI-PBEC-kulturen äger rum i två huvudfaser: det nedsänkta steget i cBD-medium kompletterat med 1 nM EC 23 tills cellerna når full sammanflöde, följt av avlägsnande av apikalt medium och kultur vid ALI för att möjliggöra differentiering; i denna ALI-fas odlas cellerna i cBD-medium kompletterat med 50 nM EC 23. (Eb) Grafisk representation av basalceller som täcker insatsen under nedsänkt kultur. (EG) Grafisk representation av det differentierade epitelcellskiktet erhållet efter odling vid ALI i närvaro av ökade koncentrationer av EC 23. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Expansion med nedsänkt kultur
Med hjälp av metoden som presenteras här kan i genomsnitt åtta kryovialer med 400 000 celler/kryovial erhållas från en 6-brunnsplatta för långtidsförvaring i flytande kväve (figur 2A). För att uppnå detta odlas isolerade PBECs i 6-brunnsplattor i minst 7 dagar och högst 14 dagar (figur 2B) i närvaro av Primocin för att utesluta mikrobiell (särskilt mykoplasma) kontaminering. Figur 2A,B ger insikt i erhållna cellnummer och erforderlig odlingstid bland olika isoleringar från olika givare. Innan cellerna skördas genom trypsinisering för lagring i flytande kväve måste sammanflödet vara över 80%. Om detta inte uppnås inom 14 dagar ska cellerna inte fryskonserveras. Det är viktigt att vid skörd för lagring och passering bör cellskiktets sammanflöde inte överstiga ~ 95% (figur 2C). Efter lagring i flytande kväve kan cellerna tinas och odlas för expansion tills tillräckligt cellantal erhålls för ALI-kulturer. Mediet som används för expansion av cellerna i detta skede är c-KSFM, liknande som under den initiala odlingen efter skörd från bronkialringen18. Det finns dock inget behov av Primocin i detta skede, eftersom risken för ytterligare mikrobiell kontaminering från lungvävnaden saknas, och därför kan Primocin ändras mot penicillin/streptomycin. Detta medium gynnar epitelceller över fibroblaster och förhindrar därför eventuell överväxt av kulturen genom snabbare prolifererande fibroblaster 19,20,21. Med hjälp av c-KSFM-medium sprids cellerna ut i kolven och ansluter inte till varandra, vilket skiljer sig markant från morfologin hos odlade celler nedsänkt i detta skede i cBD-medium (figur 2D,E). Efter 5 eller 6 dagars odling av de tinade cellerna i en T75-kolv bör cellskiktet vara 80% -95% sammanflytande, vilket innebär cirka 3 x 106 celler totalt (figur 2F). Från detta kan cirka 75 skär (12-brunnsplattstorlek) genereras för ALI-odling.
Metoden för isolering och odling som beskrivs i detta bidrag kan också anpassas för användning med bronkialbiopsier eller bronkialborstar som utgångsmaterial.
Figur 2: Basalcellsexpansion före och efter kryokonservering. Celler isolerades enligt det beskrivna protokollet och odlades med användning av c-KSFM. Antalet celler som genererades per donator övervakades, antalet levande celler utfördes med hjälp av en automatiserad cellräknare (A) vid skörd av passage 0 (P0) -cellerna från 6-brunnsplattorna (steg 2 i protokollet), n = 123 givare, presenterades cellantalet som antalet celler som skördats per brunn; Varje punkt representerar en givare och medianen indikeras med en horisontell stapel. (B) Som en del av kvalitetskontrollen övervakades den tid som P0-cellerna behövde för att nå 80% till 90% sammanflöde i 6-brunnsplattorna och visades som dagar efter att den nedsänkta kulturen startats i c-KSFM (n = 127 olika givare). Varje enskild givare indikeras med en punkt, alla prickar som tillhör 1 dag smälter samman till en linje; ju bredare linjen är, desto fler givare står den för; Medianantalet dagar cellerna är i odling indikeras av en tunnare horisontell stapel. (C) Representativ ljusfältsbild av P0-celler odlade nedsänkt i c-KSFM vid den tidpunkt då cellerna skördades för långvarig kryokonservering. (D) Representativ ljusfältsbild av P1-celler odlade nedsänkt i c-KSFM vid den tidpunkt då cellerna skördades och överfördes till inlägg och (E) P1-celler odlade nedsänkta i cBD-medium. (F) Antalet levande celler som genererades per givare övervakades med hjälp av en automatisk cellräknare vid skörd av P1-celler från T75-kolven (avsnitt 4 i protokollet), n = 63 olika givare. cellantalet presenteras som antalet celler per T75-kolv, varje givare indikeras med en punkt och mediancellantalet indikeras med en horisontell stapel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kultur för luft-vätskegränssnitt (ALI)
Vid 7 dagar efter start av ALI-kulturen mäts cellskiktets elektriska motstånd och bör vara mer än 300 Ω (figur 3A); Om detta inte uppnås betraktas kulturen som misslyckad på grund av en eventuell brist på tät korsningsbildning. Det rekommenderas att utesluta möjligheten att få låga TEER-värden orsakade av skador på epitelskiktet i enskilda skär till följd av till exempel skador på cellskiktet under tvätt och aspiration. Detta kan kontrolleras genom visuell mikroskopisk inspektion av odlingsinsatserna. Enligt vår erfarenhet kan variationen mellan givarna i elektriskt motstånd vara signifikant (figur 3B), vilket också rapporteras i litteraturen14, och som observerats påverkas också markant av ursprunget till Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) som används (figur 3C).
Figur 3: Transepitelialt elektriskt motstånd som en kvalitetskontroll av ALI-PBEC-kulturer. PBEC isolerades och utvidgades, och väl differentierade ALI-PBEC-kulturer etablerades. Vid flera tidpunkter under odlingen mättes elektriskt motstånd och därefter beräknades TEER (Ω · cm2). (A) Elektriskt motstånd mättes under 14 dagar efter ALI. n = 4 olika givare. Uppgifterna visas som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). (B) Som en del av ALI-PBEC cellodlingskvalitetskontroll mättes elektriskt motstånd vid dag 7 (n = 50) och dag 14 post-ALI (n = 25); varje punkt representerar en givare och median TEER (Ω · cm2) indikeras med en horisontell stapel. Data testades för signifikans med hjälp av ett icke-parametriskt Mann-Whitney-test, och ingen signifikant skillnad hittades. (C) Media från tre olika DMEM-leverantörer testades för att bedöma påverkan på TEER-bildningen. n = 4 olika givare; medelvärden visas ± SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Samtidigt som man etablerar en väl differentierad ALI-PBEC-kultur, från början av luftexponeringen, ökar koncentrationen av RA22. På så sätt växlar cellerna från proliferation till mukociliär differentiering, vilket är synligt så tidigt som 9 dagar (givarberoende) efter luftexponering med hjälp av ljusfältmikroskopi. Rörelsen av de första cilierna är synlig vid denna punkt, och något tidigare när den baseras på genuttryck av markörer för differentierade luminala celler23 (figur 4).
Som beskrivs i protokollet kan slemproduktion också observeras vid sköljning av den apikala ytan under medieförändringen. RA är mycket ljuskänslig, vilket leder till mycket varierande aktivitet vid samma beståndskoncentration. Av denna anledning ersätts RA med den syntetiska RA-analogen EC 23 och används i samma koncentration, med liknande resultat som bestäms experimentellt. Av detta skäl och för att undvika att ändra förfarandet hölls den valda EC 23-koncentrationen lika med RA-koncentrationen (dvs. 50 nM) som tidigare använts24,25 (figur 5). Figur 5A visar de TEER-värden som uppnås vid användning av olika koncentrationer av EC 23, som visar en maximal TEER vid 50 nM inom detta intervall av testade koncentrationer. Resultaten som visas i figur 5B bekräftar att genuttrycket av markörer för cilierade celler och bägarceller är likartade vid användning av 50 nM EC 23 eller RA. EC 23 krävs också under odling i nedsänkt stadium (även om det är i en mycket lägre koncentration), eftersom utelämnande av det i detta nedsänkta stadium och endast tillsats av det i ALI-stadiet resulterar i en kultur som aldrig når full sammanflöde. Den tid som behövs för att generera en väldifferentierad ALI-PBEC-kultur med synlig ciliär slagaktivitet och slemproduktion är cirka 14 dagar, och de flesta experimenten initieras därför mellan 14-21 dagars ALI-kulturer (figur 4). Alla de viktigaste olika celltyperna (basala, cilierade, bägare och klubbceller) observeras vid 14 dagars ALI-odling, även om uttrycksnivåerna är mycket givarberoende. Detta demonstreras genom att bedöma genuttryck av TP63, FOXJ1, MUC5AC och SCGB1A1 med RT-qPCR, eller proteinuttryck med antikroppar riktade mot p63, α-tubulin, Muc5AC och CC-16 genom immunfluorescens (IF) färgning, för att detektera markörer för basala, cilierade, bägare och klubbceller, respektive25,26. Medan 14–21 dagar kan betraktas som en tumregel för de flesta experiment, kan dock en längre differentieringstid övervägas för utvalda experiment, vilket har konstaterats för xenobiotisk metabolism, SARS-CoV-2-infektion och bedömningen av mukociliär clearance27,28,29.
Figur 4: Gränssnittskultur för luft och vätska (ALI). PBEC isolerades och utvidgades, och väl differentierade ALI-PBEC-kulturer etablerades. ALI-PBEC-kulturer övervakades under 14 dagar efter ALI. Cellkulturer lyserades för isolering av RNA dag 0, 7 och 14 efter ALI. Data från två olika givare visas, varje punkt representerar en enskild givare som övervakas över tid och medianen indikeras med en horisontell stapel. Genuttryck av basala, cilierade, bägare och klubbcellmarkörer (TP63, FOXJ1, MUC5B respektive SCGB1A1) mättes med qPCR och normaliserades för RPL13A- och ATP5B-genuttryck (se referens 23 för detaljer). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse av retinsyra (RA) och dess syntetiska analog EC 23. PBEC isolerades och utvidgades, och väl differentierade ALI-PBEC-kulturer etablerades. När PBEC-kulturerna började exponeras för luft ersattes RA (50 nM) med olika koncentrationer av EC 23. (A ) Elektriskt motstånd mättes vid dag 14 post-ALI och därefter beräknades TEER (Ω · cm 2), n =2 givare, staplarna visar medelvärdet ± SD. ( B) Vid dag 14 post-ALI lyserades cellkulturer för RNA-isolering och efterföljande genuttrycksanalys av cellmarkörer för respektive cilierade och bägarceller (FOXJ1, MUC5AC) med qPCR, och normaliserad för RPL13A (n = 3 givare). En veckökning visas mot ALI-PBEC odlad med 50 nM RA och avbildad som medelvärdet ± SD. (Se referens 23 för detaljer) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Under de senaste åren har prestandan hos alternativa produkter i kultursystemet undersökts, såsom media och kulturplast. Det fanns olika skäl till sådana utvärderingar, inklusive förändringar i medelsammansättningen av tillverkarna, nya medier som infördes samt brist på produkter under COVID-19-pandemin (2020-2022). Observationen gjordes att liknande produkter från olika leverantörer resulterar i differentierade epitelcellkulturer baserat på bedömningen av markörer för epitelcelltyper, även om den slutliga cellulära sammansättningen kan variera avsevärt (figur 6A), medan skillnaderna i TEER var mindre uttalade (figur 6B). Å andra sidan resulterade medium från olika leverantörer i väsentliga skillnader i cellulär sammansättning; Vid användning av skär från olika märken var sådana skillnader begränsade (figur 6C). I synnerhet vid användning av luftvägsepitelcellodlingsmediet PneumaCult från STEMCELL Technologies observerades en annan morfologi och snabbare bildning av synlig ciliär aktivitet. Förutom dessa observationer noterades också en skillnad i TEER-värden och en skillnad i cellulär sammansättning av ALI-PBEC jämfört med cBD-medium (figur 6D).
Figur 6: Jämförelse av olika leverantörer av epitelcellmedium och cellodlingsinsatser. PBEC isolerades, expanderade och väl differentierade ALI-PBEC-kulturer etablerades. (A) ALI-PBECs odlades i 14 dagar, och sedan lyserades cellskikten för RNA-isolering. Genuttryck av basala, cilierade, bägare och klubbcellmarkörer (TP63, FOXJ1, MUC5AC respektive SCGB1A1) mättes med qPCR och normaliserades för RPL13A och ATP5B. n = 2 givare; staplarna visar medelvärdet ± SD. (B) Under 9 dagar efter ALI mättes elektriskt motstånd och därefter beräknades TEER (Ω · cm2). n = 3 olika givare; medelvärden avbildas ± SD. (C) ALI-PBEC odlades i 14 dagar med hjälp av cellodlingsinsatser som köpts från tre olika leverantörer, och sedan lyserades cellskikten för RNA-isolering. Genuttryck av cilierade, bägare och klubbcellmarkörer (FOXJ1, MUC5AC respektive SCGB1A1) mättes med qPCR och normaliserades för RPL13A. n = 18 olika givare, staplarna visar medelvärdet ± SD. Data testades för signifikans med hjälp av ett enkelriktat ANOVA icke-parametriskt Kruskal-Wallis-test och ingen signifikant skillnad hittades. (D) ALI-PBECs odlades antingen i cBD-medium eller PneumaCult-medium (STEMMCELL-teknik) i 14 dagar efter ALI, och sedan lyserades cellskikten för RNA-isolering. Genuttryck av basala, cilierade, bägare och klubbcellmarkörer (TP63, FOXJ1, MUC5B respektive SCGB1A1) mättes med qPCR och normaliserades för RPL13A (staplarna visar medelvärdet ± SD), och elektriskt motstånd mättes vid dag 5 och 12 post-ALI och användes för att beräkna TEER (Ω · cm2). n = 2; medelvärdet avbildas ± SD (se referens 23 för detaljer). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Sammansättning av de lösningar och medier som används i protokollet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver isoleringen av humana bronkialepitelceller från resekterad lungvävnad, en metod för optimal expansion av celler utan förlust av differentieringspotential, ett kryokonserveringsförfarande och ett förfarande för att generera väldifferentierade ALI-PBEC-kulturer. Dessutom ges en beskrivning av kvalitetskontroll samt instruktioner för övervakning och utvärdering av de differentierade ALI-PBECs.
Det beskrivna protokollet börjar med en makroskopiskt normal, tumörfri bronkialring som resekteras från en lunglob från patienter som genomgår operation relaterad till deras lungcancerdiagnos. Det bör därför noteras att dessa ringar strikt inte kan betraktas som frisk vävnad, vilket därför kan påverka cellodlingsegenskaperna. Alternativa källor för att erhålla bronkialepitelceller inkluderar användning av bronkialbiopsier, bronkialborstningar eller vävnad från en transplantationsgivare eller mottagande lungor. Oavsett källa bör en risk för mikrobiell kontaminering beaktas vid användning av lungvävnad, och därför används antibiotika i de olika odlingsmedierna för att minska risken för mikrobiell kontaminering av cellkulturen. I synnerhet är mykoplasma en hög och vanlig risk vid cellodling på grund av dess många olika effekter på cellodling, resistens mot antibiotika som vanligtvis används i cellodling och det faktum att mykoplasmakontaminering endast kan bekräftas genom mykoplasmadetektionsanalyser. Därför används i det inledande skedet av cellodling efter isolering av celler från lungvävnad den bredspektrum antimikrobiella formuleringen Priprimcin, och under odlingsprocessen testas slumpmässigt utvalda prover för närvaro av mykoplasma.
Isoleringsproceduren som börjar med en bronkialring ger tillräckligt utgångsmaterial för att möjliggöra graden av expansion av dessa primära celler som behövs för att starta kulturer vid ALI utan att kompromissa med differentieringskapaciteten. Att starta expansionen av de isolerade epitelcellerna med ett begränsat antal celler kan dock utgöra problem med att erhålla ett tillräckligt antal insatser med tillräckligt många celler som kan sås för ALI-odling. Förlängd odling och upprepad passage av primära celler kan resultera i replikativ åldrande. Olika lösningar har föreslagits för att övervinna denna begränsning. Horani et al. visade att Rho-kinashämmaren (ROCK) Y-27632 ökade spridningen av basalceller30, Mou et al. använde dubbel Smad-hämning för att expandera basala stamceller samtidigt som egenskaperna hos det differentierade epitelcellskiktet 31 bibehölls, och Sachs et al. har utvecklat ett luftvägsorganoidsystem som kan användas för att expandera luftvägsepitelceller och bibehålla deras differentieringspotential under flera passager32. Den senare metoden användes också för att expandera celler från källor med mycket lågt cellantal, såsom trakealaspirat (TA) från prematura spädbarn (<28 veckors graviditetsålder) och bronkoalveolär sköljvätska (BAL), före överföring till ALI-kulturen som beskrivs här33. Det visade sig att celler isolerade från BAL och TA visade en differentieringskapacitet som liknade celler genererade från bronkial vävnad, även om skillnader observerades när differentieringen var skev mot mer cilierade eller mer bägarcellsinnehållande kulturer med användning av Notch-signaleringshämning eller Th2-cytokinet IL-1333. Det rekommenderas därför att om ALI-PBECs odlas från ett utgångsmaterial med lågt epitelialt cellantal med liknande metoder, att alltid kontrollera kulturerna för de grundläggande kvalitetskriterierna, vilket diskuteras i avsnitt 6 i protokollet. Det är viktigt att användningen av matarceller också kan hjälpa till att få större cellnummer, vilket är viktigt i en miljö för transplanterbar ställningsteknik där tid och cellantal är avgörande. Detta illustreras av en studie där autologa epitelceller odlades från biopsier härrörande från en patient med trakealsjukdom och celler snabbt expanderades i närvaro av ett murint embryonalt matarskikt (mitotiskt inaktiverade 3T3-J2-fibroblaster) och den ovan nämnda hämmaren av Rho/ROCK-vägen (Y-27632)34. Den resulterande cellkulturen visade sig vara användbar för återinsättning av trakealställningar, och därmed kan detta ses som ett lämpligt protokoll för en transplantationsmodell.
När man använder protokollet som beskrivs i detta bidrag, men också när man använder andra kulturprotokoll, introduceras oundvikligen en urvalsbias. Det är viktigt att inse att skillnader i protokolldetaljer, såsom ursprunget till celler som används för att initiera kulturer, mediumsammansättning och andra protokolldetaljer, kan leda till förändringar i cellulär sammansättning av kulturerna och därmed förändringar i svaret från ALI-kulturen33,35. Dessutom har skillnader i cellegenskaper också observerats vid jämförelse av olika medier för differentiering av luftvägscellerna10,11. Vid jämförelse av PneumaCult och cBD-medium observerades skillnader i bägarcell- och klubbcells-mRNA-markörer, TEER-värden och cellskikttjocklek. Baserat på dessa observationer, trots bristen på statistisk grund, på grund av det låga antalet donatorer som används, mediets sammansättning är okänd för kunderna och högre kostnader för PneumaCult-mediet, fattades beslutet i vårt laboratorium att använda cBD-medium.
Som diskuterats kan celler initialt expanderas med hjälp av organoidkultur och därefter överföras till 2D ALI-insatssystemet. Detta är viktigt eftersom luftvägsepitelorganoider inte är lämpliga för exponering för luftburna ämnen, medan användningen av ALI 2D-systemet möjliggör utvärdering av effekterna av luftburna ämnen som cigarettrök23,36 på odlade luftvägsepitelceller. Ett annat tillvägagångssätt för att etablera ALI luftvägsepitelcellkulturer är att generera luftvägsepitelceller genom differentiering av humana pluripotenta stamceller (hiPSCs)37. I sådana protokoll, i slutskedet av differentieringsprotokollet efter differentiering till proximala luftvägsprogenitorer, kan celler differentieras genom odling till ALI med hjälp av procedurer som liknar de som beskrivs här.
I det nuvarande protokollet används cBD-medium för odling vid ALI. cBD-medium är ett serumfritt medium som bereds genom att lägga till en blandning av olika kosttillskott, inspirerade av Fulcher et al.38 samt andra studier. Tilläggslösningen innehåller 52 μg/ml bovint hypofysextrakt (BPE), 0,5 μg/ml hydrokortison, 0,5 ng/ml human EGF, 0,5 μg/ml epinefrin, 10 μg/ml transferrin, 5 μg/ml insulin, 6,5 ng/ml trijodtyronin och 0,1 ng/ml RA39. Eftersom BPE är ett vävnadsextrakt och utsätts för satsvis variation kan mediet inte betraktas som ett fullständigt definierat medium och inte heller djurfritt. Cellodlingsmedium som är fullständigt definierat föredras för att minimera skillnader mellan batch och batch. Med tanke på övergången till djurfri forskning är det viktigt att insatser görs för att producera definierade medier som inte innehåller animaliska produkter och som är överkomliga för forskarsamhället.
Olika experimentella uppställningar kan användas baserat på ALI-modellen, beroende på forskningsfrågan. Till exempel, för att undersöka effekterna av föreningar som kan påverka differentieringsprocessen, kan detta åtgärdas genom att tillsätta föreningarna till kulturen under de olika stadierna av nedsänkt kultur, under differentiering eller vid det väldifferentierade stadiet. Den cellulära sammansättningen av ALI-PBEC-kulturen kan påverkas genom tillsats av specifika föreningar; till exempel genererar differentiering av ALI-PBECs i närvaro av IL-13 en kultur med fler bägarceller och färre cilierade celler, medan behandling med γ-sekretashämmaren DAPT (används för att blockera Notch-signalering) under differentiering resulterar i en kultur med mer cilierade celler på bekostnad av bägarceller 23,40,41,42.
Vidare kan medel för att stimulera celler eller blockera vissa processer antingen appliceras på basalfacket eller (i en mycket liten volym) till kulturens apikala fack. Celler kan också utsättas för luftburna ämnen från den apikala sidan. Sådana exponeringsdesigner har använts för att studera effekten av dieselavgaser eller hel cigarettrök på PBECs23,43,44. Mediet kan skördas varje gång mediet ändras för att övervaka utsöndrade proteiner på bassidan; Detsamma gäller för den apikala sidan av cellerna som tvättas med PBS medan basalmediet uppdateras. Den så kallade apikala tvätten skördas och valfri ditioerytritol (DTE) tillsätts för att dissociera slem som produceras av bägarcellerna mer effektivt. Celllysater kan erhållas för isolering av totalt protein, RNA och kromosomalt och mitokondriellt DNA. Cellerna kan studeras ytterligare med hjälp av antikroppar för specifika markörer, genom att skära polyetylentereftalat (PET) -membranet från plastinsatsen och ytterligare skära detta membran i mindre bitar för flera immunofluorescensfärgningar45. Vidare kan flödescytometri eller FACS också användas efter trypsinisering av cellerna i insatserna. Under ALI-steget kan utvecklingen av cellbarriären övervakas genom att mäta det elektriska motståndet och därefter beräkna TEER, där det elektriska motståndet är omvänt proportionellt mot membraninsatsens yta. Beräkningen baseras på Ohms lag med följande formel: 
, där Rm är det uppmätta elektriska motståndet, Rb är baslinjens elektriska motstånd för en insats utan beläggning och celler, och SA är ytan på skärets membran. Att mäta det elektriska motståndet med EVOM2- och STX/chopstick-elektroder är enkelt men mycket beroende av hanteringsprocedurer när det införs i brunnen. Elektrodens form har också föreslagits påverka mätningen av barriärfunktionen hos den relativt stora ytan17.
Ytterligare förbättring av ALI-cellodlingssystemet, som syftar till att öka noggrann vävnadsrepresentation, inkluderar samodling av ytterligare celltyper, såsom leukocyter, fibroblaster eller endotelceller46,47,48. Det har observerats att denna samodling av ALI-PBEC med granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF) eller M-CSF-differentierade makrofager markant påverkar medfödda epitelsvar och reparation48. Det är viktigt att notera att i sådana samkulturmodeller kan medelkompatibilitet vara ett problem. Eftersom mediet som används för luftvägsepitelcellodling är utvecklat specifikt för PBEC och kanske inte är optimalt lämpat för andra celltyper, är optimering nödvändig. En annan typ av framsteg som ses inom luftvägsbiologi för vilken isolerade PBEC kan användas är användningen av Organs-on-Chips (OoC) -teknik49,50. Med hjälp av denna teknik kan påverkan av de mekaniska krafterna för andning och blodflöde, såsom stretch, luft och medelflöde, studeras 29.
Variabilitet mellan donatorer kan vara signifikant vid användning av PBEC från olika donatorer, och därför är det viktigt att överväga att använda celler från flera donatorer för att ta hänsyn till denna variabilitet i epitelcellodlingsstudier. Eftersom odlingen av ALI-PBEC är tidskrävande och förknippad med betydande kostnader, undersöks möjligheten att etablera ALI-PBEC-kulturer genom att blanda celler från olika givare i en cellodlingsinsats. På så sätt kan pilotexperiment lätt utföras med hjälp av primära celler innan man analyserar svaren från kulturer härrörande från olika enskilda givare . Dessutom kan donatorer med olika egenskaper (t.ex. olika åldersgrupp eller kön) grupperas för explorativa studier. Vid användning av donatorblandningar är det viktigt att se till att lika cellantal av olika givare är närvarande, för att förhindra möjligheten att en givare dominerar resultaten till följd av en högre spridningshastighet. Därför expanderas celler från enskilda givare separat och sås med högre densitet i insatsen jämfört med såddceller från en enskild givare, för att minimera proliferation i insatsen före övergång till ALI. Svar från donatorblandningar och motsvarande enskilda givare jämfördes genom att studera infektionskinetiken för SARS-CoV-2. Med hjälp av RT-qPCR och immunofluorescensfärgning observerades att donatorblandningen gav en bra representation av de olika enskilda givarna genom att visa liknande antal producerade viruspartiklar och liknande antal infekterade celler28.
För att bli ett godtagbart alternativ för djurmodeller bör genredigering av odlade bronkialepitelceller vara genomförbar51. RNA-interferensteknik genom att använda små interfererande RNA (siRNA) i ALI-PBECs undersöks, men eftersom cellerna måste transfekteras med siRNA under den nedsänkta fasen av kulturen, upprätthålls inte knockdown tillräckligt under ALI-odling på grund av den långa odlingstiden, såvida inte siRNA-transfektion ofta upprepas under odling52. Ändå kan siRNA framgångsrikt användas för att modifiera genuttryck i nedsänkta basalceller. Andra har framgångsrikt använt CRISPR/Cas9-teknik för att uppnå genredigering i primära ALI luftvägsepitelcellkulturer med ribonukleoprotein (RNP) leverans 53. Vid användning av sådana tekniker är det viktigt att cellerna bibehåller sin fulla differentieringskapacitet. Eftersom primära luftvägscellkulturer inte kan passera på obestämd tid är klonal expansion av de genredigerade cellerna inte lätt och tillsatsen av medium för att välja transfekterade celler är besvärlig. Därför är det svårt att uppnå den önskvärda knockdownen i alla odlade celler. Ett alternativ för att generera knockoutkloner är användningen av knock-out-strategier i hiPSCs54 och användningen av dessa celler för att generera luftvägsepitelceller. Ett annat, om än suboptimalt, alternativ är att etablera en odödlig PBE-linje för att klonalt expandera genredigerade celler55.
Protokollet som presenteras här är ett sätt att generera en väl differentierad pseudostratifierad ALI-PBEC, men andra protokoll har också visat sig etablera en sådan kultur, med mindre och större skillnader jämfört med det presenterade protokollet. Enligt vår mening är validering av odlingsmetoder och sträng kvalitetskontroll över laboratorier avgörande för att ALI-PBEC-systemet och liknande odlingssystem för luftvägsepitelceller ska bli ett giltigt alternativ för djurförsök.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några relevanta intressekonflikter.
Acknowledgments
Studierna som använder modellen som beskrivs i detta bidrag har fått stöd av en mängd olika finansieringsorganisationer, inklusive Lung Foundation Netherlands, Netherlands Organization for Health Research and Development (ZonMw, COVID-19 MKMD-bidrag), Dutch Society for the Replacement of Animal Testing (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), samt forskningsbidrag från företag som Boehringer Ingelheim och Galapagos. Figur 1 skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
- Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
- de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
- Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
- Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
- Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
- Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
- Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
- Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
- Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
- Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
- Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
- Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
- van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
- Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
- Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
- Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
- Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
- Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
- Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
- Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
- Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
- Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
- Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
- Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
- Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
- vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
- Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
- Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
- Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
- van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
- Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
- Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
- Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
- Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
- Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).
