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चांदी नैनोकणों का उपयोग कर चूहों में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस को कम करना

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65111
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Orthopedics, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत चांदी नैनोकणों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो टाइप II कोलेजेनेज-प्रेरित ऑस्टियोआर्थराइटिस चूहों के तीव्र लक्षणों को प्रभावी ढंग से सुधारने के लिए है, जिसमें श्लेष सूजन, श्लेष हाइपरप्लासिया, संवहनी हाइपरप्लासिया आदि शामिल हैं।

Abstract

घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) 45 वर्ष से अधिक उम्र के लोगों में जोड़ों की सबसे अधिक सामना की जाने वाली अपक्षयी बीमारियों में से एक है। वर्तमान में, केओए के लिए कोई प्रभावी चिकित्सा विज्ञान नहीं है, और एकमात्र अंत-बिंदु रणनीति कुल घुटने आर्थ्रोप्लास्टी (टीकेए) है; इसलिए, केओए आर्थिक बोझ और सामाजिक लागतों से जुड़ा हुआ है। प्रतिरक्षा भड़काऊ प्रतिक्रिया केओए की घटना और विकास में शामिल है। हमने पहले टाइप II कोलेजन का उपयोग करके KOA का एक माउस मॉडल स्थापित किया था। श्लेष ऊतक का हाइपरप्लासिया मॉडल में मौजूद था, बड़ी संख्या में घुसपैठ वाली भड़काऊ कोशिकाओं के साथ। सिल्वर नैनोकणों में पर्याप्त विरोधी भड़काऊ प्रभाव होते हैं और ट्यूमर थेरेपी और सर्जिकल ड्रग डिलीवरी में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इसलिए, हमने एक कोलेजनेज II-प्रेरित KOA मॉडल में चांदी के नैनोकणों के चिकित्सीय प्रभावों का मूल्यांकन किया। प्रयोगात्मक परिणामों से पता चला कि चांदी के नैनोकणों ने श्लेष हाइपरप्लासिया और श्लेष ऊतक में न्यूट्रोफिल की घुसपैठ को काफी कम कर दिया। इसलिए, यह काम ओए के लिए एक उपन्यास रणनीति की पहचान को प्रदर्शित करता है और केओए की प्रगति को रोकने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है।

Introduction

घुटने के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (केओए) पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के सबसे लगातार रूपों में से एक है और पूरे श्लेष संयुक्त में एक जटिल रोग प्रक्रिया शामिल है1. जैसे-जैसे दुनिया की आबादी धीरे-धीरे बूढ़ी हो रही है, केओए की घटनाएं काफी बढ़ रही हैं। घुटने के जोड़ में लगातार दर्द आमतौर पर केओए के रोगियों को चिकित्सा उपचार की तलाश करने के लिए प्रेरित करता है। केओए में दर्द का एटियलजि भड़काऊ प्रतिक्रिया, श्लेष हाइपरप्लासिया और उपास्थि अध: पतन से संबंधित हो सकताहै 2. सिनोवियम ऊतक दो प्रकार की कोशिकाओं से बने होते हैं: श्लेष फाइब्रोब्लास्ट और मैक्रोफेज 3,4,5। श्लेष फाइब्रोब्लास्ट श्लेष द्रव का उत्पादन करते हैं। श्लेष मैक्रोफेज सामान्य रूप से निष्क्रिय होते हैं और भड़काऊ प्रतिक्रिया से सक्रिय होते हैं। सिनोवियम की प्रारंभिक सूजन घुटने के जोड़ों के दर्द का कारण बनतीहै 6.

सिनोवियम ऊतक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया केओए के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। पिछले अध्ययनों ने पुष्टि की है कि केओए में सिनोवियम ऊतकों में भड़काऊ प्रतिक्रियाएं होती हैं, जिन्हें सिनोवाइटिस के रूप में जाना जाता है, और केओए की सिनोवाइटिस डिग्री सिनोवियमऊतकों 7,8,9 के भड़काऊ सेल घुसपैठ से निकटता से संबंधित है। सिनोवाइटिस सिनोवियम की एक भड़काऊ प्रतिक्रिया है, और इसकी रोग संबंधी विशेषताएं श्लेष कोशिकाओं का प्रसार, नए पोत गठन और भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ 5,10,11 हैं।

केओए उपचार का लक्ष्य सिनोवियम की भड़काऊ प्रतिक्रिया को राहत देना और रोग की प्रगति में देरी करना है। वर्तमान में, केओए के इलाज के लिए प्रमुख नैदानिक दवाएं नॉनस्टेरॉइडल एंटी-इंफ्लेमेटरी ड्रग्स (एनएसएआईडी) हैं; हालांकि, वे महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि नेफ्रोटॉक्सिसिटी12,13। इंट्रा-आर्टिकुलर ग्लुकोकोर्टिकोइड इंजेक्शन केओए के इलाज के लिए एक और विकल्प है; हालांकि, ग्लूकोकार्टोइकोड जल्दी से फैलता है और संयुक्त बहाव द्वारा तेजी से चयापचय किया जा सकता है। इस बीच, अंतर्निहित hyperglycemia के साथ मधुमेह रोगियों चल रहे स्टेरॉयड इंजेक्शन14 के बारे में सतर्क रहना चाहिए. संक्षेप में, केओए के लिए कोई दवा चिकित्सीय रणनीति उपलब्ध नहीं है। इसलिए, केओए के इलाज के लिए नई दवाओं की खोज बेहद जरूरी है।

चांदी के नैनोकणों का आकार 100 एनएम से कम है। उनके प्रमुख विरोधी भड़काऊ, जीवाणुरोधी, और एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव के कारण, वे व्यापक रूप से इस तरह के घाव भरने और जला चोट15,16 के रूप में स्वास्थ्य देखभाल और दवा के विभिन्न पहलुओं, में उपयोग किया गया है. वे भी लक्षित दवा वितरण में उपयोग किया जाता है, चिकित्सा इमेजिंग, और आणविक निदान17. चांदी (एजी) में अन्य धातु नैनोकणों, जैसे तांबा (Cu), जस्ता (Zn), और लोहा (Fe)15की तुलना में अधिक विरोधी भड़काऊ और एंटी-बैक्टीरियल कार्रवाई होती है। सिल्वर नैनोपार्टिकल्स, एक नए प्रकार के नैनोमटेरियल, में व्यापक स्पेक्ट्रम और शक्तिशाली रोगाणुरोधी गुण होते हैं। पिछले एक अध्ययन में पाया गया कि जलने की चोट और पेरिटोनिटिस माउस मॉडल18,19 में, चांदी नैनोकणों प्रभावी ढंग से भड़काऊ कारकों के उत्पादन को रोक सकता है और घाव भरने को बढ़ावा दे सकता है। एक पिछले अध्ययन से यह भी पता चला है कि चांदी नैनोकणों विकास कारकों और कोलेजन बयान20 के संश्लेषण को बढ़ावा देने के द्वारा मधुमेह के घावों के उपचार में सुधार.

चांदी नैनोकणों के विरोधी भड़काऊ प्रभावों के आधार पर, हमने चूहों में टाइप II कोलेजन-प्रेरित केओए के इलाज के लिए चांदी के नैनोकणों का उपयोग करने का लक्ष्य रखा। परिणामों ने सुझाव दिया कि चूहों में श्लेष संयुक्त की भड़काऊ घुसपैठ कोशिकाओं की संख्या इस उपचार के साथ काफी कम हो गई थी। परिणामों ने यह भी सुझाव दिया कि चांदी के नैनोकणों से चूहों में केओए के लक्षणों से काफी राहत मिल सकती है। इसलिए, चांदी नैनोकणों का आवेदन नैदानिक केओए के लिए नए उपचार विकल्पों के विकास का समर्थन कर सकता है।

Protocol

सभी जानवरों के काम को गुआंगज़ौ फॉरएवरजेन मेडिकल लेबोरेटरी एनिमल सेंटर (2018-0186) की पशु नैतिक और कल्याण समिति (AEWC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. केओए माउस मॉडल की स्थापना

  1. 70% आर्द्रता वाले वातावरण में और 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर बीएएलबी / सी चूहों (18-24 ग्राम; 14-14 सप्ताह पुराने) को बनाए रखें। इस प्रयोग के लिए, जानवरों को गुआंगज़ौ फॉरएवरजेन मेडिकल लेबोरेटरी एनिमल सेंटर में बनाए रखा गया था।
  2. KOA माउस मॉडल स्थापित करने के लिए टाइप II कोलेजन का उपयोग करें जैसा कि पहलेवर्णित है 21. नीचे वर्णित के रूप में इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन करें।
    1. एनाल्जेसिया के लिए एनेस्थीसिया और ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम/किग्रा, चमड़े के नीचे इंजेक्शन) के लिए 2% सोडियम पेंटोबार्बिटल (40 मिलीग्राम/किग्रा) लागू करें। फिर, टेप के साथ माउस के अंगों को ठीक करें, रेजर के साथ बालों को हटा दें, और 0.1% आयोडोफोर और अल्कोहल के तीन बार वैकल्पिक स्क्रब के साथ कीटाणुरहित करें।
    2. बाँझ दस्ताने पहनें और बाँझ कैंची का उपयोग क्रमिक रूप से त्वचा, चमड़े के नीचे के ऊतक, और इन्फ्रापेटेलर लिगामेंट को उजागर करने के लिए करें। चीरा क्षेत्र 0.5 सेमी से नीचे रखें.
      नोट: ऑपरेशन के दौरान चूहों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग कंबल का उपयोग किया गया था।
    3. 30 मिलीग्राम/किग्रा (0.4 मिलीग्राम/एमएल) प्रकार II कोलेजनेज के 10 यू को संयुक्त गुहा (इन्फ्रापेटेलर लिगामेंट के नीचे)22में इंजेक्ट करने के लिए 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें।
      नोट: सुई और त्वचा के बीच का कोण लगभग 15 डिग्री होना चाहिए; फिर, सुई की दिशा को बदला जाना चाहिए, और सुई को पूरी तरह से वापस ले लिया जाना चाहिए।
    4. इंजेक्शन के बाद, पहले चमड़े के नीचे के ऊतक सीवन, और फिर त्वचा। 0.1% आयोडोफोर के साथ सिवनी क्षेत्र बाँझ। वे संज्ञाहरण से जागने के बाद अलग से व्यक्तिगत हवादार पिंजरों (आईवीसी) में चूहों प्लेस.

2. चांदी नैनोकणों का संश्लेषण

नोट: चांदी नैनोकणों की तैयारी पहले विस्तार से19 वर्णित किया गया है. पूरी फॉर्मूलेशन प्रक्रिया बर्फ पर की जाती है। तैयारी के बाद, मिश्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है; अन्यथा, मिश्रण आसानी से कमरे के तापमान पर जम जाता है।

  1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोलेजन प्रकार I (4 मिलीग्राम/एमएल) के कुल 400 माइक्रोन जोड़ें, और बर्फ पर रखें।
  2. उपरोक्त कोलेजन में फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के कुल 200 माइक्रोन जोड़ें, समाधान को अच्छी तरह मिलाएं, और इसे बर्फ पर रखें।
  3. अंत में, उपरोक्त समाधान में चांदी नैनोकणों के 400 माइक्रोन जोड़ें, और फिर पर्याप्त रूप से मिलाएं। नैनोपार्टिकल समाधान की अंतिम एकाग्रता 1 मिमी है।
    नोट: चांदी नैनोकणों का औसत व्यास 5 एनएम से 15 एनएम23 तक होता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा इसकी पुष्टि की गई थी।

3. टाइप II कोलेजनेज-प्रेरित केओए चूहों का सिल्वर नैनोपार्टिकल उपचार

  1. 1 सप्ताह बाद अपने पिंजरों से टाइप II कोलेजनेज-प्रेरित केओए चूहों को हटा दें, और उन्हें चांदी के नैनोकणों के साथ इंजेक्ट करें। प्रति सप्ताह एक बार चांदी नैनोकणों इंजेक्ट करें, और 30 दिनों बाद नमूनों को इकट्ठा करें।
  2. एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से संज्ञाहरण के लिए कुल 2% सोडियम पेंटोबार्बिटल (खुराक: 2 एमएल / किग्रा) इंजेक्ट करें, और फिर ठीक करें, त्वचा तैयार करें, और चरण 1.2 में वर्णित के रूप में बाँझ करें।
  3. बाँझ दस्ताने पहनें और बाँझ कैंची का उपयोग क्रमिक रूप से त्वचा, चमड़े के नीचे के ऊतकों और घुटने के स्नायुबंधन को उजागर करने के लिए करें।
  4. 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें, और सुई के साथ 15 डिग्री कोण पर संयुक्त गुहा दर्ज करें। धीरे-धीरे चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण के लगभग 20 माइक्रोन इंजेक्षन करें, और धीरे-धीरे सुई24 वापस ले लें।
  5. बदले में चमड़े के नीचे के ऊतक और त्वचा को सीवन करें, और बाँझ करें। संज्ञाहरण से जागने के बाद चूहों को अलग-अलग हवादार पिंजरों (आईवीसी) में रखें।
  6. चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण (20 माइक्रोन) के इस इंजेक्शन को प्रति सप्ताह एक बार की आवृत्ति पर चार बार करें।
    नोट: चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण के साथ इलाज चूहों को अलग-अलग पिंजरों में रखा जाना चाहिए। चूहों की लड़ाई तब हो सकती है जब उन्हें एक साथ बनाए रखा जाता है, और यह प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करेगा। इंजेक्शन के दौरान, सुई संयुक्त गुहा तक पहुंचने पर तनाव की भावना होगी, और इंजेक्शन के बाद घुटने के जोड़ में सूजन होती है। इन दो विधियों का संयोजन शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करने की अनुमति देता है कि दवा को घुटने के जोड़ में सफलतापूर्वक इंजेक्ट किया गया है।

4. घुटने के जोड़ और श्लेष ऊतक का संग्रह

  1. कार्बन डाइऑक्साइड श्वासावरोध या प्रासंगिक पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किसी अन्य प्रोटोकॉल के साथ चूहों बलिदान.
  2. क्रमिक रूप से त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों को जीवंतीकृत और विच्छेदित करें, और घुटने के जोड़ को पूरी तरह से उजागर करें।
  3. फीमर और टिबिया सहित घुटने के जोड़ों की कटाई करें, और मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें।
  4. संरक्षण और निर्धारण के लिए 10% फॉर्मेलिन में फीमर, टिबिया और आसपास के नरम ऊतकों (लिगामेंट और कैप्सुला) सहित घुटने के संयुक्त ऊतकों को इकट्ठा करें।

5. हेमेटोक्सिलिन-ईोसिन धुंधला हो जाना

  1. रातोंरात निर्धारण के बाद, पैराफिन वर्गों एम्बेड करें, और 0.4 माइक्रोन मोटाई में पैराफिन एम्बेडेड ऊतक में कटौती करने के लिए एक माइक्रोटोम का उपयोग करें। आगे धुंधला हो जाना (hematoxylin-eosin धुंधला हो जाना, Safranin ओ / फास्ट ग्रीन, और immunohistochemical (आईएचसी) धुंधला हो जाना के लिए तैयार वर्गों का प्रयोग करें.
  2. xylene के साथ दो बार वर्गों deparaffinize, 5 मिनट प्रत्येक के लिए अनुक्रम में 100%, 95%, 80%, और 70% इथेनॉल में भिगोएँ, और पुनर्जलीकरण.
  3. 5 मिनट के लिए hematoxylin (0.1 ग्राम / 100 एमएल) के साथ वर्गों दाग, और फिर सीधे 1 मिनट के लिए 10 एस और ईोसिन (0.5 ग्राम / 100 एमएल) के लिए 1% एचसीएल में जगह.
  4. माइक्रोस्कोप के नीचे सिनोवियम के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का निरीक्षण करें।

6. सफ्रानिन ओ / फास्ट ग्रीन

  1. पैराफिन में ऊतक एम्बेड करें, और चरण 5.1 में वर्णित हिस्टोलॉजिक वर्गों को तैयार करें।
  2. xylene के साथ दो बार वर्गों deparaffinize, और एक इथेनॉल श्रृंखला (जैसे 100%, 95%, 80%, और आसुत जल में 70% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए प्रत्येक) के साथ उन्हें पुनर्जलीकरण.
  3. Hemtoxilin के साथ तैयार वर्गों दाग, और 2 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पीबीएस के साथ उन्हें धो लें.
  4. हाइड्रोक्लोरिक एसिड अल्कोहल के साथ वर्गों को अलग करें, और उन्हें 2 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पीबीएस के साथ धो लें।
  5. 5-10 मिनट के लिए 0.02% फास्ट ग्रीन धुंधला समाधान में वर्गों को विसर्जित करें, इसके बाद 1-2 मिनट के लिए 0.1% सफ्रानिन ओ धुंधला हो जाना।
  6. पीबीएस धोने के बाद 1% एसिटिक एसिड के साथ वर्गों को अलग करें।
  7. वर्गों में फाइब्रोकार्टिलेज गठन का पता लगाएं और विश्लेषण करें।

7. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला हो जाना

  1. पैराफिन में ऊतक एम्बेडेड, और चरण 5.1 में वर्णित के रूप में हिस्टोलॉजिक वर्गों को तैयार करें।
  2. xylene के साथ दो बार वर्गों deparaffinize, और एक इथेनॉल श्रृंखला (जैसे 100%, 95%, 80%, और आसुत जल में 70% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए प्रत्येक) के साथ उन्हें पुनर्जलीकरण. ट्रिस-ईडीटीए बफर (10 एमएम ट्रिस बेस, 1 एमएम ईडीटीए समाधान; पीएच 9.0) में वर्गों को विसर्जित करें, और एंटीजन पुनर्प्राप्ति करने के लिए 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोवेव ओवन में गर्म करें।
  3. अंतर्जात peroxidase को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान के लिए वर्गों बेनकाब.
  4. निरर्थक बंधन को अवरुद्ध करने के लिए 5% बकरी सीरम के साथ वर्गों का इलाज करें।
  5. CD177 के खिलाफ पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 1,000 कमजोर पड़ने) जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। फिर, पीबीएस के साथ वर्गों को तीन बार धो लें।
  6. पीबीएस के साथ वर्गों भिगोएँ, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी (एचआरपी-संयुग्मित बहुलक विरोधी खरगोश प्रणाली) के साथ वर्गों को सेते हैं।
  7. क्रोमोजेन के रूप में 3,3'-डायमिनोबेंजिडाइन (डीएबी) का उपयोग करके आईएचसी धुंधला का दृश्य करें।
  8. एक खुर्दबीन के तहत वर्गों देखें, और अधिग्रहीत छवियों का विश्लेषण.

Representative Results

KOA माउस मॉडल को टाइप II कोलेजनेज का उपयोग करके प्रेरित किया गया था। मॉडल प्रेरण के 1 सप्ताह बाद शुरू, तैयार चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण 4 सप्ताह (चित्रा 1) के लिए प्रति सप्ताह एक बार संयुक्त गुहा में इंजेक्ट किया गया था। प्रत्येक समूह में चूहों के वजन को दैनिक रूप से देखा और दर्ज किया गया था। परिणामों से पता चला कि केओए चूहों का औसत शरीर का वजन सामान्य नियंत्रण समूह में चूहों की तुलना में काफी कम था। हालांकि, प्रकार द्वितीय कोलेजनेज + AgNPs समूह में चूहों के औसत शरीर का वजन KOA चूहों की तुलना में अधिक था, हालांकि यह अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था (चित्रा 2). 30 दिनों के बाद, घुटने के जोड़ों के श्लेष ऊतकों को चूहों से एकत्र किया गया और रोग संबंधी परीक्षा के अधीन किया गया। हाइपरप्लासिया, संवहनी प्रसार, सिनोवियम की भड़काऊ घुसपैठ, और उपास्थि क्षति का विश्लेषण 5,10,11 किया गया था। परिणामों से पता चला कि केओए समूह में चूहों की श्लेष मोटाई सामान्य नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थी। चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण के साथ इलाज किए गए समूह में, केओए समूह(चित्रा 3)की तुलना में श्लेष झिल्ली की मोटाई कम हो गई थी। सामान्य नियंत्रण समूह की तुलना में केओए चूहों के सिनोवियम में संवहनी हाइपरप्लासिया था, और चांदी के नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण(चित्रा 4)के साथ इलाज किए गए चूहों के सिनोवियम में संवहनी हाइपरप्लासिया काफी कम हो गया था। Safranin-O धुंधला के परिणामों से पता चला है कि KOA चूहों के उपास्थि मैट्रिक्स नष्ट हो गया था, जबकि चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण के साथ इलाज चूहों एक काफी बेहतर उपास्थि मैट्रिक्स(चित्रा 5)दिखाया. प्रत्येक समूह में रूपात्मक विशेषता स्कोर का मूल्यांकन किया गया था जैसा कि पहले22 वर्णित था। परिणाम निम्नानुसार थे: खारा समूह के लिए 0 ± 0, टाइप II कोलेजन समूह के लिए 7 ± 0.63, और टाइप II कोलेजनेज + एजीएनपीएस समूह(चित्रा 6)के लिए 4.2 ± 1.17। CD177 एक प्रमुख न्यूट्रोफिल मार्कर25 है। CD177 सामान्य परिस्थितियों में 40% -60% न्यूट्रोफिल में व्यक्त किया जाता है। हालांकि, तीव्र सूजन के दौरान न्यूट्रोफिल में सीडी 177 की अभिव्यक्ति काफी बढ़ जाती है। आईएचसी धुंधला के परिणामों ने प्रदर्शित किया कि श्लेष क्षेत्र में घुसपैठ वाले न्यूट्रोफिल केओए समूह (चित्रा 7) की तुलना में एजीएनपी के साथ इलाज किए गए समूह में काफी कम हो गए थे, जो बताता है कि एजीएनपी के साथ उपचार केओए के लक्षणों में सुधार कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन स्थान। (ए) प्रकार द्वितीय कोलेजनेज इंजेक्शन के प्रतिनिधि छवियों. (बी) प्रकार द्वितीय collagenase इंजेक्शन के बाद प्रतिनिधि छवियों. (सी)केओए माउस मॉडल में चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण इंजेक्शन की प्रतिनिधि छवियां। (डी)केओए मॉडल चूहों में चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण इंजेक्शन के बाद प्रतिनिधि छवियां। लाल बिंदीदार रेखा माउस घुटने के स्नायुबंधन के समानांतर रेखा का प्रतिनिधित्व करती है। काला तीर इंसुलिन सिरिंज सुई और त्वचा के बीच के कोण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्येक समूह में चूहों के शरीर के वजन में परिवर्तन। यह पैनल अलग-अलग समय बिंदुओं पर प्रत्येक समूह में चूहों के औसत वजन को दर्शाता है; एक्स-अक्ष टाइप II कोलेजेनेज के इंजेक्शन के बाद दिनों की संख्या को इंगित करता है, और वाई-अक्ष शरीर के वजन में गुना-परिवर्तन को इंगित करता है। खारा समूह (n = 7), प्रकार II कोलेजेनेज समूह (n = 5), प्रकार II कोलेजनेज + AgNPs समूह (n = 5)। *पी < 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हेमेटोक्सिलिन-ईोसिन (एच एंड ई) श्लेष हाइपरप्लासिया का प्रतिनिधित्व करते हुए धुंधला। चूहों के प्रत्येक समूह में श्लेष ऊतकों को सर्जरी के 30 दिनों बाद एच एंड ई के साथ एकत्र, तय, खंडित और दाग दिया गया था। डबल तीर पता लगाए गए श्लेष मोटाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 0.1 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पेरिसिनोवियल संवहनी हाइपरप्लासिया की प्रतिनिधि छवि। तीर जहाजों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 0.05 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: चूहों के प्रत्येक समूह में घुटने के जोड़ का सफ्रानिन-ओ धुंधला हो जाना। स्केल बार = 0.2 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्रत्येक समूह में रूपात्मक फीचर स्कोर। श्लेष ऊतक का उपयोग प्रत्येक समूह में चूहों के लिए रूपात्मक विशेषता स्कोर को मापने के लिए किया गया था। प्रत्येक समूह में पांच ऊतक वर्गों हाइपरप्लासिया की डिग्री / श्लेष अस्तर सेल परत के इज़ाफ़ा, श्लेष ऊतक में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की डिग्री, और श्लेष स्ट्रोमा (तालिका 1) के सक्रियण की डिग्री का विश्लेषण करने के लिए चुना गया था. औसत मूल्य का उपयोग अंतिम स्कोर के रूप में किया गया था। **p < 0.01 और ***p < 0.001 अनुपचारित KOA समूह की तुलना में प्रत्येक समूह के लिए छात्र के t-परीक्षण के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: चूहों के प्रत्येक समूह में श्लेष ऊतक में एक न्यूट्रोफिल मार्कर के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला का उपयोग प्रत्येक समूह में चूहों के श्लेष ऊतक में न्यूट्रोफिल मार्कर CD177 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। तीर न्यूट्रोफिल का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: स्कोरिंग रूपात्मक विशेषताएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

चांदी नैनोकणों विरोधी भड़काऊ, जीवाणुरोधी, एंटीऑक्सीडेंट, और immunomodulatory प्रभाव प्रदर्शन, जिसका अर्थ है कि वे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों26 के उत्पादन को कम करके क्षति से कोशिकाओं और ऊतकों की रक्षा कर सकता है. कुछ शोधकर्ताओं चांदी नैनोकणों27 की विषाक्तता के बारे में चिंतित हैं. चांदी के नैनोकणों की विषाक्तता सीधे मुक्त चांदी आयनों की उपस्थिति से संबंधित है। चांदी नैनोकणों के नैनोस्केल आकार के कारण, वे आसानी से बायोमोलेक्यूल्स, कोशिकाओं और मानव अंगों 15,28,29के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि चांदी नैनोकणों ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित और मानव कोशिकाओं30 में माइटोकॉन्ड्रियल समारोह ख़राब सकता है. इसके अलावा, बड़ी मात्रा में चांदी के नैनोकणों के उपयोग के बाद, मानव अंगों में, विशेष रूप से यकृत और प्लीहा में एजी का पता लगाया जा सकता है। शोधकर्ताओं ने यह भी बताया है कि चांदी नैनोकणों transsynaptic परिवहन के माध्यम से रक्त मस्तिष्क बाधा को पार करने और मस्तिष्क31 में जमा करने की क्षमता है. चांदी नैनोकणों की बायोटॉक्सिसिटी की एक व्यवस्थित रिपोर्ट नहीं की गई है, हालांकि कुछ शोधकर्ता चांदी नैनोकणों32 की सुरक्षा को स्वीकार करते हैं।

इस अध्ययन में, हमने एक चांदी के नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण तैयार किया। दरअसल, मानव ऊतकों में चांदी के नैनोकणों की अवधि अवधि संक्षिप्त है, लेकिन कोलेजन मिश्रण के साथ लागू होने पर चांदी के नैनोकणों की अवधि लंबी हो सकती है; यह न केवल आघात को कम करता है बल्कि दवाओं की खुराक को भी कम करता है। चांदी नैनोकणों की विषाक्तता को ध्यान में रखते हुए, इस अध्ययन में लागू चांदी नैनोकणों की खुराक 30 मिलीग्राम /

प्रयोगात्मक ऑपरेशन के कुछ महत्वपूर्ण विचार इस प्रकार हैं। एंजाइमी दरार के कारण गिरावट को रोकने के लिए तैयारी के बाद टाइप II कोलेजेनेज को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण की तैयारी कमरे के तापमान पर लगातार बर्फ पर की जानी चाहिए क्योंकि चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण तेजी से एक अर्धठोस जेल बन जाता है और फिर इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। समाधान तैयारी के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए. एक छोटी सुई के साथ एक 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज इंट्रा-आर्टिकुलर प्रशासन के लिए चुना जाना चाहिए, और यह इंजेक्शन दवाओं के रिसाव को प्रभावी ढंग से रोक सकता है। चांदी नैनोपार्टिकल कोलेजन मिश्रण इंजेक्ट करने के लिए सुई को 15 डिग्री के कोण पर डाला जाना चाहिए। जब सुई होती हैnonresistant, यह इंगित करता है कि सुई घुटने के संयुक्त गुहा तक पहुंच गई है। इंजेक्शन लगाने के बाद, इंजेक्शन के कोण को बदला जाना चाहिए, और इंजेक्शन वाली दवा के रिसाव से बचने के लिए सुई को धीरे-धीरे वापस ले लिया जाना चाहिए।

इस अध्ययन में, चांदी नैनोकणों ने चूहों में टाइप II कोलेजनेज-प्रेरित केओए के लक्षणों में प्रभावी ढंग से सुधार किया, चांदी के नैनोकणों के विरोधी भड़काऊ प्रभाव का प्रदर्शन किया। कई अध्ययनों ने चांदी नैनोकणों34,35,36के साथ इन विट्रो में ऊष्मायन कोशिकाओं में एपोप्टोसिस की उपस्थिति की सूचना दी है। श्लेष हाइपरप्लासिया में कमी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन की हानि में उनकी भागीदारी के कारण चांदी के नैनोकणों के कारण हो सकती है, या इन परिणामों को प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों द्वारा मध्यस्थ किया जा सकता है। केओए मॉडल समूह में चूहों के सिनोवियम में संवहनी हाइपरप्लासिया देखा गया था। यह संभव था कि केमोकाइन ने इस प्रक्रिया के दौरान रक्त वाहिकाओं से श्लेष ऊतक तक न्यूट्रोफिल को चलाया और सूजन के फटने से कोशिकाओं को अधिक ऑक्सीजन का उपभोग करना पड़ा, इस प्रकार संवहनी हाइपरप्लासिया हो गया। इसलिए, इस परिकल्पना की विश्वसनीयता को साबित करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है। यह अध्ययन नैदानिक केओए के उपचार में अनुसंधान के लिए सैद्धांतिक लाभ प्रदान करता है। भविष्य के अध्ययनों में, हम चांदी नैनोकणों के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए रासायनिक रूप से प्रेरित केओए मॉडल विधि के साथ पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट (एसीएल) विधि को संयोजित करना चाहते हैं। प्रयोगात्मक परिणाम बताते हैं कि चांदी के नैनोकणों केओए चूहों में सिनोवियम में भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ को काफी कम कर सकते हैं, लेकिन इस प्रभाव के तंत्र को अभी भी आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, जो केओए के रोगजनन को उजागर कर सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या: 2019A1515010209) और गुआंगज़ौ शहर, चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (संख्या: 202102010164) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 305932 None
CD177 Polyclonal Antibody ThermoFisher Scientific PA5-98759 None
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 302-17-0 None
DAB MCE HY-15912 None
Eosin Beyotime Biotechnology C0109 None
Formalin Sigma-Aldrich HT501128 None
Hematoxylin Beyotime Biotechnology C0107 None
Light Microscopy Leica DM500 None
Silver nanoparticle Wolcacvi  S-10-20 Store product in the dark at 4°C
Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit Solarbio 90-15-3 None
Type II collagen Sigma-Aldrich C6885-500mg None

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References

  1. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19 (2016).
  2. Kraus, V. B., Blanco, F. J., Englund, M., Karsdal, M. A., Lohmander, L. S. Call for standardized definitions of osteoarthritis and risk stratification for clinical trials and clinical use. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (8), 1233-1241 (2015).
  3. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  4. de Sousa, E. B., Casado, P. L., Moura, N. V., Duarte, M. E., Aguiar, D. P. Synovial fluid and synovial membrane mesenchymal stem cells: Latest discoveries and therapeutic perspectives. Stem Cell Research and Therapy. 5 (5), 112 (2014).
  5. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  6. Glyn-Jones, S., et al. Osteoarthritis. Lancet. 386 (9991), 376-387 (2015).
  7. Roemer, F. W., et al. Presence of MRI-detected joint effusion and synovitis increases the risk of cartilage loss in knees without osteoarthritis at 30-month follow-up: The MOST study. Annals of Rheumatic Diseases. 70 (10), 1804-1809 (2011).
  8. Furman, B. D., et al. Articular ankle fracture results in increased synovitis, synovial macrophage infiltration, and synovial fluid concentrations of inflammatory cytokines and chemokines. Arthritis and Rheumatology. 67 (5), 1234-1239 (2015).
  9. Ayral, X., Pickering, E. H., Woodworth, T. G., Mackillop, N., Dougados, M. Synovitis: A potential predictive factor of structural progression of medial tibiofemoral knee osteoarthritis -- Results of a 1 year longitudinal arthroscopic study in 422 patients. Osteoarthritis and Cartilage. 13 (5), 361-367 (2005).
  10. Henrotin, Y., Lambert, C., Richette, P. Importance of synovitis in osteoarthritis: Evidence for the use of glycosaminoglycans against synovial inflammation. Seminars in Arthritis and Rheumatism. 43 (5), 579-587 (2014).
  11. Liu-Bryan, R. Synovium and the innate inflammatory network in osteoarthritis progression. Current Rheumatology Reports. 15 (5), 323 (2013).
  12. Towheed, T., Shea, B., Wells, G., Hochberg, M. Analgesia and non-aspirin, non-steroidal anti-inflammatory drugs for osteoarthritis of the hip. Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), (2000).
  13. Co, C. M., et al. Click chemistry-based pre-targeting cell delivery for cartilage regeneration. Regenerative Biomaterials. 8 (3), (2021).
  14. Oo, W. M., Liu, X., Hunter, D. J. Pharmacodynamics, efficacy, safety and administration of intra-articular therapies for knee osteoarthritis. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 15 (12), 1021-1032 (2019).
  15. Morozova, O. V. Silver nanostructures: Limited sensitivity of detection, toxicity and anti-inflammation effects. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 9928 (2021).
  16. He, M., et al. A pH-responsive mesoporous silica nanoparticles-based drug delivery system with controlled release of andrographolide for OA treatment. Regenerative Biomaterials. 8 (4), (2021).
  17. Samuel, M. S., Jose, S., Selvarajan, E., Mathimani, T., Pugazhendhi, A. Biosynthesized silver nanoparticles using Bacillus amyloliquefaciens; Application for cytotoxicity effect on A549 cell line and photocatalytic degradation of p-nitrophenol. Journal of Photochemistry and Photobiology B. 202, 111642 (2020).
  18. Liu, X., et al. Silver nanoparticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing. ChemMedChem. 5 (3), 468-475 (2010).
  19. Tian, J., et al. Topical delivery of silver nanoparticles promotes wound healing. ChemMedChem. 2 (1), 129-136 (2007).
  20. Vendidandala, N. R., et al. Gallocatechin-silver nanoparticle impregnated cotton gauze patches enhance wound healing in diabetic rats by suppressing oxidative stress and inflammation via modulating the Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-kappaB pathways. Life Sciences. 286, 120019 (2021).
  21. Kikuchi, T., Sakuta, T., Yamaguchi, T. Intra-articular injection of collagenase induces experimental osteoarthritis in mature rabbits. Osteoarthritis and Cartilage. 6 (3), 177-186 (1998).
  22. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).
  23. Zhao, Z., et al. Design and synthesis of Ag NPs/chitosan-starch nano-biocomposite as a modern anti-human malignant melanoma drug. International Journal of Biological Macromolecules. 236, 123823 (2023).
  24. Ahmed, E., et al. Decellularized extracellular matrix-rich hydrogel-silver nanoparticle mixture as a potential treatment for acute liver failure model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (12), 2351-2367 (2020).
  25. Bai, M., et al. CD177 modulates human neutrophil migration through activation-mediated integrin and chemoreceptor regulation. Blood. 130 (19), 2092-2100 (2017).
  26. Singh, D., Chaudhary, D., Kumar, V., Verma, A. Amelioration of diethylnitrosamine (DEN) induced renal oxidative stress and inflammation by Carissa carandas embedded silver nanoparticles in rodents. Toxicology Reports. 8, 636-645 (2021).
  27. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30 (23-24), 3891-3914 (2009).
  28. Noronha, V. T., et al. Silver nanoparticles in dentistry. Dental Materials. 33 (10), 1110-1126 (2017).
  29. Ahamed, M., Alsalhi, M. S., Siddiqui, M. K. Silver nanoparticle applications and human health. Clinica Chimica Acta. 411 (23-24), 1841-1848 (2010).
  30. Palacios-Hernandez, T., et al. cellular uptake and apoptotic responses in human coronary artery endothelial cells exposed to ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Applied Toxicology. 40 (7), 918-930 (2020).
  31. Lebda, M. A., et al. Potential role of alpha-lipoic acid and Ginkgo biloba against silver nanoparticles-induced neuronal apoptosis and blood-brain barrier impairments in rats. Life Sciences. 212, 251-260 (2018).
  32. Yin, I. X., et al. The antibacterial mechanism of silver nanoparticles and its application in dentistry. International Journal of Nanomedicine. 15, 2555-2562 (2020).
  33. Kim, Y. S., et al. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 7, 20 (2010).
  34. Pascarelli, N. A., et al. Effects of gold and silver nanoparticles in cultured human osteoarthritic chondrocytes. Journal of Applied Toxicology. 33 (12), 1506-1513 (2013).
  35. Braydich-Stolle, L. K., et al. Silver nanoparticles disrupt GDNF/Fyn kinase signaling in spermatogonial stem cells. Toxicological Sciences. 116 (2), 577-589 (2010).
  36. Eom, H. J., Choi, J. p38 MAPK activation, DNA damage, cell cycle arrest and apoptosis as mechanisms of toxicity of silver nanoparticles in Jurkat T cells. Environmental Science and Technology. 44 (21), 8337-8342 (2010).

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चिकित्सा अंक 196 सिल्वर नैनोपार्टिकल्स केओए थेरेप्यूटिक्स नी आर्थ्रोप्लास्टी इम्यून इंफ्लेमेटरी रिस्पांस साइनोवियल टिश्यू कोलेजनेज II-प्रेरित केओए मॉडल साइनोवियल हाइपरप्लासिया न्यूट्रोफिल चिकित्सीय प्रभाव
चांदी नैनोकणों का उपयोग कर चूहों में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस को कम करना
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Sang, Y., Zhang, J., Liu, C., Liu,… More

Sang, Y., Zhang, J., Liu, C., Liu, K., Yao, H., Zhao, H., Xu, W., Xu, Y., Hou, G. Ameliorating Osteoarthritis in Mice Using Silver Nanoparticles. J. Vis. Exp. (196), e65111, doi:10.3791/65111 (2023).

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