Summary
여기에 제시된 것은 활막 염증, 활막 증식, 혈관 증식 등을 포함한 II형 콜라겐분해효소 유도 골관절염 마우스의 급성 증상을 효과적으로 개선하기 위해 은 나노 입자를 사용하기 위한 프로토콜입니다.
Abstract
무릎 골관절염(KOA)은 45세 이상의 사람들에게 가장 흔하게 발생하는 관절의 퇴행성 질환 중 하나입니다. 현재 KOA에 대한 효과적인 치료법은 없으며 유일한 종점 전략은 무릎 인공관절 전치환술(TKA)입니다. 따라서 KOA는 경제적 부담 및 사회적 비용과 관련이 있습니다. 면역 염증 반응은 KOA의 발생과 발달에 관여합니다. 우리는 이전에 유형 II 콜라겐을 사용하여 KOA의 마우스 모델을 확립했습니다. 활막 조직의 증식은 많은 수의 침윤된 염증 세포와 함께 모델에 존재했습니다. 은 나노 입자는 상당한 항염증 효과가 있으며 종양 치료 및 외과적 약물 전달에 널리 사용되었습니다. 따라서 콜라겐분해효소 II 유도 KOA 모델에서 은 나노입자의 치료 효과를 평가했습니다. 실험 결과는 은 나노 입자가 활막 증식과 활막 조직의 호중구 침투를 크게 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 연구는 OA에 대한 새로운 전략의 식별을 보여주고 KOA의 진행을 방지하기 위한 이론적 기초를 제공합니다.
Introduction
무릎 골관절염(Knee osteoarthritis, KOA)은 골관절염의 가장 흔한 형태 중 하나이며 전체 활액 관절에서 복잡한 질병 과정을 수반한다1. 세계 인구가 점차 고령화됨에 따라 KOA의 발병률이 크게 증가하고 있습니다. 무릎 관절의 지속적인 통증은 일반적으로 KOA 환자가 치료를 받도록 유도합니다. KOA 통증의 원인은 염증 반응, 활막 증식, 연골 변성과 관련이 있을 수 있다2. 활막 조직은 활막 섬유아세포(synovial fibroblast)와 대식세포(macrophage) 3,4,5의 두 가지 유형의 세포로 구성되어 있습니다. 활막 섬유아세포는 활액을 생성합니다. 활막 대식세포는 일반적으로 휴면 상태이며 염증 반응에 의해 활성화됩니다. 활막의 초기 염증은 무릎 관절 통증을 유발한다6.
활막 조직 염증 면역 반응은 KOA의 발병에 중요한 역할을 합니다. 이전 연구에서는 활막염으로 알려진 KOA의 활막 조직에 염증 반응이 있음을 확인했으며, KOA의 활막염 정도는 활막 조직의 염증 세포 침윤과 밀접한 관련이 있습니다 7,8,9. 활막염은 활막의 염증 반응이며, 그 병리학적 특징은 활막 세포의 증식, 새로운 혈관 형성 및 염증 세포의 침윤이다 5,10,11.
KOA 치료의 목표는 활막의 염증 반응을 완화하고 질병의 진행을 지연시키는 것입니다. 현재 KOA 치료를 위한 주요 임상 약물은 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs)입니다. 그러나 그들은 신독성12,13과 같은 심각한 부작용을 나타냅니다. 관절 내 글루코코르티코이드 주사는 KOA 치료를 위한 또 다른 옵션입니다. 그러나 글루코코르티코이드는 빠르게 퍼지며 관절 삼출액에 의해 빠르게 대사될 수 있습니다. 한편, 기저 고혈당증이 있는 당뇨병 환자는 스테로이드 주사를 지속적으로 투여하는 것에 주의해야 한다14. 요약하자면, KOA에 사용할 수 있는 약물 치료 전략은 없습니다. 따라서 KOA 치료를 위한 신약 개발이 매우 시급합니다.
은 나노 입자의 크기는 100nm 미만입니다. 눈에 띄는 항염증, 항균 및 항산화 효과로 인해 상처 치유 및 화상 부상과 같은 의료 및 의학의 다양한 측면에서 널리 활용되었습니다15,16. 또한 표적 약물 전달, 의료 영상 및 분자 진단에도 사용됩니다17. 은(Ag)은 구리(Cu), 아연(Zn) 및 철(Fe)15과 같은 다른 금속 나노 입자보다 항염증 및 항균 작용이 더 큽니다. 새로운 유형의 나노 물질인 은 나노 입자는 광범위하고 강력한 항균 특성을 가지고 있습니다. 이전 연구에 따르면 화상 부상 및 복막염 마우스 모델18,19에서 은 나노 입자는 염증 인자의 생성을 효과적으로 억제하고 상처 치유를 촉진할 수 있습니다. 이전 연구에서는 은 나노 입자가 성장 인자와 콜라겐 침착의 합성을 촉진하여 당뇨병 상처의 치유를 향상시킨다는 것을 입증했습니다20.
은 나노 입자의 항염증 효과를 바탕으로 은 나노 입자를 사용하여 마우스의 II형 콜라겐 유도 KOA를 치료하는 것을 목표로 했습니다. 그 결과, 생쥐의 활막 관절의 염증성 침윤 세포의 수가 이 처리로 현저히 감소했음을 시사했다. 그 결과 은 나노입자가 생쥐의 KOA 증상을 크게 완화할 수 있음을 시사했다. 따라서 은 나노 입자의 적용은 임상 KOA에 대한 새로운 치료 옵션의 개발을 지원할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 작업은 광저우 Forevergen Medical Laboratory Animal Center(2018-0186)의 동물 윤리 및 복지 위원회(AEWC)의 승인을 받았습니다.
1. KOA 마우스 모델 구축
- BALB/c 마우스(18-24g, 생후 12-14주)를 습도 70%와 26°C의 환경, 12시간의 명암주기로 유지합니다. 이 실험을 위해 동물들은 광저우 포에버젠 의학 실험실 동물 센터에서 관리되었습니다.
- II형 콜라겐을 사용하여 앞서 설명한 대로 KOA 마우스 모델을 설정합니다21. 아래 설명에 따라 관절 내 주사를 수행합니다.
- 마취를 위해 펜토바르비탈나트륨(40mg/kg) 2%, 진통제로 부프레노르핀(0.05mg/kg, 피하주사)을 바릅니다. 그런 다음 테이프로 쥐 팔다리를 고정하고 면도기로 머리카락을 제거하고 0.1 % 요오드포와 알코올을 번갈아 가며 스크럽하여 3 회 소독합니다.
- 멸균 장갑을 착용하고 멸균 가위를 사용하여 피부, 피하 조직 및 슬개골 인대를 순차적으로 노출시킵니다. 절개 부위를 0.5cm 이하로 유지하십시오.
알림: 수술 중 마우스의 체온을 유지하기 위해 가열 담요를 사용했습니다. - 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 30mg/kg(0.4mg/mL) II형 콜라겐분해효소 10U를 관절강(슬개하 인대 아래)에 주입합니다22.
알림: 바늘과 피부 사이의 각도는 약 15°여야 합니다. 그런 다음 바늘의 방향을 바꾸고 바늘을 완전히 빼야 합니다. - 주사 후 피하 조직을 먼저 봉합한 다음 피부를 봉합합니다. 0.1% 요오드화로 봉합사 부위를 살균합니다. 마우스가 마취에서 깨어난 후 개별적으로 환기되는 케이지(IVC)에 별도로 넣습니다.
2. 은 나노 입자의 합성
참고 : 은 나노 입자의 제조는 이전에 상세히 설명되었습니다19. 전체 배합 공정은 얼음 위에서 수행됩니다. 준비 후 혼합물을 4 °C에서 보관합니다. 그렇지 않으면 혼합물이 실온에서 쉽게 응고됩니다.
- 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 총 400μL의 콜라겐 유형 I(4mg/mL)을 넣고 얼음 위에 놓습니다.
- 위의 콜라겐에 총 200μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 넣고 용액을 잘 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다.
- 마지막으로 상기 용액에 은 나노 입자 400 μL를 첨가 한 후 충분히 혼합한다. 나노 입자 용액의 최종 농도는 1mM입니다.
참고 :은 나노 입자의 평균 직경은 5nm에서 15nm23 사이입니다. 이것은 전자 현미경으로 확인되었습니다.
3. II형 콜라겐분해효소 유도 KOA 마우스의 은 나노입자 처리
- 1 주일 후 유형 II 콜라겐 분해 효소 유도 KOA 마우스를 케이지에서 꺼내고은 나노 입자를 주입합니다. 은 나노 입자를 일주일에 한 번 주입하고 30 일 후에 표본을 수집합니다.
- 복강 내 주사를 통해 마취를 위해 총 2% 펜토바르비탈나트륨(용량: 2mL/kg)을 주사한 후 1.2단계에서 설명한 대로 피부를 고정하고 준비한 후 멸균합니다.
- 멸균 장갑을 착용하고 멸균 가위를 사용하여 피부, 피하 조직 및 무릎 인대를 순차적으로 노출시킵니다.
- 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 바늘로 15° 각도로 관절강에 들어갑니다. 은 나노 입자 콜라겐 혼합물 약 20μL를 천천히 주입하고 바늘24를 천천히 빼냅니다.
- 피하 조직과 피부를 차례로 봉합하고 멸균합니다. 마우스가 마취에서 깨어난 후 개별적으로 환기되는 케이지(IVC)에 넣습니다.
- 은 나노 입자 콜라겐 혼합물 (20 μL)을 일주일에 한 번 빈도로 4 회 주입합니다.
참고: 은 나노 입자 콜라겐 혼합물로 처리한 마우스는 개별 케이지에 보관해야 합니다. 생쥐 싸움은 함께 유지될 때 발생할 수 있으며, 이는 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 주입 중에 바늘이 관절강에 닿았을 때 긴장감이 생기고 주입 후 무릎 관절에 붓기가 발생합니다. 이 2가지의 방법의 조합은 연구원이 약이 무릎 합동으로 성공적으로 주사되었다는 것을 보증하는 것을 허용합니다.
4. 무릎 관절 및 활막 조직의 수집
- 이산화탄소 질식 또는 관련 동물 윤리 위원회에서 승인한 기타 프로토콜로 쥐를 희생하십시오.
- 피부와 피하 조직을 순차적으로 멸균 및 해부하고 무릎 관절을 완전히 노출시킵니다.
- 대퇴골과 경골을 포함한 무릎 관절을 적출하고 근육 조직을 제거합니다.
- 대퇴골, 경골 및 주변 연조직(인대와 수정체)을 포함한 무릎 관절 조직을 10% 포르말린으로 모아 보존 및 고정합니다.
5. 헤마톡실린-에오신 염색
- 하룻밤 동안 고정한 후 절편을 파라핀으로 매립하고 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 박힌 조직을 0.4μm 두께로 자릅니다. 추가 염색(헤마톡실린-에오신 염색, 사프라닌 O/패스트 그린 및 면역조직화학(IHC) 염색)을 위해 준비된 섹션을 사용하십시오.
- 절편을 크실렌으로 두 번 탈파라핀화하고 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올을 각각 5분 동안 순서대로 담그고 다시 수분을 공급합니다.
- 헤마톡실린(0.1g/100mL)으로 절편을 5분 동안 염색한 다음 1% HCl에 10초 동안 넣고 에오신(0.5g/100mL)에 1분 동안 직접 넣습니다.
- 현미경으로 활막의 조직병리학적 변화를 관찰합니다.
6. 사프라닌 O/패스트 그린
- 조직을 파라핀에 포매하고 5.1단계에서 설명한 대로 조직학적 절편을 준비합니다.
- 자일렌으로 섹션을 두 번 탈파라핀화하고 에탄올 시리즈(예: 증류수에 각각 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올을 각각 5분 동안)로 재수화합니다.
- 준비된 부분을 헤마톡실린으로 염색하고 PBS로 각각 2분 동안 세 번 세척합니다.
- 염산 알코올로 단면을 분화하고 PBS로 각각 2 분 동안 3 회 세척합니다.
- 절편을 0.02% Fast Green 염색액에 5-10분 동안 담근 다음 0.1% Safranin O 염색액에 1-2분 동안 담그십시오.
- 1% 아세트산으로 절편을 분화한 후 PBS 세척을 수행합니다.
- 절편의 섬유연골 형성을 감지하고 분석합니다.
7. 면역조직화학(IHC) 염색
- 조직을 파라핀에 매립하고 5.1단계에서 설명한 대로 조직학적 절편을 준비합니다.
- 자일렌으로 섹션을 두 번 탈파라핀화하고 에탄올 시리즈(예: 증류수에 각각 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올을 각각 5분 동안)로 재수화합니다. Tris-EDTA 완충액(10mM Tris base, 1mM EDTA 용액, pH 9.0)에 절편을 담그고 95°C의 전자레인지에서 10분 동안 가열하여 항원 회수를 수행합니다.
- 절편을 3% 과산화수소 용액에 10분 동안 노출시켜 내인성 과산화효소를 제거합니다.
- 비특이적 결합을 차단하기 위해 5% 염소 혈청으로 절편을 치료합니다.
- CD177에 대해 희석된 1차 항체(1:1,000 희석)를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 PBS로 섹션을 세 번 씻습니다.
- 절편을 PBS로 담그고 실온에서 30분 동안 적절한 2차 항체(HRP-conjugated polymer anti-rabbit system)로 절편을 배양합니다.
- 3,3'-diaminobenzidine(DAB)을 발색원으로 사용하여 IHC 염색의 시각화를 수행합니다.
- 현미경으로 단면을 보고 획득한 이미지를 분석합니다.
Representative Results
KOA 마우스 모델은 II형 콜라겐분해효소를 사용하여 유도하였다. 모델 유도 후 1주일 후부터 제조된 은 나노입자 콜라겐 혼합물을 4주 동안 일주일에 한 번 관절강에 주입했습니다(그림 1). 각 그룹의 쥐의 체중을 관찰하고 매일 기록했습니다. 그 결과 KOA 마우스의 평균 체중은 정상 대조군의 마우스보다 현저히 낮았다. 그러나 II형 콜라겐분해효소 + AgNPs 투여군에 속한 마우스의 평균 체중은 KOA 마우스에 비해 더 높았지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았습니다(그림 2). 30일 후, 무릎 관절의 활막 조직을 마우스로부터 채취하여 병리학적 검사를 실시하였다. 증식, 혈관 증식, 활막의 염증성 침윤 및 연골 손상이 5,10,11로 분석되었습니다. 그 결과, KOA 투여군에서 마우스의 활막 두께가 정상 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다. 은 나노입자 콜라겐 혼합물을 처리한 그룹에서는 KOA 그룹에 비해 활막의 두께가 감소하였다(그림 3). 정상 대조군에 비해 KOA 마우스의 활막에서 혈관 증식이 있었고, 은 나노입자 콜라겐 혼합물로 처리한 마우스의 활막에서 혈관 증식이 현저히 감소했습니다(그림 4). Safranin-O 염색 결과는 KOA 마우스의 연골 매트릭스가 파괴된 반면, 은 나노 입자 콜라겐 혼합물로 처리된 마우스는 훨씬 더 나은 연골 매트릭스를 보여주었습니다(그림 5). 각 그룹의 형태학적 특징 점수는 앞서 설명한 바와 같이 평가하였다22. 결과는 식염수 투여군의 경우 0 ± 0, II형 콜라겐 투여군의 경우 7 ± 0.63, II형 콜라겐 분해효소 + AgNPs 투여군의 경우 4.2 ± 1.17이었다(그림 6). CD177은 주요 호중구 마커(25)이다. CD177은 정상적인 조건에서 호중구의 40%-60%에서 발현됩니다. 그러나 호중구에서 CD177의 발현은 급성 염증 중에 크게 증가합니다. IHC 염색 결과는 KOA 그룹에 비해 AgNP로 치료한 그룹에서 활막 부위의 침윤 호중구가 유의하게 감소했음을 보여주었으며(그림 7), 이는 AgNP로 치료하면 KOA의 증상을 개선할 수 있음을 시사합니다.
그림 1: 사출 주입점. (A) II형 콜라겐분해효소 주사의 대표 이미지. (B) II형 콜라겐분해효소 주입 후의 대표 이미지. (C) KOA 마우스 모델에서 은 나노 입자 콜라겐 혼합물 주입의 대표 이미지. (D) KOA 모델 마우스에서 은 나노입자 콜라겐 혼합물 주입 후의 대표 이미지. 빨간색 점선은 마우스 무릎 인대와 평행한 선을 나타냅니다. 검은색 화살표는 인슐린 주사기 바늘과 피부 사이의 각도를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 각 그룹에서 쥐의 체중 변화. 이 패널은 서로 다른 시점에서 각 그룹의 마우스의 평균 체중을 보여줍니다. x축은 II형 콜라겐분해효소 주입 후 일수를 나타내고 y축은 체중의 접힘 변화를 나타냅니다. 식염수 그룹 (n = 7), 유형 II 콜라겐 분해 효소 그룹 (n = 5), 유형 II 콜라겐 분해 효소 + AgNP 그룹 (n = 5). *p < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 활막 증식을 나타내는 Hematoxylin-eosin(H&E) 염색. 각 마우스 그룹의 활막 조직을 수집하고, 고정하고, 절편하고, 수술 후 30일에 H&E로 염색했습니다. 이중 화살표는 감지된 활막 두께를 나타냅니다. 축척 막대 = 0.1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 활막 주위 혈관 증식증의 대표 이미지. 화살표는 선박을 나타냅니다. 축척 막대 = 0.05mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 각 마우스 그룹의 무릎 관절에 대한 Safranin-O 염색. 축척 막대 = 0.2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 각 그룹의 형태학적 특징 점수. 활막 조직을 사용하여 각 그룹의 마우스에 대한 형태학적 특징 점수를 측정했습니다. 활막 내벽 세포층의 증식/확대 정도, 활막 조직의 호중구 침윤 정도, 활막 기질의 활성화 정도를 분석하기 위해 각 그룹의 5개 조직 절편을 선택하였다(표 1). 평균값이 최종 점수로 사용되었습니다. **치료 되지 않은 KOA 그룹과 비교한 각 코호트에 대한 학생 t-검정에서 p < 0.01 및 ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 각 마우스 그룹의 활막 조직에 있는 호중구 마커에 대한 면역조직화학적 염색. 면역조직화학적 염색은 각 그룹의 마우스의 활막 조직에서 호중구 마커 CD177의 발현을 검출하는 데 사용되었습니다. 화살표는 호중구를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 형태학적 특징 채점. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
은 나노 입자는 항염증, 항균, 항산화 및 면역 조절 효과를 나타내며, 이는 활성 산소 종의 생산을 감소시켜 세포와 조직을 손상으로부터 보호 할 수 있음을 의미합니다26. 일부 연구자들은은 나노 입자27의 독성에 대해 우려하고 있습니다. 은 나노 입자의 독성은 유리은 이온의 존재와 직접적인 관련이 있습니다. 은 나노 입자의 나노 크기 때문에 생체 분자, 세포 및 인체 장기 15,28,29를 쉽게 방해 할 수 있습니다. 몇몇 연구는 은 nanoparticles가 산화 긴장을 유도하고 인간 세포에 있는 미토콘드리아 기능을 손상시킬 수 있었다는 것을 보고한다30. 또한, Ag는 다량의은 나노 입자를 사용한 후 인간의 장기, 특히 간과 비장에서 검출 될 수 있습니다. 연구자들은 또한 은 나노 입자가 시냅스 간 수송을 통해 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌에 축적되는 능력을 가지고 있다고 보고했다31. 은 나노 입자의 생체 독성에 대한 체계적인 보고는 수행되지 않았지만 일부 연구자들은 은 나노 입자의 안전성을 인정합니다32.
본 연구에서는 은 나노입자 콜라겐 혼합물을 제조하였다. 실제로, 인체 조직에서은 나노 입자의 지속 기간은 짧지 만,은 나노 입자의 지속 기간은 콜라겐 혼합물과 함께 적용될 때 연장 될 수 있습니다. 이것은 외상뿐만 아니라 약물의 복용량도 줄입니다. 은 나노 입자의 독성을 고려하여, 본 연구에서 적용한 은 나노 입자의 선량은 30 mg / kg으로 이전 연구33과 일치했다.
실험 작업의 몇 가지 중요한 고려 사항은 다음과 같습니다. Type II collagenase는 효소 절단으로 인한 분해를 방지하기 위해 준비 후 -20°C에서 보관해야 합니다. 은 나노 입자 콜라겐 혼합물은 반고체 겔이 빠르게 되어 주사에 사용할 수 없기 때문에 은 나노 입자 콜라겐 혼합물의 제조는 실온에서 얼음 위에서 지속적으로 수행되어야 합니다. 용액은 준비 후 4°C에서 보관해야 합니다. 관절 내 투여를 위해 바늘이 작은 1mL 인슐린 주사기를 선택해야 하며, 이는 주입된 약물의 누출을 효과적으로 방지할 수 있습니다. 바늘은 은 나노 입자 콜라겐 혼합물을 주입하기 위해 15° 각도로 삽입해야 합니다. 바늘이 저항하지 않으면 바늘이 무릎 관절강에 도달했음을 나타냅니다. 주입 후 주입 각도를 변경하고 주사 약물의 누출을 방지하기 위해 바늘을 천천히 빼야 합니다.
본 연구에서 은 나노입자는 생쥐에서 제2형 콜라겐분해효소 유도 KOA의 증상을 효과적으로 개선하여 은 나노입자의 항염증 효과를 입증하였다. 여러 연구에서 은 나노 입자 34,35,36으로 시험관에서 배양된 세포에서 세포사멸의 존재를 보고했습니다. 활막 증식의 감소는 미토콘드리아 기능의 손상에 관여하기 때문에 은 나노 입자에 의해 발생했을 수 있으며, 이러한 결과는 활성 산소 종에 의해 매개되었을 수 있습니다. 혈관 증식은 KOA 모델 그룹의 마우스의 활막에서 관찰되었습니다. 이 과정에서 케모카인이 호중구를 혈관에서 활막 조직으로 몰아내고 염증의 폭발로 인해 세포가 더 많은 산소를 소비하게 되어 혈관 증식이 발생했을 가능성이 있습니다. 따라서 이 가설의 신뢰성을 증명하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다. 이 연구는 임상 KOA 치료에 대한 연구에 이론적 이점을 제공합니다. 향후 연구에서는 전방십자인대(ACL) 방법과 화학적으로 유도된 KOA 모델 방법을 결합하여 은 나노입자의 효과를 관찰하는 것을 목표로 합니다. 실험 결과는 은 나노 입자가 KOA 마우스의 활막에서 염증 세포의 침투를 크게 줄일 수 있음을 보여 주지만,이 효과의 메커니즘은 여전히 추가 연구가 필요하며, 이는 KOA의 발병 기전을 풀 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 광둥성 자연과학재단(번호: 2019A1515010209)과 중국 광저우시 과학기술프로젝트(번호: 202102010164)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL insulin syringe | BD | 305932 | None |
| CD177 Polyclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | PA5-98759 | None |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 302-17-0 | None |
| DAB | MCE | HY-15912 | None |
| Eosin | Beyotime Biotechnology | C0109 | None |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | None |
| Hematoxylin | Beyotime Biotechnology | C0107 | None |
| Light Microscopy | Leica | DM500 | None |
| Silver nanoparticle | Wolcacvi | S-10-20 | Store product in the dark at 4°C |
| Safranine O-Fast Green FCF Cartilage Stain Kit | Solarbio | 90-15-3 | None |
| Type II collagen | Sigma-Aldrich | C6885-500mg | None |
References
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