Summary
Störning av blod-ryggmärgsbarriären (BSCB) kan framgångsrikt uppnås med intravenös administrering av mikrobubblor och applicering av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU). Detta protokoll beskriver öppnandet av BSCB med hjälp av LIFU i en gnagarmodell, inklusive utrustningsinställning, mikrobubbelinjektion, mållokalisering och BSCB-störningsvisualisering.
Abstract
Lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) använder ultraljudspulseringar med lägre intensitet än ultraljud och testas som en reversibel och exakt neuromodulerande teknik. Även om LIFU-medierad öppning av blod-hjärnbarriären (BBB) har undersökts i detalj, har ingen standardiserad teknik för öppning av blod-ryggmärgsbarriär (BSCB) hittills fastställts. Därför presenterar detta protokoll en metod för framgångsrik BSCB-störning med hjälp av LIFU-ultraljudsbehandling i en råttmodell, inklusive beskrivningar av djurförberedelser, administrering av mikrobubblor, målval och lokalisering, samt visualisering och bekräftelse av BSCB-störningar. Tillvägagångssättet som rapporteras här är särskilt användbart för forskare som behöver en snabb och kostnadseffektiv metod för att testa och bekräfta mållokalisering och exakt BSCB-störning i en smådjursmodell med en fokuserad ultraljudsgivare, utvärdera BSCB-effekten av ultraljudsbehandlingsparametrar, eller utforska tillämpningar för LIFU vid ryggmärgen, såsom läkemedelsleverans, immunmodulering och neuromodulering. Optimering av detta protokoll för individuell användning rekommenderas, särskilt för att främja framtida prekliniskt, kliniskt och translationellt arbete.
Introduction
I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) reglerar blod-ryggmärgsbarriären (BSCB) rörelsen av cirkulerande lösta ämnen, celler och plasmakomponenter in i spinalparenkymet1. Denna skyddande egenskap är resultatet av ett specialiserat system av tätt bundna, icke-fenestrerade endotelceller som kantar ryggradens kapillärer2. Vanligtvis är det bara lipofila molekyler med låg vikt och positiv laddning som kan passera båda barriärerna3. Trots studier som tyder på att BSCB har en något högre permeabilitet än BBB, begränsar båda barriärerna leveransen av läkemedel till det centrala nervsystemet4. Flera strategier har utvecklats för att öka transporten av läkemedel över BSCB, inklusive tekniker för att öka osmotiskt tryck i ryggradens kapillärer, utveckling av läkemedel som interagerar med bradykininreceptorer och skapandet av funktionaliserade nanopartiklar5.
BSCB-störning kan också uppnås via intravenös administrering av mikrobubblor (MB) följt av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) ultraljudsbehandling6. Det akustiska fältet som genereras av ultraljudsgivaren orsakar MB-svängningar, som i sin tur belastar endotelväggen och lossar täta korsningar7. Den snäva korsningen som lossnar skapar övergående luckor i kapillärerna, vilket gör att läkemedel kan tränga in i spinalparenkymet (Figur 1). Denna process kan också skapa transendotelfenestrationer, öka transcytosen och nedreglera ATP-bindande kassetttransportörer, såsom P-glykoprotein 8,9. En viktig fördel med denna teknik är förmågan att minimera off-target effekter genom att rikta fokalområdet för ultraljudsbehandling till den plats av intresse i ryggmärgen. Flera kliniska prövningar har undersökt effekten av LIFU-medierad BBB-öppning för behandling av patologier i centrala nervsystemet, inklusive gliom, amyotrofisk lateralskleros, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom. Även om LIFU-medierad BSCB-störning inte karakteriseras i lika stor utsträckning som LIFU-medierad BBB-störning, har flera grupper rapporterat framgångsrik BSCB-störning i gnagar-, kanin- och svinmodeller10,11,12. Sammantaget växer intresset för tekniken snabbt, särskilt som en gångbar väg för läkemedelstillförsel.
I detta protokoll beskrivs en teknik för LIFU-medierad BSCB-störning i en råttmodell. Proceduren inkluderar detaljerade beskrivningar av djurförberedelser, LIFU-utrustningsinställning, MB-administration, mållokalisering och ryggmärgsextraktion. Bekräftelse av mållokalisering och BSCB-störning utvärderas via Evans blue dye (EBD) extravasering i ryggmärgen. EBD är en giftfri förening som binder till serumalbumin och kan identifieras genom sin rika blå färg visuellt och röd autofluorescens under mikroskopi13.
Stegen som listas här erbjuder ett snabbt och billigt alternativ till traditionella ultraljud (US) eller magnetisk resonans (MR)-styrda LIFU-system. Som ett resultat är denna metod användbar för forskare som är intresserade av att snabbt testa och bekräfta inriktnings- och BSCB-störningsförmågan hos sin LIFU-givare innan de skaffar ytterligare utrustning och material eller bedriver LIFU-applikationer vid ryggmärgen, såsom läkemedelsleverans, immunmodulering och neuromodulering.
Protocol
Alla djurstudier har godkänts och utförts i enlighet med Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC RA20M223). Endast vuxna honråttor av Sprague-Dawley (medelvikt: 250 g; ålder: 11 veckor) användes i den aktuella studien.
1. Lågintensiv fokuserad ultraljudsmontering och installation
- Skaffa ett fokuserat ultraljudsgivarsystem med specifikationer som är tillräckliga för att uppnå BSCB-öppning hos råttor. Föreslagna parametrar från litteraturen inkluderar en central frekvens mellan 0,25-4 MHz och förmågan att producera topptryck mellan 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Se till att systemet innehåller kör-/kontrollutrustning, som minst omfattar en våg-/signalgenerator, radiofrekvensfrekvensenhet/effektförstärkare och matchande nätverk (figur 2A).
OBS: Installationen som beskrivs här använder en kommersiellt tillgänglig multielementgivare med en central frekvens på 250 kHz och 64 mm diameter (Figur 2B). - Fäst den 3D-printade sondhållaren och vattenkonen på givaren (Figur 2C). Se till att det finns en vattentät tätning mellan konen och givaren.
OBS: En anpassad kon- och sondhållare medföljde givaren som användes i detta experiment. Konen och sondhållaren fästs på givaren med skruvar, som också medföljer. - Sterilisera ett 50 μm tjockt, akustiskt transparent polyestermembran och fäst det på botten av vattenkonen med ett gummiband.
- Fyll vattenkonen med avgasat och avjoniserat vatten med hjälp av inlopps- och utloppsrören. Var noga med att undvika luftbubblor inuti konen, eftersom de kan störa den akustiska kopplingen mellan givaren och målet. Polyestermembranet ska vara något uppblåst.
OBS: För att ta bort luftbubblor från konen, styr bubblorna till utloppsventilen samtidigt som du fyller konen med vatten genom inloppsventilen. Om det finns många små bubblor, stäng alla ventiler och vrid konen tills en stor bubbla återstår. Styr denna bubbla till utloppsventilen och fortsätt att fylla konen. - Anslut drivutrustningen, som inkluderar våggeneratorn och RF-drivförstärkaren, till givaren. Givarkabeln ansluts till utgångssidan av det matchande nätverket, och signalgeneratorn/strömmen amplifier kommer att anslutas till ingångssidan av det matchande nätverket. Kablarna ska anslutas till motsvarande kanalnummer (Figur 2D-G).
OBS: I det kommersiella systemet som används i denna studie, våggeneratorn och RF-drivförstärkaren är komponenter i givarens uteffekt (TPO) (Figur 2D). - Fäst sondhållaren på den stereotaktiska armen. Fäst den stereotaktiska armen på fixeringsplattan. Detta gör att givaren kan placeras exakt ovanför gnagaren under ultraljudsbehandling.
2. Förberedelse av djur och kirurgisk laminektomi
- Bedöva råttan med en blandning av isofluran och medicinsk luft i en induktionskammare som är fäst vid en kolfilterbehållare. Ställ in gasflödet på 400 ml/min och isofluranförångaren mellan 1.5%-2.5% för anestesiinduktion. Tiden som tillbringas i kammaren före fullständig sedering varierar, även om den vanligtvis varierar från 3-6 minuter.
- Registrera vikten på den sederade råttan och utför ett tånyptest. Om ryck eller rörelse observeras som svar på nypandet, placera tillbaka råttan i induktionskammaren i ytterligare 1 minut och upprepa tånyptestet. Upprepa vid behov för att säkerställa att råttan är och förblir helt sövd.
- Placera en värmedyna och en steril absorberande dyna på fixeringsplattan. Placera råttan på den absorberande dynan, applicera ögonsalva och placera en rektal termometer för att övervaka kroppstemperaturen.
OBS: Under det kirurgiska ingreppet bör råttans temperatur och hjärtfrekvens övervakas (helst bör hjärtfrekvensen vara mellan 330-480 slag per minut och temperaturen mellan 35,9-37,5 °C)18,19. Justera isofluran eller värmedynan i enlighet med detta för att förhindra för tidig död. Värmedynan kan ställas in på en temperatur runt 37 °C och bör slås på och av efter behov för att bibehålla optimal kroppstemperatur. - Palpera råttans sista revben, som är fäst vid ryggraden vid den 13:e bröstkotan (T13). Använd en rakhyvel för att raka bort pälsen från ryggytan mellan det sista revbenet och halsen. Torka av den exponerade huden med gasbinda doppad i 10 % jodopovidon.
- Skapa ett snitt i mittlinjen med hjälp av en irissax och dissekera genom fascian tills ryggradsutskotten och lamina är exponerade. Ta bort benet med förskjutna bentänger och vinklade irissaxar tills ryggmärgen är exponerad20. Längden på laminektomi och snitt varierar beroende på antalet olika mål som ska sonikeras. I denna studie utfördes en laminektomi i tre nivåer med ett 3 cm snitt.
OBS: Undvik att röra vid eller trycka på ryggmärgen när du tar bort ben för att förhindra skador. Om råttans bakben rycker under laminektomin, användes för mycket kraft på navelsträngen eller nervrötterna. - Fäst råttan vid fixeringsplattan genom att klämma fast de spinösa utskotten intill laminektomin. Dra lätt åt ryggraden för att minimera krökningen innan du låser clamps.
3. Mållokalisering med hjälp av laserstyrning
- Justera givarens position med den stereotaktiska armen tills den är placerad exakt ovanför laminektomin (Figur 3A). Ramen tillåter rörelse i x-, y- och z-axlarna, samt 180° rotation i vertikalplanet och 360° rotation i horisontalplanet.
- Fäst laserapparaten på botten av vattenkonen och sänk den tills laserpunkten är synlig. Justera givarens position i sidled tills laserpunkten är ovanför den plats som är målet för BSCB-störning (Figur 3B,C).
OBS: En CAD-fil (datorstödd design) för laserapparaten ingår i det kompletterande avsnittet (kompletterande figur 1). - Ta bort laserapparaten och fyll utrymmet mellan konen och ryggmärgen med avgasad ultraljudsgel (Figur 3D). För maximal koppling, se till att det inte finns några luftbubblor i gelen.
OBS: I denna studie sänktes givaren med en påsatt vattenkon tills den placerades 1 cm ovanför sladden. Eftersom vattenkonen var 30 mm lång var det totala avståndet från givaren till sladden 40 mm. Vattenkonen placerades 1 cm från ryggmärgen eftersom råttans hud, fascia och muskulatur på vardera sidan av snittet förhindrar direktkontakt mellan konens spets och strängen. Att använda siffrorna på den stereotaktiska armens y-axel kan vara till hjälp för att hålla reda på det vertikala avståndet där konen är 1 cm från sladden, särskilt eftersom gelen kommer att göra det svårt att visuellt bekräfta konens avstånd från sladden. - Ställ in parametrarna för ultraljudsbehandling på TPO. En rad värden kan användas för att uppnå en lyckad BSCB-störning. För maximal effekt, ställ in ultraljudsbehandlingsfrekvensen nära givarens mittfrekvens. De värden som användes i denna studie listas i tabell 1.
OBS: Parametrarna som anges här anpassades från tidigare arbete med LIFU, med en centerfrekvens på 500 kHz, tonsprängningstid på 500 μs, en arbetscykel på 50% och ultraljudsbehandlingstider på 5 eller 10 minuter för att säkert neuromodulera en gnagare ryggmärg21. Baserat på studier som framgångsrikt uppnådde BSCB-störning är andra parametrar som kan användas centrala frekvenser mellan 500 kHz-1 MHz, tryck på 0,2-2,1 MPa, burstlängder på 10-25 ms och ultraljudsbehandling tider på 2-5 min 6,10,11,22.
| Parameter | Värde |
| Frekvens (kHz) | 250 |
| Fokusavstånd (mm) | 40 |
| Akustiskt topptryck (MPa) | 0.47 |
| Driftcykel | 40% |
| Burst-längd (ms) | 400 |
| Period (er) | 1 |
| Ultraljudsbehandling Tid (min) | 5 |
Tabell 1: Ultraljudsbehandling parametrar som används för BSCB-störningar.
4. Administrering av mikrobubblor
- Bered en MB-lösning i enlighet med tillverkarens instruktioner. Undvik att föra in luft i lösningen.
OBS: MB är ömtåliga och klumpar ihop sig nära toppen av injektionsflaskan/sprutan om de lämnas stilla i några minuter. Skaka injektionsflaskan och sprutan regelbundet för att förhindra en ojämn spridning av MB. MB har kort livslängd; Kontrollera tillverkarens guide för att bestämma utgångstiden. - Sätt in en 22 G svansvenkateter och spola med 0,2 ml hepariniserad koksaltlösning (500 IE/ml)23. För att öka chanserna för framgångsrik svansvenkateterisering, doppa svansen i varmt vatten och placera en tourniquet vid svansroten för att förstora venens diameter.
OBS: Svansvenskateterisering kan utföras före djurets laminektomi, positionering och inriktning för att spara studietid. - Injicera 1 ml/kg 3 % EBD i katetern. Spola med 0,2 ml hepariniserad koksaltlösning. Råttans extremiteter och ögon blir blå. Bekräfta framgångsrik svansvenkateterisering genom att kontrollera om det finns blå färgförändringar i ryggmärgsvenen hos råttan (Figur 4).
OBS: EBD kan injiceras väl före MB-injektion och kommer inte att påverka ultraljudsbehandling. Dessutom, eftersom Food and Drug Administration (FDA) för närvarande inte har godkänt ultraljudsbehandling med läkemedel som redan finns i systemet, EBD kan också administreras efter ultraljudsbehandling. Detta kommer att resultera i mindre färgupptag, men kan vara mer kliniskt relevant. - Injicera en 0,2 ml bolus MB i katetern och spola med 0,2 ml hepariniserad koksaltlösning. Starta ultraljudsbehandling 1-2 minuter efter injektion av MBs. Inställningen som används här samlar inte in feedback om ultraljudsbehandling i realtid.
OBS: Studier för BSCB-störningar använder vanligtvis en högre koncentration av MB än vad som indikeras för diagnostisk avbildning. Några koncentrationer av vanliga MB-märken som används för BBB- och BSCB-störningar i råttmodeller inkluderar 0,02-0,2 ml/kg och 200 μL bolusar 10,15,24,25.
5. Ryggmärgsextraktion och vävnadsbearbetning
- Efter avslutad ultraljudsbehandling, transkardiellt perfusion råttan med 100 ml kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills blodet går helt klart. Levern, som har en rik blå färg på grund av färgämnet, ska blekna till en ljusbrunblå26.
OBS: Syftet med perfusion är att avlägsna överflödigt blod från ryggmärgens kärl. Eftersom EBD binder till albumin tar detta också bort överflödig EBD. Detta säkerställer att all EBD som detekteras antingen visuellt eller genom fluorescensmikroskopi i ryggmärgen kommer från extravasering av färgämne i spinalparenkymet. - Transkardiellt perfundering med 100 ml kall 4% paraformaldehyd (PFA). Råttans lemmar kommer att rycka under denna fixering om det görs noggrant. Denna perfusion med PFA avlivar råttan.
- Ta bort ryggmärgen och placera den i 4 % PFA vid 4 °C över natten. Byt ut PFA mot PBS följande dag.
6. Visualisering av BSCB-störningar
- Isolera en 2 cm sektion som omger platsen för ultraljudsbehandling med hjälp av ett rakblad. Dela sektionen längs mittlinjen med bladet och sektionen i 10 μm tjocka sektioner med hjälp av en mikrotom. För ljusfältsvisualisering, färga med hematoxylin-eosin (H&E) färg.
OBS: H&E-ryggmärgsproverna som visades i denna studie färgades med hematoxylin i 3 minuter och eosin i 1 minut27. - För fluorescensmikroskopi, deparaffinisera objektglasen som innehåller ryggmärgssnitten och motfärga med 25 μL 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) löst i monteringsmediet (0,5 μg/ml). Inkubera vid 4 °C i minst 10 min. Undvik ljus för att förhindra blekning.
OBS: Deparaffiniseringen kan ersättas genom att använda en kryostat för att få frysta sektioner. - Använd ett fluorescerande mikroskop för att avbilda alla objektglas. EBD-autofluorescens (excitation: 470 nm och 540 nm; emission: 680 nm) är synlig i den röda kanalen, medan DAPI finns i den blå kanalen. Använd ett ljusmikroskop för att avbilda H&E-diabilderna.
OBS: Även om detta protokoll beskrev en icke-överlevnadsprocedur, utfördes den också med hjälp av överlevnadskirurgiska tekniker. För överlevnadskirurgi, desinficera huden före snitt med 3 alternerande appliceringar av jodopovidon och administrera buprenorfin subkutant (0,05 mg/kg) före operationen. Fortsätt att ge subkutant buprenorfin var 12:e timme minst 3 dagar efter operationen, med ytterligare dagar om råttan uppvisar tecken på smärta. Om ryggmärgsskada uppstår kan råttor uppvisa urinretention eller onormal gång. Detta kommer att visa sig som släpande eller försenad rörelse av bakbenen eller palperbara, utspända blåsor. Om detta inträffar ska råttor med näringsberikat vatten gela för mat och hydrering och manuellt pumpa blåsan två gånger per dag tills reflextömningen är återställd. Om det finns fullständig förlamning av bakbenen eller svårbehandlad smärta, avliva råttan.
Representative Results
Detta dokument visar att den samtidiga tillämpningen av LIFU ultraljudsbehandling och MB-administration är en effektiv teknik för lokaliserad BSCB-störning. Öppningen av BSCB indikeras av närvaron av EBD-extravasering i spinalparenkymet. Förändringarna är tydliga både visuellt och under fluorescensmikroskopi. Ryggmärgsvaskulaturen är synlig efter laminektomi och visar den bakre ryggmärgsvenen med flera mindre kärl som strålar lateralt (Figur 4A). Intravenös injektion av EBD genom svansvenskatetern resulterar i att denna kärl berikas med blått färgämne (Figur 4B). Detta är en bra punkt i proceduren för att verifiera att laminektomin inte resulterade i att någon ryggradsvaskulatur brister, eftersom detta skulle resultera i att blått blod samlas över strängen. Efter ultraljudsbehandling bör en blå fläck bli synlig över målplatsen, vilket indikerar extravasering av EBD i det vita parenkymet på grund av BSCB-störning (Figur 4C). Storleken på denna plats varierar beroende på ett antal faktorer, inklusive storleken på givarens fokalområde och hur lång tid efter ultraljudsbehandling. För att öka chanserna att se EBD extravasering, bör man förlänga tiden mellan ultraljudsbehandling och ryggmärgsextraktion.
Även om PFA-perfusion inte är ett nödvändigt steg att utföra före navelsträngsextraktion och efterföljande vävnadsanalys, tar det bort blod från provet och ökar kontrasten mellan det vita spinalparenkymet och de blå EBD-färgade områdena. Alla råttor som fick MB administrering och LIFU ultraljudsbehandling visar uppenbar extravasering av EBD i ryggmärgen, medan negativa kontroller som fick MB och EBD utan LIFU ultraljudsbehandling inte. Representativa bilder visas i figur 5. Sagittala snitt genom vävnaderna avslöjar att EBD-extravaseringen inte bara är ytlig, utan sträcker sig långt in i själva strängen. Detta är förväntat, eftersom fokalområdet på givaren som används i denna studie är större än diametern på råttans ryggmärg. Ibland kan små mängder blödning ses i sagittala snitt. Detta kan bero på laminektomi eller ultraljudsbehandling. Om blödningen är nära den dorsala periferin av strängen är det mer troligt att det beror på laminektomin.
För att ytterligare utvärdera EBD-extravasering färgades sagittala ryggmärgssnitt med DAPI (nukleär markör) och avbildades med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. Alla sladdar som fick LIFU ultraljudsbehandling (n = 3) visade en signifikant högre intensitet av EBD-autofluorescens (p = 0,016) än sladdar som inte fick ultraljudsbehandling, med liknande intensiteter av DAPI närvarande i båda (Figur 6). H&E-analys avslöjade vidare inga neuronala skador, blödningar eller kavitetsskador som finns i de sonikerade platserna, vilket stöder säkerheten för denna procedur. Exempel på skadade strängar på grund av kirurgisk felhantering och en kraftfull ultraljudsbehandling visas som en jämförelse. Blödning, vävnadsskador, kavitetsskador och eventuell vakuolisering märks. Även om exemplet med ultraljudsbehandling med hög effekt inte visar blödning, har detta också rapporterats som en effekt av ultraljudsstörningar.
Dessutom genomfördes beteendeanalys på råttor som fick MBs, EBD och LIFU ultraljudsbehandling. Även om denna metod inte helt utesluter vävnadsskador, testar den om motoriska brister uppstod på grund av denna procedur. Råttor registrerades när de gick i en bur i 5 minuter varje dag under en period av 5 dagar, och rörelsefunktionen graderades baserat på Basso Beattie Bresnahans lokomotoriska skala (Supplemental Video File 1). Alla råttor (n = 5) fick den högsta poängen före ultraljudsbehandling, post-ultraljudsbehandling och varje dag under överlevnadsperioden (Figur 7).
Slutligen mättes de termiska effekterna av ultraljudsbehandlingen parametrar som används i denna studie med hjälp av två ex vivo råtta ryggmärgsprover och en digital termometer sond med en fin spets insatt i strängen. Temperaturen på ryggmärgsproverna spårades i 5 minuter före, under och efter ultraljudsbehandling, i totalt 15 minuter. Minimala temperaturförändringar sågs. I själva verket, det var ≤ 1.3 ° C förändring på grund av ultraljudsbehandling i båda proverna, vilket minskar sannolikheten för hypertermisk skada till följd av ultraljudsbehandling (Figur 8).
Figur 1: Lågintensiv fokuserad ultraljudsmedierad öppningsmekanism för blod-ryggmärgsbarriären . (A) Schematisk översikt över lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) ultraljudsbehandling av råtta ryggmärg. (B) Mekanismen för öppning av blod-ryggmärgsbarriären (BSCB) via LIFU-ultraljudsbehandling av intravenösa mikrobubblor (MB). MB oscillerar som svar på LIFU, vilket orsakar vidgning av täta korsningar mellan endotelceller. Denna störning av BSCB möjliggör extravasering av nanopartiklar, terapeutiska läkemedel eller Evans blå färgämne. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Lågintensiv fokuserad ultraljudsinstallation och anslutning. (A) Schematisk representation som visar typiska fokuserade ultraljudskomponenter. (B) Översiktsbild av den fokuserade ultraljudsinställningen, inklusive: 1. givarens uteffekt (TPO), 2. matchande nätverk, 3. LIFU-givare, 4. det stereotaktiska instrumentet, 5. mobila klämmor. C) Givare, inklusive: 1. sondhållare, 2. ringgivare, 3. vattenkon, 4. vatteninloppsrör, 5. vattenutloppsrör, 6. membran säkrat med ett gummiband. (D) TPO:s framsida, inklusive: 1. RF-skärmad kapsling, 2. beröringskänslig frontdisplaypanel med justerbar meny, 3. vridknapp för parameterjustering, 4. start/stopp-utgångsomkopplare. (E) Baksidan av TPO:n, inklusive: 1. kanalutgångar, 2. jord, 3. USB-ingångsport för programvarukontroll, 4. intern trigger, 5. synkroniseringsutgång, 6. strömingång och matning, 7. på/av-strömbrytare. (F) Matchande nätverksutgång, med ledningar som matchar kanalnummer. (G) Matchande nätverks-XDR-ingång, med kablar som matchar kanalnummer Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mållokalisering med laservägledning . A) Stereotaktisk arm med rörelseomfång i alla tre axlarna och rotationsförmåga. Den är fäst på fixeringsplattan nedan. B) Laserapparater för identifiering av fokalzonen. Lasern är placerad på givarens spets och är i linje med fokalområdet. (C) Illustration som visar lasern på den exponerade ryggmärgen, vilket indikerar att givarens fokalområde nu är riktat mot denna plats. (D) Givaren sänks tills spetsen på konen är placerad 1 cm ovanför sladden, och gapet fylls med gel för att säkerställa maximal koppling. Avståndet från givaren till ryggmärgen är 40 mm (brännvidd). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Evans blå färgämnesextravasering i ryggmärgen efter ultraljudsbehandling . (A) Bild av T9-T11 råtta laminektomi snitt, med den exponerade ryggmärgen och bakre ryggvenen tydligt synliga. (B) Den omgivande vävnaden och ryggmärgsvaskulaturen blir blå efter intravenös injektion av Evans blue dye (EBD). (C) EBD-extravasering i ryggmärgsparenkym på platsen för ultraljudsbehandling, vilket indikerar att BSCB-störning har inträffat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ryggmärgsextraktion och visualisering av BSCB-öppning efter perfusion. A) Avlägsnad ryggmärg från kontrollråtta utan LIFU-behandling. Denna råtta fick bara MB och EBD. Mittsagittal del av strängen inbäddad i paraffin visas i infällningen, och ingen EBD-extravasering är synlig. B) Avlägsnad ryggmärg från råtta med LIFU-behandling. Denna råtta fick också MB och EBD. Kolonnen av EBD-extravasering är synlig och lokaliserad till det sonikerade området. Mid-sagittal skiva av strängen inbäddad i paraffin visas i infällningen, med en pil som pekar på EBD-koncentrationen synlig inuti den sonikerade platsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Detektion och utvärdering av BSCB-öppning. (A) Ryggmärg färgad med DAPI (nukleär markör, blå). Minimal EBD-autofluorescens (röd) är synlig. Denna råtta fick inte LIFU. (B) Ryggmärg färgad med DAPI (nukleär markör, blå). Lokaliserad EBD-autofluorescens (röd) vid den sonikerade målplatsen är synlig. Denna råtta fick LIFU och MBs. (C) Ryggmärgen hos en råtta utan LIFU färgad med hematoxylin (nukleinsyrafärgning) och eosin (ospecifik proteinfläck) (H&E). Inga neuronala skador, blödningar eller kavitetsskador är synliga. (D) Ryggmärgen hos en råtta med LIFU färgad med H&E. Inga neuronala skador, blödningar eller kariesskador är synliga. (E) Ryggmärgen från en råtta med kirurgisk skada färgad med H&E. Pilar pekar på riklig blödning och vävnadsskada. (F) Ryggmärgen hos en råtta med skador på grund av ultraljudsbehandling med hög effekt färgad med H&E. Pilar pekar på hålrumsskador, och den infällda visar möjlig vakuolisering. (G) Stapeldiagram som visar intensiteten av DAPI och EBD i ryggmärgen hos råttor med och utan LIFU-ultraljudsbehandling. Det finns signifikant mer EBD-intensitet i LIFU-ryggmärgen jämfört med den negativa kontrollen (p = 0,016), trots liknande DAPI-intensitet (p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Beteendeanalys före och efter ultraljudsbehandling . (A) Basso, Beattie, Bresnahan-apparatuppsättning, där råttor spelades in när de gick i 5 minuter underifrån. (B) Stillbild från en inspelad video. Den här videon användes för att betygsätta råttans motoriska koordination och gång på Basso, Beattie, Bresnahan-skalan. (C) Boxplot (n = 5) som inte visar någon förändring i motoriska poäng före ultraljudsbehandling, post-ultraljudsbehandling, eller under en 5-dagars överlevnadsperiod hos råttor som fick MB och LIFU-behandling (p > 0,05). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Temperaturanalys med ex vivo ryggmärg. Graf som visar temperaturförändringar i två ex vivo ryggmärgsprover för en 5 minuters före-, under- och post-ultraljudsbehandling varaktighet. De parametrar som används för ultraljudsbehandling listas i tabell 1. För prov 1 var medeltemperaturen före, under och efter ultraljudsbehandling 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C respektive 22,0 °C ± 0,1 °C. För prov 2 var temperaturerna före, under och efter ultraljudsbehandling 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C respektive 22,4 °C ± 0,2 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: CAD-fil för lasermålsutrustning. (A) Vy av laserapparaten underifrån. Vilken laser som helst kan placeras i det centrala hålet i mitten. (B) Sidovy av laserapparaten. (C) Laserapparatens mått, med enheter i tum. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande videofil 1: Video av en råtta som går i Basso, Beattie, Bresnahan-apparaten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här beskrivs den utrustning och de steg som krävs för effektiv och riktad BSCB-störning med hjälp av lågintensivt fokuserat ultraljud (LIFU) i kombination med administrering av mikrobubblor (MB). Detta protokoll är flexibelt och kan optimeras för individuell användning med givare med olika specifikationer. Andra tekniker för LIFU-medierad BSCB-störning förlitar sig på användningen av magnetisk resonanstomografi (MRI)-styrda system för mållokalisering, vilket är en dyr resurs16. Fördelarna med den teknik som presenteras här ligger i den snabba visuella bekräftelsen i realtid av BSCB-störningar och den enkla inriktningen på grund av förfarandets öppna karaktär. Dessutom är laserapparaten enkel att använda och konstruera, och en CAD-fil ingår i det kompletterande avsnittet. Som ett resultat kan forskare som är intresserade av att utföra inledande tester av inriktningsförmågan hos sin LIFU-givare i en smådjursmodell använda detta protokoll som ett verktyg för att snabbt bekräfta fokalzonspositionering över en plats av intresse. Denna teknik kan också användas av laboratorier som börjar studera kliniska tillämpningar av LIFU, såsom läkemedelstillförsel, innan de investerar i mer komplexa vägledningsmodaliteter som US- eller MR-system. För närvarande är USA-styrda modaliteter en mer lovande och kostnadseffektiv väg jämfört med MR-system, även om de senare oftare ses i litteraturen.
Det finns flera kritiska steg i denna procedur som måste utföras noggrant för att säkerställa en framgångsrik BSCB-störning. Det är absolut nödvändigt att undvika att lägga onödigt tryck på ryggmärgen under den kirurgiska laminektomin. För mycket fysisk manipulation av sladden ökar sannolikheten för skador på BSCB. Skadan visar sig som en mörkbrun fläck inuti strängen efter extraktion på grund av blödning och ökad EBD-extravasering. Dessutom måste maximal koppling säkerställas mellan givaren och den exponerade ryggmärgen. Som ett resultat måste man vara noga med att ta bort bubblor från vattenkonen och ultraljudsgelen. Det bör inte finnas några mellanrum mellan botten av vattenkonen och sladden för att säkerställa full överföring av den akustiska vågen. Under svansvenskateteriseringen bör man undvika att oavsiktligt släppa ut luft tillsammans med hepariniserad koksaltlösning, EBD eller MB-lösningar. Injektion av luft ökar kraftigt risken för lungemboli som leder till att gnagare dör innan ingreppet är avslutat28.
Ett vanligt problem som kan uppstå under denna procedur är att EBD-injektionen misslyckas. För personer med minimal erfarenhet av svansvenskateterisering kan det spara tid att utföra detta steg före djurens laminektomi, positionering eller inriktning. EBD kan också injiceras långt före MB injektion utan att påverka ultraljudsbehandling. Att använda den tourniquet och det varma vattenbad som föreslås i detta protokoll hjälper till att vidga svansvenerna och öka framgångsfrekvensen. Dessutom minskar uttorkning av råttor sannolikheten för korrekt kateterplacering. En intraperitoneal koksaltsinjektion 10-15 minuter före svansvenskateterisering kan hjälpa. Under kateteriseringen ska man börja 2 i ovanför svansens ände och röra sig i kaudal till kraniell riktning. Att röra sig i motsatt riktning minskar sannolikheten för framgång på grund av potentiell venkollaps eller blödning.
En annan vanlig utmaning är bristen på EBD-extravasering trots ultraljudsbehandling. Detta kan tyda på att de parametrar som används för ultraljudsbehandling är otillräckliga för BSCB-störningar. Till exempel, om ultraljudsbehandling frekvensen är inställd på ett värde som skiljer sig mycket från den centrala frekvensen av givaren, ultraljudsbehandling effekt kommer att vara för låg för att oscillera MB och orsaka tät korsning lossning. Dessutom, ju fler gränssnitt mellan givaren och sladden (t.ex. vattenkon, membran, gel, luftbubblor i vatten / gel), desto lägre är den verkliga ultraljudsbehandlingsintensiteten kommer att vara vid målet. Minimera dessa gränssnitt, till exempel genom att använda avgasad gel och noggrant ta bort bubblor inuti konen, kommer att hjälpa till att överföra den fulla potentialen av ultraljudsbehandling. Protokollet uppmuntrar också att öka tiden mellan ultraljudsbehandling och perfusion för att ge mer tid för EBD-extravasering i spinal parenkym. Även om BSCB-avbrott är en övergående procedur finns luckorna i flera timmar innan de stängs. En lång väntetid ökar exponeringen för isofluran, men resulterar också i större EBD-extravasering i strängen. Alternativt, EBD extravasering kan vara närvarande trots ingen ultraljudsbehandling med LIFU. För att felsöka detta problem måste försiktighet iakttas under laminektomin för att förhindra oavsiktlig skada på BSCB. Möjliga lösningar är att lyfta råttans ryggrad under fastspänning för att öka utrymmet mellan lamellerna och strängen, samt en kortare laminektomi. En grundlig PFA-perfusion minskar också bakgrundsfärgning genom att ta bort EBD-berikat blod från kärlen i ryggmärgen. Under den transkardiella perfusionen måste försiktighet iakttas för att förhindra oavsiktlig ruptur av hjärtat, vilket kan resultera i läckage av PBS eller PFA.
Det är viktigt att notera att denna studie representerar en enda centerupplevelse för LIFU-medierad BSCB-störning. Dessutom testar eller optimerar detta protokoll inte olika ultraljudsbehandling energi parametrar och MB koncentrationer. Som ett resultat uppmuntras forskare att undersöka olika parametrar och koncentrationer när de utför denna teknik för att optimera mållokalisering och BSCB-störningar för deras specifika forskningsbehov, särskilt om de första resultaten ger några negativa effekter. Grupper som inte vill se några temperaturförändringar kan till exempel testa olika parametrar tills de hittar en uppsättning som uppfyller detta kriterium och uppnår tillräcklig BSCB-störning. Dessutom kan ytterligare experiment utföras för att bekräfta säkerheten för denna teknik. Till exempel kan provstorleken ökas, överlevnadsperioden kan förlängas och elektromyografi/gånganalysstudier kan utföras. För längre överlevnad är det viktigt att komma ihåg att vissa studier visar att höga doser av EBD ibland kan orsaka kronisk systemisk toxicitet, så en lägre dos kan vara klok29.
En annan begränsning av denna procedur är den invasiva karaktären hos laminektomin (som krävs för alla tekniker som använder LIFU för BSCB-öppning eftersom ultraljud inte kan tränga igenom ben). Den invasiva karaktären hos denna procedur kan minskas genom att begränsa längden på laminektomin. Att utföra laminektomi i de övre bröstkotorna, som är kortare och tunnare, kan minska den tid som behövs för laminektomi till under 10 minuter. På grund av MBs ömtåliga natur, liksom deras korta halveringstid, är tiden begränsad under detta protokoll. Injektionen av MB bör ske 1-2 minuter före behandling med LIFU, och nya MB bör administreras före varje ultraljudsbehandling om flera LIFU-behandlingar utförs. För experiment som involverar BSCB-störning för flera råttor kan flera MB-injektionsflaskor behöva beredas. Eftersom mikrobubblor är dyra, ändra det kirurgiska arbetsflödet för att minimera tiden mellan ultraljudsbehandlingar är att föredra för att spara antalet MB som används.
Tekniken som beskrivs här är i första hand avsedd att användas som ett forskningsprotokoll. Även om lasermålsökningsapparaten inte kommer att ersätta traditionella målsökningsmetoder i alla kliniska miljöer, kan den vara användbar i andra situationer. För icke-invasiva operationer kan traditionella MRT-metoder användas på ett tillförlitligt sätt för att rikta in sig på30. För invasiva operationer som inkluderar en laminektomi som utförs, laserpunktsapparaten som beskrivs i detta protokoll kan användas för att snabbt lokalisera centrum av fokalzonen för ultraljudsbehandling över en specifik region (till exempel en tumör eller en plats för ryggmärgsskada) i syfte att leverera läkemedel eller immunmodulerande terapi samtidigt som man kompletterar eventuell MR-vägledning som skulle äga rum.
Sammantaget beskriver detta protokoll en effektiv och framgångsrik teknik för BSCB-störningar och innehåller flera alternativ för bekräftelse av BSCB-öppningen, både i realtid och efterbehandling. Eftersom BSCB fungerar som en barriär för inträde i ryggmärgsparenkymet är störning av BSCB en möjlig metod för att förbättra leveransen av terapier. Till exempel använde Weber-Adrian et al. LIFU med en frekvens på 1,114 MHz och burstlängd på 10 ms för att förmedla genleverans till halsryggraden6. På liknande sätt visade Smith et al. att LIFU med en frekvens på 580 kHz, genomsnittligt akustiskt topptryck runt 0,46 MPa och en burstlängd på 10 ms kunde hjälpa till att leverera en monoklonal antikropp, trastuzumab, till ryggmärgen i en gnagarmodell av leptomeningeala metastaser10. De flesta studier har fokuserat på att använda LIFU, snarare än HIFU, på grund av LIFU:s förmåga att tillfälligt permeabilisera BSCB samtidigt som man undviker skador på den underliggande vävnaden. Vanligtvis använder LIFU intensiteter mellan 0,125-3 W/cm 2, medan HIFU använder intensiteter från 100-10 000 W/cm2 eller högre31. Som ett resultat utövar HIFU sina effekter främst genom uppvärmning av vävnad, medan LIFU, med samadministrering av MB, arbetar genom mekaniska kavitationseffekter. Samtidig administrering av läkemedel med MB kan resultera i större extravasering av läkemedlet i spinalparenkymet, liksom potentialen att ladda MB med läkemedel och lysera MB med ultraljud för riktad läkemedelstillförsel.
Ultraljudsbehandling, MB-koncentration och typ av givare som används i denna studie kan ändras baserat på experimentella behov. Till exempel kan en givare med ett mindre fokusområde vara att föredra för experiment där större kontroll behövs över lokaliserad målinriktning, medan en givare med högre effekt kan användas för experiment som kräver kraftfull störning på kortare tid. På grund av den flexibilitet som detta protokoll erbjuder finns det stor potential för användning inom preklinisk, klinisk och translationell forskning.
Disclosures
Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt. Amir Manbachi undervisar och konsulterar för BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical, och är uppfinnare av ett antal patentsökta FUS-teknologier. Betty Tyler har forskningsfinansiering från NIH och är delägare i Accelerating Combination Therapies (inklusive aktier eller optioner). Ashvattha Therapeutics Inc. har också licensierat ett av sina patent och är aktieägare i Peabody Pharmaceuticals. Nicholas Theodore erhåller royalties från och äger aktier i Globus Medical. Han är konsult för Globus Medical och har suttit i det vetenskapliga rådet/andra kontor för Globus Medical. Resterande författare har ingen intressekonflikt att redovisa.
Acknowledgments
med stöd av T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 och R01 HL071568-15 (N.V.T.); Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (AM). Flera figurer skapade med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
| 100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
| 22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
| 97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
| Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
| Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
| Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
| Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
| Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
| Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
| Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
| Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
| Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
| Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
| Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
| Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
| Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
| Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
| Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
| Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
| Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
| NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
| NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
| Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
| Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
| Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
| Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
| Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
| Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
| Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
| Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
| Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
| Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |
References
- Chopra, N., et al. Blood-spinal cord barrier: Its role in spinal disorders and emerging therapeutic strategies. NeuroSci. 3 (1), 1-27 (2021).
- Bartanusz, V., Jezova, D., Alajajian, B., Digicaylioglu, M. The blood-spinal cord barrier: morphology and clinical implications. Annals of Neurology. 70 (2), 194-206 (2011).
- Hersh, A. M., Alomari, S., Tyler, B. M. Crossing the blood-brain barrier: Advances in nanoparticle technology for drug delivery in neuro-oncology. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4153 (2022).
- Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain and blood-spinal cord barriers to interferons. Journal of Neuroimmunology. 76 (1-2), 105-111 (1997).
- Bellettato, C. M., Scarpa, M. Possible strategies to cross the blood-brain barrier. Italian Journal of Pediatrics. 44, 131 (2018).
- Weber-Adrian, D., et al. Gene delivery to the spinal cord using MRI-guided focused ultrasound. Gene Therapy. 22 (7), 568-577 (2015).
- Hersh, A. M., et al. Applications of focused ultrasound for the treatment of glioblastoma: A new frontier. Cancers. 14 (19), 4920 (2022).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30 (7), 979-989 (2004).
- Cho, H., et al. Localized down-regulation of P-glycoprotein by focused ultrasound and microbubbles induced blood-brain barrier disruption in rat brain. Scientific Reports. 6, 31201 (2016).
- Smith, P., Ogrodnik, N., Satkunarajah, J., O'Reilly, M. A. Characterization of ultrasound-mediated delivery of trastuzumab to normal and pathologic spinal cord tissue. Scientific Reports. 11 (1), 4412 (2021).
- Montero, A. S., et al. Ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2417-2426 (2019).
- Fletcher, S. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Honeycutt, S. E., O'Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. BioTechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
- Fletcher, S. P., Choi, M., Ramesh, R., O'Reilly, M. A. Focused ultrasound-induced blood-spinal cord barrier opening using short-burst phase-keying exposures in rats: A parameter study. Ultrasound in Medicine & Biology. 47 (7), 1747-1760 (2021).
- Cross, C. G., et al. Technical note: Quantification of blood-spinal cord barrier permeability after application of magnetic resonance-guided focused ultrasound in spinal cord injury. Medical Physics. 48 (8), 4395-4401 (2021).
- Hong, Y. R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Scientific Reports. 12 (1), 3636 (2021).
- Liao, Y. H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the L4-L5 sections of rats following spinal cord injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 882127 (2022).
- Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Influence of anesthetic agent, depth of anesthesia and body temperature on cardiovascular functional parameters in the rat. Laboratory Animals. 48 (1), 6-14 (2014).
- Lillie, L. E., Temple, N. J., Florence, L. Z. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Human & Experimental Toxicology. 15 (8), 612-616 (1996).
- Lin, X. J., et al. Spinal cord lateral hemisection and asymmetric behavioral assessments in adult rats. Journal of Visualized Experiments. (157), e57126 (2020).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. , (2023).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regeneration Research. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Saleem, M., et al. A new best practice for validating tail vein injections in rat with near-infrared-labeled agents. Journal of Visualized Experiments. (146), e59295 (2019).
- Sabbagh, A., et al. Opening of the blood-brain barrier using low-intensity pulsed ultrasound enhances responses to immunotherapy in preclinical glioma models. Clinical Cancer Research. 27 (15), 4325-4337 (2021).
- Dréan, A., et al. Temporary blood-brain barrier disruption by low intensity pulsed ultrasound increases carboplatin delivery and efficacy in preclinical models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 144 (1), 33-41 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Yamamoto, H., Imai, S., Okuyama, T., Tsubura, Y. Pulmonary lesions in rats caused by intravenous injection. Acta Pathologica Japonica. 32 (5), 741-747 (1982).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Møllgård, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Mainprize, T., et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: A clinical safety and feasibility study. Scientific Reports. 9 (1), 321 (2019).
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
