Summary
Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.
Abstract
Il modello murino di danno polmonare acuto (ALI) indotto da lipopolisaccaride (LPS) o endotossina è ancora tra i modelli più comunemente usati negli studi sugli animali di danno polmonare acuto o infiammazione acuta. Gli attuali metodi più comunemente usati nei modelli murini di danno polmonare acuto sono un'iniezione intraperitoneale di LPS e tracheostomia per l'infusione tracheale di LPS. Tuttavia, il primo metodo manca di targeting polmonare e danneggia altri organi, e il secondo metodo induce traumi operativi, rischio di infezione e un basso tasso di sopravvivenza. Qui, raccomandiamo un metodo di intubazione endotracheale orofaringea non invasivo per l'instillazione di LPS nei topi. In questo metodo, LPS viene introdotto in modo non invasivo nella trachea attraverso la cavità orofaringea per essere instillato nel polmone con l'aiuto di un apparato per l'intubazione endotracheale. Questo metodo non solo assicura il targeting polmonare, ma evita anche danni e il rischio di morte negli animali. Ci aspettiamo che questo approccio diventi ampiamente utilizzato nel campo del danno polmonare acuto.
Introduction
Il danno polmonare acuto (ALI) è una sindrome clinica comune. Sotto una varietà di fattori patogeni, la rottura della barriera fisiologica delle cellule epiteliali polmonari e delle cellule endoteliali vascolari porta ad un aumento della permeabilità alveolare, causando così una diminuzione della compliance polmonare, edema polmonare e grave ipossiemia1. La sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) è la forma più grave di ALI. L'infiammazione incontrollata e il danno da stress ossidativo sono considerati le principali cause di ALI eARDS 2 più grave. Quando le cellule epiteliali alveolari sono direttamente danneggiate a causa di un trauma, viene attivata la catena di risposta infiammatoria dei macrofagi alveolari, portando all'infiammazione nel polmone3. A livello globale, ci sono più di 3 milioni di pazienti con ARDS acuta all'anno e rappresentano circa il 10% dei ricoveri in unità di terapia intensiva; Inoltre, il tasso di mortalità nei casi gravi è pari al 46%4,5,6. Pertanto, è necessario stabilire un modello animale adatto di ALI per studiarne la patogenesi. Il topo è l'animale da esperimento più comunemente usato nello studio di ALI poiché il suo tratto respiratorio può simulare bene il tratto respiratorio umano per gli studi ALI. Inoltre, l'ALI si manifesta come massiccia infiltrazione di cellule infiammatorie, aumento della permeabilità vascolare polmonare ed edema polmonare. Le variazioni delle citochine infiammatorie nel siero e nel rapporto peso secco-umido del polmone riflettono il grado di ALI7.
Allo stato attuale, i principali metodi per la modellazione di ALI indotta da LPS nei topi includono l'intubazione tracheale intranasale e chirurgica 8,9. Qui, proponiamo un nuovo metodo per fornire LPS nella trachea attraverso l'intubazione orofaringea non invasiva. Questo metodo utilizza un intubatore illuminato per trovare la trachea del topo e quindi eroga LPS nella trachea e nel polmone. Questo metodo fornisce LPS ai polmoni in modo più accurato rispetto al metodo di consegna intranasale. Rispetto all'intubazione tracheale chirurgica, questo metodo non richiede un intervento chirurgico, evita di causare ferite e riduce il dolore nei topi10. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per stabilire un modello murino più convincente di ALI.
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Protocol
Il protocollo di sperimentazione animale è stato esaminato e approvato dal Comitato di gestione dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (record n. 2021-11). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57/BL (20-25 g, 6-8 settimane di età). I topi sono stati tenuti in una camera per animali ed erano liberi di bere e mangiare durante l'esperimento.
1. Preparazione
- Assicurarsi che la piattaforma di intubazione sia composta da una base, un montante, una graffetta, due elastici e alcune corde. Prendi una corda, passa la corda attraverso i due fori nella parte superiore del montante e lega le due estremità della corda, rispettivamente, alle piccole sporgenze nella parte superiore del montante.
NOTA: lasciare spazio per il passaggio della testa del mouse tra la stringa e i due fori. - Legare due elastici a ciascuna estremità della graffetta e fissare la graffetta con gli elastici sul retro del montante. Infine, fissare il riser alla base a 90° (Figura 1).
- Selezionare una cannula delle dimensioni e della lunghezza appropriate. Per un topo da 20−30 g, è possibile utilizzare un catetere da 22 G (lungo 2,5−3,8 cm)11. Montare la cannula su una penna a cannula e accendere la luce della penna (Figura 2).
- Preparare una piccola pinza chirurgica e una pipetta Pasteur disinfettandoli con alcool al 70%.
2. Preparazione della sostanza in esame
- Pesare e sciogliere 3 mg di LPS in 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,2) per formare una soluzione di LPS con una concentrazione di 3 mg/ml.
- Pesare e sciogliere 10 mg di pentobarbital sodico in 1 mL di soluzione salina normale per formare una soluzione di pentobarbital sodico all'1%. Filtrare-sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 μm.
3. Instillazione orofaringea non invasiva
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% alla dose di 50 mg/kg12,13. Determinare la profondità dell'anestesia da una mancanza di risposta al riflesso raddrizzante.
- Posizionare il topo anestetizzato sulla piattaforma di intubazione. Fissare i denti anteriori superiori con il filo e i due avampiedi con gli elastici (Figura 3).
- Tira fuori la lingua con una pinzetta e tienila con la mano sinistra. Spingere la cannula lentamente, lungo la bocca, con la mano destra verso l'alto, fino all'epiglottide mandibolare. Utilizzare la luce della penna a cannula per trovare la trachea e inserirla lentamente nella trachea (Figura 4).
- Dopo che la cannula è stata inserita nella trachea, ritirare lentamente la penna per intubazione e lasciare la cannula all'interno. Inserire la pipetta Pasteur nel giunto della cannula e premere la testina (Figura 5).
NOTA: Se il torace del topo si gonfia, l'intubazione ha esito positivo (Figura 6). - Dopo aver avuto successo l'intubazione endotracheale, instillare nei topi 3 mg/mL di LPS a 3 mg/kg attraverso la cannula usando una microsiringa a testa piatta14,15 (Figura 7).
- Una volta fatto, rimuovere la cannula e la microsiringa. Rimuovere il mouse dall'impalcatura e posizionarlo in una gabbia separatamente per recuperare. Osservare lo stato respiratorio del topo fino a quando non si è ripreso e ha riacquistato la coscienza.
NOTA: A 12 ore dopo l'instillazione tracheale LPS, eutanasia i topi seguendo la procedura approvata dal comitato etico animale. I saggi sierici TNF-α e le misurazioni del peso polmonare secco-umido sono stati eseguiti utilizzando procedure standard.
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Representative Results
Il metodo proposto per l'instillazione di LPS nei topi è stato verificato valutando l'espressione della citochina infiammatoria TNF-α e il rapporto peso secco e umido polmonare 12 ore dopo l'instillazione di LPS. C'erano quattro gruppi nell'esperimento: controllo in bianco (senza alcun trattamento), intubazione chirurgica16, intranasale17,18 e intubazione orofaringea non invasiva (n = 6). Rispetto al gruppo di controllo in bianco, i livelli sierici di TNF-α nel gruppo di intubazione orofaringea non invasiva erano significativamente aumentati (Figura 8A). Anche il rapporto polmone secco-umido è stato aumentato (Figura 8B), raggiungendo lo stesso livello di quello nel gruppo di intubazione tracheale chirurgica. I set di dati sono stati analizzati statisticamente con un ANOVA spaiato e test Tukey Kramer post-hoc multiple-comparisons. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM e un livello di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Figura 1: Raccordi e assemblaggio della piattaforma di intubazione. La piattaforma è composta da una base, un montante, una graffetta, due elastici e alcune corde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Kit di intubazione. Questa figura mostra il kit di intubazione e il suo assemblaggio. Questo include una lampada a penna, una fibra ottica e una cannula. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Fissazione del mouse. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Localizzazione della trachea. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Verifica della pompa per pipette Pasteur. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Prima e dopo l'immagine del torace che mostra l'intubazione riuscita . (A) Petto prima dell'intubazione. (B) Torace dopo l'intubazione; L'area che mostra il rigonfiamento del torace è contrassegnata da un cerchio rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Microcampionatore a testa piatta per l'erogazione di LPS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Valutazione della validità dell'instillazione non invasiva di LPS. (A) Espressione di TNF-α nel siero di topi C57BL/6 12 ore dopo un'iniezione endotracheale di LPS. (B) Analisi dei dati del rapporto peso secco-umido del tessuto polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Inizialmente, abbiamo guardato all'interno della cavità orale per trovare la posizione della trachea19. Tuttavia, durante questo processo, abbiamo scoperto che la trachea dei topi C57 / BL è stretta, il che rende difficile trovare la posizione corretta con questo metodo senza l'aiuto di apparecchiature come un endoscopio20. Dopo ulteriori esplorazioni, abbiamo scoperto che la luce della lampada dell'intubatore poteva penetrare la superficie del corpo, consentendo all'operatore di determinare la posizione della cannula21.
Per verificare se il tubo era entrato nella trachea, inizialmente, abbiamo provato a utilizzare un piccolo specchio, che è stato raffreddato posizionandolo sul ghiaccio. Dopo l'intubazione, abbiamo usato uno specchio per avvicinarci all'apertura della cannula. Se la nebbia appariva sullo specchio, l'intubazione era considerata un successo. Tuttavia, abbiamo scoperto che questo metodo di esame non poteva determinare con precisione se la cannula era entrata nella trachea. In primo luogo, la testa della cannula era vicina alla bocca del topo e non è stato possibile determinare se la nebbia che appariva sullo specchio fosse causata dal gas esalato dalla bocca. In secondo luogo, lo specchio doveva essere raffreddato. Con un uso costante, il tempo necessario per raffreddare lo specchio ha anche portato ad un aumento del tempo di esperimento. Abbiamo quindi utilizzato una pipetta Pasteur per pompare aria nella trachea; Il petto del topo si gonfierebbe se la cannula fosse inserita nella trachea, e se fosse inserita nell'esofago, l'addome inferiore destro si gonfierebbe22. Pertanto, abbiamo usato questo metodo come base per giudicare se l'intubazione ha avuto successo.
Rispetto all'intubazione tracheale chirurgica, l'intubazione orofaringea non invasiva evita le ferite chirurgiche e migliora il tasso di sopravvivenza degli animali da esperimento23. Rispetto all'intubazione intranasale, l'intubazione orofaringea non invasiva porta a un ingresso più accurato della cannula nei bronchi e nei polmoni24. Tuttavia, padroneggiare queste abilità tecniche richiede molta pratica. Nel caso di topi con piccole dimensioni corporee, l'inserimento della cannula nella trachea è difficile e si può facilmente graffiare la trachea durante l'operazione. Pertanto, suggeriamo che i topi con dimensioni corporee più grandi dovrebbero essere selezionati per l'esperimento.
Il metodo può anche essere utilizzato per fornire altri farmaci liquidi al bronco e al polmone, il che significa che ha un ampio potenziale di applicazione25,26.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (No.: 81903902), dalla China Postdoctoral Science Foundation (No.: 2019M663457), dal Sichuan Science and Technology Program (No.: 2020YJ0172) e dallo Xinglin Scholar Research Premotion Project dell'Università di Chengdu TCM (No.: QJRC2022053).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide | MERK | L4130 | LPS |
| Microliter Syringes | SHANGHAI GAOGE INDUSTRY AND TRADE CO., LTD | 10028505008124 | To deliver LPS |
| Mouse cannula | RWD Life Science | 803-03008-00 | Mouse cannula |
| Mouse intubation kit | RWD Life Science | 903-03027-00 | Including a base, a riser, a intubator, a surgical forceps and some strings |
| Pasteur pipette | Biosharp life science | BS-XG-03 | To verify the success of intubation |
| Pentobarbital sodium | Beijing Chemical Co., China | 20220918 | To anesthetize mice |
References
- Xia, Y., et al. Protective effect of human amnion epithelial cells through endotracheal instillation against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 33 (1), 7-11 (2017).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Lab Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Ware, L. B., Matthay, M. A. The acute respiratory distress syndrome. The New England Journal of Medicine. 342 (18), 1334-1349 (2000).
- Fan, E., Brodie, D., Slutsky, A. S. Acute respiratory distress syndrome: Advances in diagnosis and treatment. JAMA. 319 (7), 698-710 (2018).
- Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S.
- An, N., Yang, T., Zhang, X. X., Xu, M. X. Bergamottin alleviates LPS-induced acute lung injury by inducing SIRT1 and suppressing NF-κB. Innate Immunity. 27 (7-8), 543-552 (2021).
- Liu, L., et al. Comparative study of trans-oral and trans-tracheal intratracheal instillations in a murine model of acute lung injury. The Anatomical Record. 295 (9), 1513-1519 (2012).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Li, J., et al. Panaxydol attenuates ferroptosis against LPS-induced acute lung injury in mice by Keap1-Nrf2/HO-1 pathway. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 96 (2021).
- Zhou, Y., et al. Soluble epoxide hydrolase inhibitor attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury and improves survival in mice. Shock. 47 (5), 638-645 (2017).
- Nosaka, N., et al. Optimal tube length of orotracheal intubation for mice. Laboratory Animals. 53 (1), 79-83 (2019).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anaesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 89 (3), 337-342 (2018).
- Ehrentraut, H., Weisheit, C. K., Frede, S., Hilbert, T. Inducing acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59999 (2019).
- Yang, H., et al. STAT6 inhibits ferroptosis and alleviates acute lung injury by regulating P53/SLC7A11 pathway. Cell Death & Disease. 13 (6), 530 (2022).
- Aramaki, O., et al. Induction of operational tolerance and generation of regulatory cells after intratracheal delivery of alloantigen combined with nondepleting anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 76 (9), 1305-1314 (2003).
- Lan, W. Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) in a murine model of lipopolysaccharide (LPS) -induced acute lung injury (ALI). Peking Union Medical College. , PhD Thesis (2010).
- Lv, H., et al. Tenuigenin ameliorates acute lung injury by inhibiting NF-κB and MAPK signalling pathways. Respiratory Physiology & Neurobiology. 216, 43-51 (2015).
- Yang, H., Lv, H., Li, H., Ci, X., Peng, L. Oridonin protects LPS-induced acute lung injury by modulating Nrf2-mediated oxidative stress and Nrf2-independent NLRP3 and NF-κB pathways. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 62 (2019).
- Im, G. H., et al. Improvement of orthotopic lung cancer mouse model via thoracotomy and orotracheal intubation enabling in vivo imaging studies. Laboratory Animals. 48 (2), 124-131 (2014).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42 (2), 222-230 (2008).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zhang, S., et al. Microvesicles packaging IL-1β and TNF-α enhance lung inflammatory response to mechanical ventilation in part by induction of cofilin signaling. International Immunopharmacology. 63, 74-83 (2018).
- Feng, Z. Comparative study of different intratracheal instillation in acute lung injury model of mice. Jilin University. , Master's Thesis (2010).
- Chen, J. H., et al. Comparison of acute lung injury mice model established by intranasal and intratracheal instillation of lipopolysaccharide. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (02), 222-227 (2022).
- Luckow, B., Lehmann, M. H. A simplified method for bronchoalveolar lavage in mice by orotracheal intubation avoiding tracheotomy. BioTechniques. 71 (4), 534-537 (2021).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
