Рабочий процесс оптимизации рецептуры липидных наночастиц (LNP) с использованием разработанных экспериментов по смесевым процессам и самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM)

Summary

Этот протокол обеспечивает подход к оптимизации рецептуры по смешанным, непрерывным и категориальным факторам исследования, который сводит к минимуму субъективный выбор при построении экспериментального дизайна. На этапе анализа используется эффективная и простая в использовании процедура подгонки моделирования.

Abstract

Мы представляем подход к оптимизации составов липидных наночастиц (LNP) в стиле Quality by Design (QbD), направленный на то, чтобы предложить ученым доступный рабочий процесс. Неотъемлемое ограничение в этих исследованиях, где молярные соотношения ионизируемых, вспомогательных и ПЭГ-липидов должны составлять до 100%, требует специализированных методов проектирования и анализа для учета этого ограничения смеси. Сосредоточив внимание на липидных и технологических факторах, которые обычно используются при оптимизации конструкции LNP, мы предлагаем шаги, которые позволяют избежать многих трудностей, которые традиционно возникают при планировании и анализе экспериментов со смесевыми процессами, используя проекты заполнения пространства и используя недавно разработанную статистическую основу самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM). В дополнение к созданию оптимальных формулировок-кандидатов, рабочий процесс также создает графические сводки подходящих статистических моделей, которые упрощают интерпретацию результатов. Вновь выявленные препараты-кандидаты оцениваются с помощью подтверждающих прогонов и, при необходимости, могут быть проведены в контексте более всестороннего исследования второй фазы.

Introduction

Составы липидных наночастиц (LNP) для систем доставки генов in vivo обычно включают четыре составляющих липида из категорий ионизируемых, хелперных и ПЭГ-липидов ^1,2,3. Независимо от того, изучаются ли эти липиды отдельно или одновременно с другими несмешанными факторами, эксперименты для этих составов требуют «смешанных» дизайнов, потому что при наличии рецептуры-кандидата увеличение или уменьшение соотношения любого из липидов обязательно приводит к соответствующему уменьшению или увеличению суммы соотношений трех других липидов.

Например, предполагается, что мы оптимизируем формулировку LNP, в которой в настоящее время используется заданный рецепт, который будет рассматриваться в качестве эталона. Цель состоит в том, чтобы максимизировать эффективность LNP, одновременно стремясь свести к минимуму средний размер частиц. Факторами исследования, которые варьируются в эксперименте, являются молярные соотношения четырех составляющих липидов (ионизируемый, холестерин, DOPE, PEG), соотношение N: P, скорость потока и ионизируемый тип липида. Ионизируемые и вспомогательные липиды (включая холестерин) могут варьироваться в более широком диапазоне молярного соотношения, 10-60%, чем ПЭГ, которое будет варьироваться от 1 до 5% на этом рисунке. Рецептура эталонной рецептуры и диапазоны других факторов и их степень детализации округления указаны в дополнительном файле 1. В этом примере ученые могут выполнить 23 прогона (уникальные партии частиц) за один день и хотели бы использовать его в качестве размера выборки, если он соответствует минимальным требованиям. Смоделированные результаты этого эксперимента представлены в дополнительном файле 2 и дополнительном файле 3.

Рампадо и Peer⁴ опубликовали недавнюю обзорную статью на тему разработанных экспериментов по оптимизации систем доставки лекарств на основе наночастиц. Kauffman et ^al.5 рассмотрели оптимизационные исследования LNP с использованием дробных факторных и окончательных скрининговых дизайнов⁶; Однако эти типы конструкций не могут приспособиться к ограничению смеси, не прибегая к использованию неэффективных «переменных слабости»7, и обычно не используются при наличии коэффициентов смешивания ^7,8. Вместо этого для экспериментов с процессами смешивания традиционно используются «оптимальные конструкции», способные включать ограничение смеси⁹. Эти проекты нацелены на заданную пользователем функцию исследуемых факторов и являются оптимальными (в одном из нескольких возможных смыслов) только в том случае, если эта функция фиксирует истинную взаимосвязь между исследуемыми факторами и реакциями. Следует отметить, что в тексте проводится различие между "оптимальными проектами" и "оптимальными формулировками-кандидатами", причем последние относятся к наилучшим формулировкам, определенным статистической моделью. Оптимальные конструкции имеют три основных недостатка для экспериментов со смесевыми процессами. Во-первых, если ученый не сможет предвидеть взаимодействие исследуемых факторов при определении целевой модели, то результирующая модель будет предвзятой и может привести к неполноценным формулировкам-кандидатам. Во-вторых, оптимальные конструкции размещают большую часть прогонов на внешней границе факторного пространства. В исследованиях LNP это может привести к большому количеству потерянных прогонов, если частицы не образуются правильно при любых экстремальных значениях липидов или технологических настроек. В-третьих, ученые часто предпочитают проводить экспериментальные прогоны на внутренней стороне факторного пространства, чтобы получить независимое от модели ощущение поверхности отклика и наблюдать за процессом непосредственно в ранее неисследованных областях факторного пространства.

Альтернативный принцип проектирования заключается в том, чтобы нацелиться на приблизительное равномерное покрытие пространства факторов (ограниченного смесью) с помощью конструкции, заполняющей пространство¹⁰. Эти проекты приносят в жертву некоторую экспериментальную эффективность по сравнению с оптимальными проектами⁹ (предполагая, что все пространство факторов приводит к действительным формулировкам), но представляют несколько преимуществ в компромиссе, которые полезны в этом приложении. Конструкция заполнения пространства не делает никаких априорных предположений о структуре поверхности отклика; Это дает ему гибкость для фиксации непредвиденных взаимосвязей между факторами исследования. Это также упрощает создание проекта, так как не требует принятия решений о том, какие регрессионные термины добавлять или удалять по мере корректировки желаемого размера прогона. Когда некоторые точки проектирования (рецепты) приводят к неудачным составам, проекты, заполняющие пространство, позволяют моделировать границу отказа по исследуемым факторам, а также поддерживать статистические модели для ответов исследования на успешные комбинации факторов. Наконец, внутреннее покрытие факторного пространства позволяет проводить независимое от модели графическое исследование поверхности отклика.

Для визуализации подпространства коэффициента смешивания эксперимента используется специализированный треугольный «тройной график». Рисунок 1 мотивирует такое использование: в кубе точек, где каждый из трех ингредиентов может находиться в диапазоне от 0 до 1, точки, которые удовлетворяют ограничению, согласно которому сумма ингредиентов равна 1, выделены красным цветом. Ограничение смеси на три ингредиента уменьшает допустимое пространство факторов до треугольника. В приложениях LNP с четырьмя ингредиентами смеси мы создаем шесть различных тройных графиков для представления пространства факторов путем построения двух липидов одновременно по оси «Другие», которая представляет сумму других липидов.

Рисунок 1: Области треугольных факторов. На графике, заполняющем пространство внутри куба, маленькие серые точки представляют составы, которые не согласуются с ограничением смеси. Более крупные красные точки лежат на треугольнике, вписанном в куб, и представляют собой составы, для которых выполняется ограничение смеси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В дополнение к факторам липидной смеси часто существует один или несколько факторов непрерывного процесса, таких как соотношение N:P, концентрация буфера или скорость потока. Могут присутствовать категориальные факторы, такие как ионизируемый липидный тип, вспомогательный липидный тип или буферный тип. Цель состоит в том, чтобы найти рецептуру (смесь липидов и настроек для технологических факторов), которая максимизирует некоторую меру активности и/или улучшает физико-химические характеристики, такие как минимизация размера частиц и PDI (индекс полидисперсности), максимизация процентной инкапсуляции и минимизация побочных эффектов, таких как потеря массы тела, в исследованиях in vivo . Даже если вы начинаете с разумного эталонного рецепта, может возникнуть интерес к повторной оптимизации с учетом изменения генетической полезной нагрузки или при рассмотрении изменений в технологических факторах или типах липидов.

Корнелл⁷ предоставляет окончательный текст по статистическим аспектам экспериментов со смесями и процессами смешивания, а Майерс и ^др.9 предоставляют отличное резюме наиболее актуальных тем проектирования и анализа смесей для оптимизации. Однако эти работы могут перегружать ученых статистическими деталями и специализированной терминологией. Современное программное обеспечение для проектирования и анализа экспериментов обеспечивает надежное решение, которое в достаточной степени поддержит большинство задач оптимизации LNP без необходимости обращения к соответствующей теории. В то время как более сложные или высокоприоритетные исследования по-прежнему выигрывают от сотрудничества со статистиком и могут использовать оптимальные, а не заполняющие пространство конструкции, наша цель состоит в том, чтобы повысить уровень комфорта ученых и стимулировать оптимизацию составов LNP, не прибегая к неэффективному однофакторному тестированию за раз (OFAT)¹¹ или просто соглашаясь на первую формулу, которая удовлетворяет спецификациям.

В этой статье представлен рабочий процесс, который использует статистическое программное обеспечение для оптимизации общей проблемы формулировки LNP, решая проблемы проектирования и анализа в том порядке, в котором они будут встречаться. Фактически, этот метод будет работать для общих задач оптимизации и не ограничивается LNP. Попутно рассматривается несколько общих вопросов, которые возникают, и даются рекомендации, основанные на опыте и результатах моделирования¹². Недавно разработанная структура самовалидированных ансамблевых моделей (SVEM)¹³ значительно улучшила хрупкий подход к анализу результатов экспериментов со смесевыми процессами, и мы используем этот подход для обеспечения упрощенной стратегии оптимизации рецептуры. В то время как рабочий процесс построен в общем виде, которому можно было бы следовать с помощью других программных пакетов, JMP 17 Pro уникален тем, что предлагает SVEM вместе с графическими инструментами сводки, которые, как мы обнаружили, необходимы для упрощения запутанного анализа экспериментов со смесевыми процессами. В результате в протоколе также содержатся инструкции, специфичные для JMP.

SVEM использует ту же основу модели линейной регрессии, что и традиционный подход, но он позволяет нам избежать утомительных модификаций, необходимых для соответствия «полной модели» эффектов-кандидатов, используя либо прямой выбор, либо базовый подход с штрафной выборкой (Лассо). Кроме того, SVEM обеспечивает улучшенную подгонку «уменьшенной модели», которая сводит к минимуму вероятность включения шума (процесс плюс аналитическая дисперсия), который появляется в данных. Он работает путем усреднения прогнозируемых моделей, полученных в результате многократного перевзвешивания относительной важности каждого прогона в модели 13,14,15,16,17,18. SVEM предоставляет основу для моделирования экспериментов со смесевыми процессами, которая не только проще в реализации, но и традиционная одноразовая регрессия, и дает более качественные кандидаты на оптимальную рецептуру^12,13. Математические детали SVEM выходят за рамки данной статьи, и даже беглое резюме, выходящее за рамки соответствующего обзора литературы, отвлекло бы внимание от его главного преимущества в этом приложении: оно обеспечивает простую, надежную и точную процедуру «нажми и работай» для практиков.

Представленный рабочий процесс согласуется с подходом Quality by Design (QbD)¹⁹ к фармацевтической разработке²⁰. Результатом исследования будет понимание функциональной взаимосвязи, которая связывает атрибуты материала и параметры процесса с критическими атрибутами качества (CQA)²¹. Daniel et ^al.22 обсуждают использование фреймворка QbD специально для производства платформы РНК: наш рабочий процесс может быть использован в качестве инструмента в этой структуре.

Protocol

Эксперимент, описанный в разделе «Репрезентативные результаты», был проведен в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, а процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными нашим Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Коммерчески получены 6-8-недельные самки мышей Balb/C. Животные получали стандартную пищу и воду ad libitum и содержались в стандартных условиях с 12-часовыми циклами света / темноты, при температуре 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) с влажностью 40-60%.

1. Запись цели исследования, ответов и факторов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе JMP 17 Pro используется для разработки и анализа эксперимента. Эквивалентное программное обеспечение можно использовать, выполнив аналогичные действия. Примеры и дальнейшие инструкции по всем шагам, выполняемым в Разделе 1, см. в Дополнительном файле 1.

1. Кратко изложите цель эксперимента в документе с отметкой даты.
2. Перечислите первичные ответы (CQA), которые будут измеряться во время эксперимента.
3. Перечислите любые вторичные реакции (например, последующие ограничения на физико-химические свойства), которые могут быть измерены.
4. Перечислите параметры процесса, которые могут быть связаны с ответами, в том числе те, которые наиболее релевантны цели исследования.
5. Если исследование будет проходить в течение нескольких дней, включите в день категориальный «блокирующий» фактор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это уравновешивает настройки факторов по дням, чтобы предотвратить смешивание дневных сдвигов в среднем значении процесса с исследуемыми факторами.
6. Выберите факторы, которые будут варьироваться, и те, которые будут оставаться постоянными во время исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструменты приоритизации рисков, такие как анализ эффектов вида отказа²⁰ , для выбора наиболее релевантного подмножества факторов (рис. 2). Обычно все липиды должны варьироваться; хотя в некоторых случаях с ограниченным бюджетом разумно зафиксировать PEG в фиксированном соотношении.
7. Установите диапазоны для различных множителей и соответствующую десятичную точность для каждого из них.
8. Определите размер дизайна исследования (количество уникальных партий частиц), используя минимальную и максимальную эвристику. Включенные вручную контрольные тестовые прогоны не учитываются при расчете размера прогона, рекомендованного эвристикой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая эвристика предполагает, что ответы являются непрерывными. Минимальная эвристика предполагает, что при необходимости можно будет провести последующее исследование в дополнение к подтверждению оптимальных формулировок-кандидатов. Если будет целесообразно выполнить только прогоны подтверждения, то лучше заложить в бюджет количество прогонов, полученных из максимальной эвристики. Для двоичных первичных ответов обратитесь за помощью к статистику, чтобы определить соответствующее количество запусков.
   1. Минимальная эвристика: Выделите три прогона на коэффициент смешивания, два на коэффициент непрерывного процесса и по одному на уровень каждого категориального фактора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования с четырьмя липидными факторами, двумя непрерывными и одной трехсторонней категориальной переменной процесса это приводит к предположению (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 прогонов, заполняющих пространство. Добавьте дополнительные прогоны, если некоторые из них могут выйти из строя из-за проблем с рецептурой или измерением.
   2. Максимальная эвристика: Запустите программное обеспечение для построения оптимальных конструкций и введите необходимые параметры для второго порядка (включая основные эффекты, двусторонние взаимодействия между всеми эффектами и квадратичные эффекты для факторов непрерывного процесса). Рассчитайте минимальный размер запуска в соответствии с алгоритмом программного обеспечения. Добавьте 1 к результату, полученному с помощью программного обеспечения, чтобы определить максимальную эвристику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к дополнительному файлу 1 для получения подробных инструкций по выполнению этих шагов. Пример с четырьмя липидными факторами, двумя непрерывными и одной трехсторонней категориальной переменной процесса приводит к рекомендуемому размеру пробега 34 (33 из рекомендации программного обеспечения + 1). Любые прогоны, выходящие за рамки этого, вероятно, лучше использовать для подтверждения или последующих исследований.

Рисунок 2: Причинно-следственная диаграмма. На диаграмме показаны общие факторы в задаче оптимизации рецептуры LNP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Создание дизайнерского стола с объемно-заполняющим дизайном

1. Откройте JMP и перейдите в строку меню к DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Введите ответы на исследование (см. Дополнительный файл 1).
3. Необязательно: добавьте столбцы для дополнительных ответов, указав, следует ли развернуть, свернуть или нацелить каждый из них, нажав кнопку Добавить ответ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки могут быть изменены позже и не влияют на дизайн. Аналогичным образом, дополнительные столбцы для дополнительных ответов могут быть добавлены после создания таблицы дизайна.
4. Введите исследуемые коэффициенты и соответствующие диапазоны. Используйте кнопку « Смесь » для добавления коэффициентов смешивания, кнопку « Непрерывный » для добавления непрерывных множителей или кнопку «Категориальный» для добавления категориальных множителей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере исследования используются факторы и диапазоны, показанные на рисунке 3, которые включают ионизируемое молярное отношение (в диапазоне от 0,1 до 0,6), молярное отношение помощника (также от 0,1 до 0,6), молярное отношение холестерина (от 0,1 до 0,6), молярное отношение PEG (от 0,01 до 0,05) и ионизируемый липидный тип (который может быть H101, H102 или H103).
5. Введите заданное количество запусков для проекта в поле «Количество запусков ».
6. Необязательно: увеличьте средний размер кластера с 50 по умолчанию до 2000 с помощью меню красного треугольника рядом с заголовком « Дизайн заполнения пространства » и в подменю « Дополнительные параметры ».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это настройка алгоритма заполнения пространства, которая может привести к немного лучшему построению проекта за счет дополнительного вычислительного времени.
7. Создайте таблицу проекта, заполняющую пространство, для выбранных факторов и размера прогона. Нажмите «Быстрое гибкое заполнение», затем нажмите « Создать таблицу».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первые два прогона из примера проекта показаны на рисунке 4.
8. Добавьте в таблицу столбец «Примечания » для аннотирования всех созданных вручную запусков. Дважды щелкните первый пустой заголовок столбца, чтобы добавить столбец, а затем дважды щелкните новый заголовок столбца, чтобы изменить имя.
9. Если применимо, вручную включите контрольные запуски тестов в таблицу проектирования. Включите репликацию для одного из контрольных тестов. Отметьте имя теста в столбце «Примечания » и выделите цветом строки репликации эталона для упрощения идентификации графика.
   1. Добавьте новую строку, дважды щелкнув заголовок первой пустой строки, и введите настройки коэффициента эталона. Продублируйте эту строку, чтобы создать репликацию теста. Выделите обе строки и перейдите в раздел «Строки > цвета », чтобы назначить цвет для построения графиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реплика обеспечивает независимую от модели оценку процесса плюс аналитическую дисперсию и обеспечивает дополнительную графическую информацию.
10. Если какие-либо контрольные прогоны выходят за пределы диапазона исследуемых факторов, укажите это в столбце «Примечания» для будущего исключения из анализа.
11. Округлите коэффициенты смеси до соответствующей зернистости. Для этого:
    1. Выделите заголовки столбцов для коэффициентов смешивания, щелкните правой кнопкой мыши один из заголовков столбцов и перейдите к столбцу «Новая формула» > «Преобразовать > округление...», введите правильный интервал округления и нажмите кнопку «ОК».
    2. Убедитесь, что строки не выделены, щелкнув нижний треугольник на пересечении заголовков строк и столбцов.
    3. Скопируйте значения из вновь созданных округленных столбцов (Ctrl + C) и вставьте (Ctrl + V) в исходные столбцы смеси. Наконец, удалите временные столбцы с округленными значениями.
12. После округления соотношений липидов убедитесь, что их сумма равна 100%, выбрав заголовки столбцов для коэффициентов смеси, щелкнув один из них правой кнопкой мыши и перейдя в столбец «Новая формула» > «Объединить > сумму». Если сумма какой-либо строки не равна 1, вручную отрегулируйте один из коэффициентов смеси, убедившись, что настройка коэффициента остается в пределах диапазона коэффициентов. Удалите столбец суммы после внесения корректировок.
13. Следуйте той же процедуре, которая используется для округления коэффициентов смешивания, чтобы округлить технологические факторы до их соответствующей степени детализации.
14. Отформатируйте липидные столбцы, чтобы они отображались в процентах с нужным количеством десятичных знаков: выберите заголовки столбцов, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Стандартизировать атрибуты...». В следующем окне установите для параметра «Формат » значение «Процент » и при необходимости отрегулируйте количество десятичных знаков.
15. Если добавлены ручные запуски, такие как контрольные показатели, повторно рандомизируйте порядок строк таблицы: добавьте новый столбец со случайными значениями (щелкните правой кнопкой мыши заголовок последнего столбца и выберите « Новый столбец формулы» > «Случайный» > «Случайный нормальный»). Отсортируйте этот столбец в порядке возрастания, щелкнув правой кнопкой мыши заголовок столбца, а затем удалите столбец.
16. Необязательно: добавьте столбец Идентификатор выполнения . Заполните его текущей датой, именем эксперимента и номером строки из таблицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример см. на рисунке 5.
17. Сгенерируйте троичные графики для визуализации точек дизайна над липидными факторами (рис. 6). Кроме того, изучите распределение прогонов по факторам процесса (рисунок 7): выберите График > Троичный график. Выберите только коэффициенты смешивания для X, Построение графиков.
18. Чтобы проверить распределение по факторам процесса, выберите « Анализировать» > «Распределение» и введите факторы процесса для Y, столбцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ученый-составитель должен подтвердить осуществимость всех запусков. Если существуют невыполнимые запуски, перезапустите проект с учетом вновь обнаруженных ограничений.

Рисунок 3: Исследуемые факторы и диапазоны. Скриншоты настроек в экспериментальном программном обеспечении полезны для воспроизведения настройки исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Начальный результат для дизайна, заполняющего пространство. Показывая первые две строки таблицы, настройки необходимо округлить до желаемой точности, а также убедиться, что количество липидов в сумме равно 1. Бенчмарк был добавлен в таблицу вручную. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Отформатированная учебная таблица. Уровни факторов были округлены и отформатированы, а также добавлен столбец Идентификатор выполнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Проектные точки на троичном графике. 23 состава показаны в зависимости от соответствующих соотношений ионизируемых, вспомогательных и «других» (холестерин + ПЭГ). Зеленая точка в центре представляет собой эталонное молярное соотношение 33:33:33:1 ионизируемый (H101):холестерин:хелпер (DOPE):P EG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Распределение несмешанных технологических факторов в эксперименте. Гистограммы показывают, как экспериментальные прогоны распределены по ионизируемому типу липидов, соотношению N: P и скорости потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Проведение эксперимента

1. Запустите эксперимент в порядке, указанном в таблице конструктора. Запишите показания в столбцы, встроенные в экспериментальную таблицу.
2. Если для одного и того же ответа на идентичную партию рецептуры проводится несколько анализов, рассчитайте среднее значение этих результатов в каждой партии. Добавьте в таблицу столбец для каждого измерения анализа.
   1. Чтобы получить среднее значение, выделите все связанные столбцы, щелкните правой кнопкой мыши один из выбранных заголовков столбцов и выберите « Новый столбец формулы» > «Объединить > среднее значение». Используйте этот столбец «Среднее » для будущего анализа ответов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не начиная рецептуру заново, повторные измерения анализа только фиксируют дисперсию анализа и не являются независимыми копиями.
3. Задокументируйте любое возникновение осаждения препарата или проблем с переносимостью in vivo (таких как сильная потеря массы тела или смерть) с помощью двоичных показателей (0/1) в новом столбце для каждого типа проблемы.

4. Анализ экспериментальных результатов

1. Нанесите показания на график и изучите распределение ответов: откройте Graph > Graph Builder и перетащите каждый ответ в область Y для отдельных графиков. Повторите это для всех ответов.
2. Проверьте относительное расстояние между цветными прогонами репликации, если они были включены. Это позволяет понять общую (процессную и аналитическую) вариацию в эталоне по сравнению с изменчивостью из-за изменений настроек факторов во всем факторном пространстве (рис. 8).
3. Определите, следует ли моделировать необработанный ответ или вместо него следует использовать преобразование. Для ответов, которые ограничены положительными, но не ограничены выше (например, потенция), подгоните как нормальное, так и логическое нормальное распределение к экспериментальным результатам. Если логнормальное распределение лучше согласуется с более низким AICc (исправленным информационным критерием Акаике), то возьмем логарифмическое преобразование этого ответа.
   1. Перейдите в раздел " Анализ > распределении" и выберите ответ для Y, столбцы. В результирующем отчете о распределении нажмите на красный треугольник рядом с именем ответа и выберите в раскрывающемся меню «Непрерывная подгонка» > «Подгонка нормальной» и «Непрерывная подгонка» > « Логнормальная ». В последующем отчете «Сравнение распределений » проверьте значения AICc, чтобы определить, какое распределение лучше соответствует ответу.
   2. Чтобы выполнить преобразование журнала, щелкните правой кнопкой мыши заголовок столбца ответа и выберите « Создать столбец формулы» > «Журнал > журнал». После построения модели и сохранения столбца прогнозов в масштабе журнала преобразуйте ответ обратно в исходный масштаб, выбрав Создать столбец формулы > Журнал > Exp.
   3. Для пропорций ответов, ограниченных от 0 до 1, сравните соответствие нормального и бета-распределения. Если бета-версия имеет более низкий AICc, выполните логит-преобразование. В отчете «Распространение» для ответа выберите «Непрерывная подгонка» > «Подгонка нормальной» и «Непрерывная подгонка > подгонка бета-версии».
      1. Для преобразования logit щелкните правой кнопкой мыши заголовок столбца ответа в таблице данных и выберите « Создать столбец формулы» > «Специальность > Logit». После построения модели сохраните столбец прогнозирования. Чтобы вернуться к исходному масштабу, используйте столбец «Новая формула» > разделе «Специальность > логистика».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Регрессионный анализ SVEM устойчив к отклонениям от нормы в распределении ответов. Однако эти преобразования могут привести к более легкой интерпретации результатов и улучшению соответствия моделей.
4. Постройте график прогонов на троичном графике. Раскрасьте точки в соответствии с ответами (или преобразованными ответами, если преобразование было применено): открыть график > троичный график. Выберите только коэффициенты смешивания для X, Построение графиков. Щелкните правой кнопкой мыши любой из результирующих графиков, выберите «Легенда строки », а затем выберите столбец (преобразованный) ответ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раскрашивание точек в соответствии с ответами дает независимую от модели визуальную перспективу поведения по отношению к смешанным факторам.
5. Удалите сценарий модели, созданный проектом, заполняющим пространство.
6. Постройте независимую модель для каждого ответа в зависимости от исследуемых факторов, повторяя следующие шаги для каждого ответа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В случае вторичного двоичного ответа (например, сбой формулировки или смерть мыши) смоделируйте и этот ответ. Измените параметр целевого распределения с « Обычный » на «Биномиальный».
7. Постройте «полную» модель, включающую все возможные эффекты. Эта модель должна включать основные эффекты каждого фактора, двух- и трехсторонние взаимодействия, квадратичные и частичные кубические члены в факторах процесса и кубические члены Шеффе для коэффициентов^{смеси 23,24}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте один и тот же набор возможных эффектов для каждого ответа. Метод выбора моделей SVEM будет независимо уточнять модели для каждого ответа, что может привести к созданию уникальных уменьшенных моделей для каждого из них. На рисунке 9 показаны некоторые из этих потенциальных эффектов. В следующих подшагах подробно описан этот процесс.
   1. Выберите Анализ > подгонка модели.
   2. Убедитесь, что блокирующие факторы (например, день) не могут взаимодействовать с другими факторами исследования. Выберите все блокирующие факторы и нажмите кнопку Добавить. Не включайте эти факторы ни в один из последующих подшагов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующие факторы важно учитывать в модели, но блокирующие факторы не должны взаимодействовать с другими факторами исследования. Основная цель блокирующих факторов — помочь контролировать изменчивость эксперимента и повысить чувствительность эксперимента.
   3. Выделите все факторы исследования. Измените значение поля «Градус » на 3 (по умолчанию оно равно 2). Нажмите на Factorial, чтобы получить степень.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие включает в себя основные эффекты, а также двух- и трехсторонние взаимодействия в модели.
   4. Выберите только несмешанные коэффициенты в окне выбора. Щелкните Макросы > частичный кубический.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие вводит квадратичные эффекты для факторов непрерывного процесса и их взаимодействия с другими несмешанными факторами в модели.
   5. Выберите только коэффициенты смеси из списка выбора. Нажмите кнопку Macros > Scheffe Cubic. Деактивируйте опцию No Intercept по умолчанию (см. рис. 9).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включение перехвата в модель является важным шагом при использовании методов лассо, а также полезно в контексте прямого выбора. Обычно используется традиционная настройка по умолчанию No Intercept , поскольку установка пересечения одновременно со всеми основными эффектами смеси без таких модификаций, как подход SVEM, невозможна с помощью обычной процедуры регрессии^{наименьших квадратов 12}.
   6. Укажите столбец ответа: выделите столбец ответа и нажмите Y.
   7. Измените значение параметра «Личность » на «Обобщенная регрессия». Установите для параметра «Распространение » значение «Обычный».
   8. Сохраните эту настройку модели в таблице данных для использования с дополнительными ответами, щелкнув меню красного треугольника рядом с пунктом Спецификация модели и выбрав Сохранить в таблицу данных.
8. Примените метод прямого выбора SVEM для соответствия уменьшенной модели, без обязательного включения основных эффектов коэффициента смешивания, и сохраните столбец формулы прогноза в таблице данных.
   1. В диалоговом окне " Подогнать модель " нажмите кнопку "Выполнить".
   2. В поле «Метод оценки» выберите «Прямой выбор SVEM».
   3. Разверните меню «Дополнительные элементы управления» > «Принудительные условия » и снимите флажки, связанные с основными эффектами смеси. Должен оставаться установленным только флажок Термин перехвата . На рисунке 10 показана настройка по умолчанию, в которой применяются основные эффекты. На этом шаге эти флажки должны быть сняты, чтобы позволить модели включать или исключать эти эффекты на основе процедуры прямого выбора.
   4. Нажмите кнопку Перейти, чтобы запустить процедуру SVEM Forward Selection.
9. Постройте график фактических ответов по предсказанным ответам из модели SVEM, чтобы проверить разумную прогностическую способность. (Рисунок 11). Нажмите на красный треугольник рядом с пунктом SVEM Forward Selection и выберите Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Щелкните красный треугольник рядом с пунктом SVEM Forward Selection и выберите Save Columns > Save Prediction Formula , чтобы создать новый столбец, содержащий формулу прогноза в таблице данных.
11. Необязательно: повторите описанные выше шаги, используя SVEM Lasso в качестве метода оценки , чтобы определить, предлагается ли другой оптимальный рецепт после выполнения последующих шагов. Если это так, запустите оба рецепта в качестве подтверждающих запусков (обсуждается в разделе 5), чтобы увидеть, какой из них лучше всего работает на практике¹².
12. Повторите шаги построения модели для каждого ответа.
13. После того, как столбцы прогнозов для всех ответов сохранены в таблице данных, нанесите график трассировок ответов для всех прогнозируемых столбцов ответов с помощью платформы Profiler: выберите Graph > Profiler, выберите все столбцы прогнозирования, созданные на предыдущем шаге для Y, Prediction Formula, и нажмите OK (рисунок 12).
14. Определите оптимальную рецептуру (рецепты) кандидата.
    1. Определите «функцию желательности» для каждого ответа, указав, должен ли ответ быть максимизирован, сведен к минимуму или сопоставлен с целью. Задайте для всех первичных ответов вес важности 1,0, а для всех вторичных ответов — вес важности 0,2. В меню красного треугольника профилировщика прогнозов выберите «Оптимизация и желательность» > «Функции желательности», затем «Оптимизация и желательность» > «Задать желательность». Введите настройки в последующие окна.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Важные веса являются относительными и субъективными, поэтому стоит проверить чувствительность комбинированного оптимума к изменениям этих весов в разумных пределах (например, от равного взвешивания до взвешивания 1:5).
    2. Дайте команду профилировщику, чтобы найти оптимальные настройки фактора, которые максимизируют функцию желательности (рисунок 12): в профилировщике выберите «Оптимизация и желательность» > «Максимизировать желательность».
       ПРИМЕЧАНИЕ: Прогнозируемые значения ответов у оптимальных кандидатов могут переоценивать значение ответов с правильным перекосом, таких как потенция; Тем не менее, прогоны подтверждения обеспечат более точные наблюдения за этими формулировками-кандидатами. Основная цель состоит в том, чтобы найти оптимальную рецептуру ( настройки оптимальной рецептуры).
    3. Запишите оптимальные настройки коэффициентов и запишите важные весовые коэффициенты, используемые для каждого ответа: в меню « Профилировщик прогнозов » выберите « Настройки фактора» > «Запомнить настройки».
15. Дополнительно: Для категориальных факторов, таких как ионизируемый тип липидов, найдите условно оптимальные составы для каждого уровня фактора.
    1. Сначала установите желаемый уровень фактора в профилировщике, затем, удерживая клавишу Ctrl , щелкните левой кнопкой мыши внутри графика этого фактора и выберите «Настройка блокировки факторов». Выберите «Оптимизация и желательность» > «Максимизировать желательность», чтобы найти условный оптимум с этим фактором, заблокированным при его текущем значении.
    2. Прежде чем продолжить, разблокируйте настройки фактора, используя то же меню, которое используется для блокировки настроек фактора.
16. Повторите процесс оптимизации после корректировки весов важности ответов (используя « Оптимизация и желательность» > «Установить желательность»), возможно, только оптимизируя первичный ответ (ответы) или установив для некоторых вторичных ответов больший или меньший вес важности, или установив цель вторичных ответов на «Нет » (рис. 13).
17. Запишите нового оптимального кандидата (в меню «Профилировщик прогнозов» выберите «Параметры фактора» > «Запомнить настройки»).
18. Создание графических сводок оптимальных областей факторного пространства: создание таблицы данных с 50 000 строк, заполненных случайно сгенерированными параметрами факторов в пределах допустимого пространства факторов вместе с соответствующими прогнозируемыми значениями из редуцированной модели для каждого из ответов и совместной функции желательности.
    1. В профилировщике выберите Выводить случайную таблицу. Задайте для параметра Сколько запусков имитировать? значение 50 000 и нажмите кнопку ОК.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При этом генерируется новая таблица с прогнозируемыми значениями ответов для каждого из 50 000 составов. Столбец «Желательность» зависит от весов важности ответов, которые используются при выборе параметра «Выводить случайную таблицу ».
    2. Во вновь созданной таблице добавьте новый столбец, который вычисляет процентиль столбца "Желательность ". Используйте этот столбец процентиля на троичных графиках вместо необработанного столбца «Желательность ». Щелкните правой кнопкой мыши заголовок столбца "Желательность " и выберите "Новый столбец формулы" > " Распределенная > кумулятивная вероятность", чтобы создать новый столбец "Интегральная вероятность[желательность] ".
    3. Создайте рисунок, описанный в следующих шагах. Многократно изменяйте цветовую схему графика, чтобы отобразить прогнозы для каждого ответа и для столбца «Совокупная вероятность[желательность] ».
    4. Постройте тройные графики для четырех липидных факторов. В таблице перейдите к разделам График > Троичный график, выберите коэффициенты смешивания для X, Построение графика и нажмите кнопку ОК. Щелкните правой кнопкой мыши один из результирующих графиков, выберите условные обозначения строки, а затем выберите столбец прогнозируемого ответа. Измените раскрывающийся список «Цвета» на «Струя».
       ПРИМЕЧАНИЕ: Это показывает лучшие и худшие области по отношению к липидным факторам. На рисунке 14 показаны процентили совместной желательности при рассмотрении максимизации потенции (важность = 1) и минимизации размера (важность = 0,2) при усреднении по любым факторам, которые не показаны на осях троичного графика. На рисунке 15 показан необработанный прогнозируемый размер. Также разумно разбить эти графики условно по другим факторам, таким как создание отдельного набора тройных графиков для каждого ионизируемого типа липидов с помощью локального фильтра данных (доступного в меню красного треугольника рядом с тройным графиком).
    5. Аналогичным образом, используйте Graph > Graph Builder для построения графика 50 000 точек с цветовой кодировкой (представляющих уникальные составы) по отдельности или совместно, и поиска взаимосвязей между ответом (реакциями) и фактором (факторами). Ищите настройки фактора, которые дают наибольшую желательность. Исследуйте различные комбинации факторов на графике.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При раскрашивании графиков используйте кумулятивную вероятность [Желательность], но при построении графика желательности на вертикальной оси в зависимости от факторов процесса используйте необработанный столбец желательности . Столбец «Желательность » также может быть размещен на оси 3D-визуализации графика > точечной диаграммы вместе с двумя другими технологическими факторами для многомерного исследования. На рисунке 16 показана совместная желательность всех составов, которые могут быть образованы с каждым из трех ионизируемых типов липидов. В наиболее желательных составах используется Н102, а Н101 обеспечивает некоторые потенциально конкурентоспособные альтернативы.
    6. Сохраните профилировщик и его запомненные параметры обратно в таблицу данных. Щелкните красный треугольник рядом с профилировщиком и выберите Сохранить сценарий > В таблицу данных....

Рисунок 8: Наблюдаемые показания потенции в эксперименте. Точки показывают значения потенции, которые наблюдались в 23 прогонах; Реплицированные прогоны тестов показаны зеленым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Программный диалог для запуска анализа. Эффекты-кандидаты были введены вместе с реакцией целевой потенции, а опция «Без перехвата» была снята. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10. Дополнительный диалог для задания параметров SVEM. По умолчанию основные липидные эффекты принудительно включаются в модель. Поскольку перехват включен, мы рекомендуем снять эти флажки, чтобы не форсировать эффекты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Фактический по прогнозируемому графику. На этом рисунке показано сравнение наблюдаемой потенции со значением, прогнозируемым для каждой формулировки моделью SVEM. Корреляция не обязательно должна быть такой сильной, как в этом примере, но ожидается, что мы увидим, по крайней мере, умеренную корреляцию и проверим выбросы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 12: Профилировщик прогнозов. В двух верхних рядах графиков показаны срезы прогнозируемой функции отклика при оптимальной формулировке (как определено подходом SVEM). Нижняя строка графиков показывает взвешенную «желательность» состава, которая является функцией последнего столбца графиков, который показывает, что потенция должна быть максимизирована, а размер должен быть минимизирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 13: Три оптимальных кандидата в рецептуру от SVEM-Forward Selection. Изменение весов относительной важности ответов может привести к различным оптимальным формулировкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 14: Троичные графики процентиля желательности. На графике показаны 50 000 составов с цветовой кодировкой по процентилю желательности, где желательность установлена с весом важности 1,0 для максимизации потенции и 0,2 для минимизации размера, эти графики показывают, что оптимальная область составов состоит из более низкого процента ионизируемого липида и более высокого процента ПЭГ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 15: Троичный график для предсказанного размера. На графике показаны прогнозы размера модели SVEM для каждого из 50 000 составов. Размер минимизируется при более высоком проценте вспомогательного липида и максимизируется при более низком проценте хелпера. Поскольку другие факторы свободно варьируются в пределах 50 000 нанесенных на график составов, это означает, что эта взаимосвязь сохраняется во всех диапазонах других факторов (ПЭГ, скорость потока и т. д.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 16: Графики Скрипки для желательности составов, включающих три различных типа ионизируемых липидов. Каждая из 50 000 точек представляет собой уникальную формулировку из всего допустимого пространства факторов. Пики этих распределений являются максимальными значениями желательности, которые вычисляются аналитически с помощью профилировщика прогнозов. H102 имеет самый большой пик и, таким образом, дает оптимальный состав. Подход SVEM к построению модели, генерирующей этот результат, автоматически отфильтровывает статистически незначимые факторы: цель этого графика — рассмотреть практическую значимость на уровнях факторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Запуск подтверждения

1. Подготовьте таблицу, в которой перечислены оптимальные кандидаты, выявленные ранее (рис. 17).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения True Potency и True Size на рисунке 17 заполняются с помощью смоделированных генерирующих функций: на практике они будут получены путем формулирования, а затем измерения производительности этих рецептов.
   1. Включите контрольный показатель с набором потенциальных запусков, которые будут сформулированы и измерены.
   2. Если было обнаружено, что какой-либо из составов из эксперимента дает желаемые результаты, возможно, превосходя контрольный показатель, выберите лучший для добавления в таблицу-кандидат и повторите тестирование вместе с новыми составами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Либо вручную добавьте нужные запуски в таблицу-кандидат, либо используйте Запомнившиеся настройки окна профилировщика, если эти запуски взяты из предыдущего эксперимента. Определите номер строки прогона, перейдите в профилировщик прогнозов > параметрах фактора > установите значение «Данные в строке» и введите номер строки. Затем выберите « Профилировщик прогнозов» > «Настройки фактора» > «Запомнить настройки » и соответствующим образом пометьте их (например, «контроль» или «лучший запуск из предыдущего эксперимента»).
   3. Щелкните правой кнопкой мыши таблицу «Запомненные настройки » в профилировщике и выберите «Преобразовать в таблицу данных».
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от приоритета и бюджета исследования рассмотрите возможность запуска повторений для каждого запуска подтверждения, особенно при замене контрольного показателя. Создайте и проанализируйте каждую формулировку дважды, используя средний результат для ранжирования. Обратите внимание на любых кандидатов с широким диапазоном ответов в двух репликах, так как это может указывать на высокую дисперсию процесса.
   4. При необходимости из-за бюджетных ограничений отбирайте из выявленных кандидатов в соответствии с экспериментальным бюджетом или отсеивайте избыточных кандидатов.
2. Выполните прогоны подтверждения. Составьте формулировки и соберите показания.
3. Проверьте соответствие между результатами исходного эксперимента и результатами для подтверждающей партии для тестов или других повторяющихся рецептов. Если произойдет большой и неожиданный сдвиг, подумайте, что могло способствовать сдвигу, и возможно ли, что это повлияло на все запуски из пакета подтверждения.
4. Сравните показатели кандидата с оптимальными рецептурами. Изучите, превзошли ли какие-либо новые кандидаты бенчмарк.
5. Необязательно: добавьте результат повторных запусков в экспериментальную таблицу и повторно запустите анализ, описанный в разделе 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг рабочего процесса содержит инструкции по построению последующего исследования вместе с этими прогонами, если это необходимо.

Рисунок 17: Таблица из десяти оптимальных кандидатов, которые будут запущены в качестве подтверждающих запусков. Истинная потенция и истинный размер были заполнены из функций генерации моделирования (без каких-либо дополнительных технологических или аналитических вариаций). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Необязательно: Разработка последующего исследования, которое будет проводиться одновременно с прогонами подтверждения

1. Оцените необходимость последующего исследования с учетом следующих критериев:
   1. Определите, лежит ли оптимальная формулировка вдоль одной из границ факторов и желателен ли второй эксперимент для расширения хотя бы одного из диапазонов факторов.
   2. Оцените, использовался ли в первоначальном эксперименте относительно небольшой размер прогона или относительно большие диапазоны факторов и есть ли необходимость «увеличить» идентифицированную оптимальную область с помощью дополнительных прогонов и обновленного анализа.
   3. Проверьте, не вводится ли дополнительный фактор. Это может быть уровень категориального фактора, такого как дополнительный ионизируемый липид, или фактор, который оставался постоянным в первоначальном исследовании, например, буферная концентрация.
   4. Если ни одно из вышеперечисленных условий не выполняется, перейдите к шагу 7.
2. Подготовьтесь к дополнительным экспериментальным запускам, которые будут проводиться одновременно с подтверждающими запусками.
   1. Определите пределы фактора, обеспечивающие частичное перекрытие с регионом из первоначального исследования. Если совпадений не существует, необходимо разработать новое исследование.
   2. Разработка новых экспериментальных серий с конструкцией, заполняющей пространство. Выберите DOE > специального назначения > дизайна заполнения пространства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продвинутых пользователей рассмотрите D-оптимальный дизайн с помощью DOE > Custom Design.
   3. После создания прогонов, заполняющих пространство, вручную включите два или три прогона из исходного эксперимента, которые лежат в новом пространстве факторов. Распределите эти прогоны случайным образом в экспериментальной таблице, используя шаги, описанные в разделе 2, чтобы добавить строки, а затем рандомизировать порядок строк.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут использоваться для оценки любого сдвига в средних значениях отклика между блоками.
   4. Объедините прогоны подтверждения и новое заполнение пробелов в одну таблицу и рандомизируйте порядок выполнения. Используйте таблицы > объединения , а затем создайте и отсортируйте по новому случайному столбцу, чтобы рандомизировать порядок выполнения, как описано в разделе 2.
3. Сформулируйте новые рецепты и соберите результаты.
4. Объедините новые экспериментальные прогоны и результаты в исходную таблицу данных эксперимента, введя столбец идентификатора эксперимента для указания источника каждого результата. Используйте команду «Таблицы» > «Объединить » и выберите параметр « Создать исходный столбец».
5. Убедитесь, что свойства столбцов для каждого фактора отображают объединенный диапазон для обоих исследований: щелкните правой кнопкой мыши заголовок столбца для каждого фактора и проверьте диапазоны свойств Coding и Mix , если они присутствуют.
6. Начните анализ результатов нового эксперимента.
   1. Включите столбец идентификатора эксперимента в качестве термина в модель, чтобы он служил блокирующим фактором. Убедитесь, что этот термин не взаимодействует с исследуемыми факторами. Запустите сценарий диалогового окна « Подогнать модель », сохраненный в таблице в разделе 4, выберите столбец «Идентификатор эксперимента» и нажмите кнопку « Добавить », чтобы включить его в список возможных эффектов.
   2. Запустите это диалоговое окно «Модель соответствия » в объединенной таблице данных, чтобы совместно проанализировать результаты нового эксперимента и первоначального исследования. Придерживайтесь предыдущих инструкций для создания обновленных оптимальных кандидатов на формулировку и графических сводок.
   3. Для валидации независимо проанализируйте результаты нового эксперимента, исключив результаты первоначального эксперимента. То есть выполните шаги, описанные в разделе 4 на новой экспериментальной таблице.
   4. Убедитесь, что оптимальные составы, определенные этими моделями, тесно связаны с теми, которые определены совместным анализом.
   5. Просмотрите графические сводки, чтобы подтвердить, что как совместный, так и индивидуальный анализ новых экспериментальных результатов демонстрирует сходное поведение поверхности реакции (это означает, что существует аналогичная связь между ответом (ответами) и факторами).
   6. Сравните комбинированный и индивидуальный анализ новых результатов с первоначальным экспериментом на предмет согласованности. Используйте схожие структуры графов для сравнения и изучите выявленные оптимальные рецепты различий.

7. Документирование окончательных научных выводов исследования

1. Если контрольный элемент управления изменяется на вновь идентифицированный рецепт в связи с исследованием, зарегистрируйте новую настройку и укажите файлы проектирования и анализа, в которых записывается ее происхождение.
2. Сохраните все экспериментальные таблицы и сводки анализа, желательно с именами файлов с отметкой даты, для дальнейшего использования.

Representative Results

Этот подход был подтвержден для обоих широко классифицированных типов липидов: MC3-подобных классических липидов и липидоидов (например, C12-200), обычно полученных из комбинаторной химии. По сравнению с эталонной формулой LNP, разработанной с использованием метода «один фактор за раз» (OFAT), составы-кандидаты, полученные в ходе нашего рабочего процесса, часто демонстрируют улучшение эффективности в 4-5 раз по логарифмической шкале, как показано в показаниях люциферазы печени мыши на рисунке 18. В таблице 1 показано соответствующее улучшение экспрессии люциферазы печени мышей, наблюдаемое в контрольной производительности на протяжении двух фаз оптимизации (первоначальное исследование и последующее последующее исследование). На первом этапе основное внимание уделялось оптимизации соотношения липидов при сохранении неизменными других факторов. В последующем исследовании был введен дополнительный вспомогательный тип липидов, и была проведена оптимизация с учетом как состава липидного соотношения, так и вспомогательного типа липидов. Следовательно, был выбран вновь введенный вспомогательный тип липидов для использования с соответствующим оптимизированным липидным составом. Значительное повышение активности позволяет предположить, что эти оптимизированные композиции могут демонстрировать превосходные возможности эндосомального ускользания²⁵.

Моделирование может быть использовано, чтобы показать ожидаемое качество оптимального кандидата, полученного с помощью этой процедуры. В рамках примера эксперимента, использованного в протоколе, мы можем многократно повторить моделирование для разных размеров тиражей и оценить результаты в соответствии с моделируемой функцией, генерирующей процесс. Сценарий JMP для этой цели приведен в дополнительном файле 4. В частности, была сгенерирована конструкция, заполняющая пространство, а столбцы отклика были заполнены значениями наших функций генератора, а также шумом, представляющим аналитическое и технологическое изменение. Мы сопоставляем эти смоделированные ответы с различными методами анализа (включая SVEM Forward Selection) для получения соответствующего оптимального рецепта-кандидата. Затем кандидаты из каждого метода анализа сравниваются со значением истинного оптимума из порождающих функций. На рисунке 19 показан средний процент максимального теоретического отклика, достигнутого каждым из трех методов анализа с использованием заполняющих пространство конструкций размера, заданного на горизонтальной оси. Полная модель, которая включает в себя все возможные эффекты и не уменьшает модель на основе статистической значимости этих эффектов, показывает наихудшие результаты. Большая часть дополнительной работы, которая традиционно идет на подгонку регрессионных моделей для экспериментов со смесевыми процессами, включает в себя модификации (удаление пересечения, форсирование основных эффектов смеси, исключение использования эффектов чистой квадратичной смеси и т. д.), которые необходимы для соответствия этой полной модели⁹, и с этой точки зрения эти процедуры не нужны¹². Кроме того, эта модель не может быть установлена до тех пор, пока размер конструкции не достигнет количества эффектов в модели. При меньших экспериментальных размерах мы можем использовать традиционный метод прямого отбора, который превосходит полную модель по отношению к средней производительности оптимальной формулировки-кандидата для каждого фиксированного экспериментального размера. Аналогичным образом, модификация SVEM этого подхода к прямому отбору еще больше повышает эффективность оптимальных кандидатов. Этот график показывает, что использование SVEM-Forward Selection^12,13 для анализа эксперимента по заполнению пространства из 24 прогонов позволяет достичь того же среднего качества, которое обычно требуется для 50 прогонов при анализе с помощью традиционной модели прямого выбора (ориентируясь на минимальный AICc). Несмотря на то, что фактическая производительность будет варьироваться от процесса к процессу, это моделирование, наряду с опубликованными результатами на SVEM 12,13,16,17,26, демонстрирует потенциал этой процедуры моделирования для оптимизации рецептуры.

Рисунок 18: Улучшение экспрессии люциферазы в печени после двух раундов экспериментов. Раунд 0 показывает показания люциферазы печени для контрольного состава; Раунд 1 показывает показания люциферазы печени после первого эксперимента, которые оптимизируют молярные соотношения липидов, составляющих LNP; Раунд 2 показывает показания люциферазы печени после второго эксперимента, который дополнительно оптимизирует составляющие молярные соотношения, а также учитывает дополнительный вспомогательный тип липидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 19: Качество оптимальной формулировки в зависимости от размера эксперимента и статистической модели. Вертикальная ось представляет собой процент теоретической максимальной желательности, а горизонтальная ось представляет собой размер конструкции, заполняющей пространство. Каждая точка показывает среднее значение более 150 симуляций. Синяя линия (треугольники) представляет собой полную модель (без какого-либо исключения статистически незначимых эффектов), желтая линия (круги) представляет традиционную модель прямого выбора на основе AICc (с пересечением и без форсирования основных эффектов смеси), а зеленая линия (перевернутые треугольники) представляет модель прямого выбора на основе SVEM (с пересечением и без форсирования основных эффектов смеси). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Круглый	Идентификатор частицы	Экспрессия люциферазы в печени (фотон/сек)
0	Контрольный тест	8.Э+06
1	Оптимизировано по соотношению липидов	2.Э+09
2	Оптимизирован по соотношению липидов и вспомогательному типу липидов	8.Э+10

Таблица 1: Систематическое улучшение экспрессии люциферазы за счет оптимизации дизайна эксперимента (DOE). Эта таблица иллюстрирует значительное улучшение экспрессии люциферазы с улучшением до 10 000 раз по шкале фотон/секунда, от начального эталона до окончательного «оптимального кандидата».

Дополнительный файл 1: 04 апреля 2023 г. Резюме.docx - В этом документе содержится отчет об исследовании, включая его цель, оцененные ответы, рассмотренные факторы и общее количество выполненных запусков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - JMP-файл с смоделированным экспериментом и его результатами. Этот файл также содержит прилагаемые сценарии анализа, совместимые с JMP 17 Pro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - Файл Excel, включающий смоделированный эксперимент и его результаты, подходящий для читателей, у которых может не быть доступа к JMP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: моделирование смеси 20DEC22.jsl - Это сценарий JMP 17 Pro, используемый для моделирования экспериментов по составлению рецептур LNP и оценки эффективности различных методов анализа. Сценарий использует подход SVEM-Forward Selection (без перехвата), который является ключевым методом анализа, используемым в этом рабочем процессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Современное программное обеспечение для разработки и анализа экспериментов со смесевыми процессами позволяет ученым улучшать свои составы липидных наночастиц в структурированном рабочем процессе, который позволяет избежать неэффективных экспериментов с OFAT. Недавно разработанный подход к моделированию SVEM устраняет многие загадочные регрессионные модификации и стратегии сокращения моделей, которые ранее могли отвлекать ученых посторонними статистическими соображениями. После того, как результаты собраны, структура анализа SVEM предлагает подход, который легче реализовать и, как правило, создает лучшие модели, чем традиционные подходы к моделированию¹³. Кроме того, графический анализ, основанный на формулах прогнозирования для каждого ответа, легко интерпретируется учеными, давая четкое резюме предельного поведения ответа по отдельным факторам, а также по небольшим группам факторов, не требуя интерпретации высококоррелированных оценок параметров из регрессионной модели. Это позволяет ученым сосредоточиться на оценке практической значимости исследуемых факторов после того, как SVEM автоматически устранил статистически незначимые эффекты.

Рабочий процесс использовался на практике для систематического изменения липидного состава и параметров рецептуры, таких как соотношение N/P, скорость потока и соотношение смешивания, для оптимизации, а также для выбора наилучших вспомогательных типов липидов, ионизируемых типов липидов и типов буферов. Цели этих примеров обычно включают максимизацию потенции in vivo или in vitro и инкапсуляцию различных полезных нагрузок, таких как мРНК или ДНК, для соответствующих мишеней in vivo, таких как клетки печени, или иногда через несколько типов клеток в случае применения in vitro. Для конкретных применений нам, возможно, потребуется сбалансировать биофизические свойства, такие как размер, PDI, дзета-потенциал и процентная инкапсуляция, при изучении потенции in vivo. Кроме того, цель состоит в том, чтобы найти мощный, но хорошо переносимый состав, и поэтому мы можем включить в анализ такие реакции, как изменение массы тела, цитокиновый ответ или выявление ферментов печени, таких как АСТ / АЛТ. Закономерности были выявлены в результате многочисленных экспериментов с LNP. Примечательно, что изменения в молярном соотношении ионизируемого липида и соотношении N / P, по-видимому, значительно влияют на инкапсуляцию РНК. Кроме того, изменения в молярном соотношении ПЭГ, по-видимому, влияют на стабильность частиц, о чем свидетельствуют влияния на размер и PDI. В целом, избыток ПЭГ в ядре LNP, как правило, оказывает пагубное влияние на потенцию у мышей.

Улучшение производительности особенно заметно, когда нацелено более одного ответа: даже если эталон уже хорошо работает по отношению к первичному ответу (например, потенции), совместная оптимизация обычно поддерживает или улучшает поведение по отношению к первичному ответу, одновременно улучшая поведение по отношению к другим ответам (минимизация PDI, размера или потери массы тела). Мы проверяем подлинность этих улучшений с помощью прогонов подтверждения, в ходе которых мы готовим и напрямую сравниваем эталонную формулировку (возможно, с репликой) и новые формулировки-кандидаты.

Этап проектирования этого рабочего процесса состоит из нескольких важных этапов. Во-первых, убедитесь, что факторы и их диапазоны правильно введены в платформу дизайна, заполняющую пространство. Во-вторых, используйте графику и предметные знания, чтобы подтвердить осуществимость каждой результирующей формулировки до начала эксперимента. Наконец, выполните эксперимент в соответствии с рандомизированным порядком, указанным в таблице проектирования. Соблюдение этой последовательности помогает предотвратить неизмеренные ковариаты, такие как порядок производства рецептуры или температура окружающей среды, от смешения исследуемых факторов. Конструкции, заполняющие пространство, проще в изготовлении - с меньшим потенциалом ошибки пользователя, чем оптимальные конструкции процесса смешивания, которые требуют дополнительных решений во время настройки, которые могут расстроить неопытных пользователей и отбить у них охоту использовать запланированные эксперименты. Тем не менее, после работы над этим протоколом ученым может быть полезно дополнительное чтение о том, как оптимальные конструкции могут потенциально заменить конструкции заполнения пространства в протоколе, такие как описано в главе 6 Goos and Jones (2011)²⁷. Особенно для последующих исследований, которые «увеличивают» оптимальную область, где меньше беспокойства по поводу отказов вдоль границ смеси, D-оптимальные конструкции могут быть более эффективными, чем конструкции, заполняющие пространство.

Аналогичным образом, этап анализа этого рабочего процесса состоит из нескольких важных этапов. Во-первых, убедитесь, что модель определяет соответствующий набор возможных эффектов, включая взаимодействия, а не только основные (первого порядка) эффекты факторов. Во-вторых, используйте SVEM Forward Selection в качестве основы моделирования. В-третьих, отключите параметр по умолчанию «Без перехвата» и избегайте принудительного смешивания основных эффектов. Наконец, правильно установите функции желательности для ответов, прежде чем начинать оптимизацию. Для пользователей, не имеющих доступа к SVEM, наилучшим подходом является использование традиционного прямого выбора (ориентируясь на минимальный AICc) для задачи^{регрессии 12}. В протоколе упоминается, что также можно использовать SVEM Lasso: в среднем этот подход дает результаты, аналогичные SVEM Forward Selection, хотя для определенных наборов данных эти два подхода могут давать несколько отличающиеся оптимальные формулировки, которые можно сравнить с подтверждением¹². Тем не менее, SVEM Lasso даст худшие результаты моделирования, если пользователь совершит простую ошибку, забыв отключить параметр¹² без пересечения по умолчанию: по этой причине мы использовали SVEM Forward Selection в качестве метода по умолчанию, поскольку он более устойчив к этой опции.

Основное ограничение этого метода заключается в том, что время от времени будут проводиться исследования с большей сложностью, которым будет полезна помощь статистиков для разработки и анализа. Ситуации, когда бюджет выполнения более ограничен, чем обычно (ниже минимальной эвристики), ответы двоичны, существует большое количество категориальных факторов или уровней одного категориального фактора, когда цель исследования состоит в том, чтобы рассмотреть вопрос об исключении одного или нескольких смешанных факторов из рецепта, или когда существуют дополнительные ограничения на факторное пространство, статистик может по-разному подходить, например, за счет использования оптимальных или гибридных конструкций^12,28 или путем добавления дополнительной структуры к конструкции. В частности, гибридный дизайн может быть сформирован путем создания заполняющего пространство дизайна с большинством бюджетных прогонов, а затем «дополняет» дизайн оставшимися прогонами (обычно 2-4) с использованием D-оптимального критерия. Другой гибридный подход заключается в создании дизайна, заполняющего пространство, над смесью (липидами) и непрерывными (процесс) факторами, а затем в добавлении любых категориальных факторов с использованием «оптимального» распределения уровней факторов. Тем не менее, упрощенный подход к проектированию с заполнением пространства, принятый в протоколе, был разработан в течение последних нескольких лет в процессе проведения десятков экспериментов по оптимизации рецептуры LNP, и мы считаем, что он предлагает надежный подход, который будет успешно работать в большинстве случаев, а также дает ученым уверенность в их способности использовать разработанные эксперименты.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC