Ett arbetsflöde för optimering av lipidnanopartikelformulering (LNP) med hjälp av designade blandningsprocessexperiment och självvaliderade ensemblemodeller (SVEM)

Summary

Detta protokoll ger ett tillvägagångssätt för formuleringsoptimering över blandnings-, kontinuerliga och kategoriska studiefaktorer som minimerar subjektiva val i den experimentella designkonstruktionen. För analysfasen används en effektiv och lättanvänd modelleringsmonteringsprocedur.

Abstract

Vi presenterar ett Quality by Design (QbD) utformat tillvägagångssätt för att optimera lipidnanopartikelformuleringar (LNP), som syftar till att erbjuda forskare ett tillgängligt arbetsflöde. Den inneboende begränsningen i dessa studier, där molförhållandena för joniserbara, hjälpar- och PEG-lipider måste lägga till upp till 100%, kräver specialiserade design- och analysmetoder för att tillgodose denna blandningsbegränsning. Med fokus på lipid- och processfaktorer som vanligtvis används vid LNP-designoptimering tillhandahåller vi steg som undviker många av de svårigheter som traditionellt uppstår vid design och analys av blandningsprocessexperiment genom att använda rymdfyllande mönster och utnyttja det nyligen utvecklade statistiska ramverket för självvaliderade ensemblemodeller (SVEM). Förutom att producera kandidatoptimala formuleringar bygger arbetsflödet också grafiska sammanfattningar av de anpassade statistiska modellerna som förenklar tolkningen av resultaten. De nyligen identifierade kandidatformuleringarna utvärderas med konfirmeringskörningar och kan eventuellt genomföras inom ramen för en mer omfattande studie i andra fas.

Introduction

Lipidnanopartikelformuleringar (LNP) för in vivo-genleveranssystem involverar i allmänhet fyra beståndsdelar lipider från kategorierna joniserbara, hjälpar- och PEG-lipider ^1,2,3. Oavsett om dessa lipider studeras ensamma eller samtidigt med andra icke-blandningsfaktorer, kräver experiment för dessa formuleringar "blandningsdesign" eftersom - givet en kandidatformulering - ökning eller minskning av förhållandet mellan någon av lipiderna nödvändigtvis leder till en motsvarande minskning eller ökning av summan av förhållandena mellan de andra tre lipiderna.

Som illustration antas det att vi optimerar en LNP-formulering som för närvarande använder ett fastställt recept som kommer att behandlas som riktmärke. Målet är att maximera LNP: s styrka samtidigt som man sekundärt syftar till att minimera den genomsnittliga partikelstorleken. Studiefaktorerna som varieras i experimentet är molförhållandena för de fyra ingående lipiderna (joniserbara, kolesterol, DOPE, PEG), N: P-förhållandet, flödeshastigheten och den joniserbara lipidtypen. De joniserbara lipiderna och hjälparlipiderna (inklusive kolesterol) får variera över ett bredare spektrum av molförhållande, 10-60%, än PEG, vilket kommer att varieras från 1-5% i denna illustration. Referensformuleringsreceptet och intervallen för de andra faktorerna och deras avrundningskornighet specificeras i kompletterande fil 1. För det här exemplet kan forskarna utföra 23 körningar (unika partier av partiklar) på en enda dag och vill använda det som provstorlek om det uppfyller minimikraven. Simulerade resultat för detta experiment finns i Kompletterande fil 2 och Kompletterande fil 3.

Rampado och Peer⁴ har nyligen publicerat ett översiktspapper om ämnet designade experiment för optimering av nanopartikelbaserade läkemedelsleveranssystem. Kauffman et ^al.5 övervägde LNP-optimeringsstudier med fraktionerad faktoriell och definitiv screeningdesign⁶; Dessa typer av konstruktioner kan dock inte hantera en blandningsbegränsning utan att använda ineffektiva "slackvariabler"7 och används vanligtvis inte när blandningsfaktorer förekommer ^7,8. I stället används traditionellt "optimala konstruktioner" som kan innefatta en blandningsbegränsning för blandningsprocessexperiment⁹. Dessa designer riktar sig mot en användarspecificerad funktion av studiefaktorerna och är endast optimala (i en av ett antal möjliga sinnen) om denna funktion fångar det verkliga förhållandet mellan studiefaktorerna och svaren. Observera att det finns en skillnad i texten mellan "optimal design" och "optimal formuleringskandidat", där den senare hänvisar till de bästa formuleringarna som identifierats av en statistisk modell. Optimala konstruktioner har tre huvudsakliga nackdelar för blandningsprocessexperiment. För det första, om forskaren misslyckas med att förutse en interaktion mellan studiefaktorerna när man specificerar målmodellen, kommer den resulterande modellen att vara partisk och kan producera sämre kandidatformuleringar. För det andra placerar optimala konstruktioner de flesta körningarna på faktorutrymmets yttre gräns. I LNP-studier kan detta leda till ett stort antal förlorade körningar om partiklarna inte bildas korrekt vid någon ytterlighet av lipid- eller processinställningarna. För det tredje föredrar forskare ofta att ha experimentella körningar på insidan av faktorutrymmet för att få en modelloberoende känsla av responsytan och att observera processen direkt i tidigare outforskade regioner i faktorutrymmet.

En alternativ designprincip är att rikta in sig på en ungefärlig enhetlig täckning av det (blandningsbegränsade) faktorutrymmet med en rymdfyllande design¹⁰. Dessa konstruktioner offrar viss experimentell effektivitet i förhållande till optimala mönster⁹ (förutsatt att hela faktorutrymmet leder till giltiga formuleringar) men presenterar flera fördelar i en avvägning som är användbara i denna applikation. Den utrymmesfyllande designen gör inga a priori-antaganden om responsytans struktur; Detta ger den flexibiliteten att fånga oväntade relationer mellan studiefaktorerna. Detta effektiviserar också designgenereringen eftersom det inte kräver att beslut fattas om vilka regressionstermer som ska läggas till eller tas bort när önskad körningsstorlek justeras. När vissa designpunkter (recept) leder till misslyckade formuleringar, gör utrymmesfyllande design det möjligt att modellera felgränsen över studiefaktorerna samtidigt som man stöder statistiska modeller för studiesvaren över de framgångsrika faktorkombinationerna. Slutligen möjliggör faktorutrymmets inre täckning modelloberoende grafisk utforskning av responsytan.

För att visualisera blandningsfaktorns underutrymme i ett blandningsprocessexperiment används specialiserade triangulära "ternära tomter". Figur 1 motiverar denna användning: i kuben av punkter där tre ingredienser vardera får sträcka sig från 0 till 1, markeras de punkter som uppfyller en begränsning att summan av ingredienserna är lika med 1 i rött. Blandningsbegränsningen på de tre ingredienserna reducerar det möjliga faktorutrymmet till en triangel. I LNP-applikationer med fyra blandningsingredienser producerar vi sex olika ternära diagram för att representera faktorutrymmet genom att plotta två lipider åt gången mot en "Övriga" axel som representerar summan av de andra lipiderna.

Figur 1: Triangulära faktorregioner. I det utrymmesfyllande diagrammet i kuben representerar de små grå prickarna formuleringar som inte överensstämmer med blandningsbegränsningen. De större röda punkterna ligger på en triangel inskriven i kuben och representerar formuleringar för vilka blandningsbegränsningen är uppfylld. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Förutom lipidblandningsfaktorerna finns det ofta en eller flera kontinuerliga processfaktorer såsom N: P-förhållande, buffertkoncentration eller flödeshastighet. Kategoriska faktorer kan vara närvarande, såsom joniserbar lipidtyp, hjälparlipidtyp eller bufferttyp. Målet är att hitta en formulering (en blandning av lipider och inställningar för processfaktorer) som maximerar ett visst mått på styrka och / eller förbättrar fysiokemiska egenskaper som att minimera partikelstorlek och PDI (polydispersitetsindex), maximera procentuell inkapsling och minimera biverkningar - såsom viktminskning - in vivo-studier . Även när man utgår från ett rimligt referensrecept kan det finnas intresse av omoptimering med tanke på en förändring i den genetiska nyttolasten eller när man överväger förändringar i processfaktorerna eller lipidtyperna.

Cornell⁷ ger en definitiv text om de statistiska aspekterna av blandnings- och blandningsprocessexperiment, med Myers et ^al.9 som ger en utmärkt sammanfattning av de mest relevanta blandningsdesign- och analysämnena för optimering. Dessa verk kan dock överbelasta forskare med statistiska detaljer och med specialiserad terminologi. Modern programvara för design och analys av experiment ger en robust lösning som tillräckligt stöder de flesta LNP-optimeringsproblem utan att behöva vädja till relevant teori. Medan mer komplicerade eller högprioriterade studier fortfarande kommer att dra nytta av samarbete med en statistiker och kan använda optimala snarare än rymdfyllande mönster, är vårt mål att förbättra forskarnas komfortnivå och uppmuntra optimering av LNP-formuleringar utan att vädja till ineffektiv enfaktor-i-taget (OFAT) testning¹¹ eller helt enkelt nöja sig med den första formuleringen som uppfyller specifikationerna.

I den här artikeln presenteras ett arbetsflöde som använder statistisk programvara för att optimera ett generiskt LNP-formuleringsproblem, adressera design- och analysproblem i den ordning de kommer att påträffas. Faktum är att metoden kommer att fungera för allmänna optimeringsproblem och är inte begränsad till LNP. Längs vägen tas flera vanliga frågor upp och rekommendationer ges som är grundade i erfarenhet och i simuleringsresultat¹². Det nyligen utvecklade ramverket för självvaliderade ensemblemodeller (SVEM)¹³ har avsevärt förbättrat det annars bräckliga tillvägagångssättet för att analysera resultat från blandningsprocessexperiment, och vi använder detta tillvägagångssätt för att tillhandahålla en förenklad strategi för formuleringsoptimering. Medan arbetsflödet är konstruerat på ett allmänt sätt som kan följas med andra programvarupaket, är JMP 17 Pro unik i att erbjuda SVEM tillsammans med de grafiska sammanfattningsverktygen som vi har funnit vara nödvändiga för att förenkla den annars svårbegripliga analysen av blandningsprocessexperiment. Som ett resultat tillhandahålls också JMP-specifika instruktioner i protokollet.

SVEM använder samma linjära regressionsmodellgrund som det traditionella tillvägagångssättet, men det gör det möjligt för oss att undvika tråkiga modifieringar som krävs för att passa en "fullständig modell" av kandidateffekter genom att använda antingen en framåtriktad selektion eller en straffad urval (Lasso) basmetod. Dessutom ger SVEM en förbättrad passform för "reducerad modell" som minimerar risken för att införliva brus (process plus analytisk varians) som visas i data. Det fungerar genom att medelvärdet av de förutsagda modellerna som härrör från upprepad omviktning av den relativa betydelsen av varje körning i modellen 13,14,15,16,17,18. SVEM tillhandahåller ett ramverk för modellering av blandningsprocessexperiment som både är lättare att implementera än traditionell engångsregression och ger bättre kvalitet optimala formuleringskandidater^12,13. De matematiska detaljerna i SVEM ligger utanför ramen för detta dokument och till och med en kortfattad sammanfattning utöver den relevanta litteraturöversikten skulle distrahera från dess huvudsakliga fördel i denna applikation: det möjliggör en enkel, robust och korrekt klicka-och-kör-procedur för utövare.

Det presenterade arbetsflödet överensstämmer med Quality by Design (QbD)^19-metoden för läkemedelsutveckling²⁰. Resultatet av studien kommer att vara en förståelse för det funktionella förhållandet som kopplar materialattribut och processparametrar till kritiska kvalitetsattribut (CQA)²¹. Daniel et ^al.22 diskuterar att använda ett QbD-ramverk specifikt för RNA-plattformsproduktion: vårt arbetsflöde kan användas som ett verktyg inom detta ramverk.

Protocol

Experimentet som beskrivs i avsnittet Representativa resultat utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och procedurerna utfördes enligt riktlinjer som fastställts av vår Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). 6-8 veckor gamla kvinnliga Balb / C-möss erhölls kommersiellt. Djur fick ad libitum standard chow och vatten och hölls under standardförhållanden med 12 timmars ljus / mörka cykler, vid en temperatur av 65-75 ° F (~ 18-23 ° C) med 40-60% luftfuktighet.

1. Registrera studiens syfte, svar och faktorer

I hela detta protokoll används JMP 17 Pro för att designa och analysera experimentet. Motsvarande programvara kan användas enligt liknande steg. För exempel och ytterligare instruktioner för alla steg som utförs i avsnitt 1, se Kompletterande fil 1.

1. Sammanfatta syftet med experimentet i ett datumstämplat dokument.
2. Lista de primära svaren (CQA) som kommer att mätas under experimentet.
3. Ange eventuella sekundära reaktioner (t.ex. nedströms begränsningar av fysiokemiska egenskaper) som kan mätas.
4. Ange processparametrar som kan relateras till svaren, inklusive de som är mest relevanta för studiens syfte.
5. Om studien kommer att pågå över flera dagar, inkludera en dag kategorisk "blockering" faktor.
   OBS: Detta balanserar faktorinställningar över dagar för att förhindra att dagnivåförändringar i processen förväxlas med studiefaktorerna.
6. Välj de faktorer som ska varieras och de som ska hållas konstanta under studien.
   Använd riskprioriteringsverktyg som analyser av fellägeseffekter²⁰ för att välja den mest relevanta delmängden av faktorer (figur 2). Vanligtvis bör alla lipider tillåtas variera; även om det i vissa budgetbegränsade fall är rimligt att låsa PEG vid ett fast förhållande.
7. Fastställ intervallen för de olika faktorerna och relevant decimalprecision för var och en.
8. Bestäm studiens designstorlek (antalet unika partier av partiklar) med hjälp av minsta och maximala heuristik. Manuellt inkluderade prestandamåttskörningar räknas inte in i den körningsstorlek som rekommenderas av heuristiken.
   Följande heuristik förutsätter att svaren är kontinuerliga. Den minsta heuristiken förutsätter att det kommer att vara möjligt att utföra en uppföljningsstudie, om det behövs, förutom att utföra bekräftelsekörningar för kandidatoptimala formuleringar. Om det bara är möjligt att utföra bekräftelsekörningar är det bättre att budgetera för antalet körningar som erhållits från maximal heuristik. För binära primära svar, sök hjälp från en statistiker för att bestämma lämpligt antal körningar.
   1. Minsta heuristik: Tilldela tre körningar per blandningsfaktor, två per kontinuerlig processfaktor och en per nivå för varje kategorisk faktor.
      OBS: För en studie med fyra lipidfaktorer, två kontinuerliga och en trevägs kategorisk processvariabel, leder detta till ett förslag på (3 x 4) + (2 x 2) + 3 = 19 rymdfyllande körningar. Lägg till ytterligare körningar om vissa sannolikt kommer att misslyckas på grund av formulerings- eller mätproblem.
   2. Maximal heuristik: Starta programvaran för att bygga optimala mönster och mata in de nödvändiga parametrarna för en andra ordning (inklusive huvudeffekter, tvåvägsinteraktioner mellan alla effekter och kvadratiska effekter för kontinuerliga processfaktorer). Beräkna minsta körstorlek enligt programvarans algoritm. Lägg till 1 till resultatet som erhållits från programvaran för att definiera maximal heuristik.
      Se Kompletterande fil 1 för detaljerade instruktioner om hur du utför dessa steg. Ett provfall med fyra lipidfaktorer, två kontinuerliga och en trevägs kategorisk processvariabel, leder till en rekommenderad körningsstorlek på 34 (33 från programvarurekommendation + 1). Eventuella körningar utöver detta skulle sannolikt användas bättre för bekräftelse- eller uppföljningsstudier.

Figur 2: Orsak och verkan-diagram. Diagrammet visar gemensamma faktorer i ett LNP-formuleringsoptimeringsproblem. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Skapande av designbordet med en rymdfyllande design

1. Öppna JMP och navigera i menyraden till DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Ange studiesvaren (se kompletterande fil 1).
3. Valfritt: Lägg till kolumner för ytterligare svar, som anger om var och en ska maximeras, minimeras eller riktas genom att klicka på Lägg till svar.
   Dessa inställningar kan ändras senare och påverkar inte designen. På samma sätt kan ytterligare kolumner för ytterligare svar läggas till efter att designtabellen har skapats.
4. Ange studiefaktorerna och motsvarande intervall. Använd knappen Blandning om du vill lägga till blandningsfaktorer, knappen Kontinuerlig om du vill lägga till kontinuerliga faktorer eller knappen Kategorisk om du vill lägga till kategoriska faktorer.
   OBS: Denna exempelstudie använder de faktorer och intervall som illustreras i figur 3, som inkluderar det joniserbara molära förhållandet (mellan 0,1 och 0,6), hjälparmolförhållandet (även mellan 0,1 och 0,6), kolesterolmolförhållandet (mellan 0,1 och 0,6), PEG-molförhållandet (från 0,01 till 0,05) och den joniserbara lipidtypen (som kan vara H101, H102 eller H103).
5. Ange det förutbestämda antalet körningar för designen i fältet Antal körningar .
6. Valfritt: Öka den genomsnittliga klusterstorleken från standardvärdet 50 till 2000 via den röda triangelmenyn bredvid rubriken Utrymmesfyllningsdesign och på undermenyn Avancerade alternativ .
   OBS: Detta är en inställning för rymdfyllningsalgoritmen som kan leda till något bättre designkonstruktion på bekostnad av ytterligare beräkningstid.
7. Generera designtabellen för utrymmesfyllning för de valda faktorerna och körstorleken. Klicka på Snabb flexibel fyllning och sedan på Gör tabell.
   De två första körningarna från en exempeldesign visas i figur 4.
8. Lägg till en anteckningskolumn i tabellen för att kommentera manuellt skapade körningar. Dubbelklicka på den första tomma kolumnrubriken för att lägga till en kolumn och dubbelklicka sedan på den nya kolumnrubriken för att redigera namnet.
9. Om tillämpligt, införliva benchmark-kontrollkörningar manuellt i designtabellen. Inkludera en replikat för ett av kontrollriktmärkena. Markera referensnamnet i kolumnen Anteckningar och färgkoda replikeringsraderna för benchmark för enkel diagramidentifiering.
   1. Lägg till en ny rad genom att dubbelklicka på den första tomma radrubriken och ange inställningarna för referensfaktorn. Duplicera den här raden för att skapa en replik av riktmärket. Markera båda raderna och navigera till Rader > färger för att tilldela en färg för diagramändamål.
      OBS: Replikatet ger en modelloberoende uppskattning av processen plus analytisk varians och ger ytterligare grafisk insikt.
10. Om någon benchmarkkontroll överskrider intervallet för studiefaktorerna, ange detta i kolumnen "Anmärkningar" för framtida uteslutning från analys.
11. Avrunda blandningsfaktorerna till lämplig granularitet. För att göra det,
    1. Markera kolumnrubrikerna för blandningsfaktorerna, högerklicka på en av kolumnrubrikerna och navigera till Ny formelkolumn > Transformera > runda..., ange rätt avrundningsintervall och klicka på OK.
    2. Kontrollera att inga rader är markerade genom att klicka på den nedre triangeln i skärningspunkten mellan rad- och kolumnrubriker.
    3. Kopiera värdena från de nyskapade rundade kolumnerna (Ctrl + C) och klistra in (Ctrl + V) i de ursprungliga blandningskolumnerna. Ta slutligen bort kolumnerna för tillfälligt avrundat värde.
12. När du har avrundat lipidförhållandena kontrollerar du att summan är lika med 100 % genom att välja kolumnrubrikerna för blandningsfaktorerna, högerklicka på en och gå till Ny formelkolumn > Kombinera > summa. Om summan av en rad inte är lika med 1 justerar du manuellt en av blandningsfaktorerna och ser till att faktorinställningen håller sig inom faktorintervallet. Ta bort summakolumnen när justeringarna är klara.
13. Följ samma procedur som används för avrundning av blandningsfaktorerna för att runda processfaktorerna till deras respektive granularitet.
14. Formatera lipidkolumnerna så att de visas i procent med önskat antal decimaler: markera kolumnrubrikerna, högerklicka och välj Standardisera attribut.... I nästa fönster ställer du in Format till procent och justerar antalet decimaler efter behov.
15. Om manuella körningar läggs till, till exempel riktmärken, slumpar du tabellradsordningen igen: lägg till en ny kolumn med slumpmässiga värden (Högerklicka på den sista kolumnrubriken och välj Ny formelkolumn > Slumpmässig > Slumpmässig normal). Sortera den här kolumnen i stigande ordning genom att högerklicka på kolumnrubriken och ta sedan bort kolumnen.
16. Valfritt: lägg till en Kör ID-kolumn . Fyll i detta med aktuellt datum, experimentnamn och radnummer från tabellen.
    Se (bild 5) för ett exempel.
17. Generera ternära diagram för att visualisera designpunkterna över lipidfaktorerna (figur 6). Undersök också körningsfördelningen över processfaktorerna (figur 7): välj diagram > ternära diagram. Välj endast blandningsfaktorerna för X, Plottning.
18. Om du vill undersöka fördelningen över processfaktorerna väljer du Analysera > fördelning och anger processfaktorerna för Y, Kolumner.
    OBS: Formuleringsforskaren bör bekräfta genomförbarheten av alla körningar. Om det inte går att köra startar du om designen med tanke på de nyligen identifierade begränsningarna.

Figur 3: Studiefaktorer och intervall. Skärmbilder av inställningar i experimentell programvara är användbara för att reproducera studieupplägget. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Inledande utdata för en rymdfyllande design. Visar de två första raderna i tabellen, inställningarna måste avrundas till önskad precision samtidigt som man ser till att lipidmängderna summeras till 1. Riktmärket lades till i tabellen manuellt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Formaterad studietabell. Faktornivåerna har avrundats och formaterats och kolumnen Kör ID har lagts till. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Designpunkter på ett ternära diagram. De 23 formuleringarna visas som en funktion av motsvarande joniserbara, hjälpar- och "andra" (kolesterol + PEG) -förhållanden. Den gröna punkten i mitten representerar riktmärket 33:33:33:1 molförhållande för joniserbart (H101):Kolesterol:Helper (DOPE):P EG. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Fördelning av icke-blandade processfaktorer i experimentet. Histogrammen visar hur experimentkörningarna är fördelade över joniserbar lipidtyp, N: P-förhållande och flödeshastighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Köra experimentet

1. Kör experimentet i den ordning som anges i designtabellen. Registrera avläsningarna i kolumnerna som är inbyggda i experimenttabellen.
2. Om flera tester utförs för samma svar på en identisk formuleringssats, beräkna ett medelvärde för dessa resultat inom varje sats. Lägg till en kolumn för varje analysmått i tabellen.
   1. För att få ett medelvärde, markera alla relaterade kolumner, högerklicka på en av de markerade kolumnrubrikerna och välj Ny formelkolumn > Kombinera > genomsnitt. Använd den här kolumnen Genomsnitt för framtida svarsanalys.
      OBS: Utan att starta receptet på nytt fångar upprepade analysmätningar endast analysvariansen och utgör inte oberoende replikat.
3. Dokumentera eventuella förekomster av formuleringsutfällning eller in vivo-toleransproblem (t.ex. svår viktminskning eller dödsfall) med binära (0/1) indikatorer i en ny kolumn för varje typ av problem.

4. Analysera experimentella resultat

1. Rita upp avläsningarna och undersök svarens fördelningar: öppna Diagram > Diagramverktyget och dra varje svar till Y-området för enskilda diagram. Upprepa detta för alla svar.
2. Undersök det relativa avståndet mellan de färgkodade replikatkörningarna, om en sådan inkluderades. Detta gör det möjligt att förstå den totala (processmässiga och analytiska) variationen vid riktmärket jämfört med variabiliteten på grund av förändringar i faktorinställningarna över hela faktorutrymmet (figur 8).
3. Fastställ om råsvaret ska modelleras eller om en transformering ska användas i stället. För svar som är begränsade till att vara positiva men som är obegränsade ovan (t.ex. potens), passa både en normalfördelning och en lognormal fördelning till experimentresultaten. Om den lognormala fördelningen passar bättre med en lägre AICc (korrigerad Akaikes informationskriterium), ta sedan en loggtransformation av det svaret.
   1. Gå till Analysera > distribution och välj svaret för Y, Kolumner. I den resulterande distributionsrapporten klickar du på den röda triangeln bredvid svarets namn och väljer Kontinuerlig anpassning > Passa normal och Kontinuerlig anpassning > Passa loggnormal från rullgardinsmenyn. I den efterföljande rapporten Jämför fördelningar kontrollerar du AICc-värdena för att se vilken fördelning som passar svaret bäst.
   2. Om du vill utföra en loggtransformering högerklickar du på svarskolumnrubriken och väljer Ny formelkolumn > Logga > logg. När en modell har skapats och en förutsägelsekolumn i loggskalan sparas transformerar du svaret tillbaka till den ursprungliga skalan genom att välja Ny formelkolumn > Logg > Exp.
   3. För proportionella svar avgränsade mellan 0 och 1, jämför passformen för en normal- och betafördelning. Om betadistributionen har en lägre AICc utför du en logittransformering. I distributionsrapporten för svaret väljer du Kontinuerlig anpassning > Passa normal och Kontinuerlig anpassning > Passa beta.
      1. För logit-transformeringen högerklickar du på svarskolumnrubriken i datatabellen och väljer Ny formelkolumn > Specialitet > Logit. Efter modellbyggande sparar du förutsägelsekolumnen. Om du vill återgå till den ursprungliga skalan använder du kolumnen Ny formel > Specialitet > Logistic.
         OBS: Den regressionsbaserade SVEM-analysen är robust för avvikelser från normalitet i svarsfördelningen. Dessa omvandlingar kan dock leda till enklare tolkning av resultaten och till en förbättrad passform av modellerna.
4. Rita körningarna på en ternär tomt. Färglägg punkterna enligt svaren (eller de transformerade svaren om en omformning tillämpades): öppna diagram > ternära diagram. Välj endast blandningsfaktorerna för X, Plottning. Högerklicka på något av de resulterande diagrammen, välj Radförklaring och välj sedan kolumnen (transformerad) svar.
   OBS: Färgning av punkterna enligt svar ger ett modelloberoende visuellt perspektiv på beteende i förhållande till blandningsfaktorer.
5. Ta bort modellskriptet som genererats av rymdfyllningsdesignen.
6. Bygg en oberoende modell för varje svar som en funktion av studiefaktorerna och upprepa följande steg för varje svar.
   OBS: I händelse av ett sekundärt binärt svar (t.ex. formuleringsfel eller musdöd), modellera även detta svar. Ändra inställningen för målfördelning från Normal till Binomial.
7. Konstruera en "fullständig" modell som omfattar alla kandidateffekter. Denna modell bör inkludera de viktigaste effekterna av varje faktor, två- och trevägsinteraktioner, kvadratiska och partiella kubiska termer i processfaktorerna och Scheffé-kubiska termer för blandningsfaktorerna^23,24.
   Använd samma uppsättning kandidateffekter för varje svar. SVEM-modellvalstekniken kommer oberoende att förfina modellerna för varje svar, vilket potentiellt resulterar i unika reducerade modeller för var och en. Figur 9 illustrerar några av dessa kandidateffekter. Följande delsteg beskriver den här processen.
   1. Välj Analysera > passformsmodell.
   2. Se till att blockeringsfaktorer (t.ex. dag) inte får interagera med andra studiefaktorer. Välj eventuella blockeringsfaktorer och klicka på Lägg till. Ta inte med dessa faktorer i något av de efterföljande delstegen.
      OBS: Blockeringsfaktorer är viktiga att ta hänsyn till i modellen men blockeringsfaktorer bör inte tillåtas interagera med andra studiefaktorer. Huvudsyftet med blockeringsfaktorer är att hjälpa till att kontrollera experimentets variabilitet och förbättra experimentets känslighet.
   3. Markera alla studiefaktorer. Ändra värdet för fältet Grad till 3 (det är inställt på 2 som standard). Klicka på Factorial to degree.
      Den här åtgärden omfattar huvudeffekter samt två- och trevägsinteraktioner i modellen.
   4. Markera endast de icke-blandade faktorerna i markeringsfönstret. Klicka på Makron > delvis kubik.
      OBS: Denna åtgärd introducerar kvadratiska effekter för de kontinuerliga processfaktorerna och deras interaktion med andra icke-blandningsfaktorer i modellen.
   5. Välj endast blandningsfaktorerna i urvalslistan. Klicka på Makron > Scheffe Cubic. Inaktivera standardalternativet Ingen avlyssning (se bild 9).
      OBS: Att inkludera en skärningspunkt i modellen är ett viktigt steg när du använder Lasso-metoder och är också till hjälp i framåtvalssammanhang. Den traditionella standardinställningen Ingen skärningspunkt är vanligtvis på plats eftersom det inte är möjligt att anpassa en skärningspunkt samtidigt med alla blandningens huvudeffekter, utan modifieringar som SVEM-metoden, med den vanliga minstakvadratregressionsproceduren¹².
   6. Ange svarskolumnen: markera svarskolumnen och klicka på Y.
   7. Ändra inställningen Personlighet till Generaliserad regression. Håll Distribution inställt på Normal.
   8. Spara den här modellkonfigurationen i datatabellen för användning med ytterligare svar genom att klicka på den röda triangelmenyn bredvid Modellspecifikation och välja Spara i datatabell.
8. Använd SVEM framåtvalsmetoden för att passa den reducerade modellen, utan obligatorisk inkludering av blandningsfaktorns huvudeffekter, och lagra kolumnen förutsägelseformel i datatabellen.
   1. I dialogrutan Anpassa modell klickar du på Kör.
   2. För Uppskattningsmetod väljer du SVEM Forward Selection.
   3. Expandera menyerna Avancerade kontroller > Tvinga termer och avmarkera rutorna som är associerade med blandningens huvudeffekter. Endast rutan Fånga upp termen ska förbli markerad. Figur 10 visar standardinställningen där huvudeffekterna tvingas. I det här steget måste dessa rutor vara avmarkerade så att modellen kan inkludera eller exkludera dessa effekter baserat på förfarandet för framåtriktad markering.
   4. Klicka på Gå för att köra proceduren för SVEM Forward Selection.
9. Plotta de faktiska svaren med de förutsagda svaren från SVEM-modellen för att verifiera en rimlig prediktiv förmåga. (Figur 11). Klicka på den röda triangeln bredvid SVEM Forward Selection och välj Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Klicka på den röda triangeln bredvid SVEM Forward Selection och välj Spara kolumner > Save Prediction Formula för att skapa en ny kolumn som innehåller förutsägelseformeln i datatabellen.
11. Valfritt: Upprepa stegen ovan med SVEM-lasso som uppskattningsmetod för att avgöra om ett annat optimalt recept föreslås efter att du har utfört de efterföljande stegen. Om så är fallet, kör båda recepten som bekräftelsekörningar (diskuteras i avsnitt 5) för att se vilka som fungerar bäst i praktiken¹².
12. Upprepa stegen för att skapa modeller för varje svar.
13. När förutsägelsekolumnerna för alla svar har sparats i datatabellen visar du svarsspårningarna för alla predikterade svarskolumner med hjälp av profilerplattformen: Välj Diagram > Profilerar och välj alla förutsägelsekolumner som skapades i föregående steg för Y, Förutsägelseformel och klicka på OK (bild 12).
14. Identifiera kandidatens optimala formulering(ar).
    1. Definiera "önskvärdhetsfunktionen" för varje svar och ange om svaret ska maximeras, minimeras eller matchas med ett mål. Ange att primära svar ska använda prioritetsvikten 1,0 och eventuella sekundära svar ska använda prioritetsvikten 0,2. På den röda triangelmenyn Förutsägelseprofilering väljer du Optimering och önskvärdhet > Önskvärdhetsfunktioner och sedan Optimering och önskvärdhet > Ange önskvärdhet. Ange inställningarna i de efterföljande fönstren.
       OBS: De viktiga vikterna är relativa och subjektiva, så det är värt att kontrollera känsligheten hos det kombinerade optimum för förändringar i dessa vikter inom ett rimligt intervall (t.ex. från lika viktning till 1:5 viktning).
    2. Kommando profileraren för att hitta de optimala faktorinställningarna som maximerar önskvärdhetsfunktionen (bild 12): från profileraren väljer du Optimering och önskvärdhet > Maximera önskvärdhet.
       OBS: De förutsagda värdena för svaren hos de optimala kandidaterna kan överskatta värdet av rätt skeva svar såsom potens; Konfirmeringskörningarna kommer dock att ge mer exakta observationer av dessa kandidatformuleringar. Huvudsyftet är att hitta den optimala formuleringen ( inställningarna för det optimala receptet).
    3. Registrera de optimala faktorinställningarna och notera de viktiga viktningar som används för varje svar: på menyn Förutsägelseprofilering väljer du Faktorinställningar > Kom ihåg inställningar.
15. Valfritt: För kategoriska faktorer som joniserbar lipidtyp, hitta de villkorligt optimala formuleringarna för varje faktornivå.
    1. Ställ först in önskad nivå för faktorn i profileraren, håll sedan Ctrl-tangenten och vänsterklicka inuti diagrammet för den faktorn och välj Inställning av låsfaktorer. Välj Optimering och önskvärdhet > Maximera önskvärdhet för att hitta det villkorliga optimala med denna faktor låst vid dess aktuella inställning.
    2. Lås upp faktorinställningarna innan du fortsätter, med samma meny som används för att låsa faktorinställningarna.
16. Upprepa optimeringsprocessen efter att ha justerat svarens viktvikter (med hjälp av optimering och önskvärdhet > uppsättning önskvärdheter), kanske bara optimera de primära svaren eller ställa in några av de sekundära svaren för att ha mer eller mindre viktvikt, eller ställa in målet för de sekundära svaren till Ingen (figur 13).
17. Registrera den nya optimala kandidaten (på menyn Förutsägelseprofilering väljer du Faktorinställningar > Kom ihåg inställningar.)
18. Skapa grafiska sammanfattningar av de optimala regionerna i faktorutrymmet: generera en datatabell med 50 000 rader fyllda med slumpmässigt genererade faktorinställningar inom det tillåtna faktorutrymmet, tillsammans med motsvarande förutsagda värden från den reducerade modellen för vart och ett av svaren och den gemensamma önskvärdhetsfunktionen.
    1. I profileraren väljer du Slumpmässig utdatatabell. Ange Hur många körningar ska simuleras? till 50 000 och klicka på OK.
       OBS: Detta genererar en ny tabell med de förutsagda värdena för svaren vid var och en av de 50 000 formuleringarna. Kolumnen Önskvärdhet beror på prioritetsvikterna för de svar som finns på plats när alternativet Slumpmässig utdatatabell är markerat.
    2. I den nyligen skapade tabellen lägger du till en ny kolumn som beräknar percentilen för kolumnen Önskvärdhet. Använd den här percentilkolumnen i de ternära diagrammen i stället för den råa önskvärdhetskolumnen. Högerklicka på kolumnrubriken Önskvärdhet och välj Ny formelkolumn > Fördelnings- > kumulativ sannolikhet för att skapa en ny kolumn för Ackumulerad sannolikhet[Önskvärdhet].
    3. Generera grafiken som beskrivs i följande steg. Ändra färgschemat för grafiken upprepade gånger för att visa förutsägelserna för varje svar och för kolumnen Kumulativ sannolikhet[Önskvärdhet].
    4. Konstruera ternära diagram för de fyra lipidfaktorerna. I tabellen navigerar du till Diagram > Ternära diagram, väljer blandningsfaktorerna för X, Plottar och klickar på OK. Högerklicka i ett av diagrammen i resultatet, välj Radförklaring och välj sedan kolumnen för förväntat svar. Ändra rullgardinsmenyn Färger till Jet.
       OBS: Detta visar de bästa och sämsta regionerna med avseende på lipidfaktorerna. Figur 14 visar percentilerna för ledens önskvärdhet när man överväger att maximera potensen (betydelse = 1) och minimera storleken (betydelse = 0,2), medan medelvärdet över alla faktorer som inte visas på de ternära plotaxlarna. Figur 15 visar den råa förutsagda storleken. Det är också rimligt att bryta ner dessa grafer villkorligt på andra faktorer, såsom att skapa en distinkt uppsättning ternära diagram för varje joniserbar lipidtyp med ett lokalt datafilter (tillgängligt från den röda triangelmenyn bredvid Ternära diagram).
    5. På samma sätt kan du använda Graph > Graph Builder för att plotta de 50 000 färgkodade punkterna (som representerar unika formuleringar) mot icke-blandningsprocessfaktorerna, antingen individuellt eller gemensamt, och söka efter relationer mellan svaren och faktorerna. Leta efter de faktorinställningar som ger högst önskvärdhet. Utforska olika kombinationer av faktorer i grafiken.
       OBS: När du färglägger grafer, använd Kumulativ sannolikhet [Önskvärdhet], men när du plottar önskvärdheten på den vertikala axeln mot processfaktorer använder du den råa önskvärdhetskolumnen . Kolumnen Önskvärdhet kan också placeras på en axel i 3D-visualiseringen Graph > Scatterplot tillsammans med två andra processfaktorer för multivariat utforskning. Figur 16 visar den gemensamma önskvärdheten av alla formuleringar som kan bildas med var och en av de tre joniserbara lipidtyperna. De mest önskvärda formuleringarna använder H102, med H101 som ger några potentiellt konkurrenskraftiga alternativ.
    6. Spara profileraren och dess ihågkomna inställningar i datatabellen. Klicka på den röda triangeln bredvid Profiler och välj Spara skript > till datatabell....

Figur 8: Observerade potensavläsningar från experimentet. Punkterna visar potensvärdena som observerades från de 23 körningarna; De replikerade prestandamåttskörningarna visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 9: Programvarudialogruta för att initiera analysen. Kandidateffekterna har angetts tillsammans med målpotensresponsen och alternativet Ingen avlyssning har avmarkerats. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10. Ytterligare dialogruta för att ange SVEM-alternativ. Som standard tvingas lipidhuvudeffekterna in i modellen. Eftersom en avlyssning ingår rekommenderar vi att du avmarkerar dessa rutor för att inte tvinga effekterna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 11: Faktiskt per förutspådd yta. Denna figur plottar den observerade potensen mot det värde som förutsägs för varje formulering av SVEM-modellen. Korrelationen behöver inte vara lika stark som i det här exemplet, men förväntningen är att se åtminstone en måttlig korrelation och att kontrollera om det finns avvikande värden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 12: Förutsägelseprofiler. De två översta raderna med diagram visar segmenten för den förutsagda responsfunktionen vid den optimala formuleringen (som identifierats med SVEM-metoden). Den nedre raden av grafer visar formuleringens viktade "önskvärdhet", vilket är en funktion av den sista kolumnen i grafer som visar att styrkan bör maximeras och storleken bör minimeras. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 13: Tre optimala formuleringskandidater från SVEM-Forward Selection. Att ändra svarens relativa viktning kan leda till olika optimala formuleringar. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 14: Ternära diagram för percentilen av önskvärdhet. Diagrammet visar de 50 000 formuleringarna färgkodade efter percentil av önskvärdhet, där önskvärdheten är inställd med viktvikt på 1,0 för att maximera styrkan och 0,2 för att minimera storleken, dessa diagram visar att den optimala regionen av formuleringar består av lägre procentsatser joniserbar lipid och högre procentandelar av PEG. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 15: Ternära diagram för den förväntade storleken. Diagrammet visar storleksförutsägelserna från SVEM-modellen för var och en av de 50 000 formuleringarna. Storleken minimeras med högre procentandelar hjälparlipid och maximeras med lägre procentandelar hjälparlipid. Eftersom de andra faktorerna varierar fritt över de 50 000 plottade formuleringarna, innebär detta att detta förhållande gäller över intervallen för de andra faktorerna (PEG, flödeshastighet etc.). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 16: Violindiagram för önskvärdheten av formuleringar som involverar de tre olika joniserbara lipidtyperna. Var och en av de 50 000 punkterna representerar en unik formulering från hela det tillåtna faktorutrymmet. Topparna för dessa fördelningar är de maximala önskvärdhetsvärdena som beräknas analytiskt med förutsägelseprofileraren. H102 har den största toppen och ger därmed den optimala formuleringen. SVEM-metoden för att skapa modellen som genererar dessa utdata filtrerar automatiskt bort statistiskt obetydliga faktorer: syftet med denna graf är att överväga praktisk betydelse över faktornivåerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Bekräftelsen körs

1. Förbered en tabell med de optimala kandidater som identifierats tidigare (figur 17).
   OBS: Värdena för sann styrka och sann storlek i figur 17 fylls i med hjälp av de simulerade genereringsfunktionerna: i praktiken kommer dessa att erhållas genom att formulera och sedan mäta prestandan hos dessa recept.
   1. Inkludera benchmark-kontrollen med uppsättningen kandidatkörningar som kommer att formuleras och mätas.
   2. Om någon av formuleringarna från experimentet visade sig ge önskvärda resultat, kanske genom att överträffa riktmärket, välj det bästa att lägga till kandidattabellen och testa igen tillsammans med nya formuleringar.
      Lägg antingen till önskade körningar manuellt i kandidattabellen eller använd Ihågkomna inställningar i fönstret Profiler om körningarna kommer från föregående experiment. Identifiera körningens radnummer, navigera till Förutsägelseprofilerare > faktorinställningar > Ange till Data i rad och ange radnumret. Välj sedan Förutsägelseprofilering > faktorinställningar > Kom ihåg inställningar och etikett på lämpligt sätt (t.ex. "benchmark" eller "best run from the previous experiment").
   3. Högerklicka på tabellen Ihågkomna inställningar i profileraren och välj Gör till datatabell.
      Beroende på studiens prioritet och budget bör du överväga att köra repliker för varje bekräftelsekörning, särskilt om du ersätter prestandamåttet. Skapa och analysera varje formulering två gånger, med hjälp av det genomsnittliga resultatet för rangordning. Var uppmärksam på alla kandidater med ett brett svarsintervall över de två replikaten eftersom detta kan indikera hög processvarians.
   4. Om det är nödvändigt på grund av budgetbegränsningar, välj ner från de identifierade kandidaterna för att matcha experimentbudgeten eller för att eliminera överflödiga kandidater.
2. Utför bekräftelsekörningarna. Konstruera formuleringarna och samla avläsningarna.
3. Kontrollera överensstämmelsen mellan resultaten från det ursprungliga experimentet och resultaten för bekräftelsebatchen för riktmärken eller andra upprepade recept. Om det finns ett stort och oväntat skift, överväg vad som kan ha bidragit till skiftet och om det är möjligt att alla körningar från bekräftelsebatchen påverkades.
4. Jämför prestandan hos kandidatens optimala formuleringar. Undersök om några nya kandidater överträffade riktmärket.
5. Valfritt: Lägg till resultatet av bekräftelsekörningarna i experimenttabellen och kör analysen igen i avsnitt 4.
   OBS: Nästa steg i arbetsflödet ger instruktioner för att konstruera en uppföljningsstudie tillsammans med dessa körningar om så önskas.

Figur 17: Tabell över tio optimala kandidater som ska köras som bekräftelsekörningar. True Potency och True Size har fyllts i från simuleringsgenererande funktioner (utan någon extra process eller analytisk variation). Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Valfritt: Utforma en uppföljningsstudie som ska köras samtidigt med bekräftelsekörningarna

1. Bedöm behovet av en uppföljningsstudie med beaktande av följande kriterier:
   1. Bestäm om den optimala formuleringen ligger längs en av faktorgränserna och om ett andra experiment önskas expandera minst ett av faktorområdena.
   2. Utvärdera om det inledande experimentet använde en relativt liten körningsstorlek eller relativt stora faktorintervall och om det finns ett behov av att "zooma in" på den identifierade optimala regionen med ytterligare körningar och uppdaterad analys.
   3. Kontrollera om en ytterligare faktor införs. Detta kan vara en nivå av en kategorisk faktor såsom en ytterligare joniserbar lipid eller en faktor som förblev konstant i den initiala studien, till exempel buffertkoncentration.
   4. Om inget av ovanstående villkor är uppfyllt fortsätter du till steg 7.
2. Förbered dig för ytterligare experimentkörningar som ska utföras samtidigt med bekräftelsekörningarna.
   1. Definiera faktorgränserna som säkerställer en partiell överlappning med regionen från den inledande studien. Om ingen överlappning finns måste en ny studie utformas.
   2. Utveckla de nya experimentella körningarna med en rymdfyllande design. Välj DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
      OBS: För avancerade användare, överväga en D-optimal design via DOE > Custom Design.
   3. När utrymmesfyllningskörningarna har genererats införlivar du manuellt två eller tre körningar från det ursprungliga experimentet som ligger inom det nya faktorutrymmet. Distribuera dessa körningar slumpmässigt inom experimenttabellen med hjälp av stegen som beskrivs i avsnitt 2 för att lägga till rader och sedan slumpa radordningen.
      OBS: Dessa kommer att användas för att uppskatta eventuella förskjutningar i svarsmedlen mellan blocken.
   4. Sammanfoga bekräftelsekörningarna och den nya utrymmesfyllningen körs i en enda tabell och slumpa körningsordningen. Använd tabeller > sammanfoga och skapa och sortera sedan efter en ny slumpmässig kolumn för att slumpa körningsordningen, enligt beskrivningen i avsnitt 2.
3. Formulera de nya recepten och samla resultaten.
4. Sammanfoga de nya experimentkörningarna och resultaten till den ursprungliga experimentdatatabellen och introducera en experiment-ID-kolumn för att ange källan till varje resultat. Använd Tabeller > Sammanfoga och välj alternativet Skapa källkolumn.
5. Kontrollera att kolumnegenskaperna för varje faktor visar det kombinerade intervallet för båda studierna: högerklicka på kolumnrubriken för varje faktor och granska egenskapsintervallen för kodning och blandning , om sådana finns.
6. Börja analysera det nya experimentets resultat.
   1. Inkludera kolumnen experiment-ID som en term i modellen för att fungera som en blockerande faktor. Se till att denna term inte interagerar med studiefaktorerna. Kör dialogskriptet Anpassa modell som sparats i tabellen i avsnitt 4, markera kolumnen experiment-ID och klicka på Lägg till för att inkludera den i listan över kandidateffekter.
   2. Kör den här dialogrutan Anpassa modell i den sammanfogade datatabellen för att gemensamt analysera resultaten från det nya experimentet och den inledande studien. Följ tidigare instruktioner för att generera uppdaterade optimala formuleringskandidater och grafiska sammanfattningar.
   3. För validering, analysera självständigt resultaten från det nya experimentet, exklusive resultat från det första experimentet. Det vill säga utför stegen som beskrivs i avsnitt 4 på den nya experimenttabellen.
   4. Se till att optimala formuleringar som identifieras av dessa modeller ligger nära de som erkänns av den gemensamma analysen.
   5. Granska grafiska sammanfattningar för att bekräfta att både de gemensamma och individuella analyserna av de nya experimentella resultaten uppvisar liknande responsytbeteenden (vilket innebär att det finns ett liknande förhållande mellan svaret / svaren och faktorerna).
   6. Jämför de kombinerade och individuella analyserna av nya resultat med det första experimentet för konsistens. Använd liknande grafstrukturer för jämförelse och undersök de identifierade optimala recepten för skillnader.

7. Dokumentera studiens slutliga vetenskapliga slutsatser

1. Om benchmark-kontrollen ändras till ett nyligen identifierat recept på grund av studien, logga den nya inställningen och ange design- och analysfilerna som registrerar dess ursprung.
2. Underhålla alla experimentella tabeller och analyssammanfattningar, helst med datumstämplade filnamn, för framtida referens.

Representative Results

Detta tillvägagångssätt har validerats över båda brett klassificerade lipidtyper: MC3-liknande klassiska lipider och lipidoider (t.ex. C12-200), vanligtvis härledda från kombinatorisk kemi. Jämfört med en riktmärke LNP-formulering utvecklad med hjälp av en One Factor at a Time-metod (OFAT) visar kandidatformuleringarna som genereras genom vårt arbetsflöde ofta potensförbättringar på 4- till 5-faldig på en logaritmisk skala, såsom visas i leverluciferasavläsningarna i mus i figur 18. Tabell 1 visar motsvarande förbättringar i leverluciferasuttryck hos möss som observerats under benchmarkkontrollens prestanda under två optimeringsfaser (en inledande studie och en efterföljande uppföljningsstudie). I den första fasen låg fokus på att optimera lipidförhållandena samtidigt som andra faktorer hölls konstanta. I uppföljningsstudien introducerades ytterligare en hjälparlipidtyp och optimering utfördes med hänsyn till både lipidkvotsammansättningen och hjälparlipidtypen. Följaktligen valdes den nyligen introducerade hjälparlipidtypen för att användas med den tillhörande optimerade lipidkompositionen. Den signifikanta förbättringen av styrkan tyder på att dessa optimerade kompositioner kan uppvisa överlägsen endosomal flyktförmåga²⁵.

Simuleringar kan användas för att visa den förväntade kvaliteten på den optimala kandidaten som produceras genom denna procedur. Inom ramen för exempelexperimentet som används i protokollet kan vi upprepa simuleringen många gånger för olika körningsstorlekar och utvärdera resultaten enligt den simulerade processgenererande funktionen. Ett JMP-skript för detta ändamål finns i tilläggsfil 4. Specifikt genererades en utrymmesfyllande design och svarskolumnerna fylldes med värden från våra generatorfunktioner, plus brus som representerar analytisk och processvariation. Vi anpassar dessa simulerade svar med olika analystekniker (inklusive SVEM Forward Selection) för att producera ett motsvarande kandidatoptimalt recept. Kandidaterna från varje analysmetod jämförs sedan med värdet på det sanna optimum från de genererande funktionerna. Figur 19 illustrerar den genomsnittliga procentandelen av maximal teoretisk respons som uppnås med var och en av de tre analysmetoderna med hjälp av rymdfyllnadskonstruktioner av storlek angiven på den horisontella axeln. Den fullständiga modellen, som inkluderar alla kandidateffekter och inte reducerar modellen baserat på den statistiska signifikansen av dessa effekter, presterar sämst. Mycket av det merarbete som traditionellt går åt till att anpassa regressionsmodeller för blandningsprocessexperiment innebär modifieringar (avlägsnande av skärningspunkten, framtvingande av blandningens huvudeffekter, förhindrande av användning av rena kvadratiska blandningseffekter etc.) som krävs för att passa denna fullständiga modell⁹, och ur detta perspektiv är dessa förfaranden onödiga¹². Dessutom kan denna modell inte anpassas förrän designstorleken når antalet effekter i modellen. Vid mindre experimentella storlekar kan vi passa den traditionella framåtvalsmetoden, som överträffar hela modellen med avseende på den genomsnittliga prestandan för den optimala kandidatformuleringen för varje fast experimentell storlek. På samma sätt förbättrar SVEM-modifieringen av denna framåtriktade urvalsmetod ytterligare de optimala kandidaternas prestanda. Detta diagram visar att användning av SVEM-Forward Selection^12,13 för att analysera ett 24-kört rymdfyllningsexperiment uppnår samma genomsnittliga kvalitet som vanligtvis kräver 50 körningar när den analyseras med en traditionell framåtriktad markering (inriktning på minsta AICc) -modell. Även om den faktiska prestandan kommer att variera från process till process, visar denna simulering - tillsammans med publicerade resultat på SVEM 12,13,16,17,26 - potentialen i denna modelleringsprocedur för formuleringsoptimering.

Figur 18: Förbättring av leverluciferasuttryck efter två försöksomgångar. Omgång 0 visar leverluciferasavläsningen för referensformuleringen; Omgång 1 visar leverluciferasavläsningen efter det första experimentet som optimerar LNP-beståndsdelens lipidmolära förhållanden; Omgång 2 visar leverluciferasavläsningen efter det andra experimentet, vilket ytterligare optimerar de ingående molära förhållandena samtidigt som man överväger en ytterligare hjälparlipidtyp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 19: Kvaliteten på optimal formulering som en funktion av experimentell storlek och statistisk modell. Den vertikala axeln representerar procentandelen teoretisk maximal önskvärdhet, och den horisontella axeln representerar storleken på rymdfyllningsdesignen. Varje punkt visar medelvärdet över 150 simuleringar. Den blå linjen (trianglar) representerar hela modellen (utan eliminering av statistiskt obetydliga effekter), den gula (cirklar) linjen representerar den traditionella AICc-baserade framåtvalsmodellen (med en skärningspunkt och utan att tvinga blandningens huvudeffekter) och den gröna linjen (upp och ner trianglar) representerar den SVEM-baserade framåtvalsmodellen (med en skärningspunkt och utan att tvinga blandningens huvudeffekter). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Rund	Partikel-ID	Luciferasuttryck i levern (foton/sek)
0	Riktmärke för kontroll	8.E+06
1	Optimerad över lipidförhållanden	2.E+09
2	Optimerad över lipidförhållanden och hjälparlipidtyp	8.E+10

Tabell 1: Systematisk förbättring av luciferasuttryck genom optimering av Design of Experiment (DOE). Denna tabell illustrerar den signifikanta förbättringen av uttrycket av luciferas, med en upp till 10 000-faldig förbättring på foton/sekund-skalan, från det ursprungliga riktmärket till den slutliga "optimala kandidaten".

Kompletterande fil 1: 04APR2023 Sammanfattning.docx - Detta dokument ger en redogörelse för studien inklusive dess syfte, de bedömda svaren, de faktorer som beaktas och det totala antalet körningar som utförts. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - En JMP-fil med det simulerade experimentet och dess resultat. Den här filen innehåller även bifogade analysskript som är kompatibla med JMP 17 Pro. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - En Excel-fil som innehåller det simulerade experimentet och dess resultat, lämplig för läsare som kanske inte har tillgång till JMP. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: blandningssimulering 20DEC22.jsl - Detta är ett JMP 17 Pro-skript som används för att simulera LNP-formuleringsexperiment och utvärdera prestanda för olika analysmetoder. Skriptet använder metoden SVEM-Forward Selection (no intercept), som är den viktigaste analysmetoden som används i det här arbetsflödet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Modern programvara för design och analys av blandningsprocessexperiment gör det möjligt för forskare att förbättra sina lipidnanopartikelformuleringar i ett strukturerat arbetsflöde som undviker ineffektiva OFAT-experiment. Den nyligen utvecklade SWEM-modelleringsmetoden eliminerar många av de mystiska regressionsmodifieringarna och modellreduktionsstrategierna som tidigare kan ha distraherat forskare med främmande statistiska överväganden. När resultaten har samlats in erbjuder SWEM-analysramen ett tillvägagångssätt som både är lättare att implementera och tenderar att producera bättre modeller än traditionella modelleringsmetoder¹³. Dessutom är de grafiska analyserna som är baserade på prediktionsformlerna för varje svar lätt att tolka av forskare, vilket ger en tydlig sammanfattning av responsens marginella beteende över enskilda faktorer såväl som små grupper av faktorer utan att kräva tolkning av starkt korrelerade parameteruppskattningar från en regressionsmodell. Detta gör det möjligt för forskare att fokusera på att bedöma praktisk betydelse över studiefaktorer efter att SVEM automatiskt har tagit bort statistiskt obetydliga effekter.

Arbetsflödet har använts i praktiken för att systematiskt variera lipidsammansättning och formuleringsparametrar såsom N/P-förhållande, flödeshastighet och blandningsförhållande för optimering och för att välja de bästa hjälparlipidtyperna, joniserbara lipidtyper och bufferttyper. Målen i dessa exempel inkluderar vanligtvis att maximera in vivo- eller in vitro-styrkan och kapsla in varierande nyttolaster som mRNA eller DNA för relevanta in vivo-mål som leverceller, eller ibland över flera celltyper vid in vitro-applikationer. För specifika applikationer kan vi behöva balansera biofysiska egenskaper som storlek, PDI, zetapotential och procentuell inkapsling när vi undersöker in vivo-potens. Dessutom är målet att hitta en potent, men ändå väl tolererad formulering och så kan vi inkludera svar som förändring i kroppsvikt, cytokinrespons eller elicitering av leverenzymer såsom AST / ALAT i analysen. Mönster har framkommit från många LNP-experiment. I synnerhet verkar förändringar i molförhållandet mellan den joniserbara lipiden och N / P-förhållandet signifikant påverka RNA-inkapsling. Dessutom verkar förändringar i PEG-molförhållandet påverka partikelstabiliteten, vilket indikeras av påverkan på storlek och PDI. I allmänhet tenderar ett överskott av PEG i LNP-kärnan att ha en skadlig effekt på styrkan hos möss.

Prestandaförbättringar är särskilt märkbara när mer än ett svar är riktat: även om riktmärket redan fungerar bra med avseende på det primära svaret (t.ex. potens), upprätthåller eller förbättrar gemensam optimering vanligtvis beteendet med avseende på det primära svaret samtidigt som beteendet förbättras med avseende på andra svar (minimerar PDI, storlek eller viktminskning). Vi validerar äktheten av dessa förbättringar med bekräftelsekörningar, där vi förbereder och direkt jämför referensformuleringen (eventuellt med en replikat) och nya kandidatformuleringar.

Designfasen för det här arbetsflödet har flera viktiga steg. Kontrollera först att faktorerna och deras intervall är korrekt inmatade i den rymdfyllande designplattformen. För det andra, använd grafik och ämneskunskap för att bekräfta genomförbarheten av varje resulterande formulering innan experimentet påbörjas. Slutligen utför du experimentet enligt den slumpmässiga ordning som anges av designtabellen. Att följa denna sekvens hjälper till att förhindra ouppmätta kovariater - såsom formuleringsproduktionens ordning eller omgivningstemperatur - från att förvirra de faktorer som studeras. De utrymmesfyllande designerna är lättare att konstruera - med mindre risk för användarfel än optimala blandningsprocessdesigner, vilket kräver extra beslut under installationen som kan frustrera oerfarna användare och avskräcka dem från att använda designade experiment. Men efter att ha arbetat igenom detta protokoll kan forskare dra nytta av ytterligare läsning om hur optimala mönster potentiellt kan ersätta rymdfyllande mönster i protokollet, såsom beskrivs i kapitel 6 i Goos and Jones (2011) ²⁷. Speciellt för uppföljningsstudier som "zoomar in" på en optimal region - där det finns mindre oro för fel längs blandningsgränserna - kan D-optimala konstruktioner vara effektivare än rymdfyllande mönster.

På samma sätt har analysfasen i det här arbetsflödet flera kritiska steg. Se först till att modellen specificerar en lämplig uppsättning kandidateffekter, inklusive interaktioner, snarare än bara de viktigaste (första ordningens) effekterna av faktorerna. För det andra, använd SVEM Forward Selection som modelleringsramverk. För det tredje, inaktivera standardalternativet Ingen avlyssning och undvik att tvinga blandningens huvudeffekter. Slutligen, ställ in önskvärdhetsfunktionerna för svaren korrekt innan du påbörjar optimeringen. För användare utan åtkomst till SVEM är det bästa sättet att använda traditionellt framåtval (med inriktning på lägsta AICc) för regressionsproblemet¹². Protokollet nämner att det också är möjligt att använda SVEM Lasso: i genomsnitt ger detta tillvägagångssätt liknande resultat som SVEM Forward Selection, men för vissa dataset kan de två metoderna producera något olika optimala formuleringar som kan jämföras med bekräftelsekörningar¹². SVEM Lasso kommer dock att ge sämre modelleringsresultat om användaren gör det enkla misstaget att glömma att inaktivera standardalternativet Ingen avlyssning ¹²: av denna anledning har vi använt SVEM Forward Selection som standardmetod, eftersom det är mer robust för det här alternativet.

Den primära begränsningen med denna metod är att det kommer att finnas enstaka studier med större komplexitet som kommer att dra nytta av hjälp av en statistiker för design och analys. Situationer där körningsbudgeten är mer begränsad än vanligt (under minimiheuristiken), svaren är binära, det finns ett stort antal kategoriska faktorer eller nivåer av en enda kategorisk faktor, där ett forskningsmål är att överväga att eliminera en eller flera blandningsfaktorer från receptet, eller där det finns ytterligare begränsningar för faktorutrymmet kan hanteras annorlunda av en statistiker, till exempel genom att använda optimal eller hybrid^12,28 mönster eller genom att lägga till ytterligare struktur till designen. Specifikt kan en hybriddesign bildas genom att skapa en rymdfyllande design med de flesta budgeterade körningarna och sedan "förstärka" designen med de återstående körningarna (vanligtvis 2-4) med hjälp av ett D-optimalt kriterium. En annan hybridmetod är att generera en rymdfyllande design över blandningen (lipid) och kontinuerliga (process) faktorer, och sedan lägga till eventuella kategoriska faktorer med hjälp av en "optimal" fördelning av faktornivåer. Ändå har den förenklade utrymmesfyllande designmetoden som tagits i protokollet utvecklats under de senaste åren i processen att köra dussintals LNP-formuleringsoptimeringsexperiment, och vi tror att det erbjuder ett robust tillvägagångssätt som kommer att fungera framgångsrikt i de flesta fall samtidigt som det ger forskare förtroende för deras förmåga att använda designade experiment.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC