Um fluxo de trabalho para otimização de formulação de nanopartículas lipídicas (LNP) usando experimentos de processo de mistura projetados e modelos de conjunto autovalidados (SVEM)

Summary

Este protocolo fornece uma abordagem para otimização de formulação sobre fatores de estudo de mistura, contínuos e categóricos que minimiza escolhas subjetivas na construção do planejamento experimental. Para a fase de análise, um procedimento de ajuste de modelagem eficaz e fácil de usar é empregado.

Abstract

Apresentamos uma abordagem no estilo Quality by Design (QbD) para otimizar formulações de nanopartículas lipídicas (LNP), com o objetivo de oferecer aos cientistas um fluxo de trabalho acessível. A restrição inerente a esses estudos, onde as razões molares de lipídios ionizáveis, auxiliares e PEG devem somar até 100%, requer planejamento especializado e métodos de análise para acomodar essa restrição de mistura. Com foco nos fatores lipídicos e de processo que são comumente usados na otimização do projeto LNP, fornecemos etapas que evitam muitas das dificuldades que tradicionalmente surgem no projeto e na análise de experimentos de processo de mistura, empregando projetos de preenchimento de espaço e utilizando a estrutura estatística recentemente desenvolvida de modelos de conjunto autovalidados (SVEM). Além de produzir formulações ótimas candidatas, o fluxo de trabalho também constrói resumos gráficos dos modelos estatísticos ajustados que simplificam a interpretação dos resultados. As formulações candidatas recém-identificadas são avaliadas com provas de confirmação e, opcionalmente, podem ser conduzidas no contexto de um estudo de segunda fase mais abrangente.

Introduction

Formulações de nanopartículas lipídicas (LNP) para sistemas de liberação gênica in vivo geralmente envolvem quatro lipídios constituintes das categorias de lipídios ionizáveis, auxiliares e PEG ^1,2,3. Quer esses lipídios estejam sendo estudados isoladamente ou simultaneamente com outros fatores não-misturados, experimentos para essas formulações requerem desenhos de "mistura", porque - dada uma formulação candidata - aumentar ou diminuir a proporção de qualquer um dos lipídios leva necessariamente a uma diminuição ou aumento correspondente na soma das proporções dos outros três lipídios.

Para ilustração, supõe-se que estamos otimizando uma formulação de LNP que atualmente usa uma receita definida que será tratada como referência. O objetivo é maximizar a potência do LNP e, secundariamente, minimizar o tamanho médio das partículas. Os fatores de estudo que são variados no experimento são as razões molares dos quatro lipídios constituintes (ionizável, colesterol, DOPE, PEG), a relação N:P, a taxa de fluxo e o tipo de lipídio ionizável. Os lipídios ionizáveis e auxiliares (incluindo o colesterol) podem variar em uma faixa mais ampla de razão molar, 10-60%, do que o PEG, que será variado de 1-5% nesta ilustração. A receita de formulação de referência e os intervalos dos outros fatores e sua granularidade de arredondamento são especificados no Arquivo Suplementar 1. Para este exemplo, os cientistas são capazes de realizar 23 corridas (lotes únicos de partículas) em um único dia e gostariam de usar isso como tamanho de amostra se atender aos requisitos mínimos. Os resultados simulados para este experimento são fornecidos no Arquivo Suplementar 2 e no Arquivo Suplementar 3.

Rampado e Peer⁴ publicaram um artigo de revisão recente sobre o tema de experimentos projetados para a otimização de sistemas de liberação de fármacos baseados em nanopartículas. Kauffman et ^al.5 consideraram estudos de otimização do LNP utilizando desenhos fatoriais fracionários e triagem definitiva⁶; no entanto, esses tipos de delineamentos não podem acomodar uma restrição de mistura sem recorrer ao uso de "variáveis folgadas" ^{ineficientes7} e não são tipicamente usados quando fatores de mistura estão presentes ^7,8. Em vez disso, "projetos ótimos" capazes de incorporar uma restrição de mistura são tradicionalmente usados para experimentos de processo de mistura⁹. Esses desenhos visam uma função especificada pelo usuário dos fatores de estudo e só são ótimos (em um dos vários sentidos possíveis) se essa função capturar a verdadeira relação entre os fatores de estudo e as respostas. Note-se que há uma distinção no texto entre "desenhos ótimos" e "candidatos a formulações ótimas", sendo que este último se refere às melhores formulações identificadas por um modelo estatístico. Os projetos ideais vêm com três desvantagens principais para experimentos de processo de mistura. Primeiro, se o cientista não conseguir antecipar uma interação dos fatores de estudo ao especificar o modelo-alvo, então o modelo resultante será enviesado e poderá produzir formulações candidatas inferiores. Em segundo lugar, os projetos ideais colocam a maioria das corridas no limite externo do espaço do fator. Em estudos de LNP, isso pode levar a um grande número de corridas perdidas se as partículas não se formarem corretamente em quaisquer extremos das configurações lipídicas ou de processo. Em terceiro lugar, os cientistas geralmente preferem fazer ensaios experimentais no interior do espaço fatorial para obter uma noção independente do modelo da superfície de resposta e observar o processo diretamente em regiões anteriormente inexploradas do espaço fatorial.

Um princípio de projeto alternativo é visar uma cobertura uniforme aproximada do espaço do fator (com restrição de mistura) com um projeto de preenchimento de espaço¹⁰. Esses desenhos sacrificam alguma eficiência experimental em relação aos desenhos ótimos⁹ (assumindo que todo o espaço fatorial leva a formulações válidas), mas apresentam vários benefícios em um trade-off que são úteis nesta aplicação. O projeto de preenchimento de espaço não faz suposições a priori sobre a estrutura da superfície de resposta; Isso lhe dá a flexibilidade de capturar relações inesperadas entre os fatores do estudo. Isso também simplifica a geração de design porque não requer a tomada de decisões sobre quais termos de regressão adicionar ou remover à medida que o tamanho de execução desejado é ajustado. Quando alguns pontos de projeto (receitas) levam a formulações fracassadas, os projetos de preenchimento de espaço tornam possível modelar o limite de falha sobre os fatores de estudo, ao mesmo tempo em que apoiam modelos estatísticos para as respostas do estudo sobre as combinações de fatores bem-sucedidas. Finalmente, a cobertura interior do espaço do fator permite a exploração gráfica independente do modelo da superfície de resposta.

Para visualizar o subespaço do fator de mistura de um experimento de processo de mistura, são usadas "parcelas ternárias" triangulares especializadas. A Figura 1 motiva esse uso: no cubo de pontos onde três ingredientes podem variar de 0 a 1, os pontos que satisfazem uma restrição de que a soma dos ingredientes é igual a 1 são destacados em vermelho. A restrição de mistura nos três ingredientes reduz o espaço de fator viável a um triângulo. Em aplicações de LNP com quatro ingredientes de mistura, produzimos seis gráficos ternários diferentes para representar o espaço fatorial plotando dois lipídios de cada vez contra um eixo "Outros" que representa a soma dos outros lipídios.

Figura 1: Regiões do fator triangular. No gráfico de preenchimento de espaço dentro do cubo, os pequenos pontos cinzas representam formulações que são inconsistentes com a restrição de mistura. Os pontos vermelhos maiores encontram-se em um triângulo inscrito dentro do cubo e representam formulações para as quais a restrição de mistura é satisfeita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além dos fatores de mistura lipídica, muitas vezes há um ou mais fatores de processo contínuos, como relação N:P, concentração de tampão ou taxa de fluxo. Fatores categóricos podem estar presentes, como tipo de lipídio ionizável, tipo de lipídio auxiliar ou tipo de tampão. O objetivo é encontrar uma formulação (uma mistura de lipídios e ajustes para fatores de processo) que maximize alguma medida de potência e/ou melhore características físico-químicas, como minimizar o tamanho das partículas e o PDI (índice de polidispersidade), maximizar o encapsulamento percentual e minimizar efeitos colaterais - como perda de peso corporal - em estudos in vivo . Mesmo quando se parte de uma receita de referência razoável, pode haver interesse em reotimizar dada uma mudança na carga útil genética ou ao considerar mudanças nos fatores de processo ou tipos lipídicos.

Cornell⁷ fornece um texto definitivo sobre os aspectos estatísticos dos experimentos de mistura e processo de mistura, com Myers et ^al.9 fornecendo um excelente resumo dos tópicos mais relevantes de planejamento e análise de misturas para otimização. No entanto, esses trabalhos podem sobrecarregar os cientistas com detalhes estatísticos e com terminologia especializada. O software moderno para o projeto e análise de experimentos fornece uma solução robusta que suportará suficientemente a maioria dos problemas de otimização do LNP sem ter que apelar para a teoria relevante. Embora estudos mais complicados ou de alta prioridade ainda se beneficiem da colaboração com um estatístico e possam empregar projetos ótimos em vez de de preenchimento de espaço, nosso objetivo é melhorar o nível de conforto dos cientistas e incentivar a otimização de formulações LNP sem apelar para testes ineficientes de um fator de cada vez (OFAT)¹¹ ou simplesmente se contentar com a primeira formulação que satisfaça as especificações.

Neste artigo, é apresentado um fluxo de trabalho que utiliza software estatístico para otimizar um problema genérico de formulação de LNP, abordando problemas de projeto e análise na ordem em que serão encontrados. Na verdade, o método funcionará para problemas gerais de otimização e não se restringe aos LNPs. Ao longo do caminho, várias questões comuns que surgem são abordadas e recomendações são fornecidas que são fundamentadas na experiência e nos resultados da simulação¹². A estrutura recentemente desenvolvida de modelos de conjunto autovalidados (SVEM)¹³ melhorou muito a abordagem de outra forma frágil para analisar resultados de experimentos de processo de mistura, e usamos essa abordagem para fornecer uma estratégia simplificada para otimização de formulação. Enquanto o fluxo de trabalho é construído de uma maneira geral que poderia ser seguida usando outros pacotes de software, o JMP 17 Pro é único em oferecer SVEM juntamente com as ferramentas de resumo gráfico que achamos necessárias para simplificar a análise arcana de experimentos de processo de mistura. Como resultado, instruções específicas do JMP também são fornecidas no protocolo.

O SVEM emprega a mesma base de modelo de regressão linear que a abordagem tradicional, mas nos permite evitar modificações tediosas que são necessárias para ajustar um "modelo completo" de efeitos candidatos usando uma abordagem de base de seleção direta ou seleção penalizada (Lasso). Além disso, o SVEM fornece um ajuste aprimorado de "modelo reduzido" que minimiza o potencial de incorporação de ruído (processo mais variância analítica) que aparece nos dados. Ele funciona pela média dos modelos previstos resultantes da reponderação repetida da importância relativa de cada corrida no modelo 13,14,15,16,17,18. O SVEM fornece uma estrutura para modelar experimentos de processo de mistura que é mais fácil de implementar do que a regressão de tiro único tradicional e produz candidatos à formulação ótima de melhor qualidade^12,13. Os detalhes matemáticos do SVEM estão além do escopo deste artigo e mesmo um resumo superficial além da revisão da literatura relevante desviaria a atenção de sua principal vantagem nesta aplicação: ele permite um procedimento simples, robusto e preciso de clique para executar para os praticantes.

O fluxo de trabalho apresentado é consistente com a abordagem Quality by Design (QbD)¹⁹ para o desenvolvimento^{farmacêutico20}. O resultado do estudo será a compreensão da relação funcional que vincula os atributos do material e os parâmetros do processo aos atributos críticos da qualidade (CQAs)²¹. Daniel et ^al.22 discutem o uso de um framework QbD especificamente para a produção de plataformas de RNA: nosso fluxo de trabalho poderia ser usado como uma ferramenta dentro desse framework.

Protocol

O experimento descrito na seção Resultados Representativos foi realizado de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes estabelecidas pela nossa Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Camundongos Balb/C fêmeas com 6-8 semanas de idade foram obtidas comercialmente. Os animais receberam ração padrão ad libitum e água e foram alojados em condições padrão com ciclos claro/escuro de 12 horas, a uma temperatura de 65-75 °F (~18-23 °C) com 40-60% de umidade.

1. Registro do objetivo, respostas e fatores do estudo

NOTA: Ao longo deste protocolo, o JMP 17 Pro é usado para projetar e analisar o experimento. Software equivalente pode ser usado seguindo etapas semelhantes. Para obter exemplos e instruções adicionais para todas as etapas executadas na Seção 1, consulte o Arquivo Suplementar 1.

1. Resuma o objetivo do experimento em um documento com carimbo de data.
2. Liste as respostas primárias (CQAs) que serão medidas durante o experimento.
3. Liste quaisquer respostas secundárias (por exemplo, restrições a jusante nas propriedades físico-químicas) que possam ser medidas.
4. Listar parâmetros de processo que podem estar relacionados às respostas, incluindo aqueles que são mais relevantes para o objetivo do estudo.
5. Se o estudo for executado ao longo de vários dias, inclua um fator de "bloqueio" categórico de dia.
   NOTA: Isso equilibra as configurações de fatores ao longo dos dias para evitar que as mudanças de nível de dia na média do processo sejam confundidas com os fatores de estudo.
6. Selecionar os fatores a serem variados e aqueles a serem mantidos constantes durante o estudo.
   NOTA: Use ferramentas de priorização de risco, como análises de efeitos de modo de falha²⁰ , para selecionar o subconjunto de fatores mais relevante (Figura 2). Normalmente, todos os lipídios devem ser permitidos a variar; embora em alguns casos com restrições orçamentárias, seja razoável bloquear o PEG em uma proporção fixa.
7. Estabeleça os intervalos para os fatores variáveis e a precisão decimal relevante para cada um.
8. Decida o tamanho do desenho do estudo (o número de lotes únicos de partículas) usando as heurísticas mínima e máxima. As execuções de benchmark de controle incluídas manualmente não contam para o tamanho de execução recomendado pela heurística.
   Observação : as heurísticas a seguir assumem que as respostas são contínuas. A heurística mínima pressupõe que será possível realizar um estudo de acompanhamento, se necessário, além de realizar corridas de confirmação para formulações ótimas candidatas. Se for viável apenas executar execuções de confirmação, então é melhor orçar o número de execuções obtidas a partir da heurística máxima. Para respostas primárias binárias, procure ajuda de um estatístico para determinar o número apropriado de execuções.
   1. Heurística mínima: Aloque três execuções por fator de mistura, duas por fator de processo contínuo e uma por nível de cada fator categórico.
      NOTA: Para um estudo com quatro fatores lipídicos, dois contínuos e uma variável de processo categórica de três vias, isso leva a uma sugestão de (3 x 4) + (2 x 2) + 3=19 corridas de preenchimento de espaço. Adicione execuções adicionais se algumas provavelmente falharão devido a problemas de formulação ou medição.
   2. Heurística máxima: Inicie o software para construir projetos ideais e insira os parâmetros necessários para uma segunda ordem (incluindo efeitos principais, interações bidirecionais entre todos os efeitos e efeitos quadráticos para fatores de processo contínuos). Calcule o tamanho mínimo de execução de acordo com o algoritmo do software. Adicione 1 ao resultado obtido do software para definir a heurística máxima.
      Observação : consulte o arquivo suplementar 1 para obter instruções detalhadas sobre como executar essas etapas. Um caso de amostra com quatro fatores lipídicos, dois contínuos e uma variável de processo categórica de três vias, leva a um tamanho de execução recomendado de 34 (33 da recomendação do software + 1). Qualquer corrida além disso provavelmente seria melhor usada para estudos de confirmação ou acompanhamento.

Figura 2: Diagrama de causa e efeito. O diagrama mostra fatores comuns em um problema de otimização de formulação LNP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Criação da mesa de design com um design de preenchimento de espaço

1. Abra o JMP e navegue na barra de menus até DOE > Special Purpose > Space Filling Design.
2. Insira as respostas do estudo (consulte Arquivo Suplementar 1).
3. Opcional: adicione colunas para respostas adicionais, indicando se cada uma deve ser maximizada, minimizada ou direcionada clicando em Adicionar Resposta.
   Observação : essas configurações podem ser modificadas posteriormente e não afetam o design. Da mesma forma, colunas adicionais para respostas adicionais podem ser adicionadas após a criação da tabela de design.
4. Insira os fatores de estudo e os intervalos correspondentes. Use o botão Mistura para adicionar fatores de mistura, o botão Contínuo para adicionar fatores contínuos ou o botão Categórico para adicionar fatores categóricos.
   NOTA: Este estudo de exemplo usa os fatores e intervalos ilustrados na Figura 3, que incluem a razão molar ionizável (variando entre 0,1 e 0,6), a razão molar auxiliar (também entre 0,1 e 0,6), a razão molar colesterol (entre 0,1 e 0,6), a razão molar PEG (de 0,01 a 0,05) e o tipo de lipídio ionizável (que pode ser H101, H102 ou H103).
5. Insira o número predeterminado de execuções para o design no campo Número de Execuções .
6. Opcional: aumente o Tamanho Médio do Cluster do padrão de 50 para 2000 por meio do menu triângulo vermelho ao lado do cabeçalho Design de Preenchimento de Espaço e no submenu Opções Avançadas .
   NOTA: Esta é uma configuração para o algoritmo de preenchimento de espaço que pode levar a uma construção de projeto ligeiramente melhor ao custo de tempo computacional adicional.
7. Gere a tabela de design de preenchimento de espaço para os fatores escolhidos e o tamanho da execução. Clique em Preenchimento Rápido Flexível e, em seguida, clique em Criar Tabela.
   Observação : as duas primeiras execuções de um design de exemplo são mostradas na Figura 4.
8. Adicione uma coluna Anotações à tabela para anotar todas as execuções criadas manualmente. Clique duas vezes no primeiro cabeçalho de coluna vazio para adicionar uma coluna e, em seguida, clique duas vezes no novo cabeçalho de coluna para editar o nome.
9. Se aplicável, incorpore manualmente as execuções de controle de benchmark na tabela de design. Inclua uma réplica para um dos benchmarks de controle. Marque o nome do benchmark na coluna Notes e codifique as linhas de replicação do benchmark para facilitar a identificação do gráfico.
   1. Adicione uma nova linha clicando duas vezes no cabeçalho da primeira linha vazia e insira as configurações do fator de referência. Duplique essa linha para criar uma réplica do benchmark. Realce ambas as linhas e navegue até Linhas > Cores para atribuir uma cor para fins gráficos.
      NOTA: A réplica fornece uma estimativa independente de modelo do processo mais a variância analítica e fornecerá informações gráficas adicionais.
10. Se qualquer execução de controle de referência exceder o intervalo dos fatores de estudo, denote isso na coluna "Notas" para futura exclusão da análise.
11. Arredondar os fatores de mistura para a granularidade apropriada. Para isso,
    1. Realce os cabeçalhos de coluna dos fatores de mistura, clique com o botão direito do mouse em um dos cabeçalhos de coluna e navegue até Nova Coluna de Fórmula > Transformar > Rodada..., insira o intervalo de arredondamento correto e clique em OK.
    2. Verifique se nenhuma linha está selecionada clicando no triângulo inferior na interseção de cabeçalhos de linha e coluna.
    3. Copie os valores das colunas arredondadas recém-criadas (Ctrl + C) e cole (Ctrl + V) nas colunas de mistura originais. Finalmente, exclua as colunas de valor arredondado temporárias.
12. Depois de arredondar as proporções lipídicas, verifique se sua soma é igual a 100% selecionando os cabeçalhos de coluna para os fatores de mistura, clicando com o botão direito do mouse em um e indo para Nova Coluna de Fórmula > Combinar > Soma. Se a soma de qualquer linha não for igual a 1, ajuste manualmente um dos fatores de mistura, garantindo que a configuração do fator permaneça dentro do intervalo de fatores. Exclua a coluna de soma depois que os ajustes forem feitos.
13. Siga o mesmo procedimento usado para arredondar os fatores de mistura para arredondar os fatores de processo para sua respectiva granularidade.
14. Formate as colunas lipídicas para exibir como porcentagens com o número desejado de decimais: selecione os cabeçalhos das colunas, clique com o botão direito do mouse e escolha Padronizar atributos.... Na próxima janela, defina Formatar como Porcentagem e ajuste o número de decimais conforme necessário.
15. Se forem adicionadas execuções manuais, como benchmarks, randomize novamente a ordem das linhas da tabela: adicione uma nova coluna com valores aleatórios (clique com o botão direito do mouse no cabeçalho da última coluna e selecione Nova Coluna de Fórmula > Aleatório > Aleatório Normal). Classifique essa coluna em ordem crescente clicando com o botão direito do mouse no cabeçalho da coluna e exclua a coluna.
16. Opcional: adicione uma coluna Run ID . Preencha isso com a data atual, o nome do experimento e o número da linha da tabela.
    NOTA: Consulte (Figura 5) para obter um exemplo.
17. Gere gráficos ternários para visualizar os pontos de delineamento sobre os fatores lipídicos (Figura 6). Além disso, examine a distribuição de execução sobre os fatores de processo (Figura 7): selecione Gráfico > Gráfico ternário. Selecione apenas os fatores de mistura para X, Plotagem.
18. Para examinar a distribuição sobre os fatores de processo, selecione Analisar > Distribuição e insira os fatores de processo para Y, Colunas.
    NOTA: O cientista da formulação deve confirmar a viabilidade de todas as corridas. Se existirem execuções inviáveis, reinicie o design considerando as restrições recém-descobertas.

Figura 3: Fatores e intervalos do estudo. Capturas de tela de configurações dentro do software experimental são úteis para reproduzir a configuração do estudo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Saída inicial para um projeto de preenchimento de espaço. Mostrando as duas primeiras linhas da tabela, as configurações precisam ser arredondadas para a precisão desejada, ao mesmo tempo em que se certifica de que as quantidades de lipídio somem 1. O benchmark foi adicionado à tabela manualmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Tabela de estudo formatada. Os níveis de fator foram arredondados e formatados e uma coluna Run ID foi adicionada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Pontos de projeto em um gráfico ternário. As 23 formulações são mostradas em função das razões Ionizable, Helper e "Others" correspondentes (Colesterol+PEG). O ponto verde no centro representa a razão molar de referência 33:33:33:1 de Ionizable (H101):Colesterol:Helper (DOPE):P EG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Distribuição dos fatores de processo não misturados no experimento. Os histogramas mostram como os ensaios experimentais são espaçados entre o Tipo de Lipídio Ionizável, a Razão N:P e a Taxa de Fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Executando o experimento

1. Execute o experimento na ordem fornecida pela tabela de design. Registre as leituras nas colunas embutidas na tabela experimental.
2. Se forem realizados vários ensaios para a mesma resposta em um lote de formulação idêntico, calcule uma média para esses resultados dentro de cada lote. Adicione uma coluna para cada medida de ensaio à tabela.
   1. Para obter uma média, selecione todas as colunas relacionadas, clique com o botão direito do mouse em um dos cabeçalhos de coluna selecionados e escolha Nova Coluna de Fórmula > Combinar > Média. Use esta coluna Média para análises futuras de respostas.
      NOTA: Sem começar a receita de novo, as medições de ensaio repetidas apenas capturam a variância do ensaio e não constituem réplicas independentes.
3. Documente qualquer ocorrência de precipitação da formulação ou problemas de tolerabilidade in vivo (como perda de peso corporal grave ou morte) com indicadores binários (0/1) em uma nova coluna para cada tipo de problema.

4. Análise dos resultados experimentais

1. Plote as leituras e examine as distribuições das respostas: abra o Graph > Graph Builder e arraste cada resposta para a área Y para gráficos individuais. Repita isso para todas as respostas.
2. Examine a distância relativa entre as execuções de réplica codificadas por cores, se uma foi incluída. Isso permite a compreensão da variação total (processual e analítica) no benchmark em comparação com a variabilidade devido a mudanças nas configurações dos fatores em todo o espaço fatorial (Figura 8).
3. Determine se a resposta bruta deve ser modelada ou se uma transformação deve ser usada. Para respostas que são restritas a serem positivas, mas não são limitadas acima (por exemplo, potência), ajuste uma distribuição normal e uma distribuição lognormal aos resultados experimentais. Se a distribuição lognormal se encaixar melhor com um AICc (Critério de Informação de Akaike corrigido) mais baixo, faça uma transformação de log dessa resposta.
   1. Navegue até Analisar > distribuição e selecione a resposta para Y, Colunas. No relatório de distribuição resultante, clique no triângulo vermelho ao lado do nome da resposta e escolha Ajuste Contínuo > Ajuste Normal e Ajuste Contínuo > Ajuste Lognormal no menu suspenso. No relatório Comparar distribuições subsequente, verifique os valores AICc para verificar qual distribuição se ajusta melhor à resposta.
   2. Para executar uma transformação de log, clique com o botão direito do mouse no cabeçalho da coluna de resposta e selecione Nova Coluna de Fórmula > Log > Log. Quando um modelo é criado e uma coluna de previsão na escala de log é salva, transforme a resposta de volta para a escala original selecionando Nova Coluna de Fórmula > Log > Exp.
   3. Para respostas de proporções limitadas entre 0 e 1, compare o ajuste de uma distribuição normal e beta. Se a distribuição beta tiver um AICc mais baixo, execute uma transformação logit. No relatório Distribuição da resposta, escolha Ajuste contínuo > Ajuste normal e Ajuste contínuo > Ajuste beta.
      1. Para a transformação logit, clique com o botão direito do mouse no cabeçalho da coluna de resposta na tabela de dados e selecione Nova Coluna de Fórmula > Especialidade > Logit. Após a construção do modelo, salve a coluna de previsão. Para reverter para a escala original, use Nova Coluna de Fórmula > Especialidade > Logística.
         NOTA: A análise SVEM baseada em regressão é robusta para desvios da normalidade na distribuição de respostas. No entanto, essas transformações podem levar a uma interpretação mais fácil dos resultados e a um melhor ajuste dos modelos.
4. Grafe as execuções em um lote ternário. Colora os pontos de acordo com as respostas (ou as respostas transformadas se uma transformação foi aplicada): abrir Gráfico > Gráfico Ternário. Selecione apenas os fatores de mistura para X, Plotagem. Clique com o botão direito do mouse em qualquer um dos gráficos resultantes, selecione Legenda de Linha e, em seguida, selecione a coluna de resposta (transformada).
   NOTA: Colorir os pontos de acordo com as respostas fornece uma perspectiva visual independente do modelo do comportamento em relação aos fatores de mistura.
5. Exclua o script Model gerado pelo Design de Preenchimento de Espaço.
6. Construa um modelo independente para cada resposta em função dos fatores de estudo, repetindo os seguintes passos para cada resposta.
   NOTA: No caso de uma resposta binária secundária (por exemplo, falha de formulação ou morte do rato), modele também esta resposta. Altere a configuração de distribuição de destino de Normal para Binomial.
7. Construa um modelo "completo" que inclua todos os efeitos candidatos. Esse modelo deve incluir os efeitos principais de cada fator, interações de duas e três vias, termos cúbicos quadráticos e parciais nos fatores de processo, e termos cúbicos de Scheffé para os fatores de mistura^23,24.
   Observação : use o mesmo conjunto de efeitos candidatos para cada resposta. A técnica de seleção de modelos SVEM refinará independentemente os modelos para cada resposta, potencialmente resultando em modelos reduzidos únicos para cada uma delas. A Figura 9 ilustra alguns desses efeitos candidatos. As subetapas a seguir detalham esse processo.
   1. Selecione Analisar > modelo de ajuste.
   2. Certifique-se de que os fatores de bloqueio (por exemplo, Day) não tenham permissão para interagir com outros fatores do estudo. Selecione os fatores de bloqueio e clique em Adicionar. Não inclua esses fatores em nenhuma das subetapas subsequentes.
      NOTA: Os fatores de bloqueio são importantes para serem considerados no modelo, mas os fatores de bloqueio não devem interagir com outros fatores do estudo. O principal objetivo dos fatores de bloqueio é ajudar a controlar a variabilidade do experimento e melhorar a sensibilidade do experimento.
   3. Destaque todos os fatores do estudo. Modifique o valor do campo Grau para 3 (ele é definido como 2 por padrão). Clique em Fatorial para Grau.
      Observação : essa ação inclui efeitos principais, bem como interações de duas e três vias no modelo.
   4. Selecione apenas os fatores que não são de mistura na janela de seleção. Clique em Macros > Cubic Parcial.
      NOTA: Esta ação introduz efeitos quadráticos para os fatores de processo contínuo e sua interação com outros fatores não misturados no modelo.
   5. Escolha apenas os fatores de mistura na lista de seleção. Clique em Macros > Scheffe Cubic. Desative a opção padrão No Intercept (consulte a Figura 9).
      NOTA: Incluir uma interceptação no modelo é uma etapa essencial ao usar métodos Lasso e também é útil no contexto de seleção direta. A configuração padrão tradicional No Intercept geralmente está em vigor porque o ajuste de um intercepto simultaneamente com todos os efeitos principais da mistura, sem modificações como a abordagem SVEM, não é viável com o procedimento regular de regressão de mínimos quadrados¹².
   6. Especifique a coluna de resposta: realce a coluna de resposta e clique em Y.
   7. Altere a configuração Personalidade para Regressão Generalizada. Mantenha a Distribuição definida como Normal.
   8. Salve essa configuração de modelo na tabela de dados para uso com respostas adicionais clicando no menu de triângulo vermelho ao lado de Especificação do modelo e selecionando Salvar na tabela de dados.
8. Aplique o método de seleção direta SVEM para ajustar o modelo reduzido, sem inclusão obrigatória dos efeitos principais do fator de mistura, e armazene a coluna da fórmula de previsão na tabela de dados.
   1. Na caixa de diálogo Ajustar modelo , clique em Executar.
   2. Para o Método de Estimativa, selecione SVEM Forward Selection.
   3. Expanda os menus Controles Avançados > Termos de Força e desmarque as caixas associadas aos efeitos principais da mistura. Somente a caixa de termos do Intercept deve permanecer marcada. A Figura 10 exibe a configuração padrão onde os efeitos principais são forçados. Para esta etapa, essas caixas precisam ser desmarcadas para permitir que o modelo inclua ou exclua esses efeitos com base no procedimento de seleção antecipada.
   4. Clique em Ir para executar o procedimento SVEM Forward Selection.
9. Plotar as respostas reais pelas respostas previstas do modelo SVEM para verificar uma capacidade preditiva razoável. (Figura 11). Clique no triângulo vermelho ao lado de SVEM Forward Selection e selecione Diagnostic Plots > Plot Actual by Predicted.
10. Clique no triângulo vermelho ao lado de SVEM Forward Selection e selecione Save Columns > Save Prediction Formula para criar uma nova coluna contendo a fórmula de previsão na tabela de dados.
11. Opcional: Repita as etapas acima usando o Laço SVEM como o Método de Estimativa para determinar se uma receita ideal diferente é sugerida depois de executar as etapas subsequentes. Em caso afirmativo, execute ambas as receitas como corridas de confirmação (discutidas na Seção 5) para ver qual tem o melhor desempenho na prática¹².
12. Repita as etapas de construção de modelo para cada resposta.
13. Depois que as colunas de previsão para todas as respostas forem salvas na tabela de dados, represente graficamente os rastreamentos de resposta para todas as colunas de resposta previstas usando a plataforma Profiler: Selecione Graph > Profiler e selecione todas as colunas de previsão criadas na etapa anterior para Y, Prediction Formula e clique em OK (Figura 12).
14. Identificar a(s) formulação(ões) ótima(s) candidata(s).
    1. Defina a "função desejabilidade" para cada resposta, especificando se a resposta deve ser maximizada, minimizada ou correspondida a um destino. Defina quaisquer respostas primárias para usar um peso de importância de 1,0 e quaisquer respostas secundárias para usar um peso de importância de 0,2. No menu do triângulo vermelho do Prediction Profiler, selecione Otimização e Desejabilidade > Funções de Desejabilidade e, em seguida, Otimização e Desejabilidade > Definir Desejabilidades. Insira as configurações nas janelas subsequentes.
       NOTA: Os pesos importantes são relativos e subjetivos, por isso vale a pena verificar a sensibilidade do ótimo combinado a mudanças nesses pesos dentro de uma faixa razoável (por exemplo, de ponderação igual a 1:5).
    2. Comando do Profiler para encontrar as configurações de fator ideais que maximizam a função de desejabilidade (Figura 12): no Profiler, selecione Otimização e Desejabilidade > Maximizar Desejabilidade.
       NOTA: Os valores previstos das respostas nos candidatos ideais podem superestimar o valor das respostas inclinadas para a direita, como potência; no entanto, as provas de confirmação fornecerão observações mais precisas dessas formulações candidatas. O objetivo principal é localizar a formulação ideal (as configurações da receita ideal).
    3. Registre as configurações de fator ideais e observe as ponderações importantes usadas para cada resposta: no menu Perfil de Previsão , selecione Configurações de fator > Lembrar configurações.
15. Opcional: Para fatores categóricos, como tipo de lipídio ionizável, encontre as formulações condicionalmente ideais para cada nível de fator.
    1. Primeiro, defina o nível desejado do fator no criador de perfil, mantenha pressionada a tecla Ctrl e clique com o botão esquerdo do mouse dentro do gráfico desse fator e selecione Configuração de fatores de bloqueio. Selecione Otimização e desejabilidade > Maximizar desejabilidade para encontrar o ótimo condicional com esse fator bloqueado em sua configuração atual.
    2. Desbloqueie as configurações de fator antes de prosseguir, usando o mesmo menu usado para bloquear as configurações de fator.
16. Repita o processo de otimização depois de ajustar os pesos de importância das respostas (usando Otimização e Desejabilidade > Definir Desejabilidades), talvez apenas otimizando a(s) resposta(s) primária(s) ou definindo algumas das respostas secundárias para ter mais ou menos peso de importância, ou definindo a meta das respostas secundárias como Nenhuma (Figura 13).
17. Registre o novo candidato ideal (no menu Perfil de Previsão , selecione Configurações de fator > Lembrar configurações.)
18. Produzir resumos gráficos das regiões ótimas do espaço fatorial: gerar uma tabela de dados com 50.000 linhas preenchidas com configurações de fatores gerados aleatoriamente dentro do espaço de fator permitido, juntamente com os valores previstos correspondentes do modelo reduzido para cada uma das respostas e a função de desejabilidade conjunta.
    1. No Profiler, selecione Tabela aleatória de saída. Defina Quantas execuções simular? como 50.000 e clique em OK.
       NOTA: Isso gera uma nova tabela com os valores previstos das respostas em cada uma das 50.000 formulações. A coluna Desejabilidade depende dos pesos de importância para as respostas que estão em vigor quando a opção Tabela aleatória de saída é selecionada.
    2. Na tabela recém-criada, adicione uma nova coluna que calcule o percentil da coluna Desejabilidade. Use essa coluna de percentil nos gráficos ternários em vez da coluna Desejabilidade bruta. Clique com o botão direito do mouse no cabeçalho da coluna Desejabilidade e selecione Nova Coluna de Fórmula > Probabilidade Cumulativa > Distributiva para criar uma nova coluna Probabilidade Cumulativa[Desejabilidade].
    3. Gere os gráficos descritos nas etapas a seguir. Altere repetidamente o esquema de cores dos gráficos para exibir as previsões para cada resposta e para a coluna Probabilidade Cumulativa[Desejabilidade].
    4. Construa gráficos ternários para os quatro fatores lipídicos. Na tabela, navegue até Gráfico > Gráfico ternário, selecione os fatores de mistura para X, Plotagem e clique em OK. Clique com o botão direito do mouse em um dos gráficos resultantes, selecione Legenda de Linha e selecione a coluna de resposta prevista. Altere o menu suspenso Cores para Jet.
       Observação : isso exibe as regiões de melhor e pior desempenho em relação aos fatores lipídicos. A Figura 14 mostra os percentis da desejabilidade articular quando se considera maximizar a Potência (importância=1) e minimizar o Tamanho (importância=0,2), enquanto se calcula a média sobre quaisquer fatores que não são mostrados nos eixos ternários do gráfico. A Figura 15 mostra o tamanho bruto previsto. Também é razoável decompor esses gráficos condicionalmente em outros fatores, como a criação de um conjunto distinto de gráficos ternários para cada tipo de lipídio ionizável com um Filtro de Dados Local (disponível no menu triângulo vermelho ao lado de Gráfico Ternário).
    5. Da mesma forma, use o Graph > Graph Builder para plotar os 50.000 pontos codificados por cores (representando formulações exclusivas) contra os fatores de processo sem mistura, individualmente ou em conjunto, e procure relações entre a(s) resposta(s) e o(s) fator(es). Procure as configurações de fator que produzem a maior desejabilidade. Explore diferentes combinações de fatores nos gráficos.
       Observação : ao colorir gráficos, use Probabilidade cumulativa[ Desejabilidade], mas ao plotar a desejabilidade no eixo vertical em relação aos fatores de processo, use a coluna Desejabilidade bruta. A coluna Desejabilidade também pode ser colocada em um eixo da visualização 3D do gráfico > do gráfico de dispersão , juntamente com dois outros fatores de processo para exploração multivariada. A Figura 16 mostra a desejabilidade conjunta de todas as formulações que podem ser formadas com cada um dos três tipos de lipídios ionizáveis. As formulações mais desejáveis utilizam H102, com H101 fornecendo algumas alternativas potencialmente competitivas.
    6. Salve o Profiler e suas configurações lembradas de volta à tabela de dados. Clique no triângulo vermelho ao lado de Profiler e selecione Salvar script > à tabela de dados....

Figura 8: Leituras de potência observadas do experimento. Os pontos mostram os valores de potência observados a partir das 23 corridas; As execuções de benchmark replicadas são mostradas em verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Caixa de diálogo do software para iniciar a análise. Os efeitos candidatos foram inseridos junto com a resposta de potência de destino e a opção Sem interceptação foi desmarcada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10. Caixa de diálogo adicional para especificar opções SVEM. Por padrão, os principais efeitos lipídicos são forçados no modelo. Como uma interceptação está incluída, recomendamos desmarcar essas caixas para não forçar os efeitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Gráfico real por previsto. Esta figura apresenta a Potência observada contra o valor previsto para cada formulação pelo modelo SVEM. A correlação não precisa ser tão forte quanto neste exemplo, mas a expectativa é ver pelo menos uma correlação moderada e verificar se há outliers. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Criador de perfil de previsão. As duas primeiras linhas de gráficos mostram as fatias da função de resposta prevista na formulação ótima (conforme identificado pela abordagem SVEM). A linha inferior dos gráficos mostra a "desejabilidade" ponderada da formulação, que é uma função da última coluna de gráficos que mostra que a Potência deve ser maximizada, e o Tamanho deve ser minimizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Três candidatos à formulação ideal do SVEM-Forward Selection. Alterar a ponderação de importância relativa das respostas pode levar a diferentes formulações ótimas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14: Gráficos ternários para o percentil de desejabilidade. O gráfico mostra as 50.000 formulações codificadas por cor por percentil de desejabilidade, onde a desejabilidade é definida com peso de importância de 1,0 para maximizar a potência e 0,2 para minimizar o tamanho, estes gráficos mostram que a região ótima das formulações consiste em menores porcentagens de lipídio ionizável e maiores porcentagens de PEG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 15: Gráfico ternário para o tamanho previsto. O gráfico mostra as previsões de tamanho do modelo SVEM para cada uma das 50.000 formulações. O tamanho é minimizado com maiores porcentagens de lipídio auxiliar e maximizado com menores porcentagens de auxiliar. Uma vez que os outros fatores variam livremente ao longo das 50.000 formulações plotadas, isso implica que essa relação se mantém em todas as faixas dos outros fatores (PEG, taxa de fluxo, etc.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 16: Gráficos de violino para a conveniência de formulações envolvendo os três diferentes tipos de lipídios ionizáveis. Cada um dos 50.000 pontos representa uma formulação única de todo o espaço de fator permitido. Os picos dessas distribuições são os valores máximos de desejabilidade que são calculados analiticamente com o perfilador de predição. H102 tem o maior pico e, portanto, produz a formulação ideal. A abordagem SVEM para construir o modelo que gera essa saída filtra automaticamente fatores estatisticamente insignificantes: o objetivo deste gráfico é considerar a significância prática em todos os níveis de fatores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. A confirmação é executada

1. Prepare uma tabela listando os candidatos ideais identificados anteriormente (Figura 17).
   NOTA: Os valores de True Potency e True Size na Figura 17 são preenchidos usando as funções geradoras simuladas: na prática, elas serão obtidas formulando e medindo o desempenho dessas receitas.
   1. Inclua o controle de benchmark com o conjunto de execuções candidatas que serão formuladas e medidas.
   2. Se alguma das formulações do experimento produzir resultados desejáveis, talvez superando o benchmark, selecione a melhor para adicionar à tabela candidata e teste novamente junto com novas formulações.
      Observação : adicione manualmente execuções desejadas para a tabela candidata ou use as configurações lembradas da janela Profiler se essas execuções forem do experimento anterior. Identifique o número da linha da execução, navegue até Criador de Perfil de Previsão > Configurações de Fator > Definir como Dados na Linha e insira o número da linha. Em seguida, escolha Prediction Profiler > Factor Settings > Remember Settings e rotule adequadamente (por exemplo, "benchmark" ou "best run from the previous experiment").
   3. Clique com o botão direito do mouse na tabela Configurações lembradas no Criador de perfil e selecione Transformar em tabela de dados.
      NOTA: Dependendo da prioridade e do orçamento do estudo, considere executar réplicas para cada execução de confirmação, especialmente se substituir o benchmark. Crie e analise cada formulação duas vezes, usando o resultado médio para o ranking. Preste atenção a qualquer candidato com um amplo intervalo de resposta nas duas replicações, pois isso pode indicar alta variância de processo.
   4. Se necessário devido a restrições orçamentárias, selecione os candidatos identificados para corresponder ao orçamento experimental ou para eliminar candidatos redundantes.
2. Execute as execuções de confirmação. Construa as formulações e reúna as leituras.
3. Verifique a consistência entre os resultados da experiência original e os resultados do lote de confirmação para benchmarks ou outras receitas repetidas. Se houver uma mudança grande e inesperada, considere o que pode ter contribuído para a mudança e se é possível que todas as execuções do lote de confirmação tenham sido afetadas.
4. Comparar o desempenho das formulações ótimas candidatas. Explore se algum novo candidato superou o benchmark.
5. Opcional: Adicione o resultado das execuções de confirmação à tabela experimental e execute novamente a análise na Seção 4.
   Observação : a próxima etapa do fluxo de trabalho fornece instruções para construir um estudo de acompanhamento junto com essas execuções, se desejado.

Figura 17: Tabela de dez candidatos ideais a serem executados como execuções de confirmação. A Potência Verdadeira e o Tamanho Verdadeiro foram preenchidos a partir das funções geradoras de simulação (sem qualquer processo adicional ou variação analítica). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Opcional: Projetar um estudo de acompanhamento a ser executado simultaneamente com as execuções de confirmação

1. Avaliar a necessidade de um estudo de seguimento considerando os seguintes critérios:
   1. Determine se a formulação ideal está ao longo de um dos limites de fatores e se um segundo experimento é desejado para expandir pelo menos uma das faixas de fatores.
   2. Avalie se o experimento inicial usou um tamanho de execução relativamente pequeno ou intervalos de fatores relativamente grandes e se há necessidade de "ampliar" a região ideal identificada com execuções adicionais e análises atualizadas.
   3. Verifique se um fator adicional está sendo introduzido. Este poderia ser um nível de um fator categórico, como um lipídio ionizável adicional ou um fator que permaneceu constante no estudo inicial, por exemplo, a concentração de tampão.
   4. Se nenhuma das condições acima for atendida, prossiga para a Etapa 7.
2. Prepare-se para ensaios experimentais adicionais a serem realizados simultaneamente com os ensaios de confirmação.
   1. Definir os limites fatoriais garantindo uma sobreposição parcial com a região do estudo inicial. Se não houver sobreposição, um novo estudo deve ser desenhado.
   2. Desenvolver as novas corridas experimentais com um design de preenchimento de espaço. Selecione DOE > Design de Preenchimento de Espaço > Finalidade Especial.
      NOTA: Para usuários avançados, considere um design ideal em D via DOE > Design personalizado.
   3. Depois que as corridas de preenchimento de espaço forem geradas, incorpore manualmente duas ou três execuções do experimento original que se encontram dentro do novo espaço de fator. Distribua essas execuções aleatoriamente dentro da tabela experimental usando as etapas descritas na Seção 2 para adicionar linhas e, em seguida, randomizar a ordem das linhas.
      NOTA: Eles serão usados para estimar qualquer mudança nas médias de resposta entre os blocos.
   4. Concatene as execuções de confirmação e o novo preenchimento de espaço em uma única tabela e randomize a ordem de execução. Use Tabelas > Concatenar e, em seguida, crie e classifique por uma nova coluna aleatória para randomizar a ordem de execução, conforme descrito na Seção 2.
3. Formule as novas receitas e colete os resultados.
4. Concatene as novas execuções experimentais e os resultados com a tabela de dados do experimento original, introduzindo uma coluna de identificação do experimento para indicar a fonte de cada resultado. Use Tabelas > Concatenar e selecione a opção Criar Coluna de Origem.
5. Verifique se as propriedades da coluna para cada fator exibem o intervalo combinado em ambos os estudos: clique com o botão direito do mouse no cabeçalho da coluna para cada fator e examine os intervalos de propriedades Codificação e Mistura , se presentes.
6. Iniciar a análise dos resultados do novo experimento.
   1. Inclua a coluna experimento-ID como um termo no modelo para servir como um fator de bloqueio. Certifique-se de que este termo não interaja com os fatores de estudo. Execute o script de diálogo Ajustar Modelo salvo na tabela na Seção 4, selecione a coluna ID do experimento e clique em Adicionar para incluí-la na lista de efeitos candidatos.
   2. Execute esta caixa de diálogo Modelo de ajuste na tabela de dados concatenados para analisar conjuntamente os resultados do novo experimento e do estudo inicial. Siga as instruções anteriores para gerar candidatos à formulação ideal atualizados e resumos gráficos.
   3. Para validação, analise independentemente os resultados do novo experimento, excluindo os resultados do experimento inicial. Ou seja, executar as etapas descritas na Seção 4 da nova tabela experimental.
   4. Garantir que as formulações ideais identificadas por esses modelos estejam alinhadas com aquelas reconhecidas pela análise conjunta.
   5. Revise resumos gráficos para confirmar que as análises conjunta e individual dos novos resultados experimentais exibem comportamentos de superfície de resposta semelhantes (o que significa que há uma relação semelhante entre a(s) resposta(s) e os fatores).
   6. Comparar as análises combinadas e individuais de novos resultados com o experimento inicial quanto à consistência. Use estruturas gráficas semelhantes para comparação e examine as receitas ideais identificadas para diferenças.

7. Documentar as conclusões científicas finais do estudo

1. Se o controle de benchmark mudar para uma receita recém-identificada devido ao estudo, registre a nova configuração e especifique os arquivos de design e análise que registram sua origem.
2. Manter todas as tabelas experimentais e resumos de análise, de preferência com nomes de arquivo com carimbo de data, para referência futura.

Representative Results

Essa abordagem foi validada em ambos os tipos de lipídios amplamente classificados: lipídios clássicos semelhantes ao MC3 e lipidoides (por exemplo, C12-200), geralmente derivados da química combinatória. Em comparação com uma formulação LNP de referência desenvolvida usando um método One Factor at a Time (OFAT), as formulações candidatas geradas por meio de nosso fluxo de trabalho frequentemente demonstram melhorias de potência de 4 a 5 vezes em uma escala logarítmica, como mostrado nas leituras de luciferase hepática de camundongo na Figura 18. A Tabela 1 mostra os aumentos correspondentes na expressão da luciferase hepática de camundongos observados sobre o desempenho do controle de referência ao longo de duas fases de otimização (um estudo inicial e um estudo de acompanhamento subsequente). Na primeira fase, o foco foi otimizar os índices lipídicos, mantendo os outros fatores constantes. No estudo de seguimento, um tipo lipídico auxiliar adicional foi introduzido e a otimização foi realizada considerando tanto a composição da razão lipídica quanto o tipo lipídico auxiliar. Consequentemente, o tipo lipídico auxiliar recém-introduzido foi selecionado para ser usado com a composição lipídica otimizada associada. O aumento significativo na potência sugere que essas composições otimizadas podem exibir capacidades de escape endossômico superiores²⁵.

Simulações podem ser usadas para mostrar a qualidade esperada do candidato ótimo produzido por este procedimento. No âmbito do experimento de exemplo usado no protocolo, podemos repetir a simulação muitas vezes para diferentes tamanhos de execução e avaliar os resultados de acordo com a função geradora do processo simulado. Um script JMP para essa finalidade é fornecido no Arquivo Suplementar 4. Especificamente, um projeto de preenchimento de espaço foi gerado e as colunas de resposta foram preenchidas com valores de nossas funções geradoras, além de ruído representando variação analítica e de processo. Nós ajustamos essas respostas simuladas com diferentes técnicas de análise (incluindo SVEM Forward Selection) para produzir uma receita ótima candidata correspondente. Os candidatos de cada método de análise são então comparados com o valor do verdadeiro ótimo das funções geradoras. A Figura 19 ilustra a porcentagem média da resposta teórica máxima alcançada por cada um dos três métodos de análise usando desenhos de preenchimento de espaço de tamanho dado no eixo horizontal. O modelo completo, que inclui todos os efeitos candidatos e não reduz o modelo com base na significância estatística desses efeitos, tem o pior desempenho. Grande parte do trabalho adicional que tradicionalmente é usado no ajuste de modelos de regressão para experimentos de processo de mistura envolve modificações (remoção do intercepto, forçando os efeitos principais da mistura, impedindo o uso de efeitos de mistura quadrática pura, etc.) que são necessárias para ajustar esse modelo completo⁹ e, nessa perspectiva, esses procedimentos são desnecessários¹². Além disso, esse modelo não pode ser ajustado até que o tamanho do projeto atinja o número de efeitos no modelo. Em tamanhos experimentais menores, podemos ajustar o método tradicional de seleção direta, que supera o modelo completo em relação ao desempenho médio da formulação candidata ótima para cada tamanho experimental fixo. Da mesma forma, a modificação SVEM para esta abordagem de seleção futura melhora ainda mais o desempenho dos candidatos ideais. Este gráfico revela que o uso do SVEM-Forward Selection^12,13 para analisar um experimento de preenchimento de espaço de 24 execuções alcança a mesma qualidade média que normalmente requer 50 execuções quando analisado com um modelo tradicional de seleção direta (visando AICc mínimo). Embora o desempenho real varie de processo para processo, esta simulação - juntamente com os resultados publicados no SVEM 12,13,16,17,26 - demonstra o potencial deste procedimento de modelagem para otimização da formulação.

Figura 18: Melhora da expressão da luciferase hepática após duas rodadas de experimentação. A rodada 0 mostra a leitura da luciferase hepática para a formulação de referência; A rodada 1 mostra a leitura da luciferase hepática após o primeiro experimento, que otimiza as razões molares lipídicas constituintes do LNP; A rodada 2 mostra a leitura da luciferase hepática após o segundo experimento, que otimiza ainda mais as razões molares constituintes, considerando também um tipo de lipídio auxiliar adicional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 19: Qualidade da formulação ótima em função do tamanho experimental e do modelo estatístico. O eixo vertical representa a porcentagem de desejabilidade máxima teórica e o eixo horizontal representa o tamanho do desenho de preenchimento de espaço. Cada ponto mostra a média de mais de 150 simulações. A linha azul (triângulos) representa o modelo completo (sem qualquer eliminação de efeitos estatisticamente insignificantes), a linha âmbar (círculos) representa o modelo tradicional de seleção direta baseado em AICc (com um intercepto e sem forçar os efeitos principais da mistura) e a linha verde (triângulos de cabeça para baixo) representa o modelo de seleção direta baseado em SVEM (com uma interceptação e sem forçar os efeitos principais da mistura). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Redondo	ID da partícula	Expressão de Luciferase no Fígado (fóton/seg)
0	Benchmark de Controle	8.E+06
1	Otimizado sobre as proporções lipídicas	2.E+09
2	Otimizado sobre as razões lipídicas e o tipo de lipídio auxiliar	8.E+10

Tabela 1: Melhoria sistemática na expressão da luciferase através da otimização do Design of Experiment (DOE). Esta tabela ilustra o aumento significativo na expressão da luciferase, com uma melhoria de até 10.000 vezes na escala fóton/segundo, desde o benchmark inicial até o "candidato ótimo" final.

Arquivo Suplementar 1: 04ABR2023 Resumo.docx - Este documento fornece um registro do estudo, incluindo seu objetivo, as respostas avaliadas, os fatores considerados e o número total de execuções executadas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: 23_run_simulated_experiment.jmp - Um arquivo JMP com o experimento simulado e seus resultados. Este arquivo também inclui scripts de análise anexados compatíveis com JMP 17 Pro. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: 23_run_simulated_experiment.xlsx - Um arquivo Excel que inclui o experimento simulado e seus resultados, adequado para leitores que podem não ter acesso ao JMP. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: simulação de mistura 20DEC22.jsl - Este é um script JMP 17 Pro usado para simular experimentos de formulação LNP e avaliar o desempenho de diferentes métodos de análise. O script usa a abordagem SVEM-Forward Selection (sem interceptação), que é o método de análise de chave usado neste fluxo de trabalho. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Um software moderno para o projeto e análise de experimentos de processo de mistura possibilita que os cientistas melhorem suas formulações de nanopartículas lipídicas em um fluxo de trabalho estruturado que evita experimentos ineficientes de OFAT. A abordagem de modelagem SVEM recentemente desenvolvida elimina muitas das modificações de regressão arcana e estratégias de redução de modelo que podem ter distraído os cientistas com considerações estatísticas estranhas. Uma vez que os resultados são coletados, a estrutura de análise SVEM oferece uma abordagem que é mais fácil de implementar e tende a produzir modelos melhores do que as abordagens de modelagem tradicionais¹³. Além disso, as análises gráficas que se baseiam nas fórmulas de predição para cada resposta são facilmente interpretáveis pelos cientistas, fornecendo um resumo claro do comportamento marginal da resposta sobre fatores individuais, bem como pequenos grupos de fatores, sem exigir a interpretação de estimativas de parâmetros altamente correlacionados a partir de um modelo de regressão. Isso permite que os cientistas se concentrem em avaliar a significância prática entre os fatores do estudo depois que o SVEM removeu automaticamente efeitos estatisticamente insignificantes.

O fluxo de trabalho tem sido usado na prática para variar sistematicamente a composição lipídica e parâmetros de formulação, como relação N/P, vazão e razão de mistura para otimização e para selecionar os melhores tipos de lipídios auxiliares, tipos de lipídios ionizáveis e tipos de tampão. Os objetivos nesses exemplos geralmente incluem maximizar a potência in vivo ou in vitro e encapsular cargas úteis variadas, como mRNA ou DNA, para alvos in vivo relevantes, como células hepáticas, ou às vezes em vários tipos de células no caso de aplicações in vitro. Para aplicações específicas, talvez seja necessário equilibrar propriedades biofísicas, como tamanho, PDI, potencial zeta e porcentagem de encapsulamento ao examinar a potência in vivo. Além disso, o objetivo é encontrar uma formulação potente, mas bem tolerada e, assim, podemos incluir respostas como mudança no peso corporal, resposta de citocinas ou elicitação de enzimas hepáticas como AST/ALT na análise. Padrões emergiram de numerosos experimentos LNP. Notavelmente, alterações na razão molar do lipídio ionizável e na relação N/P parecem afetar significativamente o encapsulamento do RNA. Além disso, mudanças na razão molar do PEG parecem afetar a estabilidade das partículas, como indicado por influências no tamanho e PDI. Em geral, um excesso de PEG no núcleo do LNP tende a ter um efeito prejudicial sobre a potência em camundongos.

As melhorias de desempenho são especialmente perceptíveis quando mais de uma resposta é direcionada: mesmo que o benchmark já tenha um bom desempenho em relação à resposta primária (por exemplo, potência), a otimização conjunta normalmente mantém ou melhora o comportamento em relação à resposta primária e, ao mesmo tempo, melhora o comportamento em relação a outras respostas (minimizando PDI, tamanho ou perda de peso corporal). Validamos a autenticidade dessas melhorias com execuções de confirmação, nas quais preparamos e comparamos diretamente a formulação de referência (possivelmente com uma réplica) e novas formulações candidatas.

A fase de design desse fluxo de trabalho tem várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de que os fatores e seus intervalos sejam inseridos corretamente na plataforma de design de preenchimento de espaço. Em segundo lugar, use gráficos e conhecimento do assunto para confirmar a viabilidade de cada formulação resultante antes de iniciar o experimento. Finalmente, execute o experimento seguindo a ordem aleatória especificada pela tabela de delineamento. A adesão a essa sequência ajuda a evitar que covariáveis não medidas - como a ordem de produção da formulação ou a temperatura ambiente - confundam os fatores em estudo. Os projetos de preenchimento de espaço são mais fáceis de construir - com menos potencial de erro do usuário do que os projetos de processo de mistura ideais, que exigem decisões extras durante a configuração que podem frustrar usuários inexperientes e desencorajá-los de usar experimentos projetados. No entanto, depois de trabalhar com esse protocolo, os cientistas podem se beneficiar de uma leitura adicional sobre como os projetos ideais poderiam potencialmente substituir os projetos de preenchimento de espaço no protocolo, como descrito no Capítulo 6 de Goos e Jones (2011)²⁷. Especialmente para estudos de acompanhamento que "ampliam" uma região ótima - onde há menos preocupação com falhas ao longo dos limites de mistura - projetos D-optimal podem ser mais eficientes do que projetos de preenchimento de espaço.

Da mesma forma, a fase de análise desse fluxo de trabalho tem várias etapas críticas. Primeiro, certifique-se de que o modelo especifique um conjunto apropriado de efeitos candidatos, incluindo interações, em vez de apenas os efeitos principais (de primeira ordem) dos fatores. Em segundo lugar, use SVEM Forward Selection como a estrutura de modelagem. Em terceiro lugar, desative a opção padrão Sem interceptação e evite forçar os efeitos principais da mistura. Finalmente, defina corretamente as funções de desejabilidade para as respostas antes de iniciar a otimização. Para usuários sem acesso ao SVEM, a melhor abordagem é usar a seleção direta tradicional (visando AICc mínimo) para o problema de regressão¹². O protocolo menciona que também é possível usar SVEM Lasso: em média, essa abordagem fornece resultados semelhantes ao SVEM Forward Selection, embora para conjuntos de dados específicos as duas abordagens possam produzir formulações ótimas ligeiramente diferentes que poderiam ser comparadas com corridas de confirmação¹². No entanto, o SVEM Lasso dará resultados de modelagem inferiores se o usuário cometer o erro fácil de esquecer de desativar a opção padrão No Intercept ¹²: por esse motivo, usamos o SVEM Forward Selection como método padrão, já que ele é mais robusto a essa opção.

A principal limitação desse método é que haverá estudos pontuais de maior complexidade que se beneficiarão do auxílio de um estatístico para delineamento e análise. Situações em que o orçamento de execução é mais limitado do que o habitual (abaixo da heurística mínima), as respostas são binárias, há um grande número de fatores categóricos ou níveis de um único fator categórico, onde um objetivo de pesquisa é considerar a eliminação de um ou mais fatores de mistura da receita, ou onde há restrições adicionais no espaço do fator podem ser abordados de forma diferente por um estatístico, tais como usando designs ótimos ou híbridos^12,28 ou adicionando estrutura adicional ao projeto. Especificamente, um projeto híbrido poderia ser formado criando um design de preenchimento de espaço com a maioria das execuções orçadas e, em seguida, "aumentando" o projeto com as execuções restantes (geralmente 2-4) usando um critério D-ótimo. Outra abordagem híbrida é gerar um projeto de preenchimento de espaço sobre os fatores de mistura (lipídios) e contínuos (processo) e, em seguida, adicionar quaisquer fatores categóricos usando uma alocação "ótima" de níveis de fatores. No entanto, a abordagem simplificada de projeto de preenchimento de espaço adotada no protocolo foi desenvolvida nos últimos anos no processo de execução de dezenas de experimentos de otimização de formulação LNP, e acreditamos que oferece uma abordagem robusta que funcionará com sucesso na maioria dos casos, ao mesmo tempo em que dá aos cientistas confiança em sua capacidade de utilizar experimentos projetados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JMP Pro 17.1	JMP Statistical Discovery LLC