Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

فحص جدوى الترايكوديرما ستروماتيكوم كونيديا داخل الدم المحيطي البشري الضامة المشتقة أحادية النواة

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. الغرض من هذه المخطوطة هو تقديم طريقة لتقييم البلعمة وقدرات إزالة البلاعم المشتقة من الدم المحيطي البشري أحادية النواة المحفزة باستخدام Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

تمثل البلاعم خط دفاع حاسم وهي مسؤولة عن منع نمو واستعمار مسببات الأمراض في الأنسجة المختلفة. البلعمة المخروطية هي عملية رئيسية تسمح بالتحقيق في الأحداث السيتوبلازمية والجزيئية التي تنطوي عليها تفاعلات البلاعم الممرضة ، وكذلك لتحديد وقت وفاة الكونيديا الداخلية. تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. التهرب من البلعمة والهروب من البلعمة هي آليات الفوعة الفطرية. هنا ، نبلغ عن الطرق التي يمكن استخدامها لتحليل البلعمة ، وإزالة ، وصلاحية T. stromaticum conidia ، وهي الفطريات التي تستخدم كعامل مكافحة حيوية وسماد حيوي وقادرة على إحداث العدوى البشرية. يتكون البروتوكول من 1) ثقافة الترايكوديرما ، 2) الغسيل للحصول على كونيديا ، 3) عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) باستخدام طريقة محلول polysucrose وتمايز PBMCs إلى بلاعم ، 4) طريقة البلعمة في المختبر باستخدام أغطية زجاجية مستديرة وتلوينها ، و 5) مقايسة إزالة لتقييم صلاحية الكونيديا بعد البلعمة الكونيديا. باختصار ، يمكن استخدام هذه التقنيات لقياس كفاءة إزالة الفطريات للبلاعم.

Introduction

يتكون جنس الترايكوديرما (الرتبة: Hypocreales ، العائلة: Hypocreaceae) من الفطريات الرمية في كل مكان وهي طفيليات من الأنواع الفطرية الأخرى وقادرة على إنتاج مجموعة من الإنزيمات المفيدة تجاريا1. تستخدم هذه الأنواع الفطرية لإنتاج البروتينات غير المتجانسة2 ، وإنتاج السليلوز3 ، والإيثانول ، والبيرة ، والنبيذ ، والورق4 ، في صناعة النسيج5 ، وصناعة الأغذية6 ، وفي الزراعة كعوامل مكافحة بيولوجية 7,8. بالإضافة إلى الاهتمام الصناعي بهذه الأنواع الفطرية ، فإن العدد المتزايد من الإصابات في البشر قد أعطى بعض أنواع الترايكوديرما حالة مسببات الأمراض الانتهازية9.

Trichoderma spp. تنمو بسرعة في الثقافة ، مع مستعمرات بيضاء وقطنية في البداية تتحول إلى الأصفر المخضر إلى الأخضرالداكن 10. يتم تكييفها للعيش في مجموعة واسعة من ظروف الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة ، والأنواع الانتهازية قادرة على البقاء على قيد الحياة في درجة الحموضة الفسيولوجية ودرجات الحرارة ، وبالتالي ، استعمار الأنسجة البشرية المختلفة11،12،13. الأهم من ذلك ، أن ارتفاع معدل الإصابة ب Trichoderma spp. قد يترافق مع عوامل الفوعة ، وهذه لم تدرس جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال الدراسات التي تركز على فهم الاستجابة المناعية ضد أنواع الترايكوديرما الانتهازية نادرة.

أثناء العدوى ، إلى جانب العدلات ، تمثل البلاعم خط الدفاع المسؤول عن البلعمة ، وبالتالي تمنع نمو واستعمار مسببات الأمراض في الأنسجة المختلفة. باستخدام مستقبلات التعرف على الأنماط ، مثل المستقبلات الشبيهة ب Toll ومستقبلات الليكتين من النوع C ، تقوم البلاعم بالفطريات البلعمية ومعالجتها في جسيمات البلعمة ، وبالتالي تعزيز انفجار الجهاز التنفسي ، وإطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، وتدمير الكائنات الحية الدقيقة البلعمية14. ومع ذلك ، يمكن أن تتأثر آلية البلعمة وتتهرب منها الاستراتيجيات الميكروبية المختلفة ، مثل حجم وشكل الخلايا الفطرية. وجود كبسولات تعيق البلعمة. تقليل عدد المستقبلات التي تحفز البلعمة ؛ إعادة تشكيل بنية ألياف الأكتين في السيتوبلازم ؛ إعاقة تشكيل الكاذب. وهروب البلعمة أو البلعمة بعد عملية البلعمة14.

تستخدم العديد من مسببات الأمراض ، بما في ذلك Cryptococcus neoformans ، الضامة كمكان مناسب للبقاء على قيد الحياة في المضيف ، ونشر العدوى وتحريضها15. يستخدم اختبار البلعمة والإزالة لتقييم الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض وتحديد الاستراتيجيات الميكروبية المستخدمة للتهرب من جهاز المناعة الفطري15،16،17. يمكن أيضا استخدام هذا النوع من التقنية لفحص الحركية التفاضلية للبلعمة ، وتحمض البلعمة المتأخر ، والانفجار التأكسدي الذي يؤدي إلى تقليل قتل الفطريات18.

يمكن استخدام طرق مختلفة لتقييم البلعمة، وبقاء الفطريات، والتهرب من عملية نضوج الجسيمات. وتشمل هذه المجهر الفلوري ، والذي يستخدم لمراقبة البلعمة ، والموقع الخلوي ، والجزيئات المنتجة أثناء البلعمة19. قياس التدفق الخلوي ، الذي يوفر بيانات كمية عن البلعمة ويستخدم لتقييم العلامات المختلفة المشاركة في العملية20,21 ؛ الفحص المجهري داخل الجسم ، والذي يستخدم لتقييم التقاط الميكروبات ونضج البلعمة22 ؛ البلعمة بوساطة الأجسام المضادة ، والتي تستخدم لتقييم خصوصية عملية البلعمة لمسببات الأمراض23 ؛ وغيرها24،25،26،27.

يستخدم البروتوكول المقدم هنا طريقة شائعة ومنخفضة التكلفة ومباشرة باستخدام المجهر الضوئي ومقايسة نمو الصفائح لتقييم البلعمة وقتل الكونيديا الفطرية. سيوفر هذا البروتوكول للقراء تعليمات خطوة بخطوة لإجراء فحص البلعمة والإزالة باستخدام الضامة المشتقة من الدم البشري أحادي النواة المعرضة ل T. stromaticum. تم استخدام PBMCs لأن Trichoderma conidia يتم تطبيقه كمكافحة حيوية ضد مسببات الأمراض النباتية والأسمدة الحيوية للمحاصيل النباتية في جميع أنحاء العالم وتسبب في العديد من الإصابات البشرية ، والتي تسمى داء المشعرات. إلى جانب ذلك ، لا يوجد سوى عملين سابقين يركزان على التفاعل بين Trichoderma conidia وجهاز المناعة البشري ، حيث قمنا بفحص العدلات28 والالتهام الذاتي في الضامة29. توضح هذه المقالة أولا كيف يمكن دراسة البلعمة في كونيديا T. stromaticum بواسطة البلاعم المشتقة من PBMC ، ثم كيف يمكن تقييم صلاحية الكونيديا المبتلعة باستخدام تقنيات بسيطة قائمة على الفحص المجهري. قد يسهل هذا البروتوكول بشكل أكبر التحقيقات في الاستجابة المناعية المرتبطة بالبلاعم أو الآليات المتعلقة بتعديل الجهاز المناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الاعتبارات الأخلاقية والموضوعات البشرية
أجريت جميع التجارب على البشر الموصوفة في هذه الدراسة وفقا لإعلان هلسنكي والقوانين الفيدرالية البرازيلية ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات بجامعة ولاية سانتا كروز (رمز تعريف المشروع: 550.382 / 2014).

تم جمع الدم المحيطي البشري من متطوعين أصحاء من مدينة Ilhéus ، باهيا ، البرازيل ، لم يتعرضوا للأنشطة المهنية المتعلقة بالفطريات المدروسة. تم استبعاد الأفراد الذين يعانون من حالات طبية صحية أو يستخدمون الأدوية. وافق جميع الأشخاص طواعية على المشاركة ووقعوا على نموذج الموافقة المستنيرة قبل إدراجهم في هذه الدراسة.

1. تحضير الكواشف والمحاليل

ملاحظة: قم بإعداد الكواشف والمحاليل التالية قبل المتابعة. راجع جدول المواد (TOM) للحصول على معلومات حول الكاشف ومورد المواد.

  1. تحضير محلول ملحي معقم متوازن مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، لم يتم استخدام برنامج تلفزيوني خال من السموم الداخلية.
  2. تحضير بطاطس سكر العنب أجار (PDA) المتوسطة ، وصب 20 مل في كل طبق بتري لثقافة T. stromaticum . قم بإعداد ست لوحات مع المساعد الرقمي الشخصي لكل متبرع ، واستخدم لوحة واحدة لكل حالة: 3 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 120 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ثلاث لوحات لكل عنصر تحكم: ثلاثة للتحكم في الترايكوديرما وثلاثة للتحكم المتوسط R10. استخدم أطباق بتري بحجم 60 مم × 15 مم أو 100 مم × 15 مم لاستعادة الكونيديا الأمثل.
  3. تعقيم 100 ٪ الجلسرين.
  4. تحضير وسط R10 لزراعة الخلايا: وسط RPMI مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ومضاد حيوي 1٪ (بنسلين / ستربتومايسين).
  5. تعقيم الماء المقطر لتحلل الخلية.
  6. تحضير الماء عند درجة الحموضة 7.0 لعملية التلوين.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، اضبط الأس الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني والمحاليل 0.1 م / لتر هيدروكسيد الصوديوم و 0.1 م / لتر حمض الهيدروكلوريك.
  7. تعقيم الغطاء الزجاجي المستدير (13 مم) والملاقط.

2. الترايكوديرما ستروماتيكوم الثقافة والمعالجة

  1. تحضير مخزون الأم (M1) من T. stromaticum:
    ملاحظة: مطلوب مخزون أم (M1) للتأكد من أن جميع التجارب تتم من نفس الجيل الطازج (F1).
    1. قم بزراعة لقاح T. stromaticum في أطباق بتري مع PDA عند 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 7-10 أيام حتى يتم ملاحظة الكونيديا وتتحول الثقافة إلى اللون الأخضر.
    2. اغسل ثقافة T. stromaticum. أضف 3-5 مل من PBS إلى سطح الثقافة باستخدام ماصة. جمع PBS من لوحة ، والاستغناء مرة أخرى على الثقافة لإزالة الكونيديا تدريجيا باستخدام ماصة. كرر هذه العملية بقدر ما هو ضروري حتى يتحول التعليق إلى اللون الأخضر الداكن.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يقترح الغسيل اللطيف للثقافة عن طريق إضافة 3-5 مل من PBS إلى اللوحة متبوعا بأداء حركة دائرية حتى يتحول التعليق إلى اللون الأخضر لاستعادة الكونيديا. مع السحب المتكرر ، يمكن جمع المزيد من الكونيديا.
    3. انقل التعليق المستعاد من اللوحة إلى أنبوب معقم سعة 15 مل باستخدام ماصة. كرر الخطوات 2.1.2-2.1.3 عدة مرات حسب الضرورة للحصول على المزيد من conidia.
    4. أجهزة الطرد المركزي التعليق عند 1,160 × جم لمدة 5 دقائق عند 12 درجة مئوية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من PBS. كرر هذه الخطوة (2.1.4) ثلاث مرات للحصول على تعليق خال من الخيوط.
      ملاحظة: لإعادة تعليق الحبيبات بشكل صحيح ، بعد الطرد المركزي ، يوصى باستخدام دوامة قصيرة.
    5. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 2-3 مل من PBS ، وعد الكونيديا في غرفة Neubauer باستخدام تخفيف 1: 100 أو 1: 1,000.
      ملاحظة: في الظروف المثلى ، يمكن استعادة التركيز النهائي 2 × 108 كونيديا / مل من الثقافة. تقييم صلاحية الكونيديا باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق اختياري.
    6. قلص التعليق إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل بإضافة 0.5 مل من معلق الكونيديا (من الخطوة 2.1.5) إلى كل أنبوب. ثم أضف 0.5 مل من الجلسرين المعقم 100٪ للحصول على مخزون M1. دوامة لفترة وجيزة ، وتحديد الأنابيب ، وتخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
  2. ثقافة T. stromaticum والحصول على كونيديا للتجربة
    1. لوحة 10 ميكرولتر من تعليق M1 (أعدت في الخطوة 2.1) في PDA عند 28 درجة مئوية في الظلام لمدة 7-10 أيام حتى يتم ملاحظة الكونيديا وتتحول الثقافة إلى اللون الأخضر للحصول على جيل F1 الطازج.
      ملاحظة: لضمان زراعة T. stromaticum جديدة للتجربة ، قم بتقييم الوقت اللازم لنمو الفطريات والوقت اللازم لتمايز البلاعم.
    2. جمع conidia ، وتكرار الخطوات 2.1.2-2.1.4.
    3. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 2-3 مل من PBS. قم بتقييم صلاحية الكونيديا باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق ، أو عد الكونيديا كما هو مذكور في الخطوة 2.1.5.

3. عزل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC)

ملاحظة: يتم الحصول على PBMCs بطريقة حاجز الكثافة باستخدام محلول بوليسكروز بكثافة 1.077 جم / مل30.

  1. القسمة 15 مل من محلول السكروز إلى أنبوب واحد سعة 50 مل لكل عينة مانحة سيتم جمعها.
  2. اجمع 20 مل من الدم من كل متبرع باستخدام ثلاثة إلى أربعة أنابيب EDTA. قم بتجنيد ما لا يقل عن أربعة متبرعين لكل تجربة. لا تجمع دماء المتبرعين ؛ بدلا من ذلك ، استخدم كل عينة على حدة كنسخة بيولوجية. لكل متبرع ، انقل الدم إلى أنبوب واحد سعة 50 مل ، وأضف برنامج تلفزيوني للحصول على حجم نهائي قدره 35 مل.
  3. حرك معلق الدم (الخطوة 3.2) ببطء على طول جدار الأنبوب الذي يحتوي على محلول polysucrose (الخطوة 3.1) لتشكيل معلق ثنائي الطور.
    ملاحظة: لمنع اختلاط الدم بمحلول السكروز ، أضف الدم ببطء. يوصى باستخدام ما لا يقل عن 7 مل من الدم من كل متبرع لعزل PBMC.
  4. قم على الفور بطرد الأنبوب الذي يحتوي على التعليق ثنائي الطور عند 1600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 24 درجة مئوية. برمجة الطرد المركزي ل PBMCs: استخدم التسارع 1 والتباطؤ 0 لتجنب التوقف المفاجئ للطرد المركزي.
  5. لاحظ تكوين حلقة بيضاء تحتوي على PBMCs بعد الطرد المركزي. توجد خلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة في الطبقة السفلية ، وتحتوي الطبقة التالية على محلول polysucrose ، وتوجد PBMCs في الحلقة البيضاء بين محلول polysucrose والبلازما (الطبقة العليا). اجمع الحلقة البيضاء عن طريق الشفط برفق باستخدام ماصة أو ماصة باستور معقمة حتى لا تلتقط خلايا الدم الحمراء أو البلازما أو محلول السكروز ، ونقلها إلى أنبوب واحد سعة 15 مل.
  6. أضف PBS إلى أنبوب 15 مل الذي يحتوي على PBMCs للحصول على حجم نهائي قدره 10 مل. تجانس التعليق ، والطرد المركزي الأنبوب عند 1600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 24 درجة مئوية.
  7. اغسل الخلايا ثلاث مرات عند 1600 × جم لمدة 5 دقائق عند 24 درجة مئوية مع 10 مل من PBS. ثم أعد تعليق الحبيبات النهائية في 2 مل من وسط R10.
  8. قم بتقييم صلاحية الخلية باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق ، وعد الخلايا في غرفة نيوباور.

4. البلعمة الحركية

ملاحظة: يتم التعامل مع الضامة المشتقة أحادية النواة من الدم المحيطي البشري باستخدام T. stromaticum conidia عند تعدد العدوى (MOI) بنسبة 1:10 أو وسط R10 فقط كعنصر تحكم. يمثل تعدد العدوى (MOI) نسبة العوامل المعدية المضافة إلى أهداف العدوى ويتم تقديمها كأرقام مطلقة: MOI = العوامل: الأهداف31. هنا ، نستخدم 1 T. stromaticum conidia (عامل) ل 10 بلاعم (أهداف). بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لفترات زمنية مختلفة (3 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 120 ساعة). بعد ذلك ، يتم استخدام غطاء زجاجي دائري لتصور الضامة الملتصقة المشاركة في عملية البلعمة تحت المجهر. يتم توفير شكل تصميم تجريبي (الشكل 1).

ملاحظة: يقترح استخدام لوحات 24 بئر.

  1. علاج البلاعم المشتقة من الإنسان باستخدام T. stromaticum conidia
    1. أضف غطاء زجاجي دائري معقم (13 مم) إلى كل بئر باستخدام ملاقط معقمة.
    2. اضبط حجم تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوات 3.7-3.8 على اللوحة 8 × 105 خلايا لكل بئر إلى حجم نهائي قدره 1 مل مع وسيط R10. استخدم مجهرا مقلوبا لتقييم مورفولوجيا الخلية.
      ملاحظة: يجب تعليق الخلايا في الوسط ولها مورفولوجيا مستديرة.
    3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت جو CO2 بنسبة 5٪ لمدة 7 أيام ، واستبدل الوسط بوسط R10 جديد كل يومين لتمايز الخلايا الوحيدة إلى بلاعم32. مراقبة مورفولوجيا الخلية باستخدام المجهر المقلوب. ستقدم البلاعم مورفولوجيا مغزلة ، بأشكال مسطحة وممتدة. يمكن أيضا ملاحظة زيادة نسبة السيتوبلازما ووجود الأقدام الكاذبة. ابحث عن البلاعم المشتقة أحادية النواة الملتصقة.
      ملاحظة: قد تظل نسبة صغيرة جدا من الخلايا الوحيدة غير المتمايزة معلقة في الوسط.
    4. قم بإزالة وسط كل بئر باستخدام ماصة ، واغسل الخلايا ب 1 مل من PBS لإزالة الحطام والخلايا غير الملتصقة.
    5. استخدم المعلق المحضر في الخطوة 2.2 لتحضير معلق جديد من T. stromaticum conidia بتركيز نهائي قدره 8 × 104 كونيديا / مل في وسط R10.
    6. أضف 1 مل من معلق الكونيديا المحضر في الخطوة 4.1.5 إلى كل بئر معالجة (3 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 120 ساعة) للحصول على MOI من 1:10. إلى عناصر التحكم ، أضف 1 مل فقط من وسيط R10 إلى البئر.
    7. تحدي البلاعم لمدة 3 ساعات مع T. stromaticum conidia عند 37 درجة مئوية تحت جو CO2 بنسبة 5٪. بعد 3 ساعات ، قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا لإزالة الكونيديا غير البلعمية.
    8. أضف 1 مل من وسط R10 إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لأوقات مختلفة (3 ساعات ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، 72 ساعة ، 96 ساعة ، و 120 ساعة) عند 37 درجة مئوية تحت جو CO2 بنسبة 5٪.
  2. التلوين والتحليل
    1. قم بإزالة الوسط من كل بئر بعد اكتمال الحضانة المقابلة (الخطوة 4.1.8) ، وأضف 1 مل من PBS إلى هذا البئر.
    2. قم بإزالة أغطية الزجاج المستديرة من الآبار باستخدام ملاقط معقمة وإبرة للتلوين باستخدام مجموعة تلطيخ.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التلوين باستخدام صبغة May Grünwald-Giemsa33.
    3. إلى كل من أغطية الزجاج المستديرة ، أضف مثبت البقع (5 ثوان) ، والصبغة 1 (5 ثوان) ، والصبغة 2 (2 ثانية) ، ودرجة حموضة الماء المخزن 7.0 (5 ثوان) ، وهي مكونات مجموعة التلطيخ. انتظر حتى تجف ، وقم بتثبيت أغطية الغطاء على شريحة زجاجية باستخدام عامل التثبيت.
    4. حدد النتيجة: عد ما مجموعه 100 بلاعم (Mø) لكل حالة زمنية. باستخدام المجهر الضوئي ، احسب عدد البلاعم مع الكونيديا البلعمية باستخدام هدف 100x وزيت الغمر (المعادلة [1]).
      Equation 1 (1)
    5. احصل على عدد البلعمة الكونيديا لكل بلاعم: اربط الكونيديا الموجودة في 100 بلاعم مقسومة على عدد البلاعم مع كونيديوم بلعمي واحد على الأقل (المعادلة [2])34.
      Equation 2 (2)
      ملاحظة: لتقييم وحساب conidia، يمكن استخدام برنامج ImageJ35.
    6. تصوير البلعمة من كل عينة وحالة زمنية باستخدام أهداف 40x و 100x لتقديم النتائج.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لمقايسة البلعمة والجدوى المخروطية باستخدام البلاعم المشتقة أحادية النواة من الدم المحيطي البشري. (1-10) مقايسة البلعمة: يجب زراعة T. stromaticum في القناة النوعية الرقمية السالكة ، ويتم استرداد الكونيديا عن طريق غسل اللوحة باستخدام برنامج تلفزيوني. يجب عزل PBMCs بطريقة حاجز الكثافة باستخدام البروتوكول الموصوف ، وزراعتها في 24 لوحة جيدة مع أغطية زجاجية مستديرة معقمة لمدة 7 أيام للتمايز إلى بلاعم ، ثم معالجتها ب MOI من 1:10 مع فترات زمنية مختلفة. تتم إزالة أغطية الزجاج المستديرة وتلطيخها بمجموعة التلوين ، ويتم تحليل النتائج باستخدام الفحص المجهري الضوئي. (1-8، 11-13) فحص صلاحية كونيديا: بعد العزل ، يتم استزراع PBMCs في 24 لوحة بئر بدون أغطية زجاجية مستديرة لمدة 7 أيام للتمايز إلى بلاعم ثم معالجتها ب MOI من 1:10 لفترات زمنية مختلفة. يجب تحليل الخلايا عن طريق الحضانة بالماء المقطر ؛ ثم يتم طرد التعليق بالطرد المركزي ، ثم يتم طلاء الحبيبات المعاد تعليقها في PDA لتحليل حركية نمو الترايكوديرما. تم تصميم هذا الرقم باستخدام قاعدة بيانات للصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. مقايسة الجدوى الكونيدية بعد البلعمة

ملاحظة: يتم توفير شكل تصميم تجريبي (الشكل 1).

ملاحظة: استخدم لوحات 24 بئر.

  1. تحدي البلاعم المشتقة من الإنسان مع T. stromaticum conidia.
    1. كرر الخطوات 4.1.2-4.1.8 للتمييز بين الخلايا الوحيدة ، وعلاج الضامة باستخدام T. stromaticum conidia.
      ملاحظة: لا تستخدم أغطية زجاجية مستديرة في الآبار. استخدم نفس الفترات الزمنية المستخدمة لفحص حركية البلعمة بحيث يمكن ربط البلعمة بالصلاحية الكونيدية.
    2. قم بتقييم تأثير الوسط R10 على نمو T. stromaticum باستخدام الآبار مع التعليق المحضر في الخطوة 4.1.5 (R10 medium + conidia) كعنصر تحكم.
  2. مقايسة الجدوى الكونيدية
    1. قم بإزالة الوسط بعد كل فترة حضانة (3 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة و 120 ساعة) ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الكونيديا التي لم يتم البلعمة.
      ملاحظة: يجب عدم غسل عنصر التحكم الذي يحتوي على R10 متوسط + كونيديا.
    2. أضف 0.5 مل من الماء المقطر المعقم إلى كل بئر ، واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة. بعد هذا الوقت ، راقب مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب للتأكد من أن الخلايا قد تم تحليلها.
    3. جمع التعليق ، ونقله إلى أنابيب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي التعليق باستخدام جهاز طرد مركزي صغير عند 6000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تخلص من المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، وقم بتلقيح 10 ميكرولتر من المعلق في اللوحة المحتوية على المساعد الرقمي الشخصي عند 28 درجة مئوية في الظلام.
    5. تحضير عنصر تحكم إيجابي لنمو T. stromaticum : استخدم معلق T. stromaticum conidia (الخطوة 2.2) لإعداد معلق جديد بتركيز نهائي قدره 8 × 106 كونيديا / مل. لوحة 10 ميكرولتر من هذا التعليق في المساعد الرقمي الشخصي عند 28 درجة مئوية في الظلام.
      ملاحظة: سيحتوي 10 ميكرولتر من هذا المعلق على نفس العدد من الكونيديا (8 × 104) التي تم استخدامها لإصابة الضامة المشتقة من النواة الأحادية في الدم. الفرق بين هذا التحكم الإيجابي والتحكم المذكور في الخطوة 5.1.2 هو أن عنصر التحكم المذكور أعلاه في الخطوة 5.1.2 يستخدم لتقييم التأثير المحتمل لوسط R10 على نمو الترايكوديرما خلال وقت البلعمة. يمثل هذا التحكم الإيجابي في الخطوة 5.2.5 باستخدام تعليق T. stromaticum conidia الذي تم جمعه في PBS عنصر تحكم لنمو الترايكوديرما دون تأثير وسط R10 ليعكس كيفية نمو الفطريات بشكل طبيعي. باستخدام هذا التحكم ، من الممكن تقييم ما إذا كان وسيط R10 يؤثر على نمو الترايكوديرما .
    6. راقب حركية نمو T. stromaticum في المساعد الرقمي الشخصي كل يوم ، وقم بتصوير الثقافة.
    7. التحليل: يمكن استخدام نقطتين لتقييم النتائج: 1) الوقت (بالأيام) اللازم للثقافة لشغل لوحة الثقافة بأكملها ، و 2) الوقت (بالأيام) حتى ظهور التصبغ الأخضر المميز ل T. stromaticum conidia في الثقافة.

6. التحليل الإحصائي

  1. استخدم اختبار Kruskal-Wallis لتحديد الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين المجموعات / العلاجات ال 8. ضع في اعتبارك p < 0.05 كذات دلالة إحصائية. يتم تقديم جميع البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري (SD). في الأشكال ، يشير # إلى دلالة إحصائية عند p < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تستخدم التقنية التي تنطوي على البلعمة من conidia الفطرية بواسطة الضامة على نطاق واسع للدراسات التي تقيم تعديل الاستجابات المناعية ضد الفطريات. استخدمنا البلعمة من T. stromaticum conidia لتقييم صلاحية الكونيديا بعد البلعمة ، لأن التهرب من البلعمة وهروب البلعمة هي آليات الفوعة الفطرية. يجب على الباحثين إجراء هذه التقنيات كواحدة من المقايسات الأولى عند التحقيق في الأنواع ذات الأهمية السريرية.

Figure 2
الشكل 2: البلعمة لبكتيريا T. stromaticum conidia بواسطة الخلايا البلعمية الكبيرة المشتقة أحادية النواة من الدم المحيطي البشري. النتائج التمثيلية لحركية البلعمة (A) تحت 40x و (B) أهداف 100x تظهر الضامة المشتقة من PBMC التي تحتوي على T. stromaticum conidia. (C) T. stromaticum conidia الحرة وتعلق على الغشاء الخارجي. (د) T. stromaticum conidia التي تم استيعابها بالكامل بواسطة البلاعم ؛ (ه) T. stromaticum conidia في المستوى العلوي؛ (و) البلعمة المتعددة؛ (ز) إنبات الكونيديا داخل (H) وخارج البلاعم. السهام: الأصفر ، كونيديا الحرة. أبيض ، كونيديا تعلق على الغشاء الخارجي. أسود ، كونيديا داخلية بالكامل ؛ الأحمر ، إنبات كونيديا داخل البلاعم. السهام المتقطعة: أسود ، البلعمة المتعددة. الأحمر ، الكونيديا تنبت في وسط R10 خارج الضامة ؛ أبيض ، كونيديا في المستوى العلوي. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 2 النتائج التمثيلية لحركية البلعمة. في بداية عملية البلعمة ، يمكن ملاحظة T. stromaticum conidia الحرة ، وكذلك الكونيديا المرتبطة بالغشاء الخارجي للبلاعم أو استيعابها بالكامل (الشكل 2A-C). يمكن ملاحظة عدد أقل من الكونيديا حرة أو متصلة بالغشاء الخارجي للبلاعم مع زيادة وقت البلعمة.

والجدير بالذكر أنه في هذا العمل ، يمكن العثور على الكونيديا حرة ومتصلة بالغشاء الخارجي (الشكل 2C) في بداية عملية البلعمة ، ويتم استيعابها بالكامل بواسطة البلاعم (الشكل 2D) ، أو في المستوى العلوي مقارنة بالبلاعم (الشكل 2E) ولكن ليس البلعمة ، ويمكن العثور على أكثر من كونيديوم واحد في نفس البلاعم (الشكل 2F). بعد فترات طويلة من الزمن (96 ساعة) ، يمكن أن تنبت الكونيديا البلعمية داخل البلاعم (الشكل 2G) ، ويمكن أن تنبت الكونيديا الحرة في وسط R10 لتشكيل خيوط عند 37 درجة مئوية (الشكل 2H).

بعد البلعمة ، كان من الممكن ملاحظة أن T. stromaticum conidia ظلت قابلة للحياة حتى بعد 120 ساعة من التفاعل مع الضامة البشرية المشتقة من PBMC. تظهر النتائج التمثيلية ثقافة الكونيديا المستعادة (الشكل 3 أ) وتمثل الوقت (بالأيام) اللازم للاستزراع لشغل صفيحة الاستزراع بأكملها (الشكل 3 ب) وتشكيل كونيديا خضراء ملونة (الشكل 3 ج). فقط T. stromaticum conidia المنفصلة كانت قادرة على التهرب من البلعمة والعثور عليها حرة في السيتوبلازم في الضامة البشرية المشتقة أحادية النواةمن الدم المحيطي 29. قد تساهم قدرة الترايكوديرما على تقليل إنتاج أنواع الأكسجين والنيتروجين التفاعلية أيضا في بقاء الكونيديا داخل البلعمة وتفسر الصلاحية بعد البلعمة28،29،36. حتى الآن ، أظهرنا أن الكونيديا البلعمية تظل قابلة للحياة وقادرة على النمو في وسط PDA حتى بعد 120 ساعة. كما تم الإبلاغ عن بقاء الكائنات الحية الدقيقة الأخرى على قيد الحياة بعد اجتياحها بواسطة البلاعم ، مثل Aspergillus27,37 و Cryptococcus38.

Figure 3
الشكل 3: قدرة إزالة الضامة البشرية المشتقة أحادية النواة من الدم المحيطي المصابة ب T. stromaticum conidia. بعد تحدي مع T. stromaticum conidia (3 ساعات ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، 72 ساعة ، 96 ساعة ، أو 120 ساعة) تم تحليل البلاعم المشتقة من PBMC ، وتم طلاء التعليق في PDA لتقييم صلاحية الكونيديا البلعمية. (أ) النتائج التمثيلية لنمو T. stromaticum بعد البلعمة بواسطة البلاعم المشتقة من PBMC. مراقبة (ب) نمو T. stromaticum و (C) conidiation في أيام مختلفة للتحكم الإيجابي مع T. stromaticum في PBS (انظر الخطوة 5.2.5) ، والتحكم في وسط R10 (انظر الخطوة 5.1.2) ، والبلعمة الكونيديا بواسطة البلاعم لفترات زمنية مختلفة (3 ساعات ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، 72 ساعة ، 96 ساعة ، 120 ساعة). نتائج تمثيلية من أربعة متبرعين أصحاء. متوسط الانحراف المعياري ± (SD). اختبار كروسكال واليس. يشير الرمز # إلى الأهمية عند p < 0.05 ، n = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالنسبة للعديد من مسببات الأمراض الفطرية بما في ذلك Aspergillus fumigatus و Cryptococcus و Candida albicans وغيرها ، فإن البلعمة المخروطية أو الخميرة هي عملية رئيسية تسمح بالتحقيق في الأحداث السيتوبلازمية والجزيئية في تفاعلات البلاعم الممرضة ، وكذلك لتحديد وقت وفاة الكونيديا الداخلية14،39،40. البلعمة هي العملية الرئيسية في التفاعل بين الترايكوديرما والمضيف. يعدل جنس الترايكوديرما العديد من مسارات البلعمة ، بما في ذلك Dectin-1 و Dectin-2 ، والمستقبل الشبيه ب Toll 2 والمستقبل الشبيه ب Toll 4 و MHC و NF-κB25،28،41،42،43. الترايكوديرما يسبب داء المشعرات في الأفراد المعرضين للخطر وغير المنقوصي المناعة9. الأهم من ذلك ، يتم استخدام العديد من الأنواع من هذا الجنس في الزراعة وهي المصدر المحتمل لداء الشعريات. هناك حاجة ماسة إلى فهم عوامل ضراوة T. stromaticum وآلية الاستجابة المناعية في جسم الإنسان ضد هذه الفطريات ، حيث أن المخاطر المهنية التي تسببها أنواع Trichoderma ، بما في ذلك T.stromaticum ، ترتفع بشكل مثير للقلق. توفر الطريقة المعروضة هنا تفاصيل لأداء البلعمة ومقايسة القتل لدراسة تفاعل الترايكوديرما والبلاعم في الضامة البشرية المشتقة من الدم المحيطي. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة الضامة من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الضامة السنخية أو البريتونية أو السلالة.

تبدأ الخطوة الأولى في هذا البروتوكول بتعليق المخزون الأم (M1) للحصول على مزارع جديدة من الفطريات. تنمو ثقافات الترايكوديرما بسرعة ، لأنها عادة ما تستحوذ على اللوحة بأكملها وتبدأ في إظهار كونيديا خضراء اللون في غضون 5 أيام. تعتبر درجة الحرارة والضوء من العوامل الحاسمة لنمو الترايكوديرما ، ويمكن أن تؤثر التغيرات في هذه العوامل على حركية الترايكوديرما وتعرض التجربة للخطر44.

بعد غسل ثقافة T. stromaticum ، يجب استعادة الحجم النهائي بين 5-8 مل. تتناسب شدة لون التعليق مع تركيز كونيديا. يمكن استخدام معلق الكونيديا الذي تم الحصول عليه في المقايسات في المختبر وفي الجسم الحي ، مثل تقييم البلعمة26 ، ومصائد العدلات خارج الخلية28 ، والتعرض داخل الأنف36,41 ، والتعرض داخل الصفاق26 ، والعدوى داخل الجلد45 ، والعدوى الوريدية46. قامت الأبحاث السابقة التي أجريت باستخدام البلاعم البشرية بتقييم الالتهام الذاتي الناجم عن Trichoderma29 وقدرة الجنس على تثبيط تكوين الفخاخ خارج الخلية في العدلات28 ، وهي آلية تستخدم للقضاء على مسببات الأمراض الفطرية والكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

من المهم ملاحظة أن وسط المزرعة المستخدم للحفاظ على الخلايا يمكن أن يؤثر على الإنبات المخروطي (الشكل 3G ، H). إذا لم يكن الإنبات مرغوبا فيه لتجربة معينة ، فإننا نوصي بإجراء فحص أولي باستخدام وسط زراعة الخلايا لتحديد حركية نمو الترايكوديرما في هذا الوسط المحدد. يجب إجراء هذا الفحص قبل بدء التجارب في المختبر مع سلالة الخلية المطلوبة ، ويجب إيقاف التجربة بعد 72 ساعة إذا وجد أن الوسيط غير متوافق. يمكن ملاحظة إنبات Trichoderma conidia (الشكل 3G ، H) من 96h داخل وخارج البلاعم.

نظرا لأن أنواع الترايكوديرما تقدم اختلافات في التشكل ودرجة الحرارة المثلى ودرجة الحموضة لنموها ، فقد لا تكون النتائج المعروضة هنا قابلة للتكرار لجميع أنواع الجنس ، وقد يحتاج هذا البروتوكول إلى تعديلات عند إجرائه مع الأنواع الأخرى. على سبيل المثال ، تنبت Trichoderma asperelloides conidia بسرعة أكبر في الثقافة من تلك الموجودة في T. stromaticum.

تتطلب البروتوكولات الموثقة السابقة لتقييم البلعمة وقتل العامل الممرض باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري كواشف باهظة الثمن ، لكنها توفر معلومات محددة حول عملية البلعمة19. يتطلب البروتوكول المقدم في هذه المقالة مجهرا ضوئيا ونمو صفيحة فقط لتقييم البلعمة ويوفر صورا شاملة لعملية البلعمة. يمكن استخدام بروتوكولات مختلفة للحصول على البلاعم المتمايزة وتحفيز تحلل البلاعم. تتضمن هذه البروتوكولات استخدام أوقات مختلفة لتمايز البلاعم بدلا من 7 أيام المستخدمة هنا26 أو استخدام 2.5٪ deoxycholate47 لتحلل البلاعم بدلا من الماء المقطر عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة ، كما هو مستخدم هنا في هذا البروتوكول. تم استخدام هذه الطرق بشكل فعال لأنواع فطرية مختلفة مثل A. fumigatus27 و A. nidulans18 و Cryptococcus neoformans15.

ترتبط بعض قيود هذا البروتوكول باستخدام برنامج تلفزيوني غير خال من السموم الداخلية ، واستخدام أغطية زجاجية مستديرة ، واستخدام دم الإنسان. نوصي باختبار برنامج تلفزيوني (غير خال من السموم الداخلية) على الخلايا للتأكد من أنه لا يمكنه تنشيط الخلايا الوحيدة وتحيز التجربة. يعد استخدام أغطية زجاجية مستديرة مفيدا جدا لتلطيخ الخلايا وعدها ، ولكن قد لا تنتشر الخلايا بالتساوي تحت الشريحة ، حيث تهاجر بعض الخلايا إلى حافة اللوحة جيدا ، وقد يكون لهذا الاختلاف تأثير على إجمالي عدد الخلايا المقدر في أغطية الزجاج المستديرة. نظرا لأننا لا نستخدم التألق المناعي أو تقنيات مماثلة في هذا البروتوكول ، فإن وجود كونيديا غير بلعمية في المستوى العلوي مقارنة بالبلاعم قد يؤدي إلى سوء تفسير نتائج البلعمة. نظرا لأننا نستخدم الدم من متبرعين بشريين ، يختلف العدد النهائي ل PBMC بين المتبرعين ، وقد لا يكون انخفاض عدد خلايا المتبرعين كافيا لجميع التجارب.

باختصار ، يمكن استخدام هذه التقنيات لقياس وظيفة الضامة وإزالة الفطريات ، وتحديدا للفطريات الخيطية مثل الترايكوديرما والميكروبات الأخرى ، مثل الخمائر والبكتيريا. علاوة على ذلك ، يوفر هذا البروتوكول اتجاهات مستقبلية لدراسة التباين الحقيقي في الاستجابة المناعية ضد الفطريات المكونة للكونيديا في التجمعات البشرية ، والتي لا يمكن ملاحظتها باستخدام نماذج حيوانية متساوية المنشأ أو خطوط خلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسات التمويل البرازيلية التالية: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) بمنح RED0011/2012 و RED008/2014. تعترف U.R.S. ، J.O.C. ، و M.E.S.M. بالمنحة الدراسية الممنوحة من Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) و FAPESB ، على التوالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

فحص الجدوى ، الترايكوديرما ستروماتيكوم ، كونيديا ، الضامة المشتقة أحادية النواة من الدم المحيطي البشري ، البلعمة ، تفاعلات مسببات الأمراض البلاعم ، الاستجابات المناعية ضد الفطريات ، هروب البلعمة ، الفوعة الفطرية ، عامل المكافحة الحيوية ، عامل الأسمدة الحيوية ، الالتهابات البشرية ، ثقافة الترايكوديرما ، غسل كونيديا ، خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) ، تمايز البلاعم ، طريقة البلعمة في المختبر ، مقايسة التخليص ، كفاءة إزالة الفطريات
فحص جدوى <em>الترايكوديرما ستروماتيكوم</em> كونيديا داخل الدم المحيطي البشري الضامة المشتقة أحادية النواة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter