Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levedygtighedsanalyse af Trichoderma stromaticum conidia inde i humant perifert blod mononukleart afledt makrofager

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Formålet med dette manuskript er at præsentere en metode til evaluering af fagocytose og clearance evner af humant perifert blod mononukleare-afledte makrofager stimuleret med Trichoderma stromaticum conidier.

Abstract

Makrofager repræsenterer en afgørende forsvarslinje og er ansvarlige for at forhindre vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Conidial fagocytose er en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder involveret i makrofagpatogeninteraktioner samt til bestemmelse af dødstidspunktet for internaliserede konidier. Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Unddragelse af fagocytose og flugt af fagosomer er mekanismer for svampevirulens. Her rapporterer vi de metoder, der kan bruges til analyse af fagocytose, clearance og levedygtighed af T. stromaticum conidia, en svamp, der anvendes som biokontrol- og biogødningsmiddel og er i stand til at fremkalde humane infektioner. Protokollen består af 1) Trichoderma-kultur , 2) vask for at opnå konidier, 3) isolering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) ved anvendelse af polysaccharoseopløsningsmetoden og differentiering af PBMC'erne i makrofager, 4) en in vitro-fagocytosemetode ved anvendelse af runde glasdæksler og farvning og 5) et clearanceassay til vurdering af konidiernes levedygtighed efter fagocytose af konidier. Sammenfattende kan disse teknikker bruges til at måle svampeclearance effektivitet af makrofager.

Introduction

Trichoderma-slægten (Order: Hypocreales, Family: Hypocreaceae) består af allestedsnærværende, saprofytiske svampe, der er parasitter af andre svampearter og er i stand til at producere en række kommercielt nyttige enzymer1. Disse svampearter anvendes til fremstilling af heterologe proteiner2, fremstilling af cellulose3, ethanol, øl, vin og papir4, i tekstilindustrien5, fødevareindustrien6 og i landbruget som biologiske bekæmpelsesmidler 7,8. Ud over den industrielle interesse for disse svampearter har det stigende antal infektioner hos mennesker givet nogle Trichoderma-arter status som opportunistiske patogener9.

Trichoderma spp. vokser hurtigt i kultur, med oprindeligt hvide og bomuldsagtige kolonier, der bliver grønlig gul til mørkegrøn10. De er tilpasset til at leve i en bred vifte af pH- og temperaturforhold, og de opportunistiske arter er i stand til at overleve ved fysiologisk pH og temperaturer og dermed kolonisere forskellige humane væv 11,12,13. Det er vigtigt, at stigningen i infektionshastigheden for Trichoderma spp. kan være forbundet med virulensfaktorer, og disse er ikke godt undersøgt. Derudover er undersøgelser, der fokuserer på at forstå immunresponset mod opportunistiske Trichoderma-arter, stadig sjældne.

Under en infektion, sammen med neutrofiler, repræsenterer makrofager forsvarslinjen, der er ansvarlig for fagocytose, og forhindrer således vækst og kolonisering af patogener i forskellige væv. Ved hjælp af mønstergenkendelsesreceptorer, såsom tolllignende receptorer og C-type lektinreceptorer, makrofager fagocytosesvampe og behandler dem til fagosomer, hvilket fremmer et åndedrætsudbrud, frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner og ødelæggelsen af de fagocytoserede mikroorganismer14. Fagocytosemekanismen kan imidlertid påvirkes og undgås af forskellige mikrobielle strategier, såsom svampecellernes størrelse og form; tilstedeværelsen af kapsler, der forhindrer fagocytose; faldende antallet af fagocytose-inducerende receptorer; ombygning af strukturen af actinfibre i cytoplasmaet; hindrer dannelsen af pseudopodier; og fagosom- eller fagosomflugt efter fagocytoseprocessen14.

Mange patogener, herunder Cryptococcus neoformans, bruger makrofager som en niche til at overleve i værten, sprede og fremkalde infektion15. Phagocytose og clearance assay bruges til at evaluere immunresponset mod patogener og til at identificere de mikrobielle strategier, der anvendes til at undgå det medfødte immunsystem 15,16,17. Denne type teknik kan også bruges til at undersøge differentialkinetikken af fagocytose, forsinket fagosomforsuring og oxidativ burst, der resulterer i reduceret svampedræbning18.

Forskellige metoder kan bruges til at evaluere fagocytose, svampeoverlevelse og unddragelse af fagosommodningsprocessen. Disse omfatter fluorescensmikroskopi, som bruges til at observere fagocytose, den cellulære placering og molekylerne produceret under fagocytose19; flowcytometri, som giver kvantitative data om fagocytose og bruges til at evaluere de forskellige markører, der er involveret i processen 20,21; intravital mikroskopi, som bruges til at vurdere mikrobiel indfangning og fagosommodning22; antistofmedieret fagocytose, som anvendes til at vurdere specificiteten af fagocytoseprocessen for et patogen23; og andre 24,25,26,27.

Protokollen, der præsenteres her, anvender en almindelig, billig og direkte metode ved hjælp af et optisk mikroskop og pladevækstassay til vurdering af fagocytose og drab af svampekonidier. Denne protokol vil give læserne trinvise instruktioner til udførelse af fagocytose og clearance assay ved hjælp af humane perifere blod mononukleare-afledte makrofager udsat for T. stromaticum. PBMC'er blev brugt, fordi Trichoderma conidia anvendes som biokontrol mod phytopathogener og en biogødning til planteafgrøder over hele verden og har forårsaget flere humane infektioner, kaldet Trichodermosis. Derudover er der kun to tidligere værker, der fokuserer på interaktionen mellem Trichoderma conidia og det menneskelige immunsystem, hvor vi undersøgte neutrofiler28 og autofagi i makrofager29. Denne artikel viser først, hvordan fagocytosen af konidierne af T. stromaticum ved PBMC-afledte makrofager kan studeres, og derefter hvordan levedygtigheden af de opslugte konidier kan vurderes ved hjælp af enkle mikroskopibaserede teknikker. Denne protokol kan yderligere lette undersøgelser af makrofagassocieret immunrespons eller immunsystemmodulationsrelaterede mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiske overvejelser og menneskelige emner
Alle eksperimenter med mennesker beskrevet i denne undersøgelse blev udført i henhold til erklæringen fra Helsinki og brasilianske føderale love og godkendt af State University of Santa Cruz's etiske komité (projektidentifikationskode: 550.382 / 2014).

Humant perifert blod blev indsamlet fra raske frivillige fra Ilhéus by, Bahia, Brasilien, der ikke blev udsat for erhvervsmæssige aktiviteter relateret til den undersøgte svamp. Personer med rapporterede helbredsmedicinske tilstande eller brug af medicin blev ekskluderet. Alle forsøgspersoner indvilligede frivilligt i at deltage og underskrev en informeret samtykkeformular, før de blev inkluderet i denne undersøgelse.

1. Fremstilling af reagenser og opløsninger

BEMÆRK: Forbered følgende reagenser og opløsninger, før du fortsætter. Se materialetabellen (TOM) for oplysninger om reagens og materialeleverandør.

  1. Forbered en afbalanceret steril fosfatbufret saltopløsning 1x (PBS).
    BEMÆRK: I denne protokol blev endotoksinfri PBS ikke anvendt.
  2. Forbered kartoffeldextroseagar (PDA) medium, og hæld 20 ml i hver petriskål til T. stromaticum-kulturen . Forbered seks plader med PDA til hver donor, og brug en plade til hver tilstand: 3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer. Derudover skal du bruge tre plader til hver kontrol: tre til Trichoderma-styringen og tre til R10-mediumstyringen. Brug petriskåle på 60 mm x 15 mm eller 100 mm x 15 mm for optimal genvinding af konidier.
  3. Steriliser 100% glycerol.
  4. Forbered et R10-medium til cellekulturen: RPMI-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotikum (penicillin/streptomycin).
  5. Steriliser destilleret vand til cellelyse.
  6. Forbered vand ved pH 7,0 til farvningsprocessen.
    BEMÆRK: Juster om nødvendigt pH-værdien ved hjælp af et pH-meter og opløsninger på 0,1 M/L NaOH og 0,1 M/L HCI.
  7. Steriliser rundt glasdæksel (13 mm) og pincet.

2. Trichoderma stromaticum kultur og forarbejdning

  1. Fremstilling af moderstamme (M1) af T. stromaticum:
    BEMÆRK: Der kræves en moderbestand (M1) for at sikre, at alle eksperimenter udføres fra kulturen af samme friske generation (F1).
    1. Dyrk en T. stromaticum inokulum i petriskåle med PDA ved 28 °C i mørke i 7-10 dage, indtil konidierne er observeret, og kulturen bliver grøn.
    2. Vask kulturen af T. stromaticum. Der tilsættes 3-5 ml PBS til dyrkningsoverfladen ved hjælp af en pipette. Saml PBS fra pladen, og dispenser den igen over kulturen for gradvist at fjerne konidierne ved hjælp af pipetten. Gentag denne proces så meget som nødvendigt, indtil suspensionen bliver mørkegrøn.
      BEMÆRK: Alternativt foreslås skånsom vask af kulturen ved at tilføje 3-5 ml PBS til pladen efterfulgt af en cirkulær bevægelse, indtil suspensionen bliver grøn for at genvinde konidierne. Ved gentagen pipettering kan der indsamles flere konidier.
    3. Den genvundne suspension overføres fra pladen til et 15 ml sterilt rør med en pipette. Gentag trin 2.1.2-2.1.3 så mange gange, som det er nødvendigt for at opnå flere konidier.
    4. Suspensionen centrifugeres ved 1.160 x g i 5 minutter ved 12 °C, og pelletpen resuspenderes i 5 ml PBS. Dette trin (2.1.4) gentages tre gange for at opnå en hyferfri suspension.
      BEMÆRK: For at resuspendere pelleten korrekt anbefales kort hvirvelstrøm efter centrifugering.
    5. Den endelige pellet resuspenderes i 2-3 ml PBS, og konidierne tælles i et Neubauer-kammer ved hjælp af en fortynding på 1:100 eller 1:1.000.
      BEMÆRK: Under optimale forhold kan en slutkoncentration på 2 x 108 konidier/ml genvindes fra kulturen. Vurdering af konidiernes levedygtighed ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode er valgfri.
    6. Suspensionen alikvote i 1,5 ml sterile reagensglas ved tilsætning af 0,5 ml konidier suspension (fra trin 2.1.5) til hvert glas. Derefter tilsættes 0,5 ml steril 100% glycerol for at opnå M1-lagre. Vortex kort, identificer rørene og opbevar ved -20 ° C eller -80 ° C.
  2. Kultur af T. stromaticum og opnåelse af konidier til eksperimentet
    1. Plade 10 μL af M1-suspensionen (fremstillet i trin 2.1) i PDA ved 28 °C i mørke i 7-10 dage, indtil konidierne observeres, og kulturen bliver grøn for at opnå den friske F1-generation.
      BEMÆRK: For at sikre en frisk T. stromaticum-kultur til forsøget skal du vurdere den tid, der kræves til svampevækst, og den tid, der kræves til makrofagdifferentiering.
    2. Konidierne opsamles, idet trin 2.1.2-2.1.4 gentages.
    3. Den endelige pellet resuspenderes i 2-3 ml PBS. Vurder konidiernes levedygtighed ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetoden, eller tæl konidierne som nævnt i trin 2.1.5.

3. Mononukleær celleisolering (PBMC) i perifert blod

BEMÆRK: PBMC'erne opnås ved densitetsbarrieremetoden under anvendelse af en polysaccharoseopløsning med densitet 1,077 g / ml30.

  1. Der alikvotes 15 ml polysaccharoseopløsning til et 50 ml glas for hver donorprøve, der skal udtages.
  2. Opsaml 20 ml blod fra hver donor ved hjælp af tre til fire EDTA-rør. Rekrutter mindst fire donorer pr. eksperiment. Saml ikke donorernes blod; Brug i stedet hver prøve separat som en biologisk replikat. For hver donor overføres blodet til et 50 ml rør, og der tilsættes PBS for at opnå et endeligt volumen på 35 ml.
  3. Blodsuspensionen (trin 3.2) overføres langsomt langs rørets væg indeholdende polysaccharoseopløsningen (trin 3.1) til dannelse af en bifasisk suspension.
    BEMÆRK: For at forhindre blanding af blodet med polysaccharoseopløsningen tilsættes blodet langsomt. Det anbefales at anvende mindst 7 ml blod fra hver donor til PBMC-isolation.
  4. Centrifuger straks glasset indeholdende den bifasiske suspension ved 1,600 x g i 30 minutter ved 24 °C. Programmér centrifugeringen af PBMC'erne: Brug acceleration 1 og deceleration 0 for at undgå et brat stop af centrifugeringen.
  5. Overhold dannelsen af en hvid ring indeholdende PBMC'erne efter centrifugering. De røde blodlegemer og granulocytter befinder sig i det nederste lag, det næste lag indeholder polysaccharoseopløsningen, og PBMC'erne befinder sig i den hvide ring mellem polysaccharoseopløsningen og plasmaet (øverste lag). Den hvide ring opsamles forsigtigt ved at aspirere med en pipette eller en steril Pasteur-pipette for ikke at fange røde blodlegemer, plasma eller polysaccharoseopløsning, og overfør til et 15 ml rør.
  6. Der tilsættes PBS til det 15 ml rør, der indeholder PBMC'erne, for at opnå et slutvolumen på 10 ml. Suspensionen homogeniseres, og glasset centrifugeres ved 1.600 x g i 30 minutter ved 24 °C.
  7. Cellerne vaskes tre gange ved 1.600 x g i 5 minutter ved 24 °C med 10 ml PBS. Derefter resuspenderes den endelige pellet i 2 ml R10-medium.
  8. Vurder cellelevedygtigheden ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetoden, og tæl cellerne i et Neubauer-kammer.

4. Phagocytose kinetik

BEMÆRK: De humane mononukleare makrofager afledt af perifert blod behandles med T. stromaticum conidia ved en infektionsmangfoldighed (MOI) på 1:10 eller kun R10-medium som kontrol. Mangfoldigheden af infektion (MOI) repræsenterer forholdet mellem de infektiøse agenser, der tilsættes infektionsmålene og præsenteres som absolutte tal: MOI = agenter: mål31. Her bruger vi 1 T. stromaticum conidia (agent) til 10 makrofager (mål). Derefter inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i forskellige perioder (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer). Dernæst bruges et rundt glasdæksel til at visualisere de klæbende makrofager, der er involveret i fagocytoseprocessen under et mikroskop. Der findes en eksperimentel designfigur (figur 1).

BEMÆRK: Det anbefales at bruge plader med 24 brønde.

  1. Behandling af human-afledte makrofager med T. stromaticum conidia
    1. Tilsæt et sterilt rundt glasdæksel (13 mm) til hvert hul ved hjælp af steril pincet.
    2. Volumen af cellesuspensionen opnået i trin 3.7-3.8 justeres til plade 8 x 105 celler pr. hul til et slutvolumen på 1 ml med R10-medium. Brug et omvendt mikroskop til at vurdere cellemorfologien.
      BEMÆRK: Cellerne skal suspenderes i mediet og have en afrundet morfologi.
    3. Inkuber cellerne ved 37 °C under en 5% CO2 atmosfære i 7 dage, og erstat substratet med frisk R10 medium hver 2. dag til differentiering af monocytterne i makrofager32. Overhold cellemorfologien ved hjælp af et omvendt mikroskop. Makrofagerne vil præsentere spindel morfologi med flade og udvidede former; Et øget cytoplasmatisk forhold og tilstedeværelsen af pseudopodia kan også observeres. Se efter klæbende mononukleare-afledte makrofager.
      BEMÆRK: En meget lille del af udifferentierede monocytter kan forblive suspenderet i mediet.
    4. Fjern mediet i hvert hul ved hjælp af en pipette, og vask cellerne med 1 ml PBS for at fjerne snavs og ikke-klæbende celler.
    5. Suspensionen fremstillet i trin 2.2 anvendes til fremstilling af en ny suspension af T. stromaticum conidia i en slutkoncentration på 8 x 104 konidier/ml i R10-medium.
    6. Der tilsættes 1 ml conidia suspension fremstillet i trin 4.1.5 til hvert behandlingshul (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer) for at opnå en MOI på 1:10. Til kontrollerne tilsættes kun 1 ml R10-medium til brønden.
    7. Udfordr makrofagerne i 3 timer med T. stromaticum conidia ved 37 °C under en 5% CO2 atmosfære. Efter 3 timer fjernes mediet, og cellerne vaskes for at fjerne de ikke-fagocyterede konidier.
    8. Der tilsættes 1 ml R10-substrat til hvert hul, og pladen inkuberes på forskellige tidspunkter (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer) ved 37 °C under en 5 % CO2 atmosfære.
  2. Farvning og analyse
    1. Substratet fjernes fra hvert hul, når den tilsvarende inkubation (trin 4.1.8) er afsluttet, og der tilsættes 1 ml PBS til dette hul.
    2. Fjern de runde glasdæksler fra brøndene ved hjælp af steril pincet og en nål til farvning med et farvningssæt.
      BEMÆRK: Alternativt kan farvning udføres ved hjælp af May Grünwald-Giemsa plet33.
    3. Til hver af de runde glasdæksler tilsættes pletfiksator (5 s), farvestof 1 (5 s), farvestof 2 (2 s) og bufret vand pH 7,0 (5 s), som er komponenterne i farvningssættet. Vent, indtil de er tørre, og fastgør dækslerne på et glasglas ved hjælp af monteringsmiddel.
    4. Kvantificer resultatet: Tæl i alt 100 makrofager (Mø) for hver tidstilstand. Brug et optisk mikroskop til at tælle antallet af makrofager med fagocyterede konidier ved hjælp af en 100x objektiv og nedsænkningsolie (ligning [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Få antallet af konidier fagocyteret pr. makrofag: Korreler de konidier, der er til stede i 100 makrofager, divideret med antallet af makrofager med mindst et fagocyteret konidium (ligning [2])34.
      Equation 2 (2)
      BEMÆRK: For at evaluere og tælle konidierne kan ImageJ-softwaren bruges35.
    6. Fotografer fagocytosen fra hver prøve og tidstilstand ved hjælp af 40x og 100x mål for at præsentere resultaterne.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af fagocytose og konidial levedygtighedsanalyse ved anvendelse af humane mononukleare makrofager afledt af humant perifert blod. (1-10) Phagocytose assay: T. stromaticum skal dyrkes i PDA, og konidierne genvindes ved at vaske pladen med PBS. PBMC'erne skal isoleres ved densitetsbarrieremetoden ved anvendelse af den beskrevne protokol, dyrkes i plader med 24 brønde med sterile runde glasdæksler i 7 dage til differentiering i makrofager og derefter behandles med en MOI på 1:10 med forskellige tidsintervaller. De runde glasdæksler fjernes og farves med farvningssættet, og resultaterne analyseres ved hjælp af lysmikroskopi. (1-8,11-13) Conidia levedygtighedsanalyse: Efter isolering dyrkes PBMC'erne i 24-brøndplader uden runde glasdæksler i 7 dage til differentiering i makrofager og behandles derefter med en MOI på 1:10 for forskellige tidsintervaller. Cellerne lyseres ved inkubation med destilleret vand; suspensionen centrifugeres derefter, og derefter belægges den resuspenderede pellet i PDA for at analysere vækstkinetikken af Trichoderma. Denne figur blev designet ved hjælp af en database med billeder. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Conidial levedygtighedsanalyse efter fagocytose

BEMÆRK: Der findes en eksperimentel designfigur (figur 1).

BEMÆRK: Brug plader med 24 brønde.

  1. Udfordre de menneskeafledte makrofager med T. stromaticum conidia.
    1. Gentag trin 4.1.2-4.1.8 for at differentiere monocytterne, og behandl makrofagerne med T. stromaticum conidier.
      BEMÆRK: Brug ikke runde glasdæksler i brøndene. Brug de samme tidsintervaller, der anvendes til analyse af fagocytosekinetikken, så fagocytosen kan korreleres med den konidiale levedygtighed.
    2. R10-substratets indvirkning på væksten i T. stromaticum vurderes ved hjælp af huller med suspensionen fremstillet i trin 4.1.5 (R10-medium + konidier) som kontrol.
  2. Analyse af kondidens levedygtighed
    1. Fjern mediet efter hver inkubationsperiode (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 120 timer), og vask cellerne to gange med PBS for at fjerne de konidier, der ikke er fagocyteret.
      BEMÆRK: Kontrollen indeholdende R10 medium + konidier må ikke vaskes.
    2. Der tilsættes 0,5 ml sterilt destilleret vand til hvert hul, og pladen inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter. Efter denne tid skal du observere cellemorfologien under et omvendt mikroskop for at sikre, at cellerne er blevet lyseret.
    3. Opsaml suspensionen, og overfør den til 1,5 ml rør. Centrifuger suspensionen med en minicentrifuge ved 6.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Supernatanten kasseres forsigtigt, pellets resuspenderes i 10 μliter sterilt destilleret vand, og 10 μl af suspensionen podes i den PDA-holdige plade ved 28 °C i mørke.
    5. Forbered en positiv kontrol for T. stromaticum-vækst : Brug suspensionen af T. stromaticum conidia (trin 2.2) til at forberede en ny suspension med en slutkoncentration på 8 x 106 konidier/ml. Plade 10 μL af denne suspension i PDA ved 28 °C i mørke.
      BEMÆRK: 10 μL af denne suspension vil indeholde det samme antal konidier (8 x 104), som blev brugt til at inficere blodets mononukleare makrofager. Forskellen mellem denne positive kontrol og den, der er nævnt i trin 5.1.2, er, at den kontrol, der er nævnt ovenfor i trin 5.1.2, anvendes til at evaluere R10-substratets mulige indvirkning på væksten af Trichoderma i fagocytoseperioden. Denne positive kontrol i trin 5.2.5 ved anvendelse af suspensionen af T. stromaticum conidia opsamlet i PBS repræsenterer en kontrol for Trichoderma-vækst uden påvirkning af R10-medium for at afspejle, hvordan svampen vokser naturligt. Ved hjælp af denne kontrol er det muligt at vurdere, om R10-mediet påvirker Trichoderma-væksten .
    6. Overhold vækstkinetikken af T. stromaticum i PDA hver dag, og fotografer kulturen.
    7. Analyse: To punkter kan bruges til at evaluere resultaterne: 1) den tid (i dage), der kræves for kulturen at optage hele kulturpladen, og 2) tiden (i dage) indtil udseendet af den karakteristiske grønne pigmentering af T. stromaticum conidia i kultur.

6. Statistisk analyse

  1. Brug en Kruskal-Wallis test til at bestemme statistisk signifikante forskelle mellem de 8 grupper/behandlinger. Betragt p < 0,05 som statistisk signifikant. Alle data præsenteres som middel ± standardafvigelse (SD). I figurerne angiver # statistisk signifikans ved p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teknikken, der involverer fagocytose af svampekonidier ved makrofager, anvendes i vid udstrækning til undersøgelser, der evaluerer moduleringen af immunresponserne mod svampe. Vi brugte fagocytosen af T. stromaticum conidia til at vurdere levedygtigheden af konidierne efter fagocytose, da unddragelse af fagocytose og flugt af fagosomer er mekanismer for svampevirulens. Forskere bør udføre disse teknikker som et af de første assays, når de undersøger en art af klinisk interesse.

Figure 2
Figur 2: Phagocytose af T. stromaticum conidia af humane perifere blod mononukleare-afledte makrofager. Repræsentative resultater af fagocytosekinetik (A) under 40x og (B) 100x mål, der viser PBMC-afledte makrofager indeholdende T. stromaticum conidier. C) T. stromaticum conidia fri og fastgjort til den ydre membran D) T. stromaticum conidia fuldstændigt internaliseret af makrofager; E) T. stromaticum conidia i et øvre plan F) multipel fagocytose og (G) konidier spiring inde i (H) og uden for makrofagerne. Pile: gul, fri conidier; hvide, konidier fastgjort til den ydre membran; sort, fuldstændig internaliseret conidier; rød, konidier spiring inde i makrofagerne. stiplede pile: sort, multipel fagocytose; røde, konidier, der spirer i R10-substratet uden for makrofagerne; hvid, konidier i det øverste plan. Skalabjælken angiver 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2 viser de repræsentative resultater af fagocytosekinetikken. I begyndelsen af fagocytoseprocessen kan der observeres frie T. stromaticum conidier såvel som konidier fastgjort til makrofagernes ydre membran eller fuldstændigt internaliseret af dem (figur 2A-C). Færre konidier kan observeres fri eller bundet til makrofagernes ydre membran med stigende fagocytosetid.

Især i dette arbejde kunne konidier findes fri og fastgjort til den ydre membran (figur 2C) i begyndelsen af fagocytoseprocessen, fuldstændigt internaliseret af makrofagerne (figur 2D) eller i et øvre plan sammenlignet med makrofagerne (figur 2E), men ikke fagocyteret, og mere end et conidium kunne findes i samme makrofag (figur 2F). Efter lange perioder (96 timer) kunne fagocyterede konidier spire inde i makrofagerne (figur 2G), og frie konidier kunne spire i R10-mediet for at danne hyfer ved 37 ° C (figur 2H).

Efter fagocytose var det muligt at observere, at T. stromaticum conidia forblev levedygtig, selv efter 120 timers interaktion med de humane PBMC-afledte makrofager. De repræsentative resultater viser kulturen af genvundne konidier (figur 3A) og repræsenterer den tid (i dage), der kræves for kulturen at optage hele kulturpladen (figur 3B) og danne farvede grønne konidier (figur 3C). Kun diskrete T. stromaticum conidia var i stand til at undgå fagosomet og findes frit i cytoplasmaet i det humane perifere blodmononukleare makrofager29. Trichodermas evne til at nedsætte produktionen af reaktive ilt- og kvælstofarter kan også bidrage til overlevelsen af konidier inde i fagosomet og forklare levedygtigheden efter fagocytose 28,29,36. Indtil videre har vi vist, at de fagocyterede konidier forbliver levedygtige og er i stand til at vokse i PDA-mediet selv efter 120 timer. Andre mikroorganismer er også blevet rapporteret at overleve efter opslugning af makrofager, såsom Aspergillus27,37 og Cryptococcus38.

Figure 3
Figur 3: Clearance evne af humane perifere blod mononukleare-afledte makrofager inficeret med T. stromaticum conidia. Efter en udfordring med T. stromaticum conidia (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer eller 120 timer) blev de PBMC-afledte makrofager lyseret, og suspensionen blev belagt i PDA for at evaluere levedygtigheden af de fagocytoserede konidier. (A) Repræsentative resultater af T. stromaticum-vækst efter fagocytose ved PBMC-afledte makrofager vises. Overvågning (B) T . stromaticum-vækst og (C) konidiation på forskellige dage for den positive kontrol med T. stromaticum i PBS (se trin 5.2.5), kontrollen for R10-substratet (se trin 5.1.2) og konidierne fagocyteret af makrofager i forskellige tidsperioder (3 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, 120 timer). Repræsentative resultater fra fire raske donorer. Gennemsnitlig ± standardafvigelse (SD). Kruskal-Wallis test. Symbolet # angiver signifikans ved p < 0,05, n = 4. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For flere svampepatogener, herunder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans og andre, er conidial eller gærfagocytose en nøgleproces, der muliggør undersøgelse af de cytoplasmatiske og molekylære begivenheder i makrofagpatogeninteraktioner såvel som til bestemmelse af dødstidspunktet for de internaliserede konidier 14,39,40. Phagocytose er nøgleprocessen i Trichoderma-værtsinteraktionen. Trichoderma-slægten modulerer flere fagocytoseveje, herunder Dectin-1 og Dectin-2, Toll-lignende receptor 2 og Toll-lignende receptor 4, MHC og NF-κB 25,28,41,42,43. Trichoderma forårsager trichodermose hos kompromitterede og ikke-immunkompromitterede individer9. Det er vigtigt, at flere arter af denne slægt anvendes i landbruget og er den potentielle kilde til Trichodermosis. Forståelse af virulensfaktorerne for T. stromaticum og mekanismen for immunresponset i menneskekroppen mod disse svampe er presserende nødvendig, da erhvervsmæssige farer forårsaget af Trichoderma-arterne, herunder T. stromaticum, stiger alarmerende. Metoden, der præsenteres her, giver detaljer til udførelse af fagocytose og dræbende assay til undersøgelse af Trichoderma-makrofaginteraktionen i humane perifere blodafledte makrofager; Denne metode kan dog også bruges til at studere makrofager fra forskellige væv, herunder alveolære, peritoneale eller afstamningsmakrofager.

Det første trin i denne protokol starter med en moderstamme (M1) suspension for at opnå friske kulturer af svampen. Trichoderma-kulturer vokser hurtigt, da de normalt overtager hele pladen og begynder at vise grønfarvede konidier inden for 5 dage. Temperatur og lys er afgørende faktorer for Trichodermas vækst, og ændringer i disse faktorer kan påvirke Trichodermas kinetik og kompromittere eksperimentet44.

Efter vask af T. stromaticum-kulturen skal et slutvolumen mellem 5-8 ml genvindes. Suspensionens farveintensitet er proportional med konidiakoncentrationen. Den opnåede conidia suspension kan anvendes til in vitro og in vivo assays, såsom til vurdering af fagocytose26, neutrofile ekstracellulære fælder28, intranasal eksponering36,41, intraperitoneal eksponering26, intrakutan infektion45 og intravenøs infektion46. Tidligere forskning udført med humane makrofager har evalueret autofagi induceret af Trichoderma29 og slægtens evne til at hæmme dannelsen af ekstracellulære fælder i neutrofiler28, hvilket er en mekanisme, der anvendes til at eliminere svampepatogener og andre mikroorganismer.

Det er vigtigt at bemærke, at dyrkningsmediet, der bruges til at opretholde cellerne, kan påvirke konidial spiring (figur 3G, H). Hvis spiring ikke ønskes til et bestemt eksperiment, anbefaler vi at udføre et indledende screeningsassay med cellekulturmediet for at fastslå vækstkinetikken af Trichoderma i det pågældende medium. Dette assay skal udføres, før in vitro-forsøgene med den ønskede celleafstamning påbegyndes, og forsøget skal stoppes efter 72 timer, hvis substratet viser sig ikke at være kompatibelt. Spiring af Trichoderma conidia (figur 3G, H) kan observeres fra 96 timer inden for og uden for makrofagerne.

Da Trichoderma-arter præsenterer forskelle i morfologi og den optimale temperatur og pH for deres vækst, er de resultater, der præsenteres her, muligvis ikke reproducerbare for alle arter af slægten, og denne protokol kan have brug for tilpasninger, når den udføres med andre arter. Som et eksempel spirer Trichoderma asperelloides conidia hurtigere i kultur end T. stromaticum.

Tidligere dokumenterede protokoller til evaluering af fagocytose og drab af patogenet ved hjælp af flowcytometri og fluorescensmikroskopi kræver dyre reagenser, men de giver specifik information om fagocytoseprocessen19. Protokollen præsenteret i denne artikel kræver kun et optisk mikroskop og pladevækst for at evaluere fagocytose og giver omfattende billeder af fagocytoseprocessen. Forskellige protokoller kan bruges til at opnå differentierede makrofager og inducere makrofaglyse. Disse protokoller inkluderer brugen af forskellige tidspunkter for makrofagdifferentiering i stedet for de 7 dage, der bruges her26 eller brugen af 2,5% deoxycholat47 til at lyse makrofagerne i stedet for destilleret vand ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter, som brugt her i denne protokol. Disse metoder er blevet effektivt anvendt til forskellige svampearter såsom A. fumigatus27, A. nidulans18 og Cryptococcus neoformans15.

Nogle begrænsninger i denne protokol er relateret til brugen af PBS, der ikke er endotoksinfri, brugen af runde glasdæksler og brugen af humant blod. Vi anbefaler at teste PBS (ikke endotoksinfri) på celler for at sikre, at den ikke kan aktivere monocytterne og bias eksperimentet. Brugen af runde glasdæksler er meget nyttig til farvning og tælling af cellerne, men cellerne spredes muligvis ikke jævnt under diaset, da nogle celler migrerer til kanten af pladen godt, og denne forskel kan have indflydelse på det estimerede samlede celleantal i de runde glasdæksler. Da vi ikke bruger immunofluorescens eller lignende teknikker i denne protokol, kan tilstedeværelsen af ikke-fagocytoserede konidier i et øvre plan sammenlignet med makrofagerne føre til fejlfortolkning af fagocytoseresultaterne. Da vi bruger blod fra menneskelige donorer, varierer det endelige PBMC-tal mellem donorer, og lave donorcelletal er muligvis ikke tilstrækkelige til alle forsøg.

Sammenfattende kan disse teknikker bruges til at måle funktionen af makrofager og svampeclearance, specifikt til filamentøse svampe såsom Trichoderma og andre mikrober, såsom gær og bakterier. Desuden giver denne protokol fremtidige anvisninger til undersøgelse af reel variabilitet i immunresponset mod konidiedannende svampe i menneskelige populationer, som ikke kan observeres ved hjælp af isogene dyremodeller eller cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af følgende brasilianske finansieringsinstitutioner: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) med tilskud RED0011/2012 og RED008/2014. U.R.S., J.O.C. og M.E.S.M. anerkender stipendiet fra henholdsvis Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) og FAPESB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Levedygtighedsanalyse Trichoderma stromaticum Conidier Mononukleart makrofager afledt af humant perifert blod fagocytose makrofagpatogeninteraktioner immunresponser mod svampe fagosomflugt svampevirulens biokontrolmiddel biogødningsmiddel humane infektioner trichodermakultur vask af konidier mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) makrofagdifferentiering in vitro fagocytosemetode clearance assay svampeclearance effektivitet
Levedygtighedsanalyse af <em>Trichoderma stromaticum</em> conidia inde i humant perifert blod mononukleart afledt makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter