Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levensvatbaarheidstest van Trichoderma stromaticum Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het evalueren van de fagocytose en klaringsmogelijkheden van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed gestimuleerd met Trichoderma stromaticum conidia.

Abstract

Macrofagen vormen een cruciale verdedigingslinie en zijn verantwoordelijk voor het voorkomen van de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Conidiumfagocytose is een sleutelproces dat het mogelijk maakt om de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken die betrokken zijn bij interacties tussen macrofagen en pathogenen, evenals voor het bepalen van het tijdstip van overlijden van geïnternaliseerde conidiën. De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen zijn mechanismen van schimmelvirulentie. Hier rapporteren we de methoden die kunnen worden gebruikt voor de analyse van de fagocytose, klaring en levensvatbaarheid van T. stromaticum conidia, een schimmel die wordt gebruikt als biologisch bestrijdingsmiddel en biomeststof en in staat is om menselijke infecties te veroorzaken. Het protocol bestaat uit 1) Trichoderma-kweek , 2) wassen om conidia te verkrijgen, 3) de isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van de polysucrose-oplossingsmethode en de differentiatie van de PBMC's in macrofagen, 4) een in vitro fagocytosemethode met behulp van ronde glazen dekglaasjes en kleuring, en 5) een klaringstest om de levensvatbaarheid van conidia na conidia-fagocytose te beoordelen. Samengevat kunnen deze technieken worden gebruikt om de efficiëntie van het opruimen van schimmels van macrofagen te meten.

Introduction

Het geslacht Trichoderma (Orde: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) is samengesteld uit alomtegenwoordige, saprofytische schimmels die parasieten zijn van andere schimmelsoorten en in staat zijn om een reeks commercieel nuttige enzymen te produceren1. Deze schimmelsoorten worden gebruikt voor de productie van heterologe eiwitten2, de productie van cellulose3, ethanol, bier, wijn en papier4, in de textielindustrie5, de voedingsindustrie6 en in de landbouw als biologische bestrijders 7,8. Naast de industriële belangstelling voor deze schimmelsoorten, heeft het toenemende aantal infecties bij mensen sommige Trichoderma-soorten de status van opportunistischepathogenen gegeven.

Trichoderma spp. groeit snel in cultuur, met aanvankelijk witte en donzige kolonies die groengeel tot donkergroen worden10. Ze zijn aangepast om te leven in een breed scala aan pH- en temperatuuromstandigheden, en de opportunistische soorten zijn in staat om te overleven bij fysiologische pH en temperaturen en zo verschillende menselijke weefsels te koloniseren 11,12,13. Belangrijk is dat de stijging van het infectiepercentage van Trichoderma spp. kan in verband worden gebracht met virulentiefactoren, en deze zijn niet goed bestudeerd. Bovendien zijn studies die zich richten op het begrijpen van de immuunrespons tegen opportunistische Trichoderma-soorten nog steeds zeldzaam.

Tijdens een infectie vertegenwoordigen macrofagen, samen met neutrofielen, de verdedigingslinie die verantwoordelijk is voor fagocytose en voorkomen ze dus de groei en kolonisatie van ziekteverwekkers in verschillende weefsels. Met behulp van patroonherkenningsreceptoren, zoals Toll-achtige receptoren en C-type lectinereceptoren, fagocytose macrofagen schimmels en verwerken ze tot fagolysosomen, waardoor een respiratoire uitbarsting, de afgifte van pro-inflammatoire cytokines en de vernietiging van de gefagocyteerde micro-organismen wordt bevorderd14. Het mechanisme van fagocytose kan echter worden beïnvloed en ontweken door verschillende microbiële strategieën, zoals de grootte en vorm van de schimmelcellen; de aanwezigheid van capsules die fagocytose belemmeren; vermindering van het aantal fagocytose-inducerende receptoren; de hermodellering van de structuur van actinevezels in het cytoplasma; het belemmeren van de vorming van pseudopodia; en fagosoom of fagolysosoom ontsnappen na het fagocytoseproces14.

Veel ziekteverwekkers, waaronder Cryptococcus neoformans, gebruiken macrofagen als een niche om in de gastheer te overleven, zich te verspreiden en infectie te induceren15. De fagocytose- en klaringstest wordt gebruikt om de immuunrespons tegen ziekteverwekkers te evalueren en om de microbiële strategieën te identificeren die worden gebruikt om het aangeboren immuunsysteem te omzeilen 15,16,17. Dit type techniek kan ook worden gebruikt om de differentiële kinetiek van fagocytose, vertraagde fagosoomverzuring en oxidatieve uitbarsting te onderzoeken die resulteren in verminderde schimmeldoding18.

Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om fagocytose, schimmeloverleving en het ontwijken van het fagosoomrijpingsproces te evalueren. Deze omvatten fluorescentiemicroscopie, die wordt gebruikt om fagocytose, de cellulaire locatie en de moleculen die tijdens fagocytose worden geproduceerd te observeren19; flowcytometrie, die kwantitatieve gegevens over fagocytose oplevert en wordt gebruikt om de verschillende markers die bij het proces betrokken zijn te evalueren20,21; intravitale microscopie, die wordt gebruikt om microbiële vangst en fagosoomrijping te beoordelen22; antilichaam-gemedieerde fagocytose, die wordt gebruikt om de specificiteit van het fagocytoseproces voor een ziekteverwekker te beoordelen23; en anderen 24,25,26,27.

Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een veelgebruikte, goedkope en directe methode met behulp van een optische microscoop en plaatgroeitest om de fagocytose en het doden van schimmelconidia te beoordelen. Dit protocol geeft de lezers stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van de fagocytose- en klaringstest met behulp van mononucleair afgeleide macrofagen uit menselijk perifeer bloed die zijn blootgesteld aan T. stromaticum. PBMC's werden gebruikt omdat Trichoderma conidia wereldwijd worden toegepast als biologische bestrijding tegen fytopathogenen en als biomeststof voor plantaardige gewassen en verschillende menselijke infecties hebben veroorzaakt, Trichodermose genaamd. Daarnaast zijn er slechts twee eerdere werken die zich richten op de interactie tussen Trichoderma conidia en het menselijke immuunsysteem, waarin we neutrofielen28 en autofagie in macrofagen29 hebben onderzocht. Dit artikel laat eerst zien hoe de fagocytose van de conidia van T. stromaticum door PBMC-afgeleide macrofagen kan worden bestudeerd, en vervolgens hoe de levensvatbaarheid van de verzwolgen conidia kan worden beoordeeld met behulp van eenvoudige microscopie-gebaseerde technieken. Dit protocol kan verder onderzoek vergemakkelijken naar macrofaag-geassocieerde immuunrespons of immuunsysteemmodulatie-gerelateerde mechanismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethische overwegingen en menselijke subjecten
Alle experimenten met mensen die in deze studie worden beschreven, werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en de Braziliaanse federale wetten en goedgekeurd door de ethische commissie van de Staatsuniversiteit van Santa Cruz (projectidentificatiecode: 550.382/ 2014).

Menselijk perifeer bloed werd verzameld van gezonde vrijwilligers uit de stad Ilhéus, Bahia, Brazilië, die niet werden blootgesteld aan beroepsactiviteiten die verband hielden met de bestudeerde schimmel. Personen met gemelde gezondheidsproblemen of die medicijnen gebruikten, werden uitgesloten. Alle proefpersonen stemden er vrijwillig mee in om deel te nemen en ondertekenden een formulier voor geïnformeerde toestemming voordat ze in dit onderzoek werden opgenomen.

1. Bereiding van de reagentia en oplossingen

NOTITIE: Bereid de volgende reagentia en oplossingen voor voordat u verder gaat. Zie de Materiaaltabel (TOM) voor informatie over het reagens en de leverancier van het materiaal.

  1. Bereid 1x een uitgebalanceerde steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    OPMERKING: In dit protocol werd geen endotoxinevrije PBS gebruikt.
  2. Bereid aardappeldextrose-agar (PDA) medium en giet 20 ml in elke petrischaal voor de T. stromaticum-cultuur . Bereid zes platen met PDA voor elke donor en gebruik één plaat voor elke aandoening: 3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur. Gebruik bovendien drie platen voor elke regeling: drie voor de Trichoderma-regeling en drie voor de R10-mediumregeling. Gebruik petrischaaltjes van 60 mm x 15 mm of 100 mm x 15 mm voor een optimaal herstel van de conidia.
  3. Steriliseer 100% glycerol.
  4. Bereid een R10-medium voor de celkweek: RPMI-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% antibioticum (penicilline/streptomycine).
  5. Steriliseer gedestilleerd water voor de cellyse.
  6. Bereid water met een pH van 7.0 voor op het kleurproces.
    OPMERKING: Pas indien nodig de pH aan met behulp van een pH-meter en oplossingen van 0.1 M/L NaOH en 0.1 M/L HCl.
  7. Steriliseer rond glazen dekglaasje (13 mm) en pincet.

2. Trichoderma stromaticum kweek en verwerking

  1. Bereiding van een moederstam (M1) van T. stromaticum:
    OPMERKING: Een moederstam (M1) is vereist om ervoor te zorgen dat alle experimenten worden uitgevoerd in de cultuur van dezelfde verse generatie (F1).
    1. Kweek een T. stromaticum-inoculum in petrischaaltjes met PDA bij 28 °C in het donker gedurende 7-10 dagen totdat de conidia worden waargenomen en de cultuur groen wordt.
    2. Was de cultuur van T. stromaticum. Voeg met een pipet 3-5 ml PBS toe aan het kweekoppervlak. Verzamel de PBS van de plaat en verdeel het opnieuw over de kweek om de conidia geleidelijk te verwijderen met behulp van de pipet. Herhaal dit proces zo vaak als nodig is totdat de suspensie donkergroen wordt.
      OPMERKING: Als alternatief wordt voorgesteld om de cultuur voorzichtig te wassen door 3-5 ml PBS aan de plaat toe te voegen, gevolgd door een cirkelvormige beweging uit te voeren totdat de suspensie groen wordt om de conidia te herstellen. Bij herhaald pipetteren kunnen meer conidia worden verzameld.
    3. Breng de teruggewonnen suspensie van de plaat over in een steriele buis van 15 ml met een pipet. Herhaal stap 2.1.2-2.1.3 zo vaak als nodig is om meer conidia te verkrijgen.
    4. Centrifugeer de suspensie bij 1.160 x g gedurende 5 minuten bij 12 °C en resuspendeer de pellet in 5 ml PBS. Herhaal deze stap (2.1.4) driemaal om een hyfen vrije suspensie te verkrijgen.
      NOTITIE: Om de pellet goed te resuspenderen, wordt na het centrifugeren een korte vortex aanbevolen.
    5. Resuspendeer de laatste pellet in 2-3 ml PBS en tel de conidia in een Neubauer-kamer met een verdunning van 1:100 of 1:1.000.
      OPMERKING: In optimale omstandigheden kan een eindconcentratie van 2 x 108 conidiën/ml uit de kweek worden teruggewonnen. Het beoordelen van de levensvatbaarheid van conidia met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode is optioneel.
    6. Aliquot de suspensie in steriele buisjes van 1,5 ml door 0,5 ml van de conidia-suspensie (uit stap 2.1.5) aan elk buisje toe te voegen. Voeg vervolgens 0,5 ml steriele 100% glycerol toe om M1-voorraden te verkrijgen. Vortex kort, identificeer de buizen en bewaar ze bij -20 °C of -80 °C.
  2. Kweek van T. stromaticum en het verkrijgen van conidia voor het experiment
    1. Plaat 10 μL van de M1-suspensie (bereid in stap 2.1) in PDA bij 28 °C in het donker gedurende 7-10 dagen totdat de conidia zijn waargenomen en de cultuur groen wordt om de nieuwe F1-generatie te verkrijgen.
      OPMERKING: Om een verse T. stromaticum-cultuur voor het experiment te garanderen, beoordeelt u de tijd die nodig is voor schimmelgroei en de tijd die nodig is voor macrofaagdifferentiatie.
    2. Verzamel de conidia en herhaal stap 2.1.2-2.1.4.
    3. Resuspendeer de laatste pellet in 2-3 ml PBS. Beoordeel de levensvatbaarheid van de conidia met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode, of tel de conidia zoals vermeld in stap 2.1.5.

3. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC)

OPMERKING: De PBMC's worden verkregen door de dichtheidsbarrièremethode met behulp van een polysucroseoplossing met een dichtheid van 1.077 g/ml30.

  1. Aliquot 15 ml van de polysucrose-oplossing op één buisje van 50 ml voor elk donormonster dat wordt afgenomen.
  2. Verzamel 20 ml bloed van elke donor met behulp van drie tot vier EDTA-buisjes. Rekruteer minimaal vier donoren per experiment. Verzamel het bloed van de donoren niet; Gebruik in plaats daarvan elk monster afzonderlijk als een biologische replicatie. Breng voor elke donor het bloed over naar een buis van 50 ml en voeg PBS toe om een uiteindelijk volume van 35 ml te verkrijgen.
  3. Breng de bloedsuspensie (stap 3.2) langzaam over langs de wand van de buis met de polysucroseoplossing (stap 3.1) om een bifasische suspensie te vormen.
    OPMERKING: Om vermenging van het bloed met de polysucrose-oplossing te voorkomen, voegt u het bloed langzaam toe. Het gebruik van minimaal 7 ml bloed van elke donor voor de PBMC-isolatie wordt aanbevolen.
  4. Centrifugeer de buis met de bifasische suspensie onmiddellijk bij 1.600 x g gedurende 30 minuten bij 24 °C. Programmeer de centrifugatie van de PBMC's: gebruik versnelling 1 en vertraging 0 om een abrupte stop van de centrifugatie te voorkomen.
  5. Observeer de vorming van een witte ring die de PBMC's bevat na centrifugeren. De rode bloedcellen en granulocyten bevinden zich in de onderste laag, de volgende laag bevat de polysucrose-oplossing en de PBMC's bevinden zich in de witte ring tussen de polysucrose-oplossing en het plasma (bovenste laag). Vang de witte ring op door voorzichtig op te zuigen met een pipet of een steriele pasteurpipet om geen rode bloedcellen, plasma of polysucrose-oplossing te vangen en over te brengen naar een buisje van 15 ml.
  6. Voeg PBS toe aan de tube van 15 ml met de PBMC's om een eindvolume van 10 ml te verkrijgen. Homogeniseer de suspensie en centrifugeer de buis bij 1.600 x g gedurende 30 minuten bij 24 °C.
  7. Was de cellen driemaal op 1.600 x g gedurende 5 minuten bij 24 °C met 10 ml PBS. Resuspendeer vervolgens de laatste pellet in 2 ml R10 medium.
  8. Beoordeel de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypanblauwe uitsluitingsmethode en tel de cellen in een Neubauer-kamer.

4. Kinetiek van fagocytose

OPMERKING: De mononucleair afgeleide macrofagen van menselijk perifeer bloed worden behandeld met T. stromaticum conidia bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 1:10 of alleen R10-medium als controle. De multipliciteit van infectie (MOI) vertegenwoordigt de verhouding van de infectieuze agentia die aan de infectiedoelen zijn toegevoegd en wordt gepresenteerd als absolute getallen: MOI = agenten:doelen31. Hier gebruiken we 1 T. stromaticum conidia (agent) voor 10 macrofagen (targets). Vervolgens worden de cellen geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2 gedurende verschillende perioden (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur). Vervolgens wordt een rond glazen dekglaasje gebruikt om de aanhangende macrofagen die betrokken zijn bij het fagocytoseproces onder een microscoop te visualiseren. Er wordt een experimentele ontwerpfiguur gegeven (Figuur 1).

OPMERKING: Het gebruik van platen met 24 putjes wordt aanbevolen.

  1. Behandeling van van mensen afkomstige macrofagen met T. stromaticum conidia
    1. Voeg met een steriel pincet een steriel rond glazen dekglaasje (13 mm) toe aan elk putje.
    2. Pas het volume van de in de stappen 3.7-3.8 verkregen celsuspensie aan om 8 x 105 cellen per putje te plaatsen tot een eindvolume van 1 ml met R10-medium. Gebruik een omgekeerde microscoop om de celmorfologie te beoordelen.
      OPMERKING: De cellen moeten in het medium worden gesuspendeerd en een afgeronde morfologie hebben.
    3. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 7 dagen in een atmosfeer van 5% CO2 en vervang het medium om de 2 dagen door vers R10-medium voor de differentiatie van de monocyten in macrofagen32. Observeer de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop. De macrofagen zullen een spindelmorfologie vertonen, met afgeplatte en verlengde vormen; Een verhoogde cytoplasmatische ratio en de aanwezigheid van pseudopodia kunnen ook worden waargenomen. Zoek naar aanhangende mononucleair afgeleide macrofagen.
      OPMERKING: Een zeer klein deel van ongedifferentieerde monocyten kan in het medium blijven zweven.
    4. Verwijder het medium van elk putje met een pipet en was de cellen met 1 ml PBS om vuil en niet-klevende cellen te verwijderen.
    5. Gebruik de in stap 2.2 bereide suspensie voor de bereiding van een nieuwe suspensie van T. stromaticum conidia in een eindconcentratie van 8 x 104 conidiën/ml in R10-medium.
    6. Voeg 1 ml van de in stap 4.1.5 bereide conidia suspensie toe aan elk behandelingsputje (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) om een MOI van 1:10 te verkrijgen. Voeg aan de bedieningselementen slechts 1 ml R10-medium toe aan het putje.
    7. Daag de macrofagen gedurende 3 uur uit met T. stromaticum conidia bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO2 . Verwijder na 3 uur het medium en was de cellen om de niet-gefagocytoseerde conidia te verwijderen.
    8. Voeg 1 ml R10 medium toe aan elk putje en incubeer de plaat op verschillende tijdstippen (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO2 .
  2. Kleuring en analyse
    1. Verwijder het medium uit elk putje nadat de overeenkomstige incubatie (stap 4.1.8) is voltooid en voeg 1 ml PBS toe aan dat putje.
    2. Verwijder de ronde glazen dekglaasjes uit de putjes met een steriel pincet en een naald om te kleuren met een kleurset.
      OPMERKING: Als alternatief kan de kleuring worden gedaan met May Grünwald-Giemsa-beits33.
    3. Voeg aan elk van de ronde glazen dekglaasjes vlekfixator (5 s), kleurstof 1 (5 s), kleurstof 2 (2 s) en gebufferd water pH 7.0 (5 s) toe, de componenten van de kleuringsset. Wacht tot ze droog zijn en bevestig de dekglaasjes met behulp van montagemiddel op een glasplaatje.
    4. Kwantificeer het resultaat: Tel in totaal 100 macrofagen (Mø) voor elke tijdsvoorwaarde. Tel met behulp van een optische microscoop het aantal macrofagen met gefagocyteerde conidia met behulp van een 100x objectief en immersieolie (vergelijking [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Verkrijg het aantal conidia dat per macrofaag is gefagocyteerd: Correleer de conidia die aanwezig zijn in 100 macrofagen gedeeld door het aantal macrofagen met ten minste één gefagocyteerd conidium (vergelijking [2])34.
      Equation 2 (2)
      OPMERKING: Om de conidia te evalueren en te tellen, kan de ImageJ-software worden gebruikt35.
    6. Fotografeer de fagocytose van elk monster en elke tijdsvoorwaarde met behulp van 40x en 100x objectieven om de resultaten te presenteren.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van de fagocytose- en conidiumlevensvatbaarheidstest met behulp van mononucleair afgeleide macrofagen uit humaan perifeer bloed. (1-10) Fagocytose-test: De T. stromaticum moet worden gekweekt in PDA en de conidia worden hersteld door de plaat te wassen met PBS. De PBMC's moeten worden geïsoleerd door de dichtheidsbarrièremethode met behulp van het beschreven protocol, gedurende 7 dagen worden gekweekt in platen met 24 putjes met steriele ronde glazen dekglaasjes voor differentiatie in macrofagen, en vervolgens worden behandeld met een MOI van 1:10 met verschillende tijdsintervallen. De ronde glazen dekglaasjes worden verwijderd en gekleurd met de kleurkit en de resultaten worden geanalyseerd met behulp van lichtmicroscopie. (1-8,11-13) Conidia levensvatbaarheidstest: Na isolatie worden de PBMC's gedurende 7 dagen gekweekt in platen met 24 putjes zonder ronde glazen dekglaasjes voor differentiatie in macrofagen en vervolgens behandeld met een MOI van 1:10 gedurende verschillende tijdsintervallen. De cellen moeten worden gelyseerd door incubatie met gedestilleerd water; de suspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd en vervolgens wordt de geresuspendeerde pellet geplateerd in PDA om de groeikinetiek van Trichoderma te analyseren. Deze figuur is ontworpen met behulp van een database met afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Conidiumlevensvatbaarheidstest na fagocytose

OPMERKING: Er wordt een experimentele ontwerpfiguur meegeleverd (Figuur 1).

NOTITIE: Gebruik platen met 24 putjes.

  1. Daag de van mensen afkomstige macrofagen uit met T. stromaticum conidia.
    1. Herhaal stap 4.1.2-4.1.8 om de monocyten te differentiëren en behandel de macrofagen met T. stromaticum conidia.
      NOTITIE: Gebruik geen ronde glazen dekglaasjes in de putjes. Gebruik dezelfde tijdsintervallen die worden gebruikt voor het bepalen van de fagocytosekinetiek, zodat de fagocytose kan worden gecorreleerd met de conidiale levensvatbaarheid.
    2. Evalueer het effect van het R10-medium op de groei van T. stromaticum door putjes met de in stap 4.1.5 bereide suspensie (R10-medium + conidiën) als controle te gebruiken.
  2. Conidium-levensvatbaarheidstest
    1. Verwijder het medium na elke incubatieperiode (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur en 120 uur) en was de cellen tweemaal met PBS om de conidia te verwijderen die niet zijn gefagocyteerd.
      OPMERKING: De controle die R10 medium + conidia bevat, mag niet worden gewassen.
    2. Voeg 0,5 ml steriel gedestilleerd water toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 . Observeer na deze tijd de celmorfologie onder een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen zijn gelyseerd.
    3. Vang de suspensie op en breng deze over in buisjes van 1,5 ml. Centrifugeer de suspensie met behulp van een minicentrifuge op 6.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Gooi het supernatans voorzichtig weg, resuspendeer de pellet in 10 μL steriel gedestilleerd water en inoculeer 10 μL van de suspensie in de PDA-houdende plaat bij 28 °C in het donker.
    5. Bereid een positieve controle voor de groei van T. stromaticum voor: Gebruik de suspensie van T. stromaticum conidia (stap 2.2) om een nieuwe suspensie te bereiden met een eindconcentratie van 8 x 106 conidiën/ml. Plaat 10 μL van deze suspensie in PDA bij 28 °C in het donker.
      OPMERKING: 10 μL van deze suspensie bevat hetzelfde aantal conidia (8 x 104) dat werd gebruikt om de mononucleair afgeleide macrofagen in het bloed te infecteren. Het verschil tussen deze positieve controle en de in stap 5.1.2 genoemde controle is dat de hierboven in stap 5.1.2 genoemde controle wordt gebruikt om de mogelijke invloed van het R10-medium op de groei van Trichoderma tijdens de fagocytose te evalueren. Deze positieve controle in stap 5.2.5 met behulp van de suspensie van T. stromaticum conidia verzameld in PBS vertegenwoordigt een controle voor de groei van Trichoderma zonder de invloed van R10-medium om weer te geven hoe de schimmel van nature groeit. Met behulp van deze controle is het mogelijk om te evalueren of het R10-medium de groei van Trichoderma beïnvloedt.
    6. Observeer elke dag de groeikinetiek van T. stromaticum in PDA en fotografeer de kweek.
    7. Analyse: Twee punten kunnen worden gebruikt om de resultaten te evalueren: 1) de tijd (in dagen) die nodig is voor de kweek om de hele kweekplaat in beslag te nemen, en 2) de tijd (in dagen) tot het verschijnen van de karakteristieke groene pigmentatie van de T. stromaticum conidia in cultuur.

6. Statistische analyse

  1. Gebruik een Kruskal-Wallis-test om statistisch significante verschillen tussen de 8 groepen/behandelingen vast te stellen. Beschouw p < 0,05 als statistisch significant. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviatie (SD). In de figuren geeft # statistische significantie aan bij p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. We gebruikten de fagocytose van T. stromaticum conidia om de levensvatbaarheid van de conidia na fagocytose te beoordelen, aangezien het ontwijken van fagocytose en het ontsnappen van fagosomen mechanismen zijn van schimmelvirulentie. Onderzoekers zouden deze technieken moeten uitvoeren als een van de eerste tests bij het onderzoeken van een soort van klinisch belang.

Figure 2
Figuur 2: Fagocytose van T. stromaticum conidia door mononucleair afgeleide macrofagen van humaan perifeer bloed. Representatieve resultaten van fagocytosekinetiek (A) onder 40x en (B) 100x objectieven die PBMC-afgeleide macrofagen tonen die T. stromaticum conidia bevatten. C) T. stromaticum conidia, vrij en gehecht aan het buitenmembraan; (D) T. stromaticum conidia volledig geïnternaliseerd door macrofagen; E) T. stromaticum conidia in een bovenvlak; (F) multipele fagocytose; en (G) conidia kieming binnen (H) en buiten de macrofagen. Pijlen: geel, vrije conidiën; wit, conidia bevestigd aan het buitenmembraan; zwarte, volledig geïnternaliseerde conidiën; rood, conidia kieming in de macrofagen. Gestippelde pijlen: zwart, meervoudige fagocytose; rood, conidia ontkiemen in het R10-medium buiten de macrofagen; wit, conidia in het bovenste vlak. De schaalbalk geeft 20 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 toont de representatieve resultaten van de fagocytosekinetiek. In het begin van het fagocytoseproces kunnen vrije T. stromaticum conidia worden waargenomen, evenals conidia die aan het buitenmembraan van macrofagen zijn gehecht of door hen volledig zijn geïnternaliseerd (Figuur 2A-C). Er kunnen minder conidia worden waargenomen die vrij zijn of vastzitten aan het buitenmembraan van de macrofagen met toenemende fagocytosetijd.

Met name in dit werk konden conidia vrij worden gevonden en vastgehecht aan het buitenmembraan (Figuur 2C) aan het begin van het fagocytoseproces, volledig geïnternaliseerd door de macrofagen (Figuur 2D), of in een bovenvlak vergeleken met de macrofagen (Figuur 2E) maar niet gefagocyteerd, en er kon meer dan één conidium worden gevonden in dezelfde macrofaag (Figuur 2F). Na lange perioden (96 uur) konden gefagocyteerde conidia ontkiemen in de macrofagen (figuur 2G), en vrije conidia konden ontkiemen in het R10-medium om hyfen te vormen bij 37 °C (figuur 2H).

Na fagocytose was het mogelijk om vast te stellen dat T. stromaticum conidia levensvatbaar bleef, zelfs na 120 uur interactie met de menselijke PBMC-afgeleide macrofagen. De representatieve resultaten tonen de kweek van teruggevonden conidia (Figuur 3A) en vertegenwoordigen de tijd (in dagen) die de cultuur nodig heeft om de hele kweekplaat in beslag te nemen (Figuur 3B) en om gekleurde groene conidia te vormen (Figuur 3C). Alleen discrete T. stromaticum conidia waren in staat om het fagosoom te ontwijken en vrij te worden gevonden in het cytoplasma van de mononucleair afgeleide macrofagen van menselijk perifeer bloed29. Het vermogen van Trichoderma om de productie van reactieve zuurstof- en stikstofsoorten te verminderen, kan ook bijdragen aan de overleving van conidia in het fagosoom en de levensvatbaarheid na fagocytose verklaren 28,29,36. Tot nu toe hebben we aangetoond dat de gefagocyteerde conidia levensvatbaar blijven en zelfs na 120 uur in het PDA-medium kunnen groeien. Van andere micro-organismen is ook gemeld dat ze overleven na verzwelging door macrofagen, zoals Aspergillus27,37 en Cryptococcus38.

Figure 3
Figuur 3: Klaringsvermogen van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed die zijn geïnfecteerd met T. stromaticum conidia. Na een provocatie met T. stromaticum conidia (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur of 120 uur) werden de PBMC-afgeleide macrofagen gelyseerd en werd de suspensie in PDA geplateerd om de levensvatbaarheid van de gefagocyteerde conidia te evalueren. (A) Representatieve resultaten van de groei van T. stromaticum na fagocytose door PBMC-afgeleide macrofagen worden getoond. Monitoring (B) de groei van T. stromaticum en (C) conidiatie op verschillende dagen voor de positieve controle met T. stromaticum in PBS (zie stap 5.2.5), de controle voor het R10-medium (zie stap 5.1.2) en de conidia die door macrofagen worden gefagocyteerd gedurende verschillende tijdsperioden (3 uur, 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur, 120 uur). Representatieve resultaten van vier gezonde donoren. Gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Kruskal-Wallis-test. Het symbool # geeft significantie aan bij p < 0,05, n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor verschillende schimmelpathogenen, waaronder Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans en anderen, is conidiale of gistfagocytose een sleutelproces dat het onderzoek mogelijk maakt van de cytoplasmatische en moleculaire gebeurtenissen in macrofaag-pathogene interacties, evenals voor de bepaling van het tijdstip van overlijden van de geïnternaliseerde conidia 14,39,40. Fagocytose is het sleutelproces in de Trichoderma-gastheer interactie. Het geslacht Trichoderma moduleert verschillende fagocytoseroutes, waaronder Dectin-1 en Dectin-2, Toll-like receptor 2 en Toll-like receptor 4, MHC en NF-KB 25,28,41,42,43. Trichodermie veroorzaakt trichodermose bij gecompromitteerde en niet-immuungecompromitteerde personen9. Belangrijk is dat verschillende soorten van dit geslacht in de landbouw worden gebruikt en de potentiële bron zijn van Trichodermose. Inzicht in de virulentiefactoren van T. stromaticum en het mechanisme van de immuunrespons in het menselijk lichaam tegen deze schimmels is dringend nodig, aangezien beroepsrisico's veroorzaakt door de Trichoderma-soorten, waaronder T. stromaticum, alarmerend toenemen. De hier gepresenteerde methode biedt details voor het uitvoeren van de fagocytose- en dodingstest voor het bestuderen van de Trichoderma-macrofaaginteractie in menselijke perifere bloed-afgeleide macrofagen; Deze methode kan echter ook worden gebruikt om macrofagen uit verschillende weefsels te bestuderen, waaronder alveolaire, peritoneale of afstammingsmacrofagen.

De eerste stap in dit protocol begint met een moederstam (M1) suspensie om verse culturen van de schimmel te verkrijgen. Trichoderma-culturen groeien snel, omdat ze meestal de hele plaat overnemen en binnen 5 dagen groengekleurde conidia beginnen te vertonen. De temperatuur en het licht zijn cruciale factoren voor de groei van Trichoderma , en veranderingen in deze factoren kunnen de kinetiek van Trichoderma beïnvloeden enhet experiment in gevaar brengen.

Na het wassen van de T. stromaticum-cultuur moet een eindvolume tussen 5-8 ml worden teruggewonnen. De kleurintensiteit van de suspensie is evenredig met de conidiaconcentratie. De verkregen conidia-suspensie kan worden gebruikt voor in vitro en in vivo assays, zoals voor het beoordelen van fagocytose26, neutrofiele extracellulaire vallen28, intranasale blootstelling36,41, intraperitoneale blootstelling26, intracutane infectie45 en intraveneuze infectie46. Eerder onderzoek uitgevoerd met menselijke macrofagen heeft de autofagie geïnduceerd door Trichoderma29 en het vermogen van het geslacht om de vorming van extracellulaire vallen in neutrofielen28 te remmen, een mechanisme dat wordt gebruikt om schimmelpathogenen en andere micro-organismen te elimineren.

Het is belangrijk op te merken dat het kweekmedium dat wordt gebruikt om de cellen in stand te houden, de conidiale kieming kan beïnvloeden (Figuur 3G,H). Als kieming voor een bepaald experiment niet gewenst is, raden we aan om een eerste screeningstest uit te voeren met het celkweekmedium om de groeikinetiek van Trichoderma in dat specifieke medium vast te stellen. Deze test moet worden uitgevoerd voordat de in-vitro-experimenten met de gewenste cellijn worden gestart, en het experiment moet na 72 uur worden stopgezet als blijkt dat het medium niet compatibel is. De kieming van Trichoderma conidia (Figuur 3G,H) kan worden waargenomen vanaf 96 uur binnen en buiten de macrofagen.

Aangezien Trichoderma-soorten verschillen vertonen in morfologie en de optimale temperatuur en pH voor hun groei, zijn de hier gepresenteerde resultaten mogelijk niet reproduceerbaar voor alle soorten van het geslacht, en dit protocol moet mogelijk worden aangepast wanneer het wordt uitgevoerd met andere soorten. Trichoderma asperelloides conidia ontkiemt bijvoorbeeld sneller in cultuur dan die van T. stromaticum.

Eerder gedocumenteerde protocollen om fagocytose en het doden van de ziekteverwekker te evalueren met behulp van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie vereisen dure reagentia, maar ze geven specifieke informatie over het fagocytoseproces19. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, vereist alleen een optische microscoop en plaatgroei om fagocytose te evalueren en biedt uitgebreide beelden van het fagocytoseproces. Verschillende protocollen kunnen worden gebruikt om gedifferentieerde macrofagen te verkrijgen en macrofaaglysis te induceren. Deze protocollen omvatten het gebruik van verschillende tijdstippen voor macrofagendifferentiatie in plaats van de 7 dagen die hierworden gebruikt 26 of het gebruik van 2,5% deoxycholaat47 om de macrofagen te lyseren in plaats van gedestilleerd water bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 minuten, zoals hier in dit protocol wordt gebruikt. Deze methoden zijn effectief gebruikt voor verschillende schimmelsoorten zoals A. fumigatus27, A. nidulans18 en Cryptococcus neoformans15.

Sommige beperkingen van dit protocol hebben betrekking op het gebruik van PBS dat niet endotoxinevrij is, het gebruik van ronde glazen dekglaasjes en het gebruik van menselijk bloed. We raden aan om de PBS (niet endotoxinevrij) op cellen te testen om er zeker van te zijn dat het de monocyten niet kan activeren en het experiment niet kan beïnvloeden. Het gebruik van ronde glazen dekglaasjes is zeer nuttig voor het kleuren en tellen van de cellen, maar het is mogelijk dat de cellen zich niet gelijkmatig onder het glaasje verspreiden, omdat sommige cellen goed naar de rand van de plaat migreren, en dit verschil kan van invloed zijn op het geschatte totale aantal cellen in de ronde glazen dekglaasjes. Aangezien we in dit protocol geen gebruik maken van immunofluorescentie of vergelijkbare technieken, kan de aanwezigheid van niet-gefagocytoseerde conidia in een bovenvlak in vergelijking met de macrofagen leiden tot een verkeerde interpretatie van de fagocytoseresultaten. Omdat we bloed van menselijke donoren gebruiken, varieert het uiteindelijke aantal PBMC's tussen donoren en is een laag aantal donorcellen mogelijk niet voldoende voor alle experimenten.

Samengevat kunnen deze technieken worden gebruikt om de functie van macrofagen en de schimmelklaring te meten, specifiek voor draadvormige schimmels zoals Trichoderma en andere microben, zoals gisten en bacteriën. Bovendien biedt dit protocol toekomstige richtingen voor het bestuderen van echte variabiliteit in de immuunrespons tegen conidia-vormende schimmels in menselijke populaties, die niet kunnen worden waargenomen met behulp van isogene diermodellen of cellijnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de volgende Braziliaanse financieringsinstellingen: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) met subsidies RED0011/2012 en RED008/2014. U.R.S., J.O.C. en M.E.S.M. erkennen de beurs die is toegekend door respectievelijk Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) en FAPESB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

Tags

Levensvatbaarheidstest Trichoderma Stromaticum Conidiën mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed fagocytose interacties tussen macrofagen en pathogenen immuunresponsen tegen schimmels fagosoomontsnapping schimmelvirrulentie biologisch bestrijdingsmiddel biofertilizermiddel menselijke infecties trichodermacultuur conidia wassen perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) macrofaagdifferentiatie in-vitrofagocytosemethode klaringsanalyse schimmelklaringsefficiëntie
Levensvatbaarheidstest van <em>Trichoderma stromaticum</em> Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., … More

dos Santos, U. R., de Castro, J. O., Santos Matos, M. E., De Bonis, G., dos Santos, J. L. Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (200), e65231, doi:10.3791/65231 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter