एक ही माउस रेटिना की कॉन्फोकल छवियों के साथ दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरग्राम का संरेखण
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल विवो दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरोग्राफी (वीआईएस-ओसीटीएफ) छवियों को एक ही माउस रेटिना के एक्स विवो कॉन्फोकल छवियों के साथ संरेखित करने के लिए चरणों को रेखांकित करता है ताकि विवो छवियों में देखे गए रेटिना गैंग्लियन सेल एक्सॉन बंडल आकृति विज्ञान को सत्यापित किया जा सके।
Abstract
हाल के वर्षों में, विवो रेटिना इमेजिंग में, जो जैविक प्रणालियों और प्रक्रियाओं के बारे में गैर-इनवेसिव, वास्तविक समय और अनुदैर्ध्य जानकारी प्रदान करता है, आंखों के रोगों में तंत्रिका क्षति का उद्देश्य मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए तेजी से लागू किया गया है। एक ही रेटिना की एक्स विवो कॉन्फोकल इमेजिंग अक्सर विशेष रूप से पशु अनुसंधान में विवो निष्कर्षों को मान्य करने के लिए आवश्यक होती है। इस अध्ययन में, हमने विवो छवियों के साथ माउस रेटिना की एक पूर्व विवो कॉन्फोकल छवि को संरेखित करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया। माउस रेटिना की विवो छवियों को प्राप्त करने के लिए दृश्य प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरग्राफी (विस-ओसीटीएफ) नामक एक नई नैदानिक-तैयार इमेजिंग तकनीक लागू की गई थी। फिर हमने विवो विस-ओसीटीएफ छवियों को मान्य करने के लिए “गोल्ड स्टैंडर्ड” के रूप में एक ही रेटिना की कॉन्फोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया। यह अध्ययन न केवल आणविक और सेलुलर तंत्र की आगे की जांच को सक्षम बनाता है, बल्कि विवो में तंत्रिका क्षति के संवेदनशील और उद्देश्य मूल्यांकन के लिए एक नींव भी स्थापित करता है।
Introduction
रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) दृश्य सूचना प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत (आईपीएल) में अपने डेंड्राइटिक पेड़ों के माध्यम से सिनैप्टिक इनपुट प्राप्त करती हैं और रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (आरएनएफएल) में अपने अक्षतंतु के माध्यम से मस्तिष्क को 1,2,3,4 तक जानकारी प्रसारित करती हैं। ग्लूकोमा जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में, प्रारंभिक आरजीसी अपघटन के परिणामस्वरूप आरएनएफएल, गैंग्लियन सेल परत (जीसीएल), आईपीएल, और रोगियों और कृंतकमॉडल 5,6,7,8,9 दोनों में ऑप्टिक तंत्रिका में सूक्ष्म परिवर्तन हो सकते हैं। इस प्रकार आरजीसी और दृष्टि हानि को रोकने के लिए समय पर हस्तक्षेप के लिए आरजीसी में इन रूपात्मक परिवर्तनों का शीघ्र पता लगाना आवश्यक है।
हमने हाल ही में आरजीसी क्षति की विवो निगरानी की आवश्यकता को पूरा करने के लिए दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (वीआईएस-ओसीटी) नामक एक नई नैदानिक-तैयार इमेजिंग तकनीक विकसित की है। विस-ओसीटी ने अक्षीय रिज़ॉल्यूशन में सुधार किया, रेटिना10,11 में 1.3 μm तक पहुंच गया, जिससे RNFL में व्यक्तिगत RGC अक्षतंतु बंडलों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिली। इसके बाद, चूहों11,12,13 में एकल अक्षतंतु बंडल स्तर पर आरजीसी क्षति को ट्रैक करने और मापने के लिए ओसीटी फाइबरोग्राफी (वीआईएस-ओसीटीएफ) स्थापित किया गया था। हालांकि, सोने के मानक के रूप में एक ही रेटिना की पूर्व विवो कॉन्फोकल इमेजिंग अक्सर विवो निष्कर्षों को मान्य करने के लिए आवश्यक होती है। इसलिए, यह अध्ययन प्रदर्शित करेगा कि एक ही माउस रेटिना की पूर्व विवो कॉन्फोकल छवियों के साथ विस-ओसीटीएफ द्वारा अधिग्रहित विवो छवियों में कैसे संरेखित किया जाए। प्रोटोकॉल का उद्देश्य पूर्व विवो कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा विवो निष्कर्षों को मान्य करना और रोगग्रस्त स्थितियों में आरजीसी क्षति के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर परिवर्तनों की जांच के लिए एक नींव स्थापित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में दो चरण हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि जानवर गहरे संज्ञाहरण के तहत है और ओसीटी इमेजिंग से पहले उनकी आंखें पूरी तरह से फैल गई हैं। यदि चूहो?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन डॉडरामस रिसर्च फाउंडेशन शेफर ग्रांट, 4-सीए कैवलियर सहयोगी पुरस्कार, R01EY029121, R01EY035088 और नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
References
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
