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Neuroscience

एक ही माउस रेटिना की कॉन्फोकल छवियों के साथ दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरग्राम का संरेखण

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65237
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1, 2, 1,3,4,5
1Department of Biology, University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 3Department of Ophthalmology, University of Virginia, 4Program in Fundamental Neuroscience, University of Virginia, 5Department of Psychology, University of Virginia

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल विवो दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरोग्राफी (वीआईएस-ओसीटीएफ) छवियों को एक ही माउस रेटिना के एक्स विवो कॉन्फोकल छवियों के साथ संरेखित करने के लिए चरणों को रेखांकित करता है ताकि विवो छवियों में देखे गए रेटिना गैंग्लियन सेल एक्सॉन बंडल आकृति विज्ञान को सत्यापित किया जा सके।

Abstract

हाल के वर्षों में, विवो रेटिना इमेजिंग में, जो जैविक प्रणालियों और प्रक्रियाओं के बारे में गैर-इनवेसिव, वास्तविक समय और अनुदैर्ध्य जानकारी प्रदान करता है, आंखों के रोगों में तंत्रिका क्षति का उद्देश्य मूल्यांकन प्राप्त करने के लिए तेजी से लागू किया गया है। एक ही रेटिना की एक्स विवो कॉन्फोकल इमेजिंग अक्सर विशेष रूप से पशु अनुसंधान में विवो निष्कर्षों को मान्य करने के लिए आवश्यक होती है। इस अध्ययन में, हमने विवो छवियों के साथ माउस रेटिना की एक पूर्व विवो कॉन्फोकल छवि को संरेखित करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया। माउस रेटिना की विवो छवियों को प्राप्त करने के लिए दृश्य प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरग्राफी (विस-ओसीटीएफ) नामक एक नई नैदानिक-तैयार इमेजिंग तकनीक लागू की गई थी। फिर हमने विवो विस-ओसीटीएफ छवियों को मान्य करने के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" के रूप में एक ही रेटिना की कॉन्फोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया। यह अध्ययन न केवल आणविक और सेलुलर तंत्र की आगे की जांच को सक्षम बनाता है, बल्कि विवो में तंत्रिका क्षति के संवेदनशील और उद्देश्य मूल्यांकन के लिए एक नींव भी स्थापित करता है।

Introduction

रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी) दृश्य सूचना प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत (आईपीएल) में अपने डेंड्राइटिक पेड़ों के माध्यम से सिनैप्टिक इनपुट प्राप्त करती हैं और रेटिना तंत्रिका फाइबर परत (आरएनएफएल) में अपने अक्षतंतु के माध्यम से मस्तिष्क को 1,2,3,4 तक जानकारी प्रसारित करती हैं। ग्लूकोमा जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में, प्रारंभिक आरजीसी अपघटन के परिणामस्वरूप आरएनएफएल, गैंग्लियन सेल परत (जीसीएल), आईपीएल, और रोगियों और कृंतकमॉडल 5,6,7,8,9 दोनों में ऑप्टिक तंत्रिका में सूक्ष्म परिवर्तन हो सकते हैं। इस प्रकार आरजीसी और दृष्टि हानि को रोकने के लिए समय पर हस्तक्षेप के लिए आरजीसी में इन रूपात्मक परिवर्तनों का शीघ्र पता लगाना आवश्यक है।

हमने हाल ही में आरजीसी क्षति की विवो निगरानी की आवश्यकता को पूरा करने के लिए दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (वीआईएस-ओसीटी) नामक एक नई नैदानिक-तैयार इमेजिंग तकनीक विकसित की है। विस-ओसीटी ने अक्षीय रिज़ॉल्यूशन में सुधार किया, रेटिना10,11 में 1.3 μm तक पहुंच गया, जिससे RNFL में व्यक्तिगत RGC अक्षतंतु बंडलों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिली। इसके बाद, चूहों11,12,13 में एकल अक्षतंतु बंडल स्तर पर आरजीसी क्षति को ट्रैक करने और मापने के लिए ओसीटी फाइबरोग्राफी (वीआईएस-ओसीटीएफ) स्थापित किया गया था। हालांकि, सोने के मानक के रूप में एक ही रेटिना की पूर्व विवो कॉन्फोकल इमेजिंग अक्सर विवो निष्कर्षों को मान्य करने के लिए आवश्यक होती है। इसलिए, यह अध्ययन प्रदर्शित करेगा कि एक ही माउस रेटिना की पूर्व विवो कॉन्फोकल छवियों के साथ विस-ओसीटीएफ द्वारा अधिग्रहित विवो छवियों में कैसे संरेखित किया जाए। प्रोटोकॉल का उद्देश्य पूर्व विवो कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा विवो निष्कर्षों को मान्य करना और रोगग्रस्त स्थितियों में आरजीसी क्षति के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर परिवर्तनों की जांच के लिए एक नींव स्थापित करना है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को वर्जीनिया विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) से जानवरों के उपयोग पर दिशानिर्देश के अनुरूप था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. विवो बनाम ओसीटी इमेजिंग में।

  1. ओसीटी प्रणाली
    1. एक छोटे जानवर बनाम-ओसीटी प्रणाली का उपयोग करके चूहों की आंखों की छवि बनाएं जो एक सुपरकॉन्टिनम प्रकाश स्रोत का उपयोग करता है, जो 480 एनएम और 650 एनएम के बीच दृश्य-प्रकाश रोशनी प्रदान करता है। सुनिश्चित करें कि कॉर्निया पर बिजली की घटना 1 mW है और 25 kHz की ए-लाइन दर और 39.3 μs प्रति ए-लाइन के एकीकरण समय का उपयोग करें।
    2. सुनिश्चित करें कि स्पेक्ट्रोमीटर की वर्णक्रमीय पहचान सीमा 508 एनएम और 613 एनएम के बीच है, जो रेटिना में 1.3 μm का अक्षीय रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। कुल इमेजिंग वॉल्यूम लगभग 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1,500 μm (z) है। पार्श्व रिज़ॉल्यूशन दृश्य क्षेत्र के केंद्र में 4.5 μm और केंद्र11,13 से 350 μm पर 8.7 μm के बीच है।
  2. माउस संज्ञाहरण
    1. सी 57बीएल /6 पृष्ठभूमि के चूहों को एनेस्थेटाइज्ड करें और या तो केटामाइन (114 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (17 मिलीग्राम / किग्रा) कॉकटेल के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ सेक्स करें और 1% ट्रॉपिकामाइड बूंदों का उपयोग करके अपने विद्यार्थियों को पतला करें। एक दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी के बाद पेडल रिफ्लेक्स के नुकसान से पर्याप्त एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें।
    2. इमेजिंग के दौरान, इन्फ्रारेड हीट लैंप का उपयोग करके माउस को गर्म रखें। प्रत्येक छवि अधिग्रहण के बाद, कॉर्नियल निर्जलीकरण को रोकने के लिए कृत्रिम आँसू लागू करें।
  3. इमेजिंग के लिए माउस की स्थिति
    1. पशु धारक पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें और दो वेल्क्रो स्ट्रैप्स की मदद से माउस को स्थिति में रखें।
      नोट: पशु धारक माउस की आंख में लेजर रखने के लिए तीन आयामों (ऊर्ध्वाधर समायोजन, ठीक क्षैतिज समायोजन, साथ ही पिच और याव समायोजन) में आंदोलन की अनुमति देता है।
  4. इमेजिंग पैरामीटर समायोजित करना
    1. कंप्यूटर चालू करें और संदर्भित सॉफ़्टवेयर खोलें, जो लेजर को स्वचालित रूप से चालू कर देगा।
    2. पशु धारक को तब तक समायोजित करें जब तक कि लेजर स्थिर न हो और माउस की आंख में केंद्रित न हो। सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में एन फेस पूर्वावलोकन, सतही संवहनी जाल के दृश्य क्षेत्र (एफओवी) और बी-स्कैन, एफओवी के भीतर रेटिना के क्रॉस-सेक्शन के माध्यम से आंख के पीछे के हिस्से की कल्पना करें।
    3. ऑप्टिकल फोकस के मामूली समायोजन करने के बाद सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस पर एक्वायर बटन पर क्लिक करके एक विज़-ओसीटी वॉल्यूम प्राप्त करें, जिसमें 512 ए-लाइन / बी-स्कैन और 512 बी-स्कैन / वॉल्यूम शामिल हैं।
      नोट: इस प्रक्रिया में ~ 10.5 सेकंड लगते हैं। छवि अधिग्रहण एक अंतर्निहित गुणवत्ता सूचकांक (क्यूआई) अनुमानक द्वारा निर्देशित होता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूर्व निर्धारित सीमा (क्यूआई < 45) से नीचे की छवियां शामिल नहीं हैं।
      1. प्रत्येक माउस के लिए, एक ही आंख से चार vis-OCT वॉल्यूम प्राप्त करें। रेटिना के विभिन्न क्षेत्रों को कवर करने के लिए एफओवी में चार कोनों में से प्रत्येक में ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ओएनएच) को संरेखित करें।
        नोट: इस तरह का प्लेसमेंट रेटिना वक्रता को कम करता है, जो पूरे एफओवी में आरएनएफएल प्रतिबिंब को अधिकतम करता है। प्रत्येक अधिग्रहण के बीच आंख को पुनर्स्थापित करने के लिए ~ 1 मिनट की आवश्यकता होती है (चित्रा 1 ए, बी)।
  5. ओसीटीएफ विश्लेषण
    नोट: MATLAB छवि विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
    1. विस-ओसीटी वॉल्यूम से विस-ओसीटी फाइबरग्राम उत्पन्न करने के लिए, रेटिना की सतह का पता लगाने के लिए तीव्रता-आधारित थ्रेशोल्ड विधि (मैटलैब कोड लाइन 808) का उपयोग करें।
      नोट: ये लाइनें बीएसस्कैन के तीव्रता मूल्यों को समायोजित करने के लिए असमायोजित फ़ंक्शन का उपयोग करती हैं। [0.0087 0.08] तर्क को असमायोजित करने के लिए पारित किया गया तर्क आउटपुट छवि की पूर्ण गतिशील सीमा को मैप करने के लिए तीव्रता की सीमा को निर्दिष्ट करता है।
    2. गहराई में पहले ~ 16 μm का चयन करके RNFL को क्रॉप करें। Matlab कोड लाइन 782 देखें।
      नोट: एक वयस्क जंगली प्रकार सी 57बीएल / 6 माउस में विवो आरएनएफएल मोटाई में विशिष्ट ~ 14 μm है और विभिन्न विभाजन विधियों13 के बीच भिन्न हो सकता है।
    3. RAW फ़ाइल (पंक्ति 9), पुनर्निर्माण के लिए फ़ाइलें (पंक्ति 11), और फ़ाइल नाम (पंक्ति 15) के पथ परिवर्तित करें, चलाएँ क्लिक करें, और MATLAB कोड द्वारा OCT छवि का विश्लेषण किए जाने की प्रतीक्षा करें. आरजीसी अक्षतंतु बंडलों और आसपास के वाहिका से बने फाइबरग्राम छवि उत्पन्न करने के लिए अक्षीय (जेड) दिशा (मैटलैब कोड लाइनें 905-908) के साथ औसत तीव्रता प्रक्षेपण की गणना करें। प्रत्येक एफओवी के लिए फाइबरग्राम प्रसंस्करण के बाद चार छवियों को पसंद के ग्राफिक्स संपादक के साथ रक्त वाहिकाओं को संरेखित करके, कुल मिलाकर ~ 1.2 x 1.2 मिमी को कवर करते हैं। RAW फ़ाइलें आमतौर पर फ़ोल्डर में सहेजी जाती हैं: Halo डेटा, OCT इमेजिंग की तारीख के तहत (उदाहरण के लिए, 0606 ऑप्टिसेंट)।
      नोट: MATLAB कोड पूरक फ़ाइल 1 में उपलब्ध हैं।

2. एक्स विवो कॉन्फोकल इमेजिंग।

  1. माउस इच्छामृत्यु
    1. विस-ओसीटी डेटा प्राप्त करने के बाद, चूहों को पेंटोबार्बिटल सोडियम (390 मिलीग्राम / एमएल) और फेनाइटोइन सोडियम (50 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण के साथ इच्छामृत्यु करें। फेनिटोइन सोडियम पेंटोबार्बिटल सोडियम के प्रभाव को बढ़ाकर कार्य करता है, जिसे कृंतक इच्छामृत्यु14,15 में व्यापक रूप से लागू किया गया है। प्रत्येक माउस के लिए, पतला मिश्रण (156 मिलीग्राम / एमएल) के 0.2 एमएल / 20 ग्राम का उपयोग करें और 20 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और फिर, पीबीएस16,17 में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 20 एमएल के साथ छिड़काव करें।
  2. आंख विच्छेदन और अभिविन्यास
    1. आंखों को अलग करें और अभिविन्यास को इंगित करने के लिए लौकिक पक्ष पर एक निशान बनाएं।
    2. पूर्वकाल कक्ष को सावधानीपूर्वक हटाने के बाद, ओकुलर लेंस, विट्रस, और 30 मिनट के लिए पीएफए में आईकप को ठीक करें।
    3. 30 मिनट के लिए पीबीएस के साथ आईकप धो लें, और धोने के दौरान पीबीएस समाधान 3 x बदलें। फिर, 30 मिनट के लिए पीबीएस (पीएच 7.5) में 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ धो लें।
    4. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए बफर (2.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ 5% गधे सीरम और ट्रिस-बफर्ड सेलाइन [पीएच 7.5] में 0.5% ट्राइटन एक्स -100) को अवरुद्ध करने में आईकप को इनक्यूबेट करें।
  3. इम्यूनोस्टेनिंग
    नोट: आईकप अब आरजीसी एक्सॉन बंडलों का पता लगाने के लिए माउस एंटी-ट्यूज 1 के प्राथमिक एंटीबॉडी और रक्त वाहिकाओं का पता लगाने के लिए चूहे एंटी-आईसीएएम -2 से सना हुआ है।
    1. आंखों के कप को प्राथमिक एंटीबॉडी, माउस एंटी-ट्यूज 1 (ब्लॉकिंग बफर में 1:200) और रैट एंटी-आईसीएएम -2 (ब्लॉकिंग बफर में 1:500) के साथ रात भर इनक्यूबेट करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. पृष्ठभूमि को कम करने और किसी भी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएसटी) युक्त फॉस्फेट-बफर्ड खारा घोल के साथ हर बार 1 घंटे के लिए 3-5 x आंखों के कप धोएं।
    3. धोने के बाद, द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ रात भर आंखों के कप को सेने के लिए, गधे एंटी-माउस इम्युनोग्लोबुलिन जी को एलेक्सा फ्लुर 488 डाई (हरी प्रतिदीप्ति) से संयुग्मित किया जाता है और गधा एंटी-रैट आईजीजी को एलेक्सा फ्लुर 594 डाई (लाल प्रतिदीप्ति) से संयुग्मित किया जाता है, सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर को अवरुद्ध करने में 1:1000 पतला होते हैं।
    4. अगले दिन, पृष्ठभूमि को कम करने और अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए पीबीएसटी के साथ 1 घंटे के लिए आईकप 3-5 गुना धोएं।
    5. फ्लैट माउंट से पहले आईकप को पीबीएस के पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  4. फ्लैट-माउंटेड रेटिना
    1. इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया के बाद, माइक्रोस्कोप के तहत आंखों के कप से रेटिना को अलग करें।
    2. रेटिना को चार पत्तियों में काटें और उन्हें आरजीसी परत के साथ सपाट माउंट करें। अभिविन्यास को इंगित करने के लिए रेटिना से जुड़े अस्थायी पक्ष पर निशान छोड़ दें।
    3. बढ़ते माध्यम13,18 के साथ रेटिना को कवर करें। स्लाइड्स को नेल पॉलिश13,18,19 से सील करें।
  5. कॉन्फोकल इमेजिंग
    नोट: कॉन्फोकल छवियों की छवि प्रसंस्करण ज़ेन माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चालू करें, और लोकेट मोड के तहत, माइक्रोस्कोप के आईपीस का उपयोग करके रुचि का क्षेत्र ढूंढें।
    2. अधिग्रहण मोड के तहत, जानकारी की सभी परतों को कवर करने के लिए पूरे रेटिना और जेड-स्टैक स्लाइस को कवर करने के लिए टाइल्स सेट करें। 1.24 μm / पिक्सेल के पिक्सेल आकार पर 5.99 मिमी (x) x 5.88 मिमी (y) x 30 μm (z) की कुल मात्रा को कवर करने के लिए पूरे रेटिना में कम से कम 25 टाइलों की छवि बनाएं।
    3. जेड-स्टैक स्लाइस को दो-आयामी एन फेस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियां बनाने के लिए प्रोजेक्ट करें (चित्रा 1 सी, डी) 11,13,19,20,21।

3. विवो और एक्स विवो छवियों में संरेखण

  1. फाइबरग्राम को संसाधित करने के बाद, एक समग्र छवि बनाएं जिसमें पसंद के ग्राफिक्स संपादक के साथ सभी रक्त वाहिकाओं को संरेखित करके प्रत्येक माउस से प्राप्त चार छवियां शामिल हैं।
    नोट: औसतन, अंतिम समग्र छवि लगभग 1.2 मिमी (एक्स) x 1.2 मिमी (वाई) है, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
  2. समग्र फाइबरग्राम को संरेखित करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका सिर (ओएनएच) और रक्त वाहिकाओं के पैटर्न का उपयोग लैंडमार्क के रूप में करें। आईसीएएम -2 के साथ सना हुआ एक ही रेटिना की कॉन्फोकल छवियों के साथ समग्र ओसीटी छवियों के रक्त वाहिका पैटर्न को ओवरलैप करके विवो और एक्स विवो संरेखण प्राप्त करें।

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Representative Results

समग्र विस-ओसीटी फाइबरग्राम की तुलना आरजीसी अक्षतंतु (चित्रा 1 डी, शीर्ष पैनल) के लिए ट्यूज -1 के साथ फ्लैट-माउंटेड रेटिना इम्यूनोस्टेन्ड की संबंधित कॉन्फोकल छवि के साथ की जाती है। ओसीटीएफ द्वारा चित्रित एक्सॉन बंडलों को कॉन्फोकल छवि पर टीयू-जे 1-लेबल एक्सॉन बंडलों के साथ मिलान किया जा सकता है। रक्त वाहिकाएं आमतौर पर फाइबरग्राम छवियों में आसपास के अक्षतंतु बंडलों की तुलना में अलग-अलग शाखाओं की संरचनाओं का प्रदर्शन करती हैं, जिन्हें कॉन्फोकल छवि (चित्रा 1 डी, निचला पैनल) पर आईसीएएम -2-लेबल रक्त वाहिकाओं के साथ मिलान किया जा सकता है।

पूर्व विवो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और विवो बनाम ओसीटी के बीच साइड-बाय-साइड तुलना से समान आरजीसी एक्सॉन बंडल नेटवर्क और आसपास के रेटिना वास्कुलचर का पता चला। ध्यान दें कि कॉन्फोकल छवि विवो छवियों के साथ पूरी तरह से मेल नहीं खा सकती है, खासकर परिधीय क्षेत्र में; ऐसा इसलिए है क्योंकि रेटिना को स्लाइड पर फ्लैट-माउंट किया गया है। एक साथ लिया गया, ये परिणाम विवो में अलग-अलग आकार के साथ दो आसन्न आरजीसी एक्सॉन बंडलों को हल करने के लिए विज़-ओसीटी फाइबरोग्राफी की क्षमता को मान्य करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एक ही माउस रेटिना की पूर्व विवो छवि के साथ विवो छवि के संरेखण का योजनाबद्ध चित्रण। (ए) माउस आंख के छोटे-पशु बनाम ओसीटी सिस्टम इमेजिंग का योजनाबद्ध; (बी) दृश्य क्षेत्र के चार कोनों में रखे ऑप्टिक तंत्रिका सिर के साथ एक ही आंख से प्राप्त चार छवियों का संरेखण; (सी) रेटिना विच्छेदन (बाएं), ट्रैक किए गए अभिविन्यास (मध्य) के साथ रेटिना फ्लैट-माउंट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, और रेटिना को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (दाएं) द्वारा चित्रित किया जा रहा है; (डी) ओसीटी फाइबरोग्राफी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आरजीसी एक्सॉन बंडल छवियों (शीर्ष पैनल) और विवो एन-फेस में रक्त वाहिकाओं (नीचे पैनल) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड की पूर्व विवो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि के साथ तुलना करना। ये चारों चित्र एक ही आंख से लिए गए हैं। पीले स्केल सलाखों = 100 μm. पैनल डी में संख्या (1-11) प्रत्येक रक्त वाहिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है। संक्षेप: ओएनएच = ऑप्टिक तंत्रिका सिर; विस-ओसीटीएफ = दृश्य-प्रकाश ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी फाइबरग्राफी; आरजीसी = रेटिना गैंग्लियन सेल; एस = बेहतर; I = हीन; टी = अस्थायी; एन = नाक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: छवि विश्लेषण के लिए MATLAB कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में दो चरण हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि जानवर गहरे संज्ञाहरण के तहत है और ओसीटी इमेजिंग से पहले उनकी आंखें पूरी तरह से फैल गई हैं। यदि चूहों को पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड नहीं किया जाता है, तो उनकी तेज सांस लेने से चेहरे की छवियों के अस्थिर आंदोलनों का कारण बन सकता है, जो फाइबरग्राम की गुणवत्ता पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है। इसके अलावा, अपर्याप्त फैलाव भी छवि की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकता है क्योंकि आईरिस प्रकाश को बाधित कर सकता है, इसे रेटिना तक पहुंचने से रोक सकता है। दूसरा, छिड़काव के बाद लेकिन माउस के आंख सॉकेट से नेत्रगोलक को हटाने से पहले, बाईं या दाईं आंख के साथ-साथ आंख के लौकिक पक्ष को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। चूंकि फ्लैट-माउंटेड रेटिना सतही परत पर आरएनएफएल के साथ ऊपर की ओर होता है, इसलिए अस्थायी पक्ष को चिह्नित करने से फ्लैट-माउंटेड रेटिना का उचित अभिविन्यास संभव होगा।

फायदों में से एक यह है कि प्रोटोकॉल को आंखों की बीमारियों के विभिन्न माउस मॉडल पर लागू किया जा सकता है, जैसे रेटिना इस्किमिया और मधुमेह रेटिनोपैथी, जब तक कि पूर्ववर्ती आंखें ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए स्पष्ट हैं। हालांकि, इस विधि की एक सीमा यह है कि भले ही रेटिना को इम्यूनोस्टेनिंग और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए ठीक से तय किया गया हो, अक्षतंतु बंडल आकृति विज्ञान बदल सकता है। यह रेटिना विच्छेदन के दौरान गलत-संचालन के कारण होता है, जिससे अक्षतंतु बंडलों में टूटना हो सकता है। इसके अतिरिक्त, जबकि रेटिना विवो में चित्रित होने पर घुमावदार कटोरे के आकार की संरचनाएं होती हैं, उन्हें कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए स्लाइड पर चपटा किया जाता है। नतीजतन, विवो बनाम ओसीटी छवियों और परिधीय रेटिना की पूर्व विवो कॉन्फोकल छवियों के बीच अपूर्ण ओवरलैप हो सकता है।

समस्या निवारण के लिए: इस तकनीक में मुख्य रूप से दो भाग शामिल हैं। सबसे पहले, विस-ओसीटी भाग के लिए, माउस आंख की गुणवत्ता स्पष्ट फाइबरग्राम प्राप्त करने की सफलता को बहुत प्रभावित कर सकती है। इसलिए, इसे नम और उज्ज्वल रखने के लिए माउस की आंख पर कृत्रिम आँसू लगातार लगाए गए थे। माउस के शरीर की स्थिति को भी ठीक किया गया था ताकि लेजर को रेटिना पर लंबवत रूप से चमकाया जा सके। इन उपायों ने एक साथ छवि की गुणवत्ता सुनिश्चित की। दूसरा, रेटिना विच्छेदन भाग के लिए, हमने पाया कि रेटिना के आसपास के श्वेतपटल को काटना, इसे तोड़ने के बजाय, ओएनएच संरचना की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण था। जब श्वेतपटल को बल के साथ फाड़ दिया गया था, तो ओएनएच कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत एक उचित आकार के अंधेरे छेद के रूप में दिखाई दिया, जिसमें रेटिना ऊतक केंद्र से गायब था। विवो और एक्स विवो संरेखण में एक पूर्ण ओएनएच संरचना बनाए रखना आवश्यक है।

संक्षेप में, हमने विवो11,12,13 में एकल अक्षतंतु बंडल स्तर पर परिवर्तनों को सीधे मापने और ट्रैक करने के लिए ओसीटीएफ की स्थापना की है। यह प्रोटोकॉल एक ही रेटिना के विवो विस-ओसीटीएफ और एक्स विवो कॉन्फोकल इमेजिंग को संरेखित करने के लिए निर्देश प्रदान करता है। ये अध्ययन मनुष्यों में तंत्रिका क्षति के उद्देश्य मूल्यांकन की स्थापना के लिए नींव रखते हैं, जो भविष्य में ग्लूकोमा निदान और उपचार में काफी सुधार कर सकते हैं।

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Disclosures

चांग, एस, कोई नहीं; जू, डब्ल्यू, कोई नहीं; फैन, डब्ल्यू, कोई नहीं; मैकडैनियल, जे.ए., कोई नहीं; डी.ए. मिलर, कोई नहीं; एम ग्रैनोनिको, कोई नहीं; एम लियू, कोई नहीं; एक्स लियू, कोई नहीं; एचएफ झांग के पास ऑप्टीसेंट हेल्थ में वित्तीय हित हैं, जिसने इस काम का समर्थन नहीं किया।

Acknowledgments

यह अध्ययन डॉडरामस रिसर्च फाउंडेशन शेफर ग्रांट, 4-सीए कैवलियर सहयोगी पुरस्कार, R01EY029121, R01EY035088 और नाइट्स टेम्पलर आई फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)		 Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)		 VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

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References

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Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

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