Summary
本方案概述了 将 体内可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF）图像与同一小鼠视网膜的 离体 共聚焦图像对齐的步骤，以验证 在体内 图像中观察到的视网膜神经节细胞轴突束形态。
Abstract
近年来， 活体 视网膜成像提供了关于生物系统和过程的无创、实时和纵向信息，越来越多地用于客观评估眼部疾病的神经损伤。同一视网膜的 离体 共聚焦成像通常是必要的，以验证 体内 发现，尤其是在动物研究中。在这项研究中，我们展示了一种将小鼠视网膜 的离体 共聚焦图像与其 体内 图像对齐的方法。一种新的临床成像技术称为可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF），用于获取小鼠视网膜的 活体 图像。然后，我们对与“金标准”相同的视网膜进行了共聚焦成像，以验证 体内 与OCTF图像的对比。这项研究不仅能够进一步研究分子和细胞机制，而且为灵敏客观地评估 体内神经损伤奠定了基础。
Introduction
视网膜神经节细胞 （RGC） 在视觉信息处理中起着关键作用，通过其在内丛状层 （IPL） 中的树突树接收突触输入，并通过它们在视网膜神经纤维层 （RNFL） 中的轴突将信息传递到大脑 1,2,3,4。在青光眼等疾病中，早期 RGC 变性可能导致患者和啮齿动物模型 RNFL、神经节细胞层 （GCL）、IPL 和视神经的细微变化 5,6,7,8,9。因此，及早发现RGC的这些形态变化对于及时干预以防止RGC和视力丧失至关重要。
我们最近开发了一种新的临床成像技术，称为可见光光学相干断层扫描（vis-OCT），以满足RGC损伤的体内监测需求。Vis-OCT 提高了轴向分辨率，在视网膜中达到 1.3 μm10,11，允许可视化 RNFL 中的单个 RGC 轴突束。随后，建立了 vis-OCT 纤维成像 （vis-OCTF） 来跟踪和量化小鼠11、12、13 中单轴突束水平的 RGC 损伤。然而，通常需要对与金标准相同的视网膜进行离体共聚焦成像，以验证体内发现。因此，本研究将演示如何将 vis-OCTF 获取的体内图像与同一小鼠视网膜的离体共聚焦图像对齐。该协议旨在通过离体共聚焦成像验证体内发现，并为检查疾病条件下 RGC 损伤的分子和细胞变化奠定基础。
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Protocol
所有动物程序均由弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院 （NIH） 的动物使用指南。有关本协议中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参阅 材料表 。
1. 体内 vs-OCT成像
- vis-OCT 系统
- 使用使用超连续光源的小动物 vs-OCT 系统对小鼠眼睛进行成像，该系统提供 480 nm 和 650 nm 之间的可见光照明。确保角膜上的功率为 1 mW，并使用 25 kHz 的 A 线速率和每条 A 线 39.3 μs 的积分时间。
- 确保光谱仪的光谱检测范围在 508 nm 和 613 nm 之间，从而在视网膜中提供 1.3 μm 的轴向分辨率。总成像体积约为 700 μm （x） x 700 μm （y） x 1,500 μm （z）。横向分辨率在视场中心的 4.5 μm 和距中心 350 μm 的 8.7 μm 之间11,13。
- 小鼠麻醉
- 用腹膜内注射氯胺酮（114mg / kg）和甲苯噻嗪（17mg / kg）混合物麻醉C57BL / 6背景和任何性别的小鼠，并使用1%托吡卡胺滴剂扩张其瞳孔。通过用力捏脚趾后踏板反射丧失来确认充分麻醉。
- 在成像过程中，使用红外线加热灯保持鼠标温暖。每次图像采集后，应用人工泪液以防止角膜脱水。
- 鼠标的定位以进行成像
- 将麻醉的鼠标放在动物支架上，并借助两条魔术贴带将鼠标保持在适当的位置。
注意： 动物支架允许在三个维度上移动（垂直调整、精细水平调整以及俯仰和偏航调整），以将激光放入鼠标的眼睛。
- 将麻醉的鼠标放在动物支架上，并借助两条魔术贴带将鼠标保持在适当的位置。
- 调整成像参数
- 打开计算机并打开参考软件，该软件将自动打开激光器。
- 调整动物支架，直到激光稳定并对准鼠标的眼睛。通过软件界面中的 En Face 预览、浅表血管丛的视野 （FOV） 和 B 扫描（视场内视网膜的横截面）可视化眼睛的后部。
- 在对光学焦点进行细微调整后，单击软件界面上的“获取”按钮 获取 vis-OCT 体积，该焦点包括 512 条 A 线/B 扫描和 512 条 B 扫描/体积。
注意：此过程需要 ~10.5 秒。图像采集由内置的质量指数 （QI） 估计器引导，以确保不包括低于预定阈值 （QI < 45） 的图像。- 对于每只小鼠，从同一只眼睛获取四个 vis-OCT 体积。将视神经头 （ONH） 对准 FOV 的四个角，以覆盖视网膜的不同区域。
注意：这种放置使视网膜曲率最小化，从而最大限度地提高整个 FOV 的 RNFL 反射率。每次采集之间需要~1分钟才能重新定位眼睛（图1A，B）。
- 对于每只小鼠，从同一只眼睛获取四个 vis-OCT 体积。将视神经头 （ONH） 对准 FOV 的四个角，以覆盖视网膜的不同区域。
- Vis-OCTF 分析
注：MATLAB用于执行图像分析。- 要从 vis-OCT 体积生成 vis-OCT 纤维图，请使用基于强度的阈值方法（MATLAB 代码行 808）检测视网膜表面。
注意： 这些线使用 imadjust 函数来调整 bscan 的强度值。传递给 imadjust 的 [0.0087， 0.08] 参数指定要映射到输出图像的完整动态范围的强度范围。 - 通过选择第一个~16μm的深度来裁剪RNFL。参见 Matlab 代码行 782。
注：成年野生型 C57BL/6 小鼠的 典型体内 RNFL 厚度为 ~14 μm，并且可能因不同的分割方法而异13。 - 更改 RAW 文件（第 9 行）、重建文件（第 11 行）和文件名（第 15 行）的路径，单击 “运行”，然后等待 MATLAB 代码分析 OCT 图像。计算沿轴向 （z） 方向（MATLAB 代码行 905-908）的平均强度投影，以生成由 RGC 轴突束和周围脉管系统组成的纤维图图像。通过将血管与所选的图形编辑器对齐，对每个 FOV 进行纤维图处理后的四张图像进行蒙太奇，总共覆盖 ~1.2 x 1.2 mm。RAW文件通常保存在OCT成像日期下的Halo Data文件夹中（例如，0606 Opticent）。
注意：补充 文件 1 中提供了 MATLAB 代码。
- 要从 vis-OCT 体积生成 vis-OCT 纤维图，请使用基于强度的阈值方法（MATLAB 代码行 808）检测视网膜表面。
2. 离体 共聚焦成像
- 小鼠安乐死
- 在获得vis-OCT数据后，用戊巴比妥钠（390mg / mL）和苯妥英钠（50mg / mL）的混合物对小鼠实施安乐死。苯妥英钠通过放大戊巴比妥钠的作用发挥作用，戊巴比妥钠已广泛应用于啮齿动物安乐死14,15。对于每只小鼠，使用 0.2 mL/20 g 稀释混合物 （156 mg/mL） 并灌注 20 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），然后灌注 20 mL 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS16,17 溶液。
- 眼球解剖和定向
- 将眼睛摘除并在颞侧做一个标记以指示方向。
- 小心地取出前房，晶状体，玻璃体，并将眼罩固定在PFA中30分钟。
- 用PBS清洗眼罩30分钟，并在洗涤过程中更换PBS溶液3次。然后，用0.5%Triton X-100在PBS（pH 7.5）中洗涤30分钟。
- 在室温下将眼罩在封闭缓冲液（5%驴血清与2.5%牛血清白蛋白和0.5%Triton X-100在Tris缓冲盐水[pH 7.5]中）孵育2小时。
- 免疫染色
注意：眼罩现在可以用小鼠抗 Tuj1 的一抗染色以检测 RGC 轴突束和大鼠抗 ICAM-2 的一抗以检测血管。- 将眼杯与一抗，小鼠抗Tuj1（在封闭缓冲液中1：200）和大鼠抗ICAM-2（在封闭缓冲液中1：500）在4°C孵育过夜。
- 用含有0.5%Triton X-100（PBST）的磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤眼罩3-5次，每次1小时，以尽量减少背景并去除任何未结合的抗体。
- 洗涤后，将眼罩与二抗、与Alexa Fluor 488染料偶联的驴抗小鼠免疫球蛋白G（绿色荧光）和与Alexa Fluor 594染料偶联的驴抗大鼠IgG（红色荧光）孵育过夜，均在封闭缓冲液中以1：1000稀释，在4°C。
- 第二天，用PBST清洗眼罩3-5次，每次1小时，以尽量减少背景并去除未结合的抗体。
- 在平放之前，将眼罩转移到PBS的培养皿中。
- 平面视网膜
- 免疫染色过程后，在显微镜下从眼罩中分离视网膜。
- 将视网膜切成四片叶子，然后平放，RGC层朝上。在附着在视网膜的颞侧留下标记以指示方向。
- 用封固剂13,18 盖玻片视网膜。用指甲油13、18、19 密封载玻片。
- 共聚焦成像
注：共聚焦图像的图像处理是使用ZEN显微镜软件进行的。- 打开共聚焦显微镜，在 定位模式下，使用显微镜的目镜找到感兴趣的区域。
- 在 采集模式下，设置平铺以覆盖整个视网膜，设置 z 堆栈切片以覆盖所有信息层。在整个视网膜上至少对 25 个图块进行成像，以覆盖 5.99 毫米 （x） x 5.88 毫米 （y） x 30 μm （z） 的总体积，像素尺寸为 1.24 μm/像素。
- 投影Z-stack切片以创建二维面共聚焦显微镜图像（图1C，D）11,13,19,20,21。
3. 体内 和 离体 图像的比对
- 处理纤维图后，通过将所有血管与所选的图形编辑器对齐，创建一个合成图像，其中包括从每只鼠标获取的四个图像。
注：平均而言，最终合成图像约为 1.2 mm （x） x 1.2 mm （y）， 如图 1B 所示。 - 使用视神经头 （ONH） 和血管模式作为标志来对齐复合纤维图。通过将复合OCT图像的血管模式与用ICAM-2染色的同一视网膜的共聚焦图像重叠来获得 体内 和 离体 对齐。
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Representative Results
将复合 vs-OCT 纤维图与用 Tuj-1 免疫染色的 RGC 轴突的平面视网膜的相应共聚焦图像进行比较（图 1D，上图）。通过 vis-OCTF 成像的轴突束可以与共聚焦图像上的 Tu-j1 标记的轴突束相匹配。在纤维图图像中，与周围的轴突束相比，血管通常表现出可区分的分支结构，这可以与共聚焦图像上的ICAM-2标记的血管相匹配（图1D，下图）。
离体共聚焦显微镜和体内 vs-OCT 之间的并排比较揭示了相同的 RGC 轴突束网络和周围的视网膜脉管系统。请注意，共聚焦图像可能与体内图像不完全匹配，尤其是在外围区域;这是因为视网膜已平放在载玻片上。综上所述，这些结果验证了vis-OCT纤维成像在体内解析两个不同大小的相邻RGC轴突束的能力。
图 1： 活体 图像与同一小鼠视网膜的 离体 图像对齐示意图。 （A） 小鼠眼睛的小动物对OCT系统成像示意图;（B） 从同一只眼睛获取的四张图像与放置在视野四个角的视神经头对齐;（C） 视网膜解剖示意图（左）、带跟踪方向的视网膜平装（中）和通过共聚焦显微镜成像的视网膜（右）;（D） 比较 vis-OCT 纤维照相和共聚焦显微镜 RGC 轴突束图像（上图），以及血管免疫染色的 体内 En-Face 与 离体 共聚焦显微镜图像（下图）。这四张图像来自同一只眼睛。黄色比例尺 = 100 μm。图 D 中的数字 （1-11） 分别代表血管。缩写：ONH=视神经头;vis-OCTF = 可见光光学相干断层扫描纤维学;RGC = 视网膜神经节细胞;S = 优越;I = 劣质;T = 时间;N = 鼻腔。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件 1：用于图像分析的 MATLAB 代码。请点击这里下载此文件。
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Discussion
该协议中有两个步骤需要注意。首先，有必要确保动物处于深度麻醉状态，并且在 vs-OCT 成像之前他们的眼睛完全散瞳。如果小鼠没有得到充分的麻醉，它们的快速呼吸可能导致 面部 图像的不稳定运动，这可能会对纤维图的质量产生不利影响。此外，扩张不足也会对图像质量产生负面影响，因为虹膜可能会阻挡光线，阻止光线到达视网膜。其次，在灌注后但从小鼠眼窝中取出眼球之前，标记左眼或右眼以及眼睛的颞侧很重要。由于平坦的视网膜朝上，RNFL 位于浅层，因此标记颞侧将使平坦的视网膜能够正确定向。
优点之一是该协议可以应用于不同的眼部疾病小鼠模型，例如视网膜缺血和糖尿病视网膜病变，只要前眼清晰进行光学成像。然而，这种方法的一个局限性是，即使正确固定视网膜进行免疫染色和共聚焦成像，轴突束形态也可能会发生变化。这是由于视网膜清扫过程中的误操作造成的，这可能导致轴突束破裂。此外，虽然视网膜在 体内成像时是弯曲的碗状结构，但它们在载玻片上被压平以进行共聚焦成像。因此，周边视网膜的 体内 OCT 图像和 离体 共聚焦图像之间可能存在不完全重叠。
对于故障排除：该技术主要包括两部分。首先，对于可见OCT部分，小鼠眼睛的质量会极大地影响获得清晰纤维图的成功。因此，不断将人工泪液涂在老鼠的眼睛上，以保持其湿润和明亮。鼠标的身体位置也经过微调，使激光尽可能垂直地照射到视网膜上。这些措施共同确保了图像质量。其次，对于视网膜解剖部分，我们发现切断视网膜周围的巩膜，而不是将其撕掉，对于维持ONH结构的完整性至关重要。当巩膜被镊子撕掉时，ONH在共聚焦显微镜下表现为一个大小适中的黑洞，视网膜组织从中心缺失。保持完整的ONH结构对于 体内 和 离体 比对至关重要。
总之，我们已经建立了 vis-OCTF 来直接量化和跟踪体内单轴突束水平的变化 11,12,13。该协议提供了对齐相同视网膜的体内与OCTF和离体共聚焦成像的说明。这些研究为建立人类神经损伤的客观评估奠定了基础，可以显著改善未来青光眼的诊断和治疗。
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Disclosures
Chang， S.， 无; Xu， W.， 无; Fan， W.， 无; 麦克丹尼尔，J.A.，无; D.A.米勒， 没有; M.格兰诺尼科， 没有; 刘明， 没有; X. Liu， 没有; H.F. Zhang 在Opticent Health中拥有经济利益，但Opticent Health不支持这项工作。
Acknowledgments
这项研究得到了青光眼研究基金会 Shaffer Grant、4-CA Cavalier 合作奖、R01EY029121、R01EY035088 和圣殿骑士眼科基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
References
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
