Summary
El presente protocolo describe los pasos para alinear las imágenes de fibragrafía de tomografía de coherencia óptica en luz visible (vis-OCTF) in vivo con imágenes confocales ex vivo de la misma retina de ratón con el fin de verificar la morfología del haz de axones de las células ganglionares de la retina observada en las imágenes in vivo .
Abstract
En los últimos años, la imagen de la retina in vivo , que proporciona información no invasiva, en tiempo real y longitudinal sobre los sistemas y procesos biológicos, se ha aplicado cada vez más para obtener una evaluación objetiva del daño neuronal en las enfermedades oculares. A menudo se necesitan imágenes confocales ex vivo de la misma retina para validar los hallazgos in vivo , especialmente en la investigación con animales. En este estudio, demostramos un método para alinear una imagen confocal ex vivo de la retina del ratón con sus imágenes in vivo . Se aplicó una nueva tecnología de imagen clínicamente preparada llamada figrafía de tomografía de coherencia óptica de luz visible (vis-OCTF) para adquirir imágenes in vivo de la retina del ratón. A continuación, realizamos la obtención de imágenes confocales de la misma retina que el "estándar de oro" para validar las imágenes in vivo vis-OCTF. Este estudio no solo permite una mayor investigación de los mecanismos moleculares y celulares, sino que también sienta las bases para una evaluación sensible y objetiva del daño neuronal in vivo.
Introduction
Las células ganglionares de la retina (CGR) desempeñan un papel fundamental en el procesamiento de la información visual, recibiendo entradas sinápticas a través de sus árboles dendríticos en la capa plexiforme interna (IPL) y transmitiendo la información a través de sus axones en la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL) al cerebro 1,2,3,4. En enfermedades como el glaucoma, la degeneración temprana de RGC puede dar lugar a cambios sutiles en el RNFL, la capa de células ganglionares (LCG), la LPI y el nervio óptico tanto en pacientes como en modelos de roedores 5,6,7,8,9. Por lo tanto, la detección temprana de estos cambios morfológicos en las CGR es esencial para una intervención oportuna para prevenir las CGR y la pérdida de visión.
Recientemente hemos desarrollado una nueva tecnología de imagen clínicamente lista llamada tomografía de coherencia óptica de luz visible (vis-OCT) para satisfacer la necesidad de monitoreo in vivo del daño de RGC. Vis-OCT mejoró la resolución axial, alcanzando 1,3 μm en la retina10,11, lo que permitió la visualización de haces de axones RGC individuales en el RNFL. Posteriormente, se estableció la figrafía vis-OCT (vis-OCTF) para rastrear y cuantificar el daño de RGC a nivel de haz de axones únicos en ratones11,12,13. Sin embargo, a menudo se necesitan imágenes confocales ex vivo de la misma retina que el estándar de oro para validar los hallazgos in vivo. Por lo tanto, este estudio demostrará cómo alinear imágenes in vivo adquiridas por vis-OCTF con imágenes confocales ex vivo de la misma retina de ratón. El protocolo tiene como objetivo validar los hallazgos in vivo mediante imágenes confocales ex vivo y establecer una base para examinar los cambios moleculares y celulares subyacentes al daño de RGC en condiciones enfermas.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia y se ajustaron a la directriz sobre el uso de animales del Instituto Nacional de Salud (NIH). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
1. Imágenes in vivo vis-OCT
- El sistema vis-OCT
- Imagine los ojos de los ratones utilizando un sistema vis-OCT de animales pequeños que utiliza una fuente de luz supercontinua, que proporciona una iluminación de luz visible entre 480 nm y 650 nm. Asegúrese de que la potencia incidente en la córnea sea de 1 mW y utilice una velocidad de línea A de 25 kHz y un tiempo de integración de 39,3 μs por línea A.
- Asegúrese de que el rango de detección espectral del espectrómetro esté entre 508 nm y 613 nm, lo que proporciona una resolución axial de 1,3 μm en la retina. El volumen total de imágenes es de aproximadamente 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). La resolución lateral está entre 4,5 μm en el centro del campo de visión y 8,7 μm a 350 μm del centro11,13.
- Anestesia de ratón
- Anestesiar ratones de origen C57BL/6 y de cualquiera de los sexos con una inyección intraperitoneal de ketamina (114 mg/kg) y xilacina (17 mg/kg) cóctel y dilatar sus pupilas con gotas de tropicamida al 1%. Confirmar la anestesia adecuada mediante la pérdida del reflejo pedal después de un pellizco firme del dedo del pie.
- Durante la toma de imágenes, mantenga el mouse caliente usando una lámpara de calor infrarroja. Después de cada adquisición de imágenes, aplique lágrimas artificiales para prevenir la deshidratación de la córnea.
- Posicionamiento del ratón para la obtención de imágenes
- Coloque el ratón anestesiado en el soporte del animal y mantenga el ratón en posición con la ayuda de dos correas de velcro.
NOTA: El soporte para animales permite el movimiento en tres dimensiones (ajuste vertical, ajuste horizontal fino, así como ajustes de cabeceo y guiñada) para colocar el láser en el ojo del ratón.
- Coloque el ratón anestesiado en el soporte del animal y mantenga el ratón en posición con la ayuda de dos correas de velcro.
- Ajuste de los parámetros de imagen
- Encienda la computadora y abra el software al que se hace referencia, que encenderá el láser automáticamente.
- Ajuste el soporte del animal hasta que el láser esté estable y centrado en el ojo del ratón. Visualice la parte posterior del ojo a través de una vista previa de En Face en la interfaz del software, el campo de visión (FOV) del plexo vascular superficial y un B-scan, la sección transversal de la retina dentro del FOV.
- Adquiera un volumen vis-OCT haciendo clic en el botón Adquirir en la interfaz del software después de realizar ajustes menores del enfoque óptico, que consta de 512 líneas A/B-scan y 512 B-scans/volumen.
NOTA: Este proceso tarda ~10,5 s. La adquisición de imágenes está guiada por un estimador de índice de calidad (QI) incorporado para garantizar que no se incluyan imágenes por debajo de un umbral predeterminado (QI < 45).- Para cada ratón, adquiera cuatro volúmenes vis-OCT del mismo ojo. Alinee la cabeza del nervio óptico (ONH, por sus siglas en inglés) en cada una de las cuatro esquinas del campo de visión para cubrir diferentes áreas de la retina.
NOTA: Dicha colocación minimiza la curvatura de la retina, lo que maximiza la reflectancia RNFL en todo el campo de visión. Se requiere ~ 1 minuto para reposicionar el ojo entre cada adquisición (Figura 1A, B).
- Para cada ratón, adquiera cuatro volúmenes vis-OCT del mismo ojo. Alinee la cabeza del nervio óptico (ONH, por sus siglas en inglés) en cada una de las cuatro esquinas del campo de visión para cubrir diferentes áreas de la retina.
- Análisis Vis-OCTF
NOTA: MATLAB se utiliza para realizar análisis de imágenes.- Para generar figramas vis-OCT a partir del volumen vis-OCC, utilice un método de umbral basado en la intensidad (línea de código 808 de MATLAB) para detectar la superficie de la retina.
NOTA: Estas líneas utilizan la función imadjust para ajustar los valores de intensidad del bscan. El argumento [0.0087 0.08] pasado a imadjust especifica el rango de intensidades que se asignarán al rango dinámico completo de la imagen de salida. - Recorte el RNFL seleccionando los primeros ~16 μm de profundidad. Consulte la línea de código 782 de Matlab.
NOTA: El grosor típico in vivo de RNFL en un ratón adulto de tipo salvaje C57BL/6 es de ~14 μm y puede variar entre los diferentes métodos de segmentación13. - Cambie las rutas del archivo RAW (línea 9), Archivos para reconstrucción (línea 11) y el nombre del archivo (línea 15), haga clic en Ejecutar y espere a que el código de MATLAB analice la imagen OCT. Calcule la proyección de la intensidad media a lo largo de la dirección axial (z) (líneas de código de MATLAB 905-908) para generar la imagen de fibrograma compuesta por haces de axones de RGC y vasculatura circundante. Ensamble las cuatro imágenes después del procesamiento de fibrogramas para cada campo de visión alineando los vasos sanguíneos con un editor de gráficos de su elección, cubriendo ~ 1,2 x 1,2 mm en total. Los archivos RAW generalmente se guardan en la carpeta: Halo Data, bajo la fecha de la imagen OCT (por ejemplo, 0606 Opticent).
NOTA: Los códigos de MATLAB están disponibles en el archivo complementario 1.
- Para generar figramas vis-OCT a partir del volumen vis-OCC, utilice un método de umbral basado en la intensidad (línea de código 808 de MATLAB) para detectar la superficie de la retina.
2. Imágenes confocales ex vivo
- Eutanasia de ratones
- Después de adquirir los datos de VINT, eutanasiar a los ratones con una mezcla de pentobarbital sódico (390 mg/mL) y fenitoína sódica (50 mg/mL). La fenitoína sódica actúa amplificando los efectos del pentobarbital sódico, que se ha aplicado ampliamente en la eutanasia de roedores14,15. Para cada ratón, utilizar 0,2 mL/20 g de la mezcla diluida (156 mg/mL) y perfundir con 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego, 20 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS16,17.
- Disección y orientación ocular
- Enuclea los ojos y haz una marca en el lado temporal para indicar la orientación.
- Después de retirar cuidadosamente la cámara anterior, el cristalino ocular, vítreo y fijar las copas oculares en PFA durante 30 min.
- Lave los oculares con PBS durante 30 minutos y reemplace la solución de PBS 3 veces durante el lavado. A continuación, lavar con Triton X-100 al 0,5% en PBS (pH 7,5) durante 30 min.
- Incubar las copas oculares en tampón de bloqueo (suero de burro al 5% con albúmina sérica bovina al 2,5% y Triton X-100 al 0,5% en solución salina tamponada con Tris [pH 7,5]) durante 2 h a temperatura ambiente.
- Inmunotinción
NOTA: Las copas oculares ya están listas para ser teñidas con los anticuerpos primarios de ratón anti-Tuj1 para detectar haces de axones de RGC y rata anti-ICAM-2 para detectar vasos sanguíneos.- Incubar las copas oculares durante la noche con los anticuerpos primarios, ratón anti-Tuj1 (1:200 en tampón de bloqueo) y rata anti-ICAM-2 (1:500 en tampón de bloqueo), a 4 °C.
- Lave los oculares de 3 a 5 veces durante 1 hora cada vez, con una solución salina tamponada con fosfato que contenga Triton X-100 (PBST) al 0,5 % para minimizar el fondo y eliminar cualquier anticuerpo no unido.
- Después del lavado, incubar las copas oculares durante la noche con los anticuerpos secundarios, la inmunoglobulina G anti-ratón de burro conjugada con el colorante Alexa Fluor 488 (fluorescencia verde) y la IgG anti-rata de burro conjugada con el colorante Alexa Fluor 594 (fluorescencia roja), todo ello diluido 1:1000 en tampón de bloqueo, a 4 °C.
- Al día siguiente, lave los oculares de 3 a 5 veces durante 1 hora cada uno con PBST para minimizar el fondo y eliminar los anticuerpos no unidos.
- Transfiera los oculares a una placa de Petri de PBS antes del montaje plano.
- Retina de montaje plano
- Después del proceso de inmunotinción, aísle las retinas de las copas oculares bajo el microscopio.
- Corta las retinas en cuatro hojas y móntalas planas con la capa RGC hacia arriba. Deje la marca en el lado temporal adherida a la retina para indicar la orientación.
- Cubra las retinas con medio de montaje13,18. Selle los portaobjetos con esmalte de uñas13,18,19.
- Imágenes confocales
NOTA: El procesamiento de imágenes confocales se realizó con el software de microscopía ZEN.- Encienda el microscopio confocal y, en el modo Localizar, busque el área de interés utilizando el ocular del microscopio.
- En el modo de adquisición, configure mosaicos para cubrir toda la retina y cortes de pila z para cubrir todas las capas de información. Visualice al menos 25 mosaicos en toda la retina para cubrir el volumen total de 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) con un tamaño de píxel de 1,24 μm/píxel.
- Proyecte los cortes de la pila Z para crear imágenes bidimensionales de microscopía confocal facial (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.
3. Alineación de imágenes in vivo y ex vivo
- Después de procesar el fitragrama, cree una imagen compuesta que incluya las cuatro imágenes adquiridas de cada ratón alineando todos los vasos sanguíneos con un editor de gráficos de su elección.
NOTA: En promedio, la imagen compuesta final mide aproximadamente 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), como se muestra en la Figura 1B. - Utilice la cabeza del nervio óptico (ONH) y el patrón de vasos sanguíneos como puntos de referencia para alinear el fibrograma compuesto. Obtener la alineación in vivo y ex vivo superponiendo el patrón de vasos sanguíneos de las imágenes OCT compuestas con las imágenes confocales de la misma retina teñida con ICAM-2.
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Representative Results
El fitragrama vis-OCT compuesto se compara con la imagen confocal correspondiente de la retina de montaje plano inmunoteñida con Tuj-1 para los axones de RGC (Figura 1D, panel superior). Los haces de axones de los que se obtienen imágenes mediante vis-OCTF se pueden hacer coincidir con los haces de axones marcados con Tu-j1 en la imagen confocal. Los vasos sanguíneos suelen exhibir estructuras ramificadas distinguibles en comparación con los haces de axones circundantes en las imágenes de fitragrama, que pueden coincidir con los vasos sanguíneos marcados con ICAM-2 en la imagen confocal (Figura 1D, panel inferior).
La comparación lado a lado entre la microscopía confocal ex vivo y la vis-OCT in vivo reveló redes idénticas de haces de axones de RGC y vasculatura retiniana circundante. Tenga en cuenta que la imagen confocal puede no coincidir perfectamente con las imágenes in vivo , especialmente en la región periférica; Esto se debe a que la retina se ha montado de forma plana en la diapositiva. En conjunto, estos resultados validan la capacidad de la figrafía vis-OCT para resolver dos haces de axones RGC adyacentes con diferentes tamaños in vivo.
Figura 1: Ilustración esquemática de la alineación de la imagen in vivo con la imagen ex vivo de la misma retina de ratón. (A) Esquema de la imagen del sistema de animales pequeños vis-OCT de un ojo de ratón; (B) Alineación de las cuatro imágenes adquiridas del mismo ojo con la cabeza del nervio óptico colocada en las cuatro esquinas del campo de visión; (C) Representación esquemática de la disección de la retina (izquierda), la retina de montaje plano con orientación rastreada (centro) y la retina siendo fotografiada por microscopía confocal (derecha); (D) Comparación de la fibragrafía vis-OCT y las imágenes del haz de axones RGC de microscopía confocal (panel superior), y la imagen in vivo de En-Face con la microscopía confocal ex vivo de los vasos sanguíneos inmunoteñidos (panel inferior). Las cuatro imágenes son del mismo ojo. Barras de escala amarillas = 100 μm. Los números (1-11) en el panel D representan vasos sanguíneos. Abreviaturas: ONH = cabeza del nervio óptico; vis-OCTF = fibra de tomografía de coherencia óptica en luz visible; RGC = célula ganglionar de la retina; S = superior; I = inferior; T = temporal; N = nasal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Códigos de MATLAB para el análisis de imágenes. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Hay dos pasos en este protocolo que requieren atención. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el animal esté bajo anestesia profunda y que sus ojos estén completamente dilatados antes de la obtención de imágenes por OCT. Si los ratones no están adecuadamente anestesiados, su respiración acelerada puede provocar movimientos inestables de las imágenes faciales , lo que puede afectar negativamente a la calidad del fitragrama. Además, una dilatación insuficiente también puede tener un impacto negativo en la calidad de la imagen, ya que el iris puede obstruir la luz, impidiendo que llegue a la retina. En segundo lugar, es importante marcar el ojo izquierdo o derecho, así como el lado temporal del ojo, después de la perfusión, pero antes de retirar el globo ocular de la cuenca del ojo del ratón. Dado que la retina de montaje plano mira hacia arriba con el RNFL en la capa superficial, marcar el lado temporal permitirá la orientación adecuada de la retina de montaje plano.
Una de las ventajas es que el protocolo se puede aplicar a diferentes modelos de ratón de enfermedades oculares, como la isquemia retiniana y la retinopatía diabética, siempre que los ojos anteriores estén despejados para la obtención de imágenes ópticas. Sin embargo, una limitación de este método es que incluso si la retina se fija correctamente para la inmunotinción y la obtención de imágenes confocal, la morfología del haz de axones puede cambiar. Esto ocurre debido a operaciones erróneas durante la disección de la retina, que pueden causar rupturas en los haces de axones. Además, mientras que las retinas son estructuras curvas en forma de cuenco cuando se obtienen imágenes in vivo, se aplanan en portaobjetos para obtener imágenes confocal. Como resultado, puede haber una superposición incompleta entre las imágenes in vivo vis-OCT y las imágenes confocales ex vivo de la retina periférica.
Para la resolución de problemas: esta técnica incluye principalmente dos partes. En primer lugar, para la parte vis-OCT, la calidad del ojo del ratón puede tener un gran impacto en el éxito de la adquisición de fibromas transparentes. Por lo tanto, se aplicaban constantemente lágrimas artificiales al ojo del ratón para mantenerlo húmedo y brillante. La posición del cuerpo del ratón también se ajustó para que el láser brillara lo más perpendicularmente posible sobre la retina. En conjunto, estas medidas garantizaron la calidad de la imagen. En segundo lugar, para la parte de disección de la retina, descubrimos que cortar la esclerótica que rodea la retina, en lugar de arrancarla, era crucial para mantener la integridad de la estructura de la ONH. Cuando se arrancó la esclerótica con fórceps, la ONH apareció como un agujero oscuro de tamaño razonable bajo la microscopía confocal, con el tejido de la retina faltando en el centro. Mantener una estructura completa de ONH es esencial para las alineaciones in vivo y ex vivo .
En resumen, hemos establecido vis-OCTF para cuantificar y rastrear directamente los cambios a nivel de haz de axones individuales in vivo11,12,13. Este protocolo proporciona instrucciones para alinear las imágenes in vivo vis-OCTF y confocales ex vivo de las mismas retinas. Estos estudios sientan las bases para establecer una evaluación objetiva del daño neuronal en humanos, lo que puede mejorar significativamente el diagnóstico y tratamiento del glaucoma en el futuro.
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Disclosures
Chang, S., Ninguno; Xu, W., Ninguno; Fan, W., Ninguno; McDaniel, J.A., Ninguno; D.A. Miller, Ninguno; M. Grannonico, Ninguno; M. Liu, Ninguno; X. Liu, Ninguno; H.F. Zhang tiene intereses financieros en Opticent Health, que no apoyó este trabajo.
Acknowledgments
Este estudio cuenta con el apoyo de la Beca Shaffer de la Fundación para la Investigación del Glaucoma, el Premio Colaborativo 4-CA Cavalier, R01EY029121, R01EY035088 y la Fundación Ocular de los Caballeros Templarios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
References
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