Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.
Abstract
تعد البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) من الفئران أداة رئيسية لدراسة البيولوجيا المعقدة لبلاعم الأنسجة. كخلايا أولية ، فإنها تمثل فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي بشكل أوثق من خطوط خلايا البلاعم الخالدة ويمكن اشتقاقها من الفئران التي تحمل بالفعل تغييرات جينية محددة. ومع ذلك ، فإن تعطيل وظيفة الجينات في BMDMs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في BMDMs ، والذي يسمح بإدخال عمليات إدخال وحذف صغيرة (indels) تؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار التي تعطل وظيفة الجينات. يصف البروتوكول كيفية تجميع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA-Cas9) وتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 المنقاة (RNPs) التي يمكن توصيلها عن طريق التثقيب الكهربائي. كما يوفر طريقة فعالة لمراقبة كفاءة التحرير باستخدام تسلسل سانجر الروتيني وبرنامج تحليل متاح مجانا عبر الإنترنت. يمكن تنفيذ البروتوكول في غضون 1 أسبوع ولا يتطلب بناء البلازميد. ينتج عنه عادة كفاءة تحرير تتراوح من 85٪ إلى 95٪.
Introduction
البلاعم هي خلايا مناعية فطرية تلعب أدوارا حاسمة في إصلاح الأنسجة والمناعة 1,2. تتميز خطوط خلايا البلاعم الخالدة ، مثل خلايا الماوس RAW 264.7 أو خلايا THP-1 البشرية ، بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك النمو القوي وسهولة تعطيل الجينات عن طريق توصيل ناقلات لتداخل الحمض النووي الريبي أو CRISPR / Cas9 3,4. ومع ذلك ، فإن التحول السرطاني يغير بشكل كبير فسيولوجيتها ، مما يؤدي إلى التنشيط الشاذ لبعض المسارات والاستجابات الصامتة للآخرين 5,6. تلخص البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) بشكل أوثق في فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي ، ولكنها تظل صعبة التلاعب وراثيا بسبب الكفاءة المنخفضة لكل من نقل البلازميد والنقل الفيروسي في هذه الخلايا المناعية الأولية 7,8. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة لتعطيل وظيفة الجينات.
يعد تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 أداة قوية للتلاعب الجيني عبر مجموعة من الأنظمة البيولوجية ، بما في ذلك خلايا الثدييات9،10،11،12. يقوم بروتين Streptococcus pyogenes Cas9 بكفاءة وعلى وجه التحديد بشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل عند تعقيده باستخدام الحمض النووي الريبي الإرشادي الخاص بالتسلسل. يؤدي إصلاح الحمض النووي من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) للحمض النووي المشقوق إلى عمليات إدخال أو حذف صغيرة (indels) تخلق طفرات إزاحة الإطار. في الدراسات المبكرة ، تم تسليم Cas9 و sgRNAs من خلال ناقلات البلازميد أو الفيروسات العدسية ، وهي طرق توصيل فعالة للعديد من خطوط الخلايا 9,10. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية ، وعلى وجه الخصوص ، الخلايا المناعية الأولية غالبا ما تكون مقاومة لهذه الطرق بسبب انخفاض كفاءة توصيل النواقل عن طريق النقل أو التنبيث. بعد ذلك ، تم تطوير طرق لتوليد مجمعات sgRNA-Cas9 في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي ، وقد حققت هذه الطرق كفاءة عالية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا13,14. اقترحت النتائج إمكانية استخدام هذا النهج لإجراء تحرير الجينوم في البلاعم الأولية.
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 (RNPs) لإجراء تحرير الجينوم في BMDMs الأولية. يحتوي على خطوات للتخفيف من تنشيط أجهزة الاستشعار المناعية الموجودة في الخلايا المناعية الأولية ويؤدي إلى تحرير يصل إلى 95٪ في المواقع المستهدفة بأقل قدر من السمية. يتضمن هذا البروتوكول أيضا مهام سير العمل لتقييم كفاءة التحرير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني (PCR) وتسلسل سانجر ، يليه في تحليل السيليكو بواسطة تتبع Indels بواسطة التحلل (TIDE) 15 ، وهي أداة برمجية عبر الإنترنت تم التحقق من صحتها جيدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم sgRNA
ملاحظة: تصف هذه الخطوة اختيار التسلسلات المستهدفة وتصميم sgRNAs. من المفيد تصميم أدلة موجودة في أول إكسون ترميز كبير ، بحيث يتم تعطيل أي بروتين مترجم في وقت مبكر من إطار القراءة المفتوح. من المفيد أيضا تحديد التسلسلات المستهدفة التي تقع ضمن نفس exon ، حيث سيؤدي ذلك إلى تبسيط تحليل كفاءة التحرير (الخطوة 6). استخدمت أمثلة تحرير الجينوم المقدمة مع هذا البروتوكول sgRNAs التي تستهدف أول إكسون لجين Src وجين Cblb ، وكذلك في موضع Rosa26 غير المشفر لجينوم الفأر.
- حدد 20 تسلسلا جينوميا للنيوكليوتيدات لاستهدافها ، باستخدام واحدة من عدة أدوات تصميم مجانية عبر الإنترنت (الجدول 1). حدد أربعة إلى خمسة أدلة غير متداخلة داخل كل جين ، حيث يختلف نشاط Cas9 حسب الدليل المحدد المختار ، ولا يمكن التنبؤ المسبق بدليل نشط للغاية.
ملاحظة: من الأهمية بمكان ضمان التوجيه الصحيح للدليل بالنسبة لتسلسل الموضع المستهدف. توفر أدوات التصميم عادة تسلسل الدليل في اتجاه 5 إلى 3 ، بغض النظر عن الشريط الكروموسومي المستهدف. للتحقق من اتجاه الشريط ، تحقق من وجود تسلسل شكل مجاور أولي (PAM) ل S. pyogenes Cas9 (nGG) على الفور 3 'من التسلسل الجينومي المستهدف. لا يتضمن تسلسل sgRNA PAM.
2. تخليق sgRNA
ملاحظة: تصف هذه الخطوة كيفية تجميع sgRNAs باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل لإنشاء قالب للنسخ في المختبر (IVT) ، ثم تنقية sgRNA باستخدام أعمدة الدوران (الشكل 1A). تتوفر sgRNAs الاصطناعية المخصصة تجاريا من خلال العديد من البائعين كبديل ل PCR / IVT.
- قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لإنشاء قالب IVT لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7. يستخدم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بادئات عالمية تحتوي على محفز بوليميراز T7 RNA وتسلسل CRISPR RNA (tracrRNA) المنشط (الجدول 2) ، بالإضافة إلى البادئات الفردية القصيرة مع تسلسل الدليل الخاص بالجينات.
- هذه هي خطوة تمديد التداخل غير المضخمة. قم بتخفيف المخزن المؤقت PCR إلى 1x وأضف 1 mM MgCl2 إضافيا. بعد ذلك ، أضف 0.25 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة ، و 0.5 مللي مول من ثلاثي فوسفات الديوكسي نيوكليوتيد (dNTP) ، و 0.02 مللي متر التمهيدي الخاص بالدليل ، و 0.02 مللي متر T7 التمهيدي العالمي الطويل العكسي (الجدول 2) إلى حجم إجمالي قدره 46 ميكرولتر. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل دورتين: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 37 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تبريد ردود الفعل على الجليد.
- هذه هي خطوة تضخيم PCR. لكل تفاعل ، أضف 2 ميكرولتر من 25 mM التمهيدي للتضخيم الأمامي و 2 μL من التمهيدي للتضخيم العكسي 25 mM. حجم التفاعل النهائي هو 50 ميكرولتر. تشوه لمدة 30 ثانية عند 95 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتشغيل 35 دورة من: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. قم بإجراء تمديد إضافي عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- تحقق من منتج تفاعل PCR على هلام أغاروز 2٪. ينتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل الممتد جزيء dsDNA 127 bp مع مروج T7 في المنبع لدليل النوكليوتيدات 20 الخاص بالجين و tracrRNA مباشرة في اتجاه مجرى النهر (الشكل 1B).
- تنقية قالب IVT: هناك العديد من البروتوكولات والمجموعات التي تعمل بشكل جيد لهذا الغرض. يستخدم هذا البروتوكول حبات التثبيت العكسي ذات الطور الصلب (SPRI). امزج 50 ميكرولتر من منتج PCR مع 90 ميكرولتر من الخرز واتبع تعليمات الشركة المصنعة. قم بإزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت (5 مللي متر تريس ، 0.1 مللي متر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك [EDTA]) والحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بقياس تركيز الحمض النووي لقالب IVT باستخدام الامتصاص عند طول موجي 260 نانومتر. هناك حاجة إلى تركيز الحمض النووي لا يقل عن 50 نانوغرام / ميكرولتر ل IVT. يمكن تخزين قالب IVT عند -20 درجة مئوية.
- رد فعل IVT
- استخدم مجموعة تجارية مصممة لإنتاج غلات عالية من IVT (انظر جدول المواد). اتبع توصيات الشركة المصنعة لإجراء تفاعل IVT. باستخدام 250 نانوغرام من قالب IVT في تفاعل 20 ميكرولتر ، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4-16 ساعة.
- تحقق من منتج IVT sgRNA عن طريق تشغيل 1 ميكرولتر من التفاعل على هلام أغاروز 2٪. يجب ملاحظة شريط RNA ساطع ، يعمل بشكل مشابه ل 70 bp dsDNA (الشكل 1C). على الرغم من أنه ليس إلزاميا ، للحصول على نطاقات حادة وأكثر دقة ، استخدم المخزن المؤقت لعينة الحمض النووي الريبي مع اليوريا ، وقم بتشويه العينة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل التحميل.
ملاحظة: يمكن رؤية نطاقات خافتة ذات وزن جزيئي أعلى واختلافات طفيفة في الهجرة مع بعض الحمض النووي الريبي الموجه بسبب الاختلافات في البنية الثانوية للحمض النووي الريبي.
- قم بإزالة فسفرة منتج sgRNA IVT لتقليل تنشيط RIG-I (مستشعر RNA أجنبي) وموت الخلية اللاحق بعد التثقيب الكهربائي. لكل تفاعل IVT 20 ميكرولتر ، أضف 69 ميكرولتر من الماء الجزيئي و 15 وحدة من الفوسفاتيز المعوي في ربلة الساق (CIP) في 1x CIP buffer. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتحلل قالب IVT لتقليل تنشيط مستشعرات الحمض النووي الخلوية ، والتي تؤدي إلى موت الخلايا بعد التثقيب الكهربائي. لكل تفاعل IVT ، أضف 2 U من DNase الخالي من RNase. احتضان لمدة 15 دقيقة على 37 درجة مئوية. يمكن تخزين منتج IVT في -20 درجة مئوية لمدة 1 يوم أو -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
- قم بتنقية منتج IVT باستخدام أعمدة الدوران. لهذه الخطوة ، تكون مجموعات تنقية حبة SPRI أقل شأنا.
- اربط الحمض النووي الريبي بالعمود عن طريق إضافة 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط إلى منتج IVT ، متبوعا ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ من درجة البيولوجيا الجزيئية. تخلط جيدا وتحميل العمود. بعد ذلك ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء الغسيل النهائي في خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي لتجنب تلوث sgRNA.
- قم بإجراء الشطف في غطاء التدفق الصفحي لتجنب التلوث. قم بالتخلص من الحمض النووي الريبي باستخدام 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعقم 10 mM Tris (درجة الحموضة 8.0).
- قياس تركيز sgRNA عن طريق قياس الامتصاص عند طول موجي 260 نانومتر.
ملاحظة: غلة sgRNA النموذجية لا تقل عن 100 ميكروغرام. - قم بتخزين sgRNA في -80 درجة مئوية. اصنع القسامات لتجنب أكثر من ثلاث دورات تجميد وذوبان.
3. التحضير للتثقيب الكهربائي
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي لتجنب التلوث. يستخدم هذا البروتوكول نظام التثقيب الكهربائي المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) مع أطراف 10 ميكرولتر.
- قم بإذابة BMDMs 48-72 ساعة قبل الاستخدام وقم بتوسيعها على الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة (TC).
ملاحظة: لكل تفاعل ، هناك حاجة إلى 4 × 105 خلايا. - تعقيم أنابيب PCR لتجميع التفاعل. قم بإعداد أنبوب PCR واحد لكل تفاعل ، وقم بتسخينه في جهاز تدوير حراري لمدة 10 دقائق عند 98 درجة مئوية. تحضير الأنابيب على دفعات وتخزينها مغلقة. ضع أنابيب PCR المعقمة على الثلج عندما تكون جاهزة للاستخدام.
- نظف محطة الماصة بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها في غطاء التدفق الصفحي. اضبط المعلمات على 1900 فولت و 20 مللي ثانية ونبضة واحدة.
- قم بإزالة أنبوب النقل من العبوة بعناية لإبقائه معقما واملأه ب 3 مل من المخزن المؤقت "E". تأكد من أن المخزن المؤقت E في درجة حرارة الغرفة قبل التثقيب الكهربائي. أدخل الأنبوب في المحطة وادفعه لأسفل حتى يصدر صوت طقطقة.
- لكل تفاعل ، القسمة 2.5 ميكرولتر من sgRNA بتركيز 1100 نانوغرام / ميكرولتر. تمييع sgRNA في محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) مع 0.9 mM CaCl2 و 0.5 mM MgCl2 (PBS + Ca / Mg). اتركه على الجليد.
- قم بإعداد لوحين: صفيحة غير مطلية ب 12 بئرا للخلايا ولوحة إضافية من 24 بئرا لاستيعاب وسائط الاستزراع. القسمة 1.5 مل من الوسط الخالي من المضادات الحيوية لكل تفاعل في آبار الصفيحة المكونة من 24 بئرا.
- تحضير بروتين Cas9. هناك العديد من الموردين التجاريين والأكاديميين لبروتين Cas9 المنقى المعقم. تمييع Cas9 إلى تركيز نهائي من 20 ميكرومتر مع PBS الباردة + الكالسيوم / المغنيسيوم. لكل تفاعل التثقيب الكهربائي ، القسمة 1 ميكرولتر من 20 ميكرومتر Cas9 في أنابيب PCR معقمة. اتركيه على الجليد.
- تحضير الخلايا للتثقيب الكهربائي.
- قم بإزالة وسط النمو. اغسل الخلايا باستخدام PBS بدون CaCl2 و MgCl2 (PBS-Ca / Mg) لإزالة المصل والكاتيونات ثنائية التكافؤ التي تعزز الالتصاق. ثم أضف PBS + 1 mM EDTA واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال.
- ماصة بلطف صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. انقل الخلايا إلى أنبوب منخفض الارتباط بالبروتين سعة 15 مل. بيليه الخلايا في 500 × غرام لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: البلاعم ملتصقة بالأواني البلاستيكية. إن استخدام أنابيب الطرد المركزي منخفضة الارتباط بالبروتين يحسن بشكل كبير من إنتاج الخلية. - العمل بسرعة لتجنب الحضانة لفترات طويلة من الخلايا في PBS + EDTA. قم بإزالة معظم المادة الطافية ، تاركا حوالي 1 مل من المادة الطافية في الأنبوب. أعد تعليق الخلايا في المادة الطافية المتبقية ، ثم انقلها إلى أنبوب microfuge منخفض الارتباط بالبروتين سعة 1.5 مل.
- قم بإزالة حصة صغيرة من الخلايا للعد. قم بتجميع الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- أثناء الطرد المركزي ، عد الخلايا وقم بتسخين أنابيب Cas9 و sgRNA إلى درجة حرارة الغرفة.
- إزالة كل طاف من بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في PBS + Ca / Mg بتركيز 4 × 107 خلايا / مل (4 × 105 خلايا لكل تفاعل 10 ميكرولتر).
ملاحظة: يتم تزويد كل مجموعة بكمية محدودة من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (Buffer R ، Buffer T). ومع ذلك ، نجد أن كفاءة التثقيب الكهربائي باستخدام PBS + Ca / Mg تعادل المخازن المؤقتة الخاصة. - عند كهربية sgRNAs لجينات مختلفة ، قم بقسمة الخلايا إلى أنابيب مختلفة منخفضة الارتباط بالبروتين لكل جين لتجنب التلوث المتبادل بين sgRNAs. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للتثقيب الكهربائي.
4. الجمعية RNP
- حافظ على sgRNA و Cas9 في درجة حرارة الغرفة لتجنب هطول الأمطار. أضف 2.5 ميكرولتر من sgRNA إلى 1 ميكرولتر من Cas9 المخفف في أنابيب PCR المعقمة. قم بتوزيع sgRNA ببطء على مدار 15 ثانية مع الخلط لمنع هطول الأمطار.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوين مجمع RNP.
5. تسليم RNP عن طريق التثقيب الكهربائي
- تحضير طرف التثقيب الكهربائي (كوفيت). اضغط على المكبس لتمديد الجذع. أدخل الجذع في الحافة.
ملاحظة: تأكد من أن الطرف آمن وأن المكبس ينزلق بسلاسة ويمتد إلى ما وراء غمد الطرف. إذا لم يتم وضع الطرف بشكل صحيح ، فقد يتم إدخال فقاعات هواء في الطرف ، مما يتسبب في فشل الطرف. - أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، ثم قم بتحميل طرف التثقيب الكهربائي بالخلايا. اسحب سعة الحجم الكاملة البالغة 10 ميكرولتر للطرف ، وتجنب الفقاعات.
- بدءا من sgRNA للتحكم السلبي ، انقل 10 ميكرولتر من الخلايا في طرف التثقيب الكهربائي إلى أنبوب العينة الذي يحتوي على 3.5 ميكرولتر من RNP من الخطوة 4. ماصة صعودا وهبوطا ثلاث مرات لخلط جيدا. اسحب 10 ميكرولتر من الخليط مرة أخرى إلى الحافة ، مع ضمان عدم وجود فقاعات.
- ضع الطرف في محطة التثقيب الكهربائي ، وقم بخفضه في المخزن المؤقت. تجنب ملامسة الأسطح البلاستيكية ذات الطرف للحفاظ على العقم. اضغط على زر البدء على شاشة اللمس.
- بعد الانتهاء ، ستشير الشاشة إلى نبض ناجح. قم بإزالة الماصة من الجهاز وضع الخلايا في بئر جاف من لوحة 12 بئر غير المطلية وغير المطلية.
- اشطف الطرف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرتين في 15 مل من PBS + Ca / Mg. ضع الماصة جانبا مع استمرار تثبيت الطرف. تأكد من أن الطرف لا يلمس أي شيء ويبقى معقما.
ملاحظة: في العديد من التجارب ، من الممكن إعادة استخدام الطرف لعينات متعددة ، مثل بعد عينة sgRNA الضابطة السلبية غير النشطة ، أو أثناء التقييمات الأولية لنشاط الدليل عندما يتم اختبار أربعة إلى خمسة sgRNAs لكل جين والقراءة الوحيدة هي كفاءة التحرير. ومع ذلك ، أثناء التحليل الوظيفي على الخلايا المحررة ، يوصى باستخدام طرف جديد لكل جين ، حيث يمكن أن تؤثر كميات صغيرة من sgRNA أو ترحيل الخلية على النتائج التجريبية. - أضف على الفور 1 مل من الوسط الخالي من المضادات الحيوية (aliquote في الخطوة 3.6) إلى الخلايا وهز اللوحة برفق للخلط.
- كرر الخطوات 5.2-5.6 لردود الفعل المتبقية.
- أعد الخلايا إلى الحاضنة.
- تحقق من صلاحية الخلايا 1-2 ساعة بعد التثقيب الكهربائي. يجب أن تكون الخلايا ملتصقة بنسبة >90٪. اختياري: أضف الجنتاميسين (5 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا بعد 1-2 ساعة من التثقيب الكهربائي للمساعدة في منع التلوث إذا لم يتداخل ذلك مع التجارب النهائية.
6. تقييم كفاءة التحرير
ملاحظة: تكتمل معظم عمليات التحرير بعد 48 ساعة.
- تحقق من الخلية أحادية الطبقة بعد 48 ساعة من التثقيب الكهربائي. إذا كانت الخلايا متقاربة بنسبة تزيد عن 50٪ ، فتابع أكثر. إذا كانت الخلايا متقاربة بنسبة <50٪ ، فانتظر 1-2 أيام إضافية. يتطلب تحليل الحمض النووي الجينومي لتحديد كفاءة التحرير 1 × 105 خلايا ، بالإضافة إلى الخلايا اللازمة لتجربة المصب.
- تحضير الحمض النووي الجينومي (gDNA).
- اغسل الخلايا باستخدام PBS (-Ca / Mg). أضف 1 مل من PBS + 1 mM EDTA. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق حتى تبدأ الخلايا في الانفصال عن اللوحة.
- افصل الخلايا عن طريق الماصة. نقل إلى أنبوب microfuge منخفضة البروتين ملزمة.
- عد الخلايا وقم بإزالة حصصة من 1 × 105 خلايا. يمكن إعادة طلاء الخلايا المتبقية لاستخدامها في تجارب أخرى. بشكل عام ، يتم إجراء التجارب بعد 5 أيام من التثقيب الكهربائي من أجل السماح بتسوس البروتين.
- قم بتجميع الخلايا لتحليل gDNA لمدة 15 ثانية بأقصى سرعة في أنبوب microfuge.
- أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من محلول التحلل. دوامة لفصل أي خلايا عالقة على جدران الأنبوب ، وتسخينها عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحلل الخلايا وتعطيل DNase الداخلي.
- ضع الأنابيب على الثلج.
- أضف 1 ميكرولتر بروتين K (20 مجم / مل). احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية ؛ يمكن تركه طوال الليل للراحة.
- يسخن إلى 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعطيل بروتيناز K.
- أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة. إزالة الطاف, الذي يحتوي على الحمض النووي. يعمل هذا التحضير الخام دون مزيد من التنقية بشكل جيد لمعظم تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل.
- تقييم كفاءة التحرير باستخدام تسلسل سانجر.
- تصميم بادئات PCR 200-300 bp المنبع من أكثر 5 'مواقع دليل و 200-300 bp المصب من أكثر 3 'مواقع دليل. حجم amplicon النموذجي هو ~ 500 bp. صمم برايمر تسلسل متداخل على بعد 125 نقطة أساس على الأقل من أقرب موقع دليل (الشكل 2 أ).
- إجراء PCR باستخدام 2 ميكرولتر من gDNA.
- تحضير منتج PCR للتسلسل. يستخدم هذا البروتوكول علاج إكسونوكلياز I / الروبيان الفوسفاتيز القلوي (ExoI / SAP). تعمل مجموعات تنقية الحمض النووي التجارية أيضا ولكنها تتطلب المزيد من الوقت العملي.
- تحضير 15 ميكرولتر من منتج PCR. أضف 7.5 ميكرولتر من الماء ، و 1 ميكرولتر من 10x ExoI buffer ، و 10 U من ExoI ، و 1 U من SAP لتحلل dNTPs والبادئات التي تتداخل مع تسلسل سانجر.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها 85 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإلغاء تنشيط الإنزيمات.
- إجراء تسلسل سانجر على منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المعالج ب Exo / SAP ؛ استخدم كمية معروفة من علامة حجم الحمض النووي لتقدير حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموجود في العينة. قد تتطلب تفاعلات التسلسل التحسين ، حيث يحتاج برنامج TIDE إلى كروماتوجرام تسلسل عالي الجودة لتقدير كفاءة التحرير بدقة. يجب أن يوفر مخطط كروماتوجرام التسلسل للموضع غير المحرر قمم واضحة مع الحد الأدنى من الخلفية (الشكل 2B ، C).
- لتقدير كفاءة التحرير ، استخدم TIDE لتحليل ملفات كروماتوجرام تسلسل سانجر باستخدام gDNA المحرر و gDNA للتحكم غير المحرر. (الجدول 1 ، الشكل 2). قم بتحميل ملفات تسلسل Sanger وقم بتشغيل البرنامج بالإعدادات الافتراضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قالب IVT هو منتج PCR 127 bp (الشكل 1B). منتج IVT كامل الطول هو 98 nt RNA ، والذي يهاجر بشكل مشابه لجزء DNA مزدوج تقطعت به السبل 70 bp (الشكل 1C).
بعد التثقيب الكهربائي ، يجب أن تكون الخلايا قابلة للحياة بنسبة >90٪ ، مع إجمالي عدد الخلايا بنسبة >70٪ من رقم خلية البداية. يجب أن تحتوي المجموعة الناتجة من الخلايا الطافرة على مجموعة متنوعة من indels ، بدءا من موقع الانقسام Cas9. يجب أن يظهر تحليل الجينات المستهدفة بواسطة تسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل سانجر نيوكليوتيدات متعددة في كل موضع في اتجاه مجرى موقع الانقسام Cas9 (الشكل 2).
الشكل 1: نظرة عامة على عملية تحرير sgRNA-Cas9. (أ) رسم تخطيطي لتصميم الدليل ، وتوليد sgRNA ، وتوصيل Cas9-sgRNA. (ب) تم حل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من IVT ل Src sgRNAs 1 و 2 و 3 على هلام أغاروز 2٪. يشير السهم إلى منتجات PCR الصحيحة 127 bp. (ج) منتجات الحمض النووي الريبي بعد IVT ل Src sgRNAs 1 و 2 و 3 تم حلها على هلام أغاروز 2٪. تشير الأقواس إلى منتجات sgRNA الصحيحة. يرجع الترحيل المتغير ل sgRNA إلى البنية الثانوية للحمض النووي الريبي. تمت إعادة طباعة هذا الرقم من أطروحة الماجستير للمؤلف الأول16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحقيق كفاءة تحرير عالية للعديد من الجينات المستهدفة. (أ) رسم تخطيطي لبادئات تسلسل PCR و Sanger. (ب) رسم تخطيطي لتدفق العمل ل TIDE لتقييم كفاءة التحرير. (ج) مخطط كروماتوجرام تسلسل ممثل سانجر لموضع ROSA26 من BMDMs المكهرب بالتحكم في sgRNA-Cas9 RNP (أعلى) و sgRNA خاص ب ROSA26 (أسفل) ؛ يتم تمييز موقع انشقاق Cas9. إخراج المد والجزر (يمين) مع كفاءة التحرير المحسوبة والنسبة المئوية للتسلسلات التي تؤوي العدد المشار إليه من indels. (د، ه) تسلسل سانجر للكروماتوجرام لجينات (D) Src و Cblb في BMDMs المحررة. تمت إعادة طباعة هذا الرقم من أطروحة الماجستير للمؤلف الأول16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زيادة معتدلة في كفاءة التحرير بسبب محسن التثقيب الكهربائي التجاري. تم تزويد BMDMs بالكهرباء بأدلة منخفضة الكفاءة لتقييم تأثير محسن التحرير التجاري. قبل التثقيب الكهربائي ، تمت إضافة 1 ميكرولتر من المحسن إلى RNPs المجمعة إلى تركيز نهائي يبلغ 4 ميكرومتر. تم تقييم كفاءة تحرير Src sgRNA المشار إليه باستخدام TIDE. تمت إعادة طباعة هذا الرقم من أطروحة الماجستير للمؤلف الأول16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم الأداة | الرابط | ||
| Synthego - أداة تصميم كريسبر | https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool | ||
| معهد برود - كريسبيك | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| تتبع Indels عن طريق التحلل (TIDE) | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
الجدول 1: عناوين URL للأدوات عبر الإنترنت.
| اسم التمهيدي | تسلسل | ||
| دليل خاص التمهيدي | ggatcctaatacgactcactatag[N20]gttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - دليل Cbl-b 3 | ggatcctaatacgactcactatagAAAATATCAAGTATATACGGgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - دليل Cbl-b 4 | ggatcctaatacgactcactatagGGTAAAATATCAAGTATAgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - روزا | ggatcctaatacgactcactatagCTCCAGTCTTTCTAGATgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - التدافع | ggatcctaatacgactcactatagGCACTACCAGAGCTAACTCAgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - دليل Src 2 | ggatcctaatacgactcactatagTCACTAGAGGGGAATCAGAGgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - دليل SRC 5 | ggatcctaatacgactcactatagCAGCAACAAGAGCAAGCCCAgttttagagctagaa | ||
| دليل خاص التمهيدي - دليل Src 6 | ggatcctaatacgactcactatagAGCCCAAGGACGCCAGCCAGgttttagagctagaa | ||
| T7 عكس طويل التمهيدي العالمي | اااااا | ||
| التمهيدي العالمي للتضخيم الأمامي | ggatcctaatacgactcactatag | ||
| التمهيدي العالمي للتضخيم العكسي | آ | ||
الجدول 2: قليل النيوكليوتيدات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد قالب IVT ل sgRNA. يتم كتابة تسلسلات هدف النوكليوتيدات ال 20 للبادئات الخاصة بالجينات.
| وسائط نمو BMDM. يحفظ في درجة حرارة 4 مئوية. | |||
| دميم | |||
| مصل الجنين البقري | 0.1 | ||
| إل-جلوتامين | 0.2 م | ||
| طاف MCSF من خلايا 3T3-MCSF ** | 0.1 | ||
| بيروفات الصوديوم | 11 ملغم / مل | ||
| تحلل العازلة. يحفظ في درجة حرارة 4 مئوية. | |||
| 2-ميركابتوإيثانول (يضاف مباشرة قبل الاستخدام) | 0.01 | ||
| مغ سي سي ال2 | 5 مللي متر | ||
| تريس | 20 مللي متر | ||
| تريتون-X 100 | 0.005 | ||
| ** تزرع خلايا 3T3-MCSF في DMEM + 10٪ FCS. يتم حصاد الطافي مع MCSF في اليوم 5 بعد الوصول إلى التقاء 100 ٪. كبديل 10ng / ml المؤتلف MCSF يمكن استخدامها بدلا من الوسائط المكيفة | |||
الجدول 3: تركيبات الوسائط والمخازن المؤقتة.
الملف التكميلي 1: ملف التسلسل الخام ل ROSA_ Mock الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: ملف التسلسل الخام لعام ROSA_TargettingGuide الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: ملف التسلسل الخام ل ScrambleGuide الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: ملف التسلسل الخام ل SrcG5 + SrcG6 الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 5: ملف التسلسل الخام لعام CBLB_Mock الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 6: ملف التسلسل الخام CBLB_TargetingGuide الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 7: ملف التسلسل الخام Mock_Guide2Locus الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 8: ملف التسلسل الخام Mock_Guide6Locus الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 9: ملف التسلسل الخام SrcGuide2_Enhancer الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 10: ملف التسلسل الخام SrcGuide2_NoEnhance الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 11: ملف التسلسل الخام ل SrcGuide6_Enhancer الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 12: ملف التسلسل الخام ل SrcGuide6_NoEnhancer الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح تحرير الجينوم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA المكهربة بالتعطيل الفعال لوظيفة الجينات في BMDMs. تختلف كفاءة التحرير حسب التسلسل المستهدف والجين. عادة ، يتم فحص أربعة إلى خمسة sgRNAs بشكل عام لتحديد واحد نشط للغاية. تتمتع بعض المواضع بكفاءة تحرير أقل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى بنية الكروماتين. في هذه الحالات ، يمكن إجراء العديد من التعديلات لزيادة كفاءة التحرير. يؤدي التسليم المشترك لاثنين من sgRNAs النشطين إلى نفس exon إلى تحسين التحرير لبعض الجينات. ومع ذلك ، عندما يتم نقل دليلين بشكل مشترك ، لاحظنا أن TIDE قد يفقد الدقة. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى تقنيات بديلة لتقييم التحرير ، مثل النشاف الغربي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يؤدي تضمين محسن NHEJ المتاح تجاريا إلى زيادة كفاءة التحرير بنسبة ~ 20٪ (الشكل 3).
هذا النهج له العديد من المزايا. لا يتطلب التوصيل المباشر ل sgRNA-Cas9 إلى الخلايا الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا لبناء البلازميد أو إنتاج ناقلات الفيروسات العدسية لتحويل BMDMs. يمكن الانتهاء من عملية توليف sgRNA ، التثقيب الكهربائي ، وتوليد خلايا متحولة في 1 أسبوع. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية مع BMDMs المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا لإنشاء خلايا متحولة مزدوجة. على الرغم من وجود طرق كيميائية لنقل الخلايا المناعية الأولية باستخدام siRNA أو mRNA17 ، إلا أن هذه الطرق الكيميائية أقل فعالية بكثير من التثقيب الكهربائي في توصيل مجمعات Cas9-sgRNA إلى الخلايا المناعية18. هناك عدة أنواع من أجهزة التثقيب الكهربائي المتاحة تجاريا. من المتوقع أن تعمل هذه الأجهزة بشكل مشابه لتسليم مجمعات Cas9-sgRNA ، على الرغم من أن معلمات الجهد تحتاج على الأرجح إلى تحسين لكل جهاز على حدة. في حين تم استخدام هذا البروتوكول في المقام الأول على BMDMs الفئران ، في تجارب محدودة ، تم الحصول على نتائج مماثلة مع BMDMs الفئران (بيانات غير منشورة). من الممكن أن تكون أنواع أخرى من البلاعم الأولية ، مثل البلاعم البريتونية للفأر أو البلاعم السنخية ، قابلة أيضا لهذا النهج ، على الرغم من أن هذا لم يتم اختباره بعد.
هذه الطريقة لها بعض القيود. عدد الخلايا التي ينتجها هذا البروتوكول محدود إلى حد ما. تولد شروطنا القياسية 4 × 105 خلايا لكل ثقب كهربائي. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن زيادة العائد بشكل كبير ، حيث أن الكفاءة غير منقوصة في تفاعل 10 ميكرولتر مع ما يصل إلى 2.4 × 106 خلايا باستخدام نفس الكمية من RNP (بيانات غير منشورة). بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر أطراف التثقيب الكهربائي 100 ميكرولتر. عيب آخر لهذه الطريقة هو النفقات. تكاليف كل من الكهرباء والمواد الاستهلاكية للتثقيب الكهربائي كبيرة. يمكن تخفيف هذه النفقات بشكل كبير عن طريق إعادة استخدام النصائح عند استخدام sgRNAs مختلفة تستهدف نفس الجين وباستخدام PBS بدلا من المخازن المؤقتة الخاصة. في حين أن تركيبات المخازن المؤقتة الخاصة غير معروفة ، فمن المفترض أن تركيبة المنحل بالكهرباء ل PBS مع 0.9 mM CaCl2 و 0.5 mM MgCl2 تقترب من التوصيل الكهربائي للمخزن المؤقت الخاص. تقلل هذه التغييرات من تكلفة المواد الاستهلاكية بنسبة 80٪ تقريبا في هذا البروتوكول.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول ، والتي يمكن أن تؤثر الانحرافات عنها بشكل كبير على كفاءة تحرير الجينات. أحد المزالق المحتملة هو أن مجموعات IVT القياسية ، والتي لم يتم تصميمها لتحقيق عوائد عالية ، غالبا ما تنتج منتجا غير كاف من IVT. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي استخدام أنابيب البولي بروبلين الدقيقة القياسية بدلا من الأنابيب منخفضة الارتباط إلى فقدان كبير للخلايا عن طريق الالتصاق. قد يؤدي نزع الفسفرة غير الكامل لمنتج IVT ووجود الحمض النووي المتبقي في إعداد sgRNA إلى تنشيط مستشعرات المناعة البلاعم والسمية اللاحقة. قد تؤدي نبضات الجهد الأعلى أو الأطول أيضا إلى زيادة موت الخلايا.
باختصار ، يعد بروتوكول تحرير الجينوم هذا ، الذي يستخدم التثقيب الكهربائي لتوصيل Cas9-sgRNA RNPs ، طريقة فعالة لتعطيل الجينات في BMDMs للفئران. يتيح ذلك للمستخدمين إجراء فحص سريع للأنماط الظاهرية في الخلايا الأولية التي تلخص عن كثب البيولوجيا المعقدة للبلاعم في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة 5R01AI144149. تم إنشاء الأشكال التخطيطية باستخدام BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , Master's thesis (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
