Summary
本研究使用温度和材料组成来控制屈服应力流体的屈服应力特性。油墨的固态可以保护打印结构，液体状状态可以连续填充打印位置，实现极软生物墨水的数字光处理3D打印。
Abstract
生物墨水的精确印刷制造是组织工程的先决条件;Jacobs工作曲线是确定数字光处理（DLP）精确打印参数的工具。然而，工作曲线的获取浪费了材料，并且对材料的成型性要求很高，不适合生物材料。此外，由于多次暴露而导致的细胞活性降低和由于重复定位而导致的结构形成失败都是传统DLP生物打印中不可避免的问题。本工作介绍了一种获取工作曲线的新方法以及基于这种工作曲线的连续DLP打印技术的改进过程。这种获得工作曲线的方法基于生物材料的吸光度和光流变特性，其不依赖于生物材料的可成形性。通过分析工作曲线改进打印工艺而获得的连续DLP打印工艺，使打印效率提高了十倍以上，大大提高了细胞的活性和功能，有利于组织工程的发展。
Introduction
组织工程1 在器官修复领域很重要。由于缺乏器官捐献，一些疾病，如肝衰竭和肾衰竭，不能很好地治愈，许多患者没有得到及时的治疗2。具有器官所需功能的类器官可以解决因缺乏器官捐献而引起的问题。类器官的构建取决于生物打印技术的进步和发展3.
与挤出型生物打印4和喷墨型生物打印5相比，数字光处理（DLP）生物打印方法的打印速度和打印精度更高6，7。挤出式方法的打印模块是逐行的，而喷墨式方法的打印模块是逐点的，效率低于DLP生物打印的逐层打印模块。在DLP生物打印中，将调制紫外线（UV）照射到整个材料层以固化一层以及图像的特征尺寸决定了DLP打印的准确性。这使得DLP技术非常高效8，9，10。由于紫外光的过度固化，固化时间和打印尺寸之间的精确关系对于高精度DLP生物打印非常重要。此外，连续DLP打印是对DLP打印方法的改进，可以大大提高打印效率11，12，13。对于连续 DLP 打印，精确的打印条件是最重要的因素。
固化时间与印刷尺寸之间的关系称为雅各布工作曲线，广泛用于DLP印刷14，15，16。获得关系的传统方法是将材料暴露一定时间并测量固化厚度，以获得有关曝光时间和固化厚度的数据点。重复此操作至少五次并拟合数据点可获得 Jacobs 工作曲线。但是，这种方法有明显的缺点;它需要消耗大量的材料才能实现固化，结果高度依赖于打印条件，DLP生物打印中使用的生物墨水昂贵且稀有，并且生物墨水的成型性通常不好，这可能导致固化厚度的测量不准确。
本文根据生物墨水的物理性质提供了一种获得固化关系的新方法。使用此理论可以优化连续DLP打印。该方法可用于更快、更准确地获得固化关系;因此，可以更好地确定连续DLP固化。
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Protocol
1. 理论准备
- 定义三个参数：液体吸光度 （Al）、固体吸光度 （As） 和阈值时间 （tT）17。
- 根据公式 1，使用这三个参数17 重写传统的 Jacobs 工作曲线：
（公式1）
这里，t H是单层的固化时间，H 是单层的高度。
（公式1）2. 参数采集
- 使用配备温度控制元件的流变仪测量生物墨水的阈值时间。
- 使用365nm光源曝光流变仪的测试平台，使光强度达到一定值。
- 设置流变仪以获取 300 秒内的时间模量数据，并通过流变仪软件中的时间设置选项每 0.3 秒获取每个数据点。点击流变仪的“开始测试”按钮开始测试，同时点击光源的“开始”按钮。
- 从曝光开始计数，当储能模量数据等于损耗模量数据时，相应的时间被识别为阈值时间。手动录制。
- 按照上文工作17所示建造吸光度测试设备。使用两个上下载玻片夹紧厚度为500μm的环形印刷结构（5毫米内径，10毫米外径），使环的内圈形成一个腔室。将腔室放在光强计的测试区域，并设置光源以暴露腔室区域。
注： 图1 为光流变测试结果和数据处理结果以及吸光度测试设备的示意图。- 当测试室未充满来自吸光度测试设备的材料的入射光强度（I i）时，通过读取测试设备的光强计的显示来测量入射光强度（Ii）。
- 用 10 μLof 生物墨水填充测试室。
- 用生物墨水将测试室暴露在 365 nm 的紫外线下。通过读取测试设备的光强计的显示，从吸光度测试设备获得光强度（Ilh）。
- 当值不再变化时，通过读取测试设备的光强计的显示，从吸光度测试设备获得生物墨水固化时的光强度（Ish）。这个值就是固体吸光度，我什。
- 使用公式2和3计算液体吸光度和固体吸光度：
等式2
等式3
- 根据得到的参数得到雅各布斯工作曲线。
等式2
等式3
图1：测试结果和设备 。 （A）光流变测试结果和数据处理结果示意图。（二）吸光度检测设备。该图经Li等人许可修改17。 请点击此处查看此图的大图。
3. 连续 DLP 打印参数设置
- 使用DLP软件实现DLP打印，并在软件中设置打印参数如下。
- 在软件的参数设置中将第一个单层的曝光时间设置为阈值时间（tT）。
- 根据公式1计算固化10μm厚材料的曝光时间，并减去阈值时间，以获得固化单层的实际曝光时间。
- 在软件的参数设置中将相邻层之间的时间间隔设置为 0 s。
- 通过单击打印软件中的 “开始” 按钮启动打印机。打印过程结束后，单击打印软件中的 “停止” 按钮完成打印。
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Representative Results
本文展示了一种获取固化参数的新方法，并介绍了一种实现连续DLP打印的新方法，展示了该方法在确定工作曲线方面的效率。
我们在DLP打印中使用了三种不同的材料来验证本文介绍的方法获得的理论工作曲线的准确性。材料是20%（v/v）聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），0.5%（w/v）苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（LAP），具有不同浓度的紫外线吸收剂-0.1%（w / v），0.15%（w / v）和0.2%（w / v）亮蓝色。实际固化厚度数据与理论工作曲线如图 2所示。
图2：理论工作曲线与实际打印数据之间的比较 。 （A） 0.1% （w/v） 吸收剂。（B） 0.15% （w/v） 吸收剂。（C） 0.2% （w/v） 吸收剂。 请点击此处查看此图的大图。
理论工作曲线可用于准确计算工作曲线。无论材料成分如何，实际印刷结果与理论结果的高度吻合证明了该方法的有效性。
我们还比较了传统DLP打印方法与本文开发的连续DLP打印方法的总打印时间。 如图3所示，打印层厚度越小，连续DLP打印效率的提高越明显。固化效率提高了十倍以上。
图 3：传统 DLP 打印与连续 DLP 打印的效率比较。 该图经Li等人许可修改11。 请点击此处查看此图的大图。
理论工作曲线的采集可用于改进DLP工艺，推动DLP技术的进步，但如果没有理论工作曲线的采集，就不可能精确控制新的印刷方法。此外，打印层厚度越小，打印质量越好，这意味着本文提出的连续DLP打印方法可以同时实现高效率和高保真度。
图 4：传统 DLP 打印与连续 DLP 打印的打印结果比较。 （A）采用传统方法的固化模型。（B）使用我们的连续DLP打印方法固化模型。该图经Li等人许可修改11。请点击此处查看此图的大图。
与需要重复印刷实验的传统方法不同，该方法只需要测试材料的相关材料性能。只需要非常少量的材料就可以准确地获得其相应的工作曲线。传统方法不仅浪费材料，而且严重依赖测量方法来确定不同曝光时间的准确成型厚度。对于成型性差的材料，很难准确获得印刷厚度，因此工作曲线不准确。
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Discussion
该协议的关键步骤在第2节中描述。有必要将光流变测试中使用的光强度与实际测试中的印刷光强度统一起来.吸光度测试设备是最重要的部分。试验箱的形状应与光强计的感光区域相同。由于材料在整个紫外光照射过程中不断变化的特性，光强度需要不断变化6。根据公式1中液体吸光度和固体吸光度的定义，简化了固化过程。将曝光开始时的数据作为液体吸光度，将光强恒定时的数据作为固体吸光度是最关键的操作。
值得注意的是，这种方法有一个不可避免的局限性，那就是固化过程的简化。由于该方法的理论建模没有考虑氧抑制等因素13，因此实际工作曲线与理论工作曲线之间存在误差。此外，如果外部扰动较大，则理论工作曲线无法准确用于研究。
获得Jacobs工作曲线的传统方法需要多次打印，不同曝光时间为15。通过测量与曝光时间相对应的印刷厚度并拟合数据来获得工作曲线。这种方法需要大量的材料，效率非常低。材料的印刷能力限制了工作曲线的精度，结构的观察和测量也放大了误差。本文中获取工作曲线的方法可以节省大量材料，仅通过简单的材料性能测试即可获得准确的工作曲线，并且可以保证工作曲线的准确性，而与材料的成形性无关。在DLP生物打印研究中，当材料非常柔软（E<10kPa）时，它不能很好地打印，这会影响传统方法获得的打印厚度数据，从而影响工作曲线18的精度。本协议中提到的方法可以为软生物材料的DLP打印工艺参数的测定提供解决方案。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢国家自然科学基金（批准号12125205，12072316，12132014）和中国博士后科学基金（批准号：2022M712754）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brilliant Blue | Aladdin (Shanghai, China). | 6104-59-2 | |
| DLP software | Creation Workshop | N/A | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | N/A | LAP; synthesized | |
| Light source | OmniCure | https://www.excelitas.com/product-category/omnicure-s-series-lamp-spot-uv-curing-systems | 365 nm |
| Polyethylene (glycol) diacrylate | Sigma-Aldrich | 455008 | PEGDA Mw ~700 |
| Rheometer | Anton Paar, Austria | MCR302 |
References
- Berthiaume, F., Maguire, T. J., Yarmush, M. L. Tissue engineering and regenerative medicine: history, progress, and challenges. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2 (1), 403-430 (2011).
- Ng, W. L., Chua, C. K., Shen, Y. -F. Print me an organ! Why we are not there yet. Progress in Polymer Science. 97, 101145 (2019).
- Sun, W., et al.
- Jiang, T., Munguia-Lopez, J. G., Flores-Torres, S., Kort-Mascort, J., Kinsella, J. M. Extrusion bioprinting of soft materials: An emerging technique for biological model fabrication. Applied Physics Reviews. 6 (1), 011310 (2019).
- Ng, W., et al. L.cControlling droplet impact velocity and droplet volume: Key factors to achieving high cell viability in sub-nanoliter droplet-based bioprinting. International Journal of Bioprinting. 8 (1), 424 (2021).
- Yu, K., et al. Printability during projection-based 3D bioprinting. Bioactive Materials. 11, 254-267 (2022).
- Zhong, Z., et al. Bioprinting of dual ECM scaffolds encapsulating limbal stem/progenitor cells in active and quiescent statuses. Biofabrication. 13 (4), (2021).
- Huh, J., et al. Combinations of photoinitiator and UV absorber for cell-based digital light processing (DLP) bioprinting. Biofabrication. 13 (3), (2021).
- Saed, A. B., et al. Functionalized poly l-lactic acid synthesis and optimization of process parameters for 3D printing of porous scaffolds via digital light processing (DLP) method. Journal of Manufacturing Processes. 56, 550-561 (2020).
- Ng, W. L., et al. Vat polymerization-based bioprinting-process, materials, applications and regulatory challenges. Biofabrication. 12 (2), 022001 (2020).
- Li, Y., et al. High-fidelity and high-efficiency additive manufacturing using tunable pre-curing digital light processing. Additive Manufacturing. 30, 100889 (2019).
- Kelly, B. E., et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction. Science. 363 (6431), 1075-1079 (2019).
- Tumbleston, J. R., et al. Continuous liquid interface production of 3D objects. Science. 347 (6228), 1349-1352 (2015).
- Classens, K., Hafkamp, T., Westbeek, S., Remmers, J. J. C., Weiland, S. Multiphysical modeling and optimal control of material properties for photopolymerization processes. Additive Manufacturing. 38, 101520 (2021).
- Gong, H., Beauchamp, M., Perry, S., Woolley, A. T., Nordin, G. P. Optical approach to resin formulation for 3D printed microfluidics. RSC Advances. 5 (129), 106621-106632 (2015).
- Hofstetter, C., Orman, S., Baudis, S., Stampfl, J. Combining cure depth and cure degree, a new way to fully characterize novel photopolymers. Additive Manufacturing. 24, 166-172 (2018).
- Li, Y., et al. Theoretical prediction and experimental validation of the digital light processing (DLP) working curve for photocurable materials. Additive Manufacturing. 37, 101716 (2021).
- Wang, M., et al. Molecularly cleavable bioinks facilitate high-performance digital light processing-based bioprinting of functional volumetric soft tissues. Nature Communications. 13 (1), 3317 (2022).
