Summary
Questo studio utilizza la temperatura e la composizione del materiale per controllare le proprietà di tensione di snervamento dei fluidi da sforzo di snervamento. Lo stato solido dell'inchiostro può proteggere la struttura di stampa e lo stato liquido può riempire continuamente la posizione di stampa, realizzando la stampa 3D di bioink estremamente morbidi.
Abstract
La fabbricazione precisa di bioink di stampa è un prerequisito per l'ingegneria tissutale; la curva di lavoro di Jacobs è lo strumento per determinare i parametri di stampa precisi dell'elaborazione della luce digitale (DLP). Tuttavia, l'acquisizione di curve di lavoro spreca materiali e richiede un'elevata formabilità di materiali, che non sono adatti per i biomateriali. Inoltre, la riduzione dell'attività cellulare dovuta a esposizioni multiple e il fallimento della formazione strutturale a causa del posizionamento ripetuto sono entrambi problemi inevitabili nel bioprinting DLP convenzionale. Questo lavoro introduce un nuovo metodo per ottenere la curva di lavoro e il processo di miglioramento della tecnologia di stampa DLP continua basata su tale curva di lavoro. Questo metodo per ottenere la curva di lavoro si basa sull'assorbanza e sulle proprietà fotoreologiche dei biomateriali, che non dipendono dalla formabilità dei biomateriali. Il processo di stampa DLP continuo, ottenuto migliorando il processo di stampa analizzando la curva di lavoro, aumenta l'efficienza di stampa più di dieci volte e migliora notevolmente l'attività e la funzionalità delle cellule, il che è vantaggioso per lo sviluppo dell'ingegneria tissutale.
Introduction
L'ingegneria tissutale1 è importante nel campo della riparazione degli organi. A causa della mancanza di donazione di organi, alcune malattie, come l'insufficienza epatica e l'insufficienza renale, non possono essere curate bene e molti pazienti non ricevono un trattamento tempestivo2. Gli organoidi con la funzione richiesta degli organi possono risolvere il problema causato dalla mancanza di donazione di organi. La costruzione di organoidi dipende dal progresso e dallo sviluppo della tecnologia di bioprinting3.
Rispetto al bioprinting di tipo estruso4 e al bioprinting a getto d'inchiostro5, la velocità di stampa e la precisione di stampa del metodo di bioprinting DLP (Digital Light Processing) sono superioria 6,7. Il modulo di stampa del metodo di estrusione è riga per riga, mentre il modulo di stampa del metodo a getto d'inchiostro è punto per punto, che è meno efficiente del modulo di stampa strato per strato del bioprinting DLP. L'esposizione modulata alla luce ultravioletta (UV) a un intero strato di materiale per polimerizzare uno strato nel bioprinting DLP e la dimensione della caratteristica dell'immagine determinano l'accuratezza della stampa DLP. Questo rende la tecnologia DLP molto efficiente 8,9,10. A causa dell'eccessiva polimerizzazione della luce UV, la relazione precisa tra il tempo di polimerizzazione e le dimensioni di stampa è importante per il bioprinting DLP ad alta precisione. Inoltre, la stampa DLP continua è una modifica del metodo di stampa DLP che può migliorare notevolmente l'efficienza di stampa11,12,13. Per la stampa DLP continua, le condizioni di stampa precise sono i fattori più importanti.
La relazione tra il tempo di polimerizzazione e le dimensioni di stampa è chiamata curva di lavoro di Jacobs, ampiamente utilizzata nella stampa DLP14,15,16. Il metodo tradizionale per ottenere la relazione è quello di esporre il materiale per un certo tempo e misurare lo spessore di polimerizzazione per ottenere un punto dati sul tempo di esposizione e sullo spessore di polimerizzazione. Ripetendo questa operazione almeno cinque volte e adattando i punti dati si ottiene la curva di lavoro di Jacobs. Tuttavia, questo metodo presenta evidenti svantaggi; ha bisogno di consumare molto materiale per ottenere la polimerizzazione, i risultati dipendono fortemente dalle condizioni di stampa, i bioink utilizzati nel bioprinting DLP sono costosi e rari e la formabilità dei bioink di solito non è buona, il che può portare a misurazioni imprecise dello spessore di polimerizzazione.
Questo articolo fornisce un nuovo metodo per ottenere la relazione di polimerizzazione in base alle proprietà fisiche del bioink. L'utilizzo di questa teoria consente di ottimizzare la stampa DLP continua. Questo metodo può essere utilizzato per ottenere la relazione di polimerizzazione in modo più rapido e accurato; la polimerizzazione continua DLP può quindi essere meglio determinata.
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Protocol
1. Preparazione teorica
- Definire tre parametri: assorbanza del liquido (Al), assorbanza solida (As) e tempo di soglia (tT)17.
- Riscrivi la tradizionale curva di lavoro di Jacobs usando questi tre parametri17 secondo l'equazione 1:
(Equazione 1)
Qui, t H è il tempo di polimerizzazione di un singolo strato eH è l'altezza di un singolo strato.
(Equazione 1)2. Acquisizione dei parametri
- Misurare il tempo di soglia del bioink utilizzando un reometro dotato di un elemento per il controllo della temperatura.
- Utilizzare una sorgente luminosa a 365 nm per esporre la piattaforma di prova del reometro e rendere l'intensità della luce a un certo valore.
- Impostare il reometro per ottenere i dati Time-Moduli durante un periodo di 300 s e prendere ogni punto dati ogni 0,3 s attraverso le opzioni Time Settings nel software del reometro. Fare clic sul pulsante Avvia test del reometro per avviare il test e, allo stesso tempo, fare clic sul pulsante Start della sorgente luminosa.
- Contando dall'inizio dell'esposizione, quando i dati del modulo di memorizzazione sono uguali ai dati del modulo di perdita, il tempo corrispondente viene riconosciuto come tempo di soglia. Registra manualmente.
- Costruire l'apparecchiatura di prova dell'assorbanza come mostrato nel lavoro precedente17. Utilizzare due vetrini superiore e inferiore per bloccare la struttura stampata a forma di anello (diametro interno 5 mm, diametro esterno 10 mm) con uno spessore di 500 μm in modo che il cerchio interno dell'anello formi una camera. Posizionare la camera sull'area di prova del misuratore di intensità luminosa e impostare la sorgente luminosa per esporre l'area della camera.
NOTA: La figura 1 mostra il diagramma schematico dei risultati dei test fotoreologici e dei risultati dell'elaborazione dei dati, nonché l'apparecchiatura di prova di assorbanza.- Misurare l'intensità della luce incidente (Ii) quando la camera di prova non è riempita di materiale proveniente dall'apparecchiatura di prova di assorbanza leggendo il display del misuratore di intensità luminosa dell'apparecchiatura di prova.
- Riempire la camera di prova con 10 μL di bioink.
- Esporre la camera di prova con bioink alla luce UV a 365 nm. Ottenere l'intensità luminosa (Ilh) dall'apparecchiatura di prova di assorbanza leggendo il display del misuratore di intensità luminosa dell'apparecchiatura di prova.
- Ottenere l'intensità della luce quando il bioink viene polimerizzato (Ish) dall'apparecchiatura di prova di assorbanza leggendo il display del misuratore di intensità luminosa dell'apparecchiatura di prova quando il valore non cambia più. Questo valore è l'assorbanza solida, Ish.
- Calcolare l'assorbanza del liquido e dell'assorbanza solida usando le equazioni 2 e 3:
Equazione 2
Equazione 3
- Ottenere la curva di lavoro di Jacobs in base ai parametri ottenuti.
Equazione 2
Equazione 3
Figura 1: Risultati delle prove e attrezzature. (A) Schema dei risultati delle prove fotoreologiche e dei risultati dell'elaborazione dei dati. b) apparecchiature per prove di assorbanza. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Impostazioni dei parametri di stampa DLP continua
- Utilizzare il software DLP per ottenere la stampa DLP e il set di parametri di stampa nel software come indicato di seguito.
- Impostare il tempo di esposizione del primo singolo strato come tempo di soglia (tT) nelle impostazioni dei parametri del software.
- Calcolare il tempo di esposizione della polimerizzazione di materiali spessi 10 μm secondo l'equazione 1 e sottrarre il tempo di soglia per ottenere il tempo di esposizione reale per l'indurimento di un singolo strato.
- Impostare l'intervallo di tempo tra livelli adiacenti su 0 s nelle impostazioni dei parametri del software.
- Avviare la stampante facendo clic sul pulsante Start nel software di stampa. Al termine del processo di stampa, terminare la stampa facendo clic sul pulsante Stop nel software di stampa.
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Representative Results
Questo articolo mostra un nuovo metodo per ottenere i parametri di polimerizzazione e introduce un nuovo modo per ottenere la stampa DLP continua, dimostrando l'efficienza di questo metodo nel determinare la curva di lavoro.
Abbiamo utilizzato tre diversi materiali nella stampa DLP per verificare l'accuratezza della curva di lavoro teorica ottenuta con il metodo introdotto in questo articolo. I materiali sono 20% (v / v) polietilene (glicole) diacrilato (PEGDA), 0,5% (p / v) litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) con diverse concentrazioni di assorbitore UV-0,1% (p / v), 0,15% (p / v) e 0,2% (w / v) blu brillante. I dati reali sullo spessore di polimerizzazione con le curve di lavoro teoriche sono mostrati nella Figura 2.
Figura 2: Confronto tra la curva teorica di lavoro e i dati di stampa effettivi. (A) Assorbitore allo 0,1% (p/v). (B) Assorbitore allo 0,15% (p/v). (C) Assorbitore allo 0,2% (p/v). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La curva di lavoro teorica può essere utilizzata per calcolare accuratamente la curva di lavoro. Indipendentemente dalla composizione del materiale, l'alta coincidenza dei risultati di stampa effettivi e dei risultati teorici dimostra l'efficacia del metodo.
Abbiamo anche confrontato il tempo di stampa totale del metodo di stampa DLP tradizionale con il metodo di stampa DLP continuo sviluppato in questo articolo. Come illustrato nella Figura 3, minore è lo spessore dello strato di stampa, più evidente è il miglioramento dell'efficienza di stampa DLP continua. L'efficienza di polimerizzazione è aumentata di oltre dieci volte.
Figura 3: Confronto dell'efficienza tra la stampa DLP tradizionale e la stampa DLP continua. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'acquisizione della curva di lavoro teorica può essere utilizzata per migliorare il processo DLP e promuovere il progresso della tecnologia DLP, ma senza l'acquisizione della curva di lavoro teorica, è impossibile controllare con precisione il nuovo metodo di stampa. Inoltre, minore è lo spessore dello strato di stampa, migliore è la qualità di stampa, il che significa che il metodo di stampa DLP continuo proposto in questo articolo può ottenere contemporaneamente alta efficienza e alta fedeltà.
Figura 4: Confronto dei risultati di stampa tra la stampa DLP tradizionale e la stampa DLP continua . (A) Il modello polimerizzato con il metodo tradizionale. (B) Il modello polimerizzato utilizzando il nostro metodo di stampa DLP continuo. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Li et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
A differenza del metodo tradizionale che richiede ripetuti esperimenti di stampa, questo metodo deve solo testare le proprietà rilevanti del materiale. È necessaria solo una piccola quantità di materiale per ottenere con precisione la curva di lavoro corrispondente. Il metodo tradizionale non solo spreca materiale, ma si basa anche fortemente sui metodi di misurazione per determinare lo spessore di stampaggio accurato dei diversi tempi di esposizione. Per i materiali con scarsa formabilità, è difficile ottenere con precisione lo spessore di stampa, quindi la curva di lavoro è imprecisa.
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Discussion
I passaggi critici di questo protocollo sono descritti nella sezione 2. È necessario unificare l'intensità luminosa utilizzata nel test fotoreologico e l'intensità della luce di stampa nei test effettivi. L'apparecchiatura di prova di assorbanza è la parte più importante. La forma della camera di prova deve essere la stessa dell'area fotosensibile del misuratore di intensità luminosa. A causa delle proprietà dei materiali che cambiano continuamente durante l'intero processo di esposizione alla luce UV, l'intensità della luce deve continuare a cambiare6. Secondo la definizione di assorbanza liquida e assorbanza solida nell'equazione 1, il processo di polimerizzazione è semplificato. Prendendo i dati all'inizio dell'esposizione come assorbanza liquida e i dati quando l'intensità della luce è costante poiché l'assorbanza solida è l'operazione più critica.
Vale la pena notare che questo metodo ha una limitazione inevitabile, che è la semplificazione del processo di polimerizzazione. Poiché la modellazione teorica di questo metodo non considera fattori come l'inibizione dell'ossigeno13, ci sono errori tra la curva di lavoro effettiva e la curva di lavoro teorica. Inoltre, se il disturbo esterno è grande, la curva di lavoro teorica non può essere utilizzata con precisione per la ricerca.
Il metodo tradizionale per ottenere la curva di lavoro di Jacobs richiede la stampa multipla con tempi di esposizione diversi15. La curva di lavoro si ottiene misurando lo spessore di stampa corrispondente al tempo di esposizione e adattando i dati. Questo metodo richiede molto materiale ed è molto inefficiente. La capacità di stampa del materiale limita la precisione della curva di lavoro e anche l'osservazione e la misurazione della struttura amplificano l'errore. Il metodo descritto in questo articolo per ottenere la curva di lavoro può far risparmiare molti materiali, curve di lavoro accurate possono essere ottenute solo attraverso semplici test delle proprietà del materiale e l'accuratezza della curva di lavoro può essere garantita indipendentemente dalla formabilità del materiale. Nella ricerca di bioprinting DLP, quando il materiale è molto morbido (E < 10 kPa) non può essere stampato bene, e questo influenzerà i dati di spessore di stampa ottenuti con il metodo tradizionale, influenzando così l'accuratezza della curva di lavoro18. Il metodo menzionato in questo protocollo può fornire una soluzione per la determinazione dei parametri del processo di stampa DLP dei biomateriali morbidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno fornito dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 12125205, 12072316, 12132014) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2022M712754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brilliant Blue | Aladdin (Shanghai, China). | 6104-59-2 | |
| DLP software | Creation Workshop | N/A | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | N/A | LAP; synthesized | |
| Light source | OmniCure | https://www.excelitas.com/product-category/omnicure-s-series-lamp-spot-uv-curing-systems | 365 nm |
| Polyethylene (glycol) diacrylate | Sigma-Aldrich | 455008 | PEGDA Mw ~700 |
| Rheometer | Anton Paar, Austria | MCR302 |
References
- Berthiaume, F., Maguire, T. J., Yarmush, M. L. Tissue engineering and regenerative medicine: history, progress, and challenges. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2 (1), 403-430 (2011).
- Ng, W. L., Chua, C. K., Shen, Y. -F. Print me an organ! Why we are not there yet. Progress in Polymer Science. 97, 101145 (2019).
- Sun, W., et al.
- Jiang, T., Munguia-Lopez, J. G., Flores-Torres, S., Kort-Mascort, J., Kinsella, J. M. Extrusion bioprinting of soft materials: An emerging technique for biological model fabrication. Applied Physics Reviews. 6 (1), 011310 (2019).
- Ng, W., et al. L.cControlling droplet impact velocity and droplet volume: Key factors to achieving high cell viability in sub-nanoliter droplet-based bioprinting. International Journal of Bioprinting. 8 (1), 424 (2021).
- Yu, K., et al. Printability during projection-based 3D bioprinting. Bioactive Materials. 11, 254-267 (2022).
- Zhong, Z., et al. Bioprinting of dual ECM scaffolds encapsulating limbal stem/progenitor cells in active and quiescent statuses. Biofabrication. 13 (4), (2021).
- Huh, J., et al. Combinations of photoinitiator and UV absorber for cell-based digital light processing (DLP) bioprinting. Biofabrication. 13 (3), (2021).
- Saed, A. B., et al. Functionalized poly l-lactic acid synthesis and optimization of process parameters for 3D printing of porous scaffolds via digital light processing (DLP) method. Journal of Manufacturing Processes. 56, 550-561 (2020).
- Ng, W. L., et al. Vat polymerization-based bioprinting-process, materials, applications and regulatory challenges. Biofabrication. 12 (2), 022001 (2020).
- Li, Y., et al. High-fidelity and high-efficiency additive manufacturing using tunable pre-curing digital light processing. Additive Manufacturing. 30, 100889 (2019).
- Kelly, B. E., et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction. Science. 363 (6431), 1075-1079 (2019).
- Tumbleston, J. R., et al. Continuous liquid interface production of 3D objects. Science. 347 (6228), 1349-1352 (2015).
- Classens, K., Hafkamp, T., Westbeek, S., Remmers, J. J. C., Weiland, S. Multiphysical modeling and optimal control of material properties for photopolymerization processes. Additive Manufacturing. 38, 101520 (2021).
- Gong, H., Beauchamp, M., Perry, S., Woolley, A. T., Nordin, G. P. Optical approach to resin formulation for 3D printed microfluidics. RSC Advances. 5 (129), 106621-106632 (2015).
- Hofstetter, C., Orman, S., Baudis, S., Stampfl, J. Combining cure depth and cure degree, a new way to fully characterize novel photopolymers. Additive Manufacturing. 24, 166-172 (2018).
- Li, Y., et al. Theoretical prediction and experimental validation of the digital light processing (DLP) working curve for photocurable materials. Additive Manufacturing. 37, 101716 (2021).
- Wang, M., et al. Molecularly cleavable bioinks facilitate high-performance digital light processing-based bioprinting of functional volumetric soft tissues. Nature Communications. 13 (1), 3317 (2022).
