Bioengineering

אפיון כמותי של תכונות ביודיו נוזלי רגיש לאור להדפסה רציפה מבוססת עיבוד אור דיגיטלי

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65277

Yang Li*^1,2,3, Yue Wang*⁴, Jun Yin³, Jin Qian^1,2

¹School of Aeronautics and Astronautics, Zhejiang University, ²Department of Engineering Mechanics, Key Laboratory of Soft Machines and Smart Devices of Zhejiang Province, Zhejiang University, ³The State Key Laboratory of Fluid Power and Mechatronic Systems, School of Mechanical Engineering, Zhejiang University, ⁴Institute of Artificial Intelligence, School of Future Technology, Shanghai University

* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה משתמש בטמפרטורה ובהרכב החומרים כדי לשלוט בתכונות עקת התשואה של נוזלי עקת התשואה. המצב המוצק של הדיו יכול להגן על מבנה ההדפסה, והמצב דמוי הנוזל יכול למלא ברציפות את מיקום ההדפסה, תוך מימוש עיבוד האור הדיגיטלי הדפסה תלת-ממדית של דיו ביולוגי רך במיוחד.

Abstract

ייצור הדפסה מדויקת של דיו ביולוגי הוא תנאי מוקדם להנדסת רקמות; עקומת העבודה של ג'ייקובס היא הכלי לקביעת פרמטרי ההדפסה המדויקים של עיבוד אור דיגיטלי (DLP). עם זאת, רכישת עקומות עבודה מבזבזת חומרים ודורשת יכולת עיצוב גבוהה של חומרים, שאינם מתאימים לביו-חומרים. בנוסף, הפחתת פעילות התא עקב חשיפות מרובות וכישלון היווצרות מבנית עקב מיקום חוזר הן בעיות בלתי נמנעות בהדפסה ביולוגית קונבנציונלית של DLP. עבודה זו מציגה שיטה חדשה להשגת עקומת העבודה ותהליך השיפור של טכנולוגיית הדפסת DLP רציפה המבוססת על עקומת עבודה כזו. שיטה זו להשגת עקומת העבודה מבוססת על תכונות הספיגה והפוטוראולוגיות של הביו-חומרים, שאינן תלויות ביכולת הצורה של הביו-חומרים. תהליך ההדפסה הרציף של DLP, המתקבל משיפור תהליך ההדפסה על ידי ניתוח עקומת העבודה, מגדיל את יעילות ההדפסה יותר מפי עשרה ומשפר מאוד את הפעילות והפונקציונליות של תאים, מה שמועיל להתפתחות הנדסת רקמות.

Introduction

הנדסת רקמות¹ חשובה בתחום תיקון איברים. בשל היעדר תרומת איברים, מחלות מסוימות, כגון אי ספיקת כבד ואי ספיקת כליות, אינן ניתנות לריפוי טוב, וחולים רבים אינם מקבלים טיפול בזמן². אורגנואידים עם התפקוד הנדרש של האיברים עשויים לפתור את הבעיה הנגרמת על ידי חוסר תרומת איברים. בניית אורגנואידים תלויה בהתקדמות ופיתוח טכנולוגיית ההדפסה הביולוגית³.

בהשוואה להדפסה ביולוגית מסוג אקסטרוזיה⁴ והדפסה ביולוגית מסוג הזרקת דיו⁵, מהירות ההדפסה ודיוק ההדפסה של שיטת ההדפסה הביולוגית של עיבוד אור דיגיטלי (DLP) גבוהים יותר ^6,7. מודול ההדפסה של שיטת סוג האקסטרוזיה הוא שורה אחר שורה, ואילו מודול ההדפסה של שיטת הזרקת הדיו הוא נקודה אחר נקודה, שהוא פחות יעיל ממודול ההדפסה שכבה אחר שכבה של הדפסה ביולוגית DLP. החשיפה לאור אולטרה סגול (UV) מאופנן לשכבה שלמה של חומר כדי לרפא שכבה בהדפסה ביולוגית של DLP וגודל התכונות של התמונה קובע את הדיוק של הדפסת DLP. זה הופך את טכנולוגיית DLP ליעילה מאוד ^8,9,10. בשל כיסוי יתר של אור UV, הקשר המדויק בין זמן הריפוי לגודל ההדפסה חשוב להדפסה ביולוגית DLP ברמת דיוק גבוהה. יתר על כן, הדפסת DLP רציפה היא שינוי של שיטת הדפסת DLP שיכול לשפר מאוד את יעילות ההדפסה^11,12,13. עבור הדפסת DLP רציפה, תנאי הדפסה מדויקים הם הגורמים החשובים ביותר.

הקשר בין זמן הריפוי לגודל ההדפסה נקרא עקומת העבודה של ג'ייקובס, אשר נמצאת בשימוש נרחב בהדפסת DLP^14,15,16. השיטה המסורתית להשגת הקשר היא לחשוף את החומר לזמן מסוים ולמדוד את עובי הריפוי כדי לקבל נקודת נתונים על זמן החשיפה ועובי הריפוי. חזרה על פעולה זו לפחות חמש פעמים והתאמת נקודות הנתונים מקבלת את עקומת העבודה של ג'ייקובס. עם זאת, שיטה זו יש חסרונות ברורים; הוא צריך לצרוך חומר רב כדי להשיג את הריפוי, התוצאות תלויות מאוד בתנאי ההדפסה, הביודיו המשמש בהדפסה ביולוגית DLP הוא יקר ונדיר, ויכולת הצורה של הביודיו בדרך כלל אינה טובה, מה שעלול להוביל למדידות לא מדויקות של עובי הריפוי.

מאמר זה מספק שיטה חדשה להשגת יחסי הריפוי בהתאם לתכונות הפיזיקליות של הביו-דיו. שימוש בתיאוריה זו יכול למטב הדפסת DLP רציפה. שיטה זו יכולה לשמש כדי להשיג את יחסי הריפוי בצורה מהירה ומדויקת יותר; לכן ניתן לקבוע טוב יותר את ריפוי ה- DLP הרציף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה תיאורטית

הגדר שלושה פרמטרים: ספיגת נוזלים (A_l), ספיגה מוצקה (A_s) וזמן סף (t_T)¹⁷.
כתוב מחדש את עקומת העבודה המסורתית של ג'ייקובס באמצעות שלושת הפרמטרים הבאים¹⁷ לפי משוואה 1:
(משוואה 1)
כאן, t H הוא זמן הריפוי של שכבה אחת בודדת,_ו-H הוא גובהה של שכבה בודדת אחת.

2. רכישת פרמטרים

מדוד את זמן הסף של הדיו הביולוגי באמצעות ראומטר המצויד באלמנט לבקרת טמפרטורה.
1. השתמש במקור אור של 365 ננומטר כדי לחשוף את פלטפורמת הבדיקה של הריומטר ולהפוך את עוצמת האור לערך מסוים.
2. הגדר את הריאומטר כדי לקבל את נתוני מודולי הזמן במהלך תקופה של 300 שניות, וקח כל נקודת נתונים כל 0.3 שניות דרך אפשרויות הגדרות הזמן בתוכנת הריומטר. לחץ על לחצן התחל בדיקה של המד כדי להתחיל את הבדיקה ובמקביל, לחץ על לחצן התחל של מקור האור.
3. ספירה מתחילת החשיפה, כאשר נתוני מודולוס האחסון שווים לנתוני מודולוס האובדן, הזמן המתאים מזוהה כזמן הסף. הקלט ידנית.
בנה את ציוד בדיקת הספיגה כפי שהוצג בעבודה הקודמת¹⁷. השתמש בשתי שקופיות זכוכית עליונות ותחתונות כדי להדק את המבנה המודפס בצורת טבעת (קוטר פנימי 5 מ"מ, קוטר חיצוני 10 מ"מ) בעובי של 500μm כך שהמעגל הפנימי של הטבעת יוצר חדר. הניחו את התא על אזור הבדיקה של מד עוצמת האור וכוונו את מקור האור כך שיחשוף את אזור התא.
הערה: איור 1 מציג את התרשים הסכמטי של תוצאות בדיקות פוטוראולוגיות ותוצאות עיבוד נתונים, ואת ציוד בדיקת הספיגה.
1. מדוד את עוצמת האור של האירוע (I_i) כאשר תא הבדיקה אינו מלא בחומר מציוד בדיקת הספיגה על ידי קריאת התצוגה של מד עוצמת האור של ציוד הבדיקה.
2. מלא את תא הבדיקה בדיו ביולוגי של 10 μLof.
3. חשוף את תא הבדיקה עם דיו ביולוגי לאור UV ברזולוציה של 365 ננומטר. קבל את עוצמת האור (I_lh) מציוד בדיקת הספיגה על ידי קריאת התצוגה של מד עוצמת האור של ציוד הבדיקה.
4. השג את עוצמת האור כאשר הדיו הביולוגי נרפא (I_sh) מציוד בדיקת הספיגה על-ידי קריאת התצוגה של מד עוצמת האור של ציוד הבדיקה כאשר הערך אינו משתנה עוד. ערך זה הוא הספיגה המוצקה, אני_ש.
5. חשב את ספיגת הנוזלים וספיגת המוצקים באמצעות משוואות 2 ו- 3:
  משוואה 2
  משוואה 3
קבל את עקומת העבודה של ג'ייקובס בהתאם לפרמטרים שהתקבלו.

איור 1: תוצאות בדיקות וציוד. (A) תרשים סכמטי של תוצאות בדיקות פוטוראולוגיות ותוצאות עיבוד נתונים. (ב) ציוד לבדיקת ספיגה. נתון זה שונה באישור Li et ^al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הגדרות פרמטר הדפסה רציף של DLP

השתמש בתוכנת DLP כדי להשיג הדפסת DLP, ואת קבוצת פרמטרי ההדפסה בתוכנה באופן הבא.
הגדר את זמן החשיפה של השכבה הבודדת הראשונה כזמן הסף (t_T) בהגדרות הפרמטרים של התוכנה.
1. חשב את זמן החשיפה של ריפוי חומרים בעובי 10 מיקרומטר לפי משוואה 1 והחסר את זמן הסף כדי לקבל את זמן החשיפה האמיתי לריפוי שכבה בודדת.
הגדר את מרווח הזמן בין שכבות סמוכות ל- 0 שניות בהגדרות הפרמטרים של התוכנה.
הפעל את המדפסת על-ידי לחיצה על לחצן התחל בתוכנת ההדפסה. כאשר תהליך ההדפסה מסתיים, סיים את ההדפסה על-ידי לחיצה על לחצן עצור בתוכנת ההדפסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאמר זה מציג שיטה חדשה להשגת פרמטרים ריפוי ומציג דרך חדשה להשגת הדפסת DLP רציפה, המדגימה את היעילות של שיטה זו בקביעת עקומת העבודה.

השתמשנו בשלושה חומרים שונים בהדפסת DLP כדי לאמת את הדיוק של עקומת העבודה התיאורטית המתקבלת בשיטה שהוצגה במאמר זה. החומרים הם 20% (v/v) פוליאתילן (גליקול) דיאקרילט (PEGDA), 0.5% (w/v) ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) עם ריכוזים שונים של בולם UV-0.1% (w / v), 0.15% (w / v), ו 0.2% (w / v) כחול מבריק. נתוני עובי הריפוי האמיתיים עם עקומות העבודה התיאורטיות מוצגים באיור 2.

תרשים 2: השוואה בין עקומת העבודה התיאורטית לבין נתוני ההדפסה בפועל . (A) בולם 0.1% (w/v). (B) בולם 0.15% (w/v). (C) בולם 0.2% (w/v). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתן להשתמש בעקומת העבודה התיאורטית כדי לחשב את עקומת העבודה במדויק. לא משנה מה הרכב החומר, צירוף המקרים הגבוה של תוצאות ההדפסה בפועל והתוצאות התיאורטיות מוכיחים את יעילות השיטה.

השווינו גם את זמן ההדפסה הכולל של שיטת ההדפסה המסורתית DLP עם שיטת ההדפסה הרציפה DLP שפותחה במאמר זה. כפי שניתן לראות באיור 3, ככל שעובי שכבת ההדפסה קטן יותר, כך ניכר שיפור ביעילות הדפסת DLP רציפה. יעילות הריפוי גדלה יותר מפי עשרה.

איור 3: השוואת יעילות בין הדפסת DLP מסורתית לבין הדפסת DLP רציפה. נתון זה שונה באישור Li et ^al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

רכישת עקומת העבודה התיאורטית יכולה לשמש לשיפור תהליך DLP ולקידום התקדמות טכנולוגיית DLP, אך ללא רכישת עקומת העבודה התיאורטית, לא ניתן לשלוט במדויק בשיטת ההדפסה החדשה. יתר על כן, ככל שעובי שכבת ההדפסה קטן יותר, כך איכות ההדפסה טובה יותר, כלומר שיטת ההדפסה הרציפה DLP המוצעת במאמר זה יכולה להשיג בו זמנית יעילות גבוהה ונאמנות גבוהה.

איור 4: השוואת תוצאות ההדפסה בין הדפסת DLP מסורתית להדפסת DLP רציפה . (A) המודל שנרפא בשיטה המסורתית. (B) המודל שנרפא באמצעות שיטת הדפסת DLP הרציפה שלנו. נתון זה שונה באישור Li et ^al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בניגוד לשיטה המסורתית הדורשת ניסויי הדפסה חוזרים ונשנים, שיטה זו צריכה רק לבדוק את תכונות החומר הרלוונטיות של החומר. רק כמות קטנה מאוד של חומר נדרשת כדי להשיג במדויק את עקומת העבודה המתאימה שלה. השיטה המסורתית לא רק מבזבזת חומר, אלא גם מסתמכת במידה רבה על שיטות מדידה כדי לקבוע את עובי היציקה המדויק של זמני חשיפה שונים. עבור חומרים עם יכולת עיצוב ירודה, קשה להשיג במדויק את עובי ההדפסה, ולכן עקומת העבודה אינה מדויקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מתוארים בסעיף 2. יש צורך לאחד את עוצמת האור המשמשת במבחן הפוטוריאולוגיה ואת עוצמת האור המודפסת בבדיקות בפועל. ציוד בדיקת הספיגה הוא החלק החשוב ביותר. צורת תא הבדיקה צריכה להיות זהה לאזור הרגיש לאור של מד עוצמת האור. בשל תכונות החומרים המשתנים ללא הרף במהלך כל תהליך החשיפה לאור UV, עוצמת האור צריכה להמשיך להשתנות⁶. על פי ההגדרה של ספיגת נוזלים וספיגת מוצקים במשוואה 1, תהליך הריפוי הוא פשוט. אם ניקח את הנתונים בתחילת החשיפה כבליעת נוזלים ואת הנתונים כאשר עוצמת האור קבועה מכיוון שהספיגה המוצקה היא הפעולה הקריטית ביותר.

ראוי לציין כי שיטה זו יש מגבלה בלתי נמנעת, שהיא פישוט של תהליך הריפוי. מכיוון שהמידול התיאורטי של שיטה זו אינו לוקח בחשבון גורמים כגון עיכוב חמצן¹³, ישנן טעויות בין עקומת העבודה בפועל לבין עקומת העבודה התיאורטית. יתר על כן, אם ההפרעה החיצונית גדולה, עקומת העבודה התיאורטית אינה יכולה לשמש במדויק למחקר.

השיטה המסורתית להשגת עקומת העבודה של ג'ייקובס דורשת הדפסה מרובה עם זמני חשיפה שונים¹⁵. עקומת העבודה מתקבלת על ידי מדידת עובי ההדפסה המתאים לזמן החשיפה והתאמת הנתונים. שיטה זו דורשת חומר רב והיא מאוד לא יעילה. יכולת ההדפסה של החומר מגבילה את דיוק עקומת העבודה, וגם התצפית והמדידה של המבנה מגבירות את השגיאה. השיטה במאמר זה להשגת עקומת העבודה יכולה לחסוך הרבה חומרים, עקומות עבודה מדויקות ניתן להשיג רק באמצעות בדיקות תכונות חומר פשוטות, וניתן להבטיח את דיוק עקומת העבודה ללא תלות ביכולת הצורה של החומר. במחקר ההדפסה הביולוגית DLP, כאשר החומר רך מאוד (E < 10 kPa) לא ניתן להדפיס אותו היטב, וזה ישפיע על נתוני עובי ההדפסה המתקבלים בשיטה המסורתית, ובכך ישפיע על הדיוק של עקומת העבודה¹⁸. השיטה המוזכרת בפרוטוקול זה יכולה לספק פתרון לקביעת פרמטרים של תהליך הדפסת DLP של ביו-חומרים רכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים בהכרת תודה על התמיכה הניתנת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '12125205, 12072316, 12132014), והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (מענק מס '2022M712754).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brilliant Blue	Aladdin (Shanghai, China).	6104-59-2
DLP software	Creation Workshop	N/A
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate		N/A	LAP; synthesized
Light source	OmniCure	https://www.excelitas.com/product-category/omnicure-s-series-lamp-spot-uv-curing-systems	365 nm
Polyethylene (glycol) diacrylate	Sigma-Aldrich	455008	PEGDA Mw ~700
Rheometer	Anton Paar, Austria	MCR302