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Neuroscience

विवो में माउस मस्तिष्क को ट्रांसक्रैनियल रूप से उत्तेजित करने के लिए मिलीमीटर आकार के कॉइल के साथ संयुक्त कम लागत वाली इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक रिकॉर्डिंग सिस्टम

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2
1Bioengineering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology, Hokkaido University, 2Bioengineering and Bioinformatics, Division of Information Science and Technology, Hokkaido University
* These authors contributed equally

Summary

विवो में माउस मस्तिष्क के ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना को चलाने के लिए मिलीमीटर आकार के कॉइल के साथ संयुक्त एक कम लागत वाली इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक रिकॉर्डिंग प्रणाली प्रस्तावित है। कस्टम-निर्मित, लचीला, मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी सब्सट्रेट के साथ पारंपरिक स्क्रू इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना के जवाब में माउस मस्तिष्क से मल्टी-साइट रिकॉर्डिंग की जा सकती है।

Abstract

एक मिलीमीटर आकार के कॉइल का उपयोग करके विवो में माउस मस्तिष्क के ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना (टीएमएस) को चलाने के लिए एक कम लागत वाली इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक (ईईजी) रिकॉर्डिंग प्रणाली यहां प्रस्तावित है। कस्टम-निर्मित, लचीला, मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी सब्सट्रेट के साथ संयुक्त पारंपरिक स्क्रू इलेक्ट्रोड का उपयोग करके, माउस मस्तिष्क से मल्टी-साइट रिकॉर्डिंग की जा सकती है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि आमतौर पर प्रयोगशालाओं में पाए जाने वाले कम लागत वाले उपकरणों का उपयोग करके मिलीमीटर आकार के कॉइल का उत्पादन कैसे किया जाता है। लचीले मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी सब्सट्रेट और पेंच इलेक्ट्रोड के लिए सर्जिकल आरोपण तकनीक बनाने के लिए व्यावहारिक प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं, जो कम शोर वाले ईईजी संकेतों का उत्पादन करने के लिए आवश्यक हैं। यद्यपि पद्धति किसी भी छोटे जानवर के मस्तिष्क से रिकॉर्डिंग के लिए उपयोगी है, वर्तमान रिपोर्ट एक एनेस्थेटाइज्ड माउस खोपड़ी में इलेक्ट्रोड कार्यान्वयन पर केंद्रित है। इसके अलावा, इस विधि को आसानी से एक जागृत छोटे जानवर तक बढ़ाया जा सकता है जो एक सामान्य एडाप्टर के माध्यम से टेथर्ड केबल से जुड़ा होता है और रिकॉर्डिंग के दौरान सिर पर टीएमएस डिवाइस के साथ तय किया जाता है। ईईजी-टीएमएस प्रणाली का वर्तमान संस्करण, जिसमें अधिकतम 32 ईईजी चैनल शामिल हो सकते हैं (16 चैनलों वाला एक डिवाइस कम चैनलों के साथ एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया जाता है) और एक टीएमएस चैनल डिवाइस, वर्णित है। इसके अतिरिक्त, एनेस्थेटाइज्ड चूहों के लिए ईईजी-टीएमएस प्रणाली के आवेदन द्वारा प्राप्त विशिष्ट परिणाम संक्षेप में रिपोर्ट किए गए हैं।

Introduction

ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना (टीएमएस) मानव मस्तिष्क विज्ञान, नैदानिक अनुप्रयोग और पशु मॉडल अनुसंधान के लिए एक आशाजनक उपकरण है क्योंकि इसकी गैर-/ कम आक्रामकता है। टीएमएस अनुप्रयोगों के प्रारंभिक चरण के दौरान, मनुष्यों और जानवरों में एकल और युग्मित-पल्स टीएमएस के जवाब में कॉर्टिकल प्रभाव का माप मोटर कॉर्टेक्स तक सीमित था; आसानी से मापने योग्य आउटपुट मोटर उत्पन्न क्षमता और प्रेरित मायोइलेक्ट्रिक क्षमता तक सीमित था जिसमें मोटर कॉर्टेक्स 1,2 शामिल था। मस्तिष्क क्षेत्रों का विस्तार करने के लिए जिन्हें टीएमएस मॉड्यूलेशन द्वारा मापा जा सकता है, इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक (ईईजी) रिकॉर्डिंग को एकल और युग्मित-पल्स टीएमएस के साथ एकीकृत किया गया था ताकिपूरे मस्तिष्क 3,4,5 में क्षेत्रों की उत्तेजना, कनेक्टिविटी और स्थानिक गतिशीलता की सीधे जांच की जा सके। इस प्रकार, मस्तिष्क के लिए टीएमएस और ईईजी रिकॉर्डिंग (टीएमएस-ईईजी) के एक साथ आवेदन का उपयोग इंट्राकॉर्टिकल तंत्रिका सर्किट की जांच के लिए मनुष्यों और जानवरों के विभिन्न सतही कॉर्टिकल मस्तिष्क क्षेत्रों की जांच करने के लिए किया गया है (देखें ट्रेम्बले एट अल.6)। इसके अलावा, टीएमएस-ईईजी सिस्टम का उपयोग अतिरिक्त कॉर्टिकल स्थानिक विशेषताओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें अन्य कॉर्टिकल क्षेत्रों में संकेतों का प्रसार और ऑसिलेटरी गतिविधि 7,8 की पीढ़ी शामिल है।

हालांकि, टीएमएस की गैर-आक्रामकता के कारण मस्तिष्क में टीएमएस की कार्रवाई का तंत्र सट्टा बना हुआ है, जो टीएमएस अनुप्रयोगों के दौरान मस्तिष्क के कार्य करने के बारे में हमारे ज्ञान को सीमित करता है। इसलिए, कृन्तकों से लेकर मनुष्यों तक जानवरों में आक्रामक अनुवाद अध्ययन तंत्रिका सर्किट और उनकी गतिविधि पर टीएमएस के प्रभावों के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं। विशेष रूप से, जानवरों में संयुक्त टीएमएस-ईईजी प्रयोगों के लिए, छोटे जानवरों के लिए एक साथ उत्तेजना और माप प्रणाली गहन रूप से विकसित नहीं की गई है। इसलिए, प्रयोगवादियों को अपनी विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार परीक्षण और त्रुटि द्वारा ऐसी प्रणाली का निर्माण करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, माउस मॉडल विवो पशु प्रजातियों के मॉडल में अन्य के बीच उपयोगी हैं क्योंकि कई ट्रांसजेनिक और तनाव-पृथक चूहों के उपभेद जैविक संसाधनों के रूप में उपलब्ध हैं। इस प्रकार, चूहों के लिए टीएमएस-ईईजी-संयुक्त माप प्रणाली बनाने का एक सुविधाजनक तरीका कई तंत्रिका विज्ञान शोधकर्ताओं के लिए वांछनीय होगा।

यह अध्ययन एक टीएमएस-ईईजी-संयुक्त विधि का प्रस्ताव करता है जिसे माउस मस्तिष्क की एक साथ उत्तेजना और रिकॉर्डिंग के लिए लागू किया जा सकता है, जो अनुसंधान में उपयोग किया जाने वाला मुख्य प्रकार का ट्रांसजेनिक जानवर है, और जिसे आसानी से विशिष्ट तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशालाओं में बनाया जा सकता है। सबसे पहले, एक कम लागत वाली ईईजी रिकॉर्डिंग प्रणाली को पारंपरिक स्क्रू इलेक्ट्रोड और एक लचीले सब्सट्रेट का उपयोग करके वर्णित किया जाता है ताकि प्रत्येक प्रयोग में इलेक्ट्रोड-सरणी स्थिति को पुन: निर्दिष्ट किया जा सके। दूसरा, एक चुंबकीय उत्तेजना प्रणाली का निर्माण एक मिलीमीटर आकार के कॉइल का उपयोग करके किया जाता है, जिसे आसानी से विशिष्ट प्रयोगशालाओं में कस्टम-बनाया जा सकता है। तीसरा, टीएमएस-ईईजी-संयुक्त प्रणाली ध्वनि और चुंबकीय उत्तेजना के जवाब में तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करती है। इस अध्ययन में प्रस्तुत विधि उन तंत्रों को प्रकट कर सकती है जो छोटे जानवरों में विशिष्ट विकार उत्पन्न करते हैं, और पशु मॉडल में प्राप्त परिणामों को संबंधित मानव विकारों को समझने के लिए अनुवादित किया जा सकता है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन में, सभी पशु प्रयोगों को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड के बाद और होक्काइडो विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ किया गया था। सी 57बीएल / 6 जे चूहों, दो पुरुष और तीन मादा, 8 से 10 सप्ताह के, वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. लचीला दो आयामी सरणी डिजाइन और निर्माण

  1. ईईजी रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में उपयोग के लिए निम्नलिखित संरचनात्मक गुणों के साथ लघु स्क्रू इलेक्ट्रोड (स्टेनलेस, एसयूएस एक्सएम 7; सामग्री की तालिका देखें) की आवश्यक संख्या तैयार करें: नाममात्र व्यास, गर्दन की लंबाई, और सिर व्यास क्रमशः 0.6 मिमी, 1.5 मिमी और 1.1 मिमी (चित्रा 1 ए)।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, 16 लघु स्क्रू इलेक्ट्रोड का उपयोग किया गया था।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एक लचीले सब्सट्रेट पर मुद्रित सर्किट आरेख का खाका तैयार करें।
    1. पेंच इलेक्ट्रोड को पढ़ने के लिए एक लचीले सब्सट्रेट (पूरे आकार, 41.2 मिमी × 19.9 मिमी; सामग्री की तालिका देखें) पर एक द्वि-आयामी (2 डी) इलेक्ट्रोड पैड पैटर्न बनाएं। 2 डी इलेक्ट्रोड व्यवस्था डिजाइन करें। चित्रा 1 बी इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट व्यवस्था और एक बेसलाइन बिंदु से सापेक्ष निर्देशांक दिखाता है (मूल पर चिह्नित क्रॉस [0, 0])।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में, टेम्पोरल लोब के भीतर श्रवण कॉर्टेक्स में तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए, पार्श्व-से-मध्यम (क्षैतिज) दिशा में इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट रोस्ट्रल-टू-कॉडल (ऊर्ध्वाधर) दिशा (चित्रा 1 बी) की तुलना में लंबा था।
    2. सुनिश्चित करें कि ईईजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए, लचीले सब्सट्रेट पर प्रत्येक कॉपर पैड ( सामग्री की तालिका देखें) में 1.3 मिमी के बाहरी व्यास और 0.8 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ एक अंगूठी का आकार होता है (चित्रा 1 सी, बाएं)। प्रत्येक स्क्रू इलेक्ट्रोड को सब्सट्रेट से गुजरने के लिए केंद्र में एक छोटा छेद (0.8 मिमी व्यास) बनाएं। संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए, प्रत्येक तांबे के पैड में 1.4 मिमी की साइड लंबाई के साथ एक चौकोर आकार होना चाहिए; इसी तरह, सब्सट्रेट पर स्क्वायर पैड से गुजरने के लिए प्रत्येक पेंच के लिए केंद्र में एक छोटा छेद (0.8 मिमी व्यास) बनाएं (चित्रा 1 सी, दाएं)।
    3. इसके बाद, एक सतह-माउंट कनेक्टर (चित्रा 1 डी, बाएं) को ठंडा करने के लिए, कनेक्टर (चित्रा 1 डी, दाएं) की ओर जाने वाले रीडआउट पैड (2 डी सरणी) डिजाइन करें। उदाहरण के लिए, 2 × 10 पिन और आसन्न पिन (चित्रा 1 डी, दाएं) के बीच 1.27 मिमी पिच के साथ एक कनेक्टर का उपयोग करें।
    4. 0.03 मिमी की रेखा चौड़ाई और 0.03 मिमी के रेखा अंतराल ( चित्रा 1 ई में पतली रेखाएं) के साथ सतह और पीछे की परत दोनों का उपयोग करके स्क्रू इलेक्ट्रोड पैड और कनेक्टर पैड को तार करें।
    5. इसके अलावा, एम्पलीफायर से संदर्भ और ग्राउंड चैनलों को जोड़ने के लिए, संदर्भ और ग्राउंड इलेक्ट्रोड के लिए इलेक्ट्रोड पैड को लचीले 2 डी सरणी के बाहर पृथक भाग से कनेक्ट करें ( चित्रा 1 ई के निचले भाग में "जी" और "एचआर" द्वारा इंगित दो ऊर्ध्वाधर आयताकार)। संदर्भ और ग्राउंड चैनल निर्धारित करने के बाद, इलेक्ट्रोड पैड को संबंधित कनेक्टर्स में ठंडा करना याद रखें (चरण 2.1 देखें)।
    6. एक उजागर क्षेत्र को ठीक से डिजाइन करें जो एक सुरक्षा परत (पॉलीमाइड परत) के साथ कवर नहीं है। सतह और पीछे दोनों परतों में पेंच इलेक्ट्रोड पैड को उजागर करते समय सतह की परत में कनेक्टर पैड को उजागर करें। पूरे इलेक्ट्रोड डिजाइन, आकार और गढ़े गए लचीले 2 डी सरणी को चित्रा 1 ई में चित्रित किया गया है, और एक गढ़े गए सब्सट्रेट की छवि चित्रा 1 एफ में दिखाई गई है।
    7. लचीली 2 डी सरणी के शीर्ष इलेक्ट्रोड भाग (सिर भाग) में, सुनिश्चित करें कि ऊपर से नीचे तक तीन-स्तरित संरचना निम्नलिखित (49.0 μm की कुल मोटाई) से बनी है: एक शीर्ष तांबे की परत (12.0 μm मोटाई), कोर पॉलीमाइड की एक मध्य परत (25.0 μm), और एक नीचे तांबे की परत (12.0 μm) (चित्रा 1G, शीर्ष)।
    8. सब्सट्रेट की ऊपरी और निचली सतह पर तांबे की परतों को चलें, उदाहरण के लिए, गीली नक़्क़ाशी और मानक निर्माण तकनीक9 का उपयोग करके।
    9. लचीले 2 डी सरणी के निचले वर्ग पैड भाग (कनेक्टर भाग) में, सुनिश्चित करें कि छह-स्तरित संरचना तीन परतों से बनी है, जिसमें एक शीर्ष तांबे की परत (12.0 μm मोटाई), एक मध्य कोर पॉलीमाइड परत (25.0 μm), और एक नीचे तांबे की परत (12.0 μm) शामिल है, जो सुरक्षात्मक पॉलीमाइड परतों द्वारा सैंडविच हैं, जिसमें शीर्ष और नीचे (दोनों 12.5 μm) परतें शामिल हैं। मजबूत सामग्री के रूप में नीचे से 2 मिमी पॉलीमाइड बोर्ड संलग्न करें (चित्रा 1 जी, नीचे)।
      नोट: लचीलापन बनाए रखने के लिए, मजबूत पॉलीमाइड बोर्ड सिर और कनेक्टर भाग के बीच लचीले 2 डी सरणी के गर्दन के हिस्से पर नहीं लगाया जाता है।
    10. इसी तरह, कनेक्टर भाग में, गीली नक़्क़ाशी और मानक निर्माण तकनीक का उपयोग करके शीर्ष पर तांबे और सुरक्षात्मक पॉलीमाइड परतों को चपका।
      नोट: कनेक्टर सहित गढ़े, लचीले, 2 डी सरणी डिवाइस का कुल वजन 0.84 ग्राम है। एक लचीले 2 डी सरणी के लिए एक लेआउट डिजाइन करने के बाद, एक वाणिज्यिक निर्माता से सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिका देखें) कभी-कभी सुविधा के लिए अनुशंसित होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक (ईईजी) रिकॉर्डिंग और सरणी सहित निर्मित डिवाइस के लिए लचीले दो-आयामी (2 डी) सरणी के घटक भाग। (ए) लघु स्क्रू इलेक्ट्रोड जो माउस खोपड़ी में एम्बेडेड है। (बी) मस्तिष्क गतिविधि (हरे घेरे) और संदर्भ चैनल (नीचे दाईं ओर वर्ग) को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए इलेक्ट्रोड पैड। मूल (0, 0) पर एक संदर्भ बिंदु (क्रॉस मार्क) से इलेक्ट्रोड पैड के सापेक्ष निर्देशांक दिखाए गए हैं; मिलीमीटर में आकार को कोष्ठक में चित्रित किया गया है। इलेक्ट्रोड पैड के केंद्र निर्देशांक क्रॉस मार्क से गुजरने वाले ऊर्ध्वाधर अक्ष के संबंध में सममित होते हैं। (सी) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (बाएं) और एक संदर्भ इलेक्ट्रोड (दाएं) के लिए इलेक्ट्रोड पैड और ड्रिल छेद सचित्र हैं। (डी) लचीले 2 डी सरणी (बाएं) और सब्सट्रेट (दाएं) पर डिज़ाइन किए गए पैड के पैटर्न और आकार के लिए उपयोग किया जाने वाला एक सतह-माउंट कनेक्टर (2 × 10 पिन)। (ई) मिलीमीटर में प्रत्येक भाग के आकार के साथ डिज़ाइन किया गया खाका। (एफ) ई में ब्लूप्रिंट द्वारा इंगित एक गढ़े गए सब्सट्रेट की छवि। (जी) लचीली 2 डी सरणी (सिर और कनेक्टर भागों) की परत संरचना। स्क्रू इलेक्ट्रोड पैड (ऊपर) और रीडआउट पैड (नीचे) के शीर्ष और साइड दृश्य सचित्र हैं। सिर और कनेक्टर भाग क्रमशः तीन-स्तरित संरचना (ऊपर) और एक छह-स्तरित संरचना (नीचे) से बने होते हैं। इसके अतिरिक्त, गर्दन का हिस्सा एक पांच-स्तरित संरचना से बना है; एक सुरक्षात्मक पॉलीमाइड परत शीर्ष और पीछे की सतह पर लगाई जाती है, और मजबूत पॉलीमाइड बोर्ड गर्दन के हिस्से पर नहीं लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. एडाप्टर निर्माण और चैनल मैपिंग

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एडाप्टर निर्माण करें।
    1. लचीले सब्सट्रेट पर 2 × 10 पिन, सतह-माउंट कनेक्टर (चित्रा 1 डी, बाएं) और 2 डी सरणी के कनेक्टर पैड (चित्रा 1 डी, दाएं) (सामग्री की तालिका देखें) पर सोल्डरिंग फ्लक्स फैलाएं।
    2. 2 × 10 पिन को ठंडा करें, कनेक्टर पैड को सतह-माउंट कनेक्टर दें। विशेष रूप से, 2 डी सरणी के निचले हिस्से पर दो पैड और संदर्भ और ग्राउंड चैनल (चित्रा 2 ए) के रूप में उपयोग किए जाने वाले दो कनेक्टर पिन के बीच संबंध की पुष्टि करें।
    3. बेसलाइन संकेतों को बाहरी बिंदु पर खिलाने के लिए दो पैड में से प्रत्येक को अलग-अलग लीड तारों से कनेक्ट करें (उदाहरण के लिए, माप प्रणाली के ग्राउंड चैनल से जुड़ा एक ग्राउंड पॉइंट; चित्रा 2 ए)।
      नोट: इस अध्ययन में, हालांकि, स्क्रू इलेक्ट्रोड के साथ परिपत्र इलेक्ट्रोड पैड में से एक का उपयोग कनेक्टर भाग में एक वर्ग इलेक्ट्रोड के बजाय संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में किया गया था।
    4. सोल्डरिंग के बाद, उजागर बिंदुओं की रक्षा और शॉर्ट सर्किट को रोकने के लिए एपॉक्सी राल ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सोल्डरिंग बिंदुओं को कवर करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए कनेक्टर केबल और हेड एम्पलीफायर को पिन करें।
    1. 2 × 10 पिन और 1.27 मिमी पिच (चित्रा 2 बी, शीर्ष बाएं) और 0.635 मिमी पिच (चित्रा 2 बी, नीचे बाएं) के साथ एक सपाट 20 पिन रिबन केबल ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक इन्सुलेशन-विस्थापन कनेक्टर (आईडीसी) तैयार करें। फ्लैट रिबन केबल को आवश्यक लंबाई (जैसे, 40 सेमी) तक काटें।
    2. आईडीसी क्रिम्पिंग टूल (चित्रा 2 बी, ऊपर दाएं) का उपयोग करके आईडीसी और फ्लैट रिबन केबल के एक छोर को क्रिम्प करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. कटर का उपयोग करके टिप एंड से लगभग 15 मिमी तक केबल के दूसरे छोर की प्रत्येक पंक्ति को अलग करें। टिप छोर से 3 मिमी इन्सुलेशन स्ट्रिप करें।
    4. क्रिम्प्ड आईडीसी को फ्लैट रिबन केबल से कनेक्ट करें और 2 × 10 पिन कनेक्टर को लचीले सब्सट्रेट (चित्रा 2 सी) से जोड़ा जाए।
    5. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और केबल की अलग लाइन के बीच पत्राचार की पुष्टि करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग की गई प्रत्येक पंक्ति गलत कनेक्शन त्रुटि उत्पन्न नहीं करती है।
    6. प्रत्येक इलेक्ट्रोड के आउटपुट के अनुरूप अलग-अलग लाइनों के उजागर तांबे के तारों को माप प्रणाली के 20 पिन कनेक्टर (1.25 मिमी पिच) में डालें, जिसमें मुख्य एम्पलीफायर (चित्रा 2 बी, नीचे दाएं) शामिल हैं।
    7. सोल्डरिंग के बाद, एक परीक्षण उपकरण का उपयोग करके स्क्रू इलेक्ट्रोड पैड और कनेक्टर पिन के बीच चालन की पुष्टि करें (उदाहरण के लिए, एक एलसीआर मीटर; सामग्री की तालिका देखें)।
    8. एपॉक्सी राल और परिरक्षण टेप का उपयोग करके सोल्डरिंग बिंदुओं को कवर करें ताकि उन्हें नुकसान से बचाया जा सके और अन्य सिग्नल लाइनों के संपर्क को रोका जा सके।
    9. एपॉक्सी राल का उपयोग करते हुए, लचीले सब्सट्रेट पर 2 डी सरणी के कनेक्टर भाग के पीछे की ओर एक पतली स्टेनलेस-स्टील रॉड (व्यास: 1.1-1.2 मिमी; लंबाई: 100 मिमी) का पालन करें।
      नोट: इस स्टेनलेस-स्टील रॉड को प्रयोगों के दौरान एक माइक्रोमैनिपुलेटर धारक द्वारा समझा जा सकता है (चित्रा 2 सी)।
    10. अंत में, स्क्रू इलेक्ट्रोड और सिग्नल आउटपुट चैनल (चित्रा 2 डी) के बीच मैपिंग की पुष्टि करें।

Figure 2
चित्रा 2: लचीले सब्सट्रेट और रिकॉर्डिंग चैनल मैपिंग पर दो-आयामी (2 डी) इलेक्ट्रोड सरणी के लिए एडाप्टर का निर्माण। (ए) कनेक्टर भाग में, संदर्भ और ग्राउंड चैनल लीड तारों के साथ नीचे इलेक्ट्रोड पैड से जुड़े होते हैं। यदि संदर्भ और ग्राउंड चैनल पहले से निर्धारित किए जाते हैं, तो चैनलों को डिजाइन चरण के दौरान संबंधित निचले इलेक्ट्रोड पैड से जोड़ा जाना चाहिए। ऐसे मामलों में, चैनलों और इलेक्ट्रोड पैड पर लीड तारों को सोल्डरिंग करना अनावश्यक है। (बी) माप एम्पलीफायर कनेक्टर (ऊपर दाएं) को जोड़ने के लिए इन्सुलेशन-विस्थापन कनेक्टर (ऊपर बाएं) को फ्लैट केबल (नीचे बाएं) के एक छोर पर चिपकाया जाता है। उपयोग किए जाने वाले चैनलों के अनुरूप सभी लाइनें हरे कनेक्टर (नीचे दाएं) से जुड़ी होती हैं। इस मामले में, क्योंकि हेड एम्पलीफायर से जुड़े प्रत्येक हरे कनेक्टर को आठ-चैनल माप के लिए सौंपा गया है, 16-चैनल मस्तिष्क गतिविधि संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए कम से कम दो कनेक्टर की आवश्यकता होती है। अन्य सिग्नल लाइनों के साथ संपर्क को रोकने के लिए सोल्डर्ड पॉइंट को एपॉक्सी राल और परिरक्षण टेप के साथ कवर किया जाता है। (सी) कनेक्टर और गढ़े गए केबल को लचीले 2 डी सरणी सब्सट्रेट की सतह पर रखा जाता है। पतली स्टेनलेस-स्टील रॉड लचीले सब्सट्रेट के पीछे की तरफ जुड़ी हुई है। (डी) माउस मस्तिष्क की सतह पर रिकॉर्डिंग चैनलों के स्थानिक स्थान और माप प्रणाली के लिए प्रत्येक बिंदु के लिए चैनल मानचित्र दिखाए गए हैं। इस मामले में, स्क्रू इलेक्ट्रोड (लाल सर्कल) के साथ 16 रिकॉर्डिंग चैनल हैं, हालांकि संभावित रिकॉर्डिंग साइटों की कुल संख्या 32 है। अन्य 16 गैर-रिकॉर्डिंग चैनलों को भी मस्तिष्क की सतह पर हरे घेरे के रूप में दिखाया गया है। मैपिंग प्लॉट में, "जी" और "आर" क्रमशः जमीन और संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए डिज़ाइन किए गए चैनलों को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. पशु शल्य चिकित्सा

  1. बाँझ शल्य चिकित्सा वातावरण तैयार करें।
    1. जानवरों से जुड़ी पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान लेटेक्स दस्ताने जैसे सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।
    2. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण और सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. सर्जिकल उपकरणों को स्टरलाइज़ करने के बाद, उन्हें बाँझ खारा का उपयोग करके धो लें।
  2. जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
    1. सर्जरी से पहले माउस के वजन को मापें। इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से एट्रोपिन सल्फेट (0.04 मिलीग्राम / किग्रा; सामग्री की तालिका देखें) का प्रबंधन करें।
    2. मेडेटोमिडीन (0.3 मिलीग्राम / किग्रा), मिडाज़ोलम (4.0 मिलीग्राम / किग्रा), और ब्यूट्रोफेनोल (5.0 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    3. पैर की अंगुली को चुटकी लेने के माध्यम से प्रतिक्रिया के स्तर से एनेस्थेटिक गहराई की पुष्टि करें।
      नोट: संज्ञाहरण लगभग 40 मिनट के बाद बंद हो जाएगा। यदि माउस एक पैर की अंगुली चुटकी का जवाब देता है, तो इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से एनेस्थेटिक मिश्रण की एक ही खुराक का प्रशासन करें।
  3. इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए पूर्व-तैयारी।
    1. हैप्टिक सनसनी को रोकने के लिए माउस मूंछ काट लें।
    2. सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों को नेत्र मरहम से चिकनाई दें। दृष्टि की भावना को बाधित करने के लिए पलकें बंद करें और ऊपरी और निचली पलकों को संशोधित टेप के साथ दबाकर बंद रखें।
    3. इलेक्ट्रिक क्लिपर से माउस के सिर पर बालों को शेव करें। मलाशय में एक थर्मामीटर डालें और हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    4. लिडोकेन हाइड्रोक्लोराइड को माउस खोपड़ी के उस हिस्से में एक सामयिक स्थानीय एनेस्थेटिक के रूप में प्रशासित करें जिसे इंजेक्ट किया जाएगा।
    5. माउस खोपड़ी को रोस्ट्रल-टू-कॉडल दिशा में स्केलपेल या सर्जिकल कैंची का उपयोग करके इंजस करें (क्षेत्र का आकार: 7 × 10 मिमी2)।
    6. चिमटी से घिसे हुए हिस्से के पास खोपड़ी को पिंच करें और उठाएं। खोपड़ी पर दिखाई देने वाली झिल्ली को स्केलपेल या सर्जिकल कैंची का उपयोग करके हटा दें। ऑपरेशन के दौरान आंखों के आसपास की रक्त वाहिकाओं को न तोड़ें।
    7. खोपड़ी की चीरा रेखा के दोनों केंद्रों के पास की त्वचा को बल के साथ पकड़ें और खोपड़ी के शीर्ष को व्यापक रूप से उजागर करने के लिए संक्रमित भाग को चौड़ा करें।
    8. सर्जिकल कैंची के साथ खोपड़ी की सतह और लैम्ब्डा के आसपास के ऊतक पर सभी झिल्ली को पूरी तरह से हटाने की पुष्टि करें।
    9. खोपड़ी के नीचे मस्तिष्क की सतह की दृश्यता बढ़ाने और अनुप्रस्थ साइनस का पता लगाने के लिए शारीरिक लवण के साथ खोपड़ी की सतह को गीला करें।
      नोट: खोपड़ी में पेंच इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपित करते समय, याद रखें कि उन्हें ऊपर और अनुप्रस्थ साइनस में एम्बेड न करें।

4. इलेक्ट्रोड प्रत्यारोपण

  1. लचीले सब्सट्रेट के पीछे की तरफ 2 डी इलेक्ट्रोड सरणी पर लगाए गए स्टेनलेस-स्टील रॉड को माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें। खोपड़ी पर लचीला सब्सट्रेट रखें।
  2. अवर कोलिकुलस के भीतर फिट होने के लिए सरणी पर चैनल (सीएच) 3 और 14 (चित्रा 2 डी) के स्थान को समायोजित करें।
    नोट: हीन कोलिकुलस अनुप्रस्थ साइनस के साथ स्थित है। हम पहले से माउस मस्तिष्क एटलस का उपयोग करके हीन कोलिकुलस के स्थान की पुष्टि करने की सलाह देते हैं।
  3. खोपड़ी पर Chs 3, 8, 9, और 14 (चित्रा 2D) के स्थानों पर छोटे घेरे बनाएं, जिसमें एक स्थायी मार्कर के साथ लैंडमार्क को लक्षित करने के लिए उपयोग किया जा सके।
  4. दंत सीमेंट के पालन को बढ़ाने के लिए खोपड़ी की सतह को सुखाएं और माउस खोपड़ी से लचीले सब्सट्रेट पर 2 डी इलेक्ट्रोड सरणी को विद्युत रूप से अलग करें।
  5. खोपड़ी की सतह पर दंत सीमेंट (लगभग 1 मिमी मोटाई; सामग्री की तालिका देखें) लागू करें। डेंटल सीमेंट लगाने के बाद, इसे ठीक करने के लिए लगभग 30 मिनट प्रतीक्षा करें।
  6. खोपड़ी की सतह पर छोटे गोलाकार निशान के अनुसार लचीले सब्सट्रेट को संरेखित करें।
  7. लचीले सब्सट्रेट पर प्रत्येक इलेक्ट्रोड पैड छेद के लिए एक दंत ड्रिल की नोक को संरेखित करें। प्रत्येक इलेक्ट्रोड पैड छेद के माध्यम से खोपड़ी में सावधानी से ड्रिल करें।
  8. लघु स्क्रू के लिए एक समर्पित स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके खोपड़ी में ड्रिल किए गए छेदों के माध्यम से लघु स्क्रू इलेक्ट्रोड में से प्रत्येक को पेंच करें।
  9. स्क्रू इलेक्ट्रोड के सिर और इलेक्ट्रोड पैड को कसकर पकड़ें। अंत में, विद्युत चालकता की पुष्टि करने के लिए परीक्षण उपकरण (जैसे, एक एलसीआर मीटर) के साथ प्रत्येक स्क्रू इलेक्ट्रोड और कनेक्टर के बीच चालकता को मापें।

5. छोटे कॉइल डिजाइन और निर्माण

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके केंद्र में एक छेद (आंतरिक व्यास: 2 मिमी; बाहरी व्यास: 7 मिमी; मोटाई: 1 मिमी) के साथ एक डोनट के आकार की डिस्क (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 देखें) डिज़ाइन करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके, गैर-गर्मी प्रतिरोधी सामग्री (जैसे, पॉली-लैक्टिक एसिड फिलामेंट) से बने दो डिस्क (चित्रा 3 ए, बाएं) प्रिंट करें; गैर-गर्मी प्रतिरोधी सामग्री हमेशा आवश्यक नहीं होती है (नीचे देखें)।
  3. एक छोटी शाफ्ट (लंबाई: 60 मिमी) बनाने के लिए एक पर्मलॉय -45 रॉड (व्यास: 2 मिमी; सामग्री की तालिका देखें) को ट्रिम करें।
  4. शाफ्ट को दो 3 डी-मुद्रित डिस्क के प्रत्येक छेद में डालें (चित्रा 3 ए, दाएं)। शाफ्ट के अंत में एक डिस्क और अंत से 11 मिमी दूसरी रखें, जिसके परिणामस्वरूप दो डिस्क के बीच 10 मिमी की दूरी हो। त्वरित गोंद के साथ डिस्क का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. डिस्क के बिना शाफ्ट के अंत को प्रभाव ड्राइवर (चित्रा 3 बी) से संलग्न करें। पर्मलॉय -45 शाफ्ट में एक छोटा चुंबक संलग्न करें। शाफ्ट से 5 मिमी चुंबक के पास एक हॉल-इफेक्ट सेंसर रखें। हॉल-प्रभाव सेंसर को डेटा अधिग्रहण (DAQ; सामग्री की तालिका देखें) सिस्टम से कनेक्ट करें।
  6. मोड़ों की संख्या गिनने के लिए, एक कंप्यूटर प्रोग्राम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें) जो डीएक्यू सिस्टम के माध्यम से हॉल-इफेक्ट सेंसर से आउटपुट संकेतों का विश्लेषण करता है।
  7. शाफ्ट से एक पतली तांबे के तार (व्यास: 0.16 मिमी) को कनेक्ट करें और तत्काल गोंद के साथ तार के शीर्ष छोर का पालन करें।
  8. प्रभाव ड्राइवर का उपयोग करके, तांबे के तार को दो डिस्क के बीच 1,000 मोड़ के लिए हवा दें। यद्यपि रोटेशन की गति मनमानी है, लगभग 5 रोटेशन प्रति सेकंड आमतौर पर उपयोग किया जाता है। फिर, तत्काल गोंद के साथ घाव के तार का पालन करें।
  9. शाफ्ट से दो डिस्क को अलग करें। यदि डिस्क को शाफ्ट से दृढ़ता से पालन किया जाता है, तो हीट गन का उपयोग करके डिस्क को पिघलाएं।
  10. सतह को इन्सुलेट और सुरक्षित करने के लिए कॉइल को एपॉक्सी राल के साथ कवर करें। फिर, बिना घाव वाले शाफ्ट हिस्से को अतिरिक्त के रूप में काट दें।
  11. सुनिश्चित करें कि प्राप्त कुंडल की ऊंचाई 10 मिमी और व्यास 6 मिमी है (चित्रा 3 बी, बाएं)। कॉइल हेरफेर के लिए, या तो एक कॉइल होल्डर (चित्रा 3 सी, दाएं) का निर्माण करें या कॉइल के लिए एक स्टेनलेस-स्टील रॉड का पालन करें (यहां नहीं दिखाया गया है)।
  12. एलसीआर मीटर का उपयोग करके कॉइल के प्रतिरोध और प्रेरकत्व को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। उदाहरण के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले कॉइल में 18.3 Ω का प्रत्यक्ष प्रवाह (डीसी) प्रतिरोध और 1 किलोहर्ट्ज प्रत्यावर्ती धारा (एसी) इनपुट पर 7.9 एमएच का प्रेरकत्व था। एसी गुण (प्रतिरोध और प्रेरकत्व) चित्रा 3 डी में दिखाए गए हैं।
  13. कुंडल पर द्विध्रुवी वर्ग तरंग लागू करने के लिए एक फ़ंक्शन जनरेटर का उपयोग करें। इनपुट वोल्टेज का विशिष्ट आयाम 2 वी जनरेटर आउटपुट के बाद 10 x लाभ के साथ द्विध्रुवीय बिजली की आपूर्ति के माध्यम से 20 V है। परिणामी तरंग एक द्विध्रुवीय वर्ग तरंग है जिसका अनुमानित आयाम 20 वी (यानी, 40 वी का पीक-टू-पीक वोल्टेज) (चित्रा 3 ई) है।
  14. हॉल-प्रभाव सेंसर और डीएक्यू प्रणाली का उपयोग करके चुंबकीय प्रवाह घनत्व को मापें। इस मामले में, उदाहरण के लिए, कॉइल का चुंबकीय प्रवाह घनत्व (बी) 113.6 ±2.5 मीट्रिक टन (एसईएम ± औसत) था जब कॉइल बॉटम हॉल-इफेक्ट सेंसर (चित्रा 3 एफ) के संपर्क में था।

Figure 3
चित्र 3: चुंबकीय उत्तेजना के लिए छोटे कुंडल। (A) त्रि-आयामी (3D)-मुद्रित डिस्क (बाएं)। पर्मलॉय -45 शाफ्ट के लिए दो समान डिस्क का पालन किया जाता है; एक शाफ्ट के अंत में है, और दूसरा 10 मिमी दूर है (दाएं)। (बी) कुंडल को बंद करने के लिए सेटअप। दो डिस्क के साथ 60 मिमी शाफ्ट एक प्रभाव ड्राइवर से जुड़ा हुआ है। शाफ्ट से जुड़े छोटे चुंबक के पास एक हॉल-इफेक्ट सेंसर रखा गया है। तांबे का तार दो डिस्क के बीच घाव है। (ग) निर्मित कुंडल। कुंडल ऊंचाई में 10 मिमी, व्यास में 6 मिमी है, और तांबे के तार के 1,000 मोड़ हैं। आकृति के दाईं ओर 3 डी-मुद्रित कॉइल धारक द्वारा हेरफेर किए गए कॉइल को दिखाया गया है। (डी) एलसीआर मीटर द्वारा दर्ज कॉइल के एसी गुण: (शीर्ष) प्रतिरोध बनाम साइनसॉइडल इनपुट की आवृत्ति; (नीचे) प्रेरकत्व बनाम इनपुट आवृत्ति। एक विशिष्ट कॉइल में एसी इनपुट के 1 kHz पर क्रमशः 21.6 और 7.9 mH का प्रतिरोध और प्रेरकत्व होता है। (ई) द्विध्रुवीय आयताकार तरंग का उपयोग ऑसिलोस्कोप द्वारा दर्ज कॉइल इनपुट के रूप में किया जाता है। (एफ) चुंबकीय प्रवाह घनत्व और एक निर्मित कुंडल और हॉल-प्रभाव सेंसर के बीच की दूरी के बीच संबंध। चुंबकीय प्रवाह घनत्व को पांच अलग-अलग हॉल-इफेक्ट सेंसर द्वारा दर्ज किया गया था, प्रत्येक सेंसर के लिए एक बार। पांच मापों का औसत प्लॉट किया गया है, और त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. सिग्नल रिकॉर्डिंग सिस्टम और प्रक्रिया

  1. फ्लैट रिबन केबल के साथ लचीले 2 डी सरणी को रिकॉर्डिंग सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) से कनेक्ट करें।
  2. कुंडल पर लगाए गए स्टेनलेस-स्टील रॉड को माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. कॉइल को ब्रेग्मा के ऊपर रखें और अवर कोलिकुलस के ऊपर फोकल बिंदु का पता लगाने के लिए पुच्छल दिशा में स्थिति को समायोजित करें। उत्सर्जक विद्युत क्षेत्र का केंद्र बिंदु कुंडल की निचली सतह पर घाव क्षेत्र की मध्य रेखा है (यानी, किनारे से केंद्र तक 1 मिमी)।
  4. एक द्विध्रुवी य बिजली की आपूर्ति और एक फ़ंक्शन जनरेटर ( सामग्री की तालिका देखें) से युक्त एक उत्तेजना प्रणाली तैयार करें और कॉइल को सिस्टम से कनेक्ट करें।
  5. डीएक्यू सिस्टम से फ़ंक्शन जनरेटर पर ट्रिगर सिग्नल लागू करने के लिए फ़ंक्शन जनरेटर के इनपुट टर्मिनल और डीएक्यू सिस्टम के आउटपुट टर्मिनल के बीच एक केबल कनेक्ट करें। उत्तेजना ओं को शुरू करने के लिए ट्रिगर संकेतों के लिए एक उपयुक्त कंप्यूटर प्रोग्राम तैयार करें। इसके अतिरिक्त, टाइमस्टैम्प के रूप में उत्तेजना समय को बचाने के लिए डीएक्यू सिस्टम को रिकॉर्डिंग सिस्टम से कनेक्ट करें।
  6. रिकॉर्डिंग सिस्टम के लिए अधिग्रहण प्रक्रिया प्रारंभ करें।
    नोट: यदि रिकॉर्डिंग सिस्टम शोर उठा रहा है, तो शोर के स्रोत का पता लगाएं और इसे कम करें।
  7. उत्तेजना प्रणाली को ट्रिगर करके चुंबकीय उत्तेजना का परीक्षण करें।
    नोट: यदि चुंबकीय उत्तेजना द्वारा उत्पादित शोर माप सीमा को संतृप्त करता है, तो सीमा को ठीक से समायोजित करें। इसके अतिरिक्त, पुष्टि करें कि रिकॉर्डिंग सिस्टम उत्तेजना टाइमस्टैम्प को ठीक से बचाता है।
  8. प्रतिक्रिया डेटा रिकॉर्ड करना शुरू करें और उत्तेजना सत्र शुरू करें। प्रत्येक उत्तेजना सत्र पूरा होने पर रिकॉर्डिंग बंद करें। बाद के विश्लेषण के लिए सभी रिकॉर्ड किए गए डेटा को सहेजें।
    नोट: पांच अलग-अलग चुंबकीय तीव्रता के साथ सभी प्रयोगात्मक स्थितियों को करने के लिए, उदाहरण के लिए, सभी सत्रों के लिए आवश्यक कुल समय लगभग 75 मिनट था। समापन बिंदु आमतौर पर सभी रिकॉर्डिंग सत्रों के समाप्त होने के बाद निर्धारित किया गया था। हालांकि, जब जानवरों ने खांसी, सांस लेने में कठिनाई और हांफने सहित नैदानिक लक्षण दिखाए, तो प्रयोगात्मक सत्र को तुरंत समाप्त कर दिया गया। इच्छामृत्यु के लिए, तेज, साफ कैंची का उपयोग करके सिर कलम किया गया था, जबकि जानवरों को संज्ञाहरण के तहत रखा गया था।

7. डेटा विश्लेषण

  1. 200 हर्ट्ज की कट-ऑफ आवृत्ति के साथ कम-पास फ़िल्टर का उपयोग करके वाइडबैंड (कच्चे) सिग्नल को फ़िल्टर करें।
  2. प्रत्येक उत्तेजना टाइमस्टैम्प के चारों ओर एक समय विंडो के दौरान फ़िल्टर किए गए वेवफॉर्म एकत्र करें। घटना से संबंधित क्षमता (ईआरपी) तरंगों को प्राप्त करने के लिए तरंगों का औसत (चित्रा 4 और चित्रा 5)।

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Representative Results

स्क्रू इलेक्ट्रोड के साथ संयुक्त लचीले सब्सट्रेट के साथ एनेस्थेटाइज्ड सी 57बीएल / 6 जे चूहों में दर्ज नमूना ईईजी डेटा नीचे प्रस्तुत किए गए हैं।

एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में, ध्वनि उत्तेजना (8 kHz टोन-बर्स्ट, 80 डीबी ध्वनि दबाव स्तर [एसपीएल]) के जवाब में उत्पन्न औसत ईईजी तरंगों को समान उत्तेजनाओं (चित्रा 4 ए) के साथ 60 परीक्षणों के लिए दिखाया गया है। रिकॉर्डिंग चैनल मैपिंग का एक योजनाबद्ध चित्र 4 ए के बीच में भी प्रस्तुत किया गया है। सीएचएस 5, 7, 10 और 12 से प्रतिक्रियाएं दोनों टेम्पोरल लोब में श्रवण कॉर्टेक्स के पास के क्षेत्रों से दर्ज की जाती हैं। श्रवण क्षेत्रों (अवर कोलिकुलस और श्रवण कॉर्टेक्स) के आसपास स्थित चैनलों के व्यक्तिगत ईईजी तरंगों में, उत्तेजना कलाकृतियों को छोड़कर प्रतिक्रियाएं ध्वनि उत्तेजना की शुरुआत के तुरंत बाद पहली बार नकारात्मक थीं (उदाहरण के लिए, सीएच 3 और 10); चरम आयाम क्रमशः 45.6 ± 4.0 μV और 25.6 ± 1.5 μV थे। प्रतिक्रियाएं बाद में बेसलाइन (चित्रा 4 बी, सी) पर कुछ हद तक सकारात्मक थीं और कम करते हुए दोलन कर रही थीं। इसके विपरीत, अन्य चैनलों की प्रतिक्रियाएं उत्तेजना की शुरुआत से लगभग स्वतंत्र थीं, हालांकि कुछ चैनल तरंगों ने समान प्रतिक्रियाएं दिखाईं।

Figure 4
चित्रा 4: माउस मस्तिष्क में 16 साइटों पर ध्वनि घटना से संबंधित क्षमता (ईआरपी) तरंगें। (ए) ध्वनि (8 किलोहर्ट्ज टोन-बर्स्ट, 80 डीबी एसपीएल) उत्तेजना के जवाब में एक एनेस्थेटाइज्ड माउस पर लागू होता है, 16-चैनल ईआरपी वेवफॉर्म सचित्र हैं। माउस मस्तिष्क का योजनाबद्ध केंद्र में दिखाया गया है, और माउस मस्तिष्क की सतह पर 16 रिकॉर्डिंग साइटों (लाल घेरे) को चैनल संख्याओं द्वारा इंगित किया गया है। इस मामले में, 16 रिकॉर्डिंग चैनलों का उपयोग किया जाता है; अन्य 16 गैर-रिकॉर्डिंग चैनलों को हरे घेरे के रूप में दिखाया गया है। (बी) सीएच 3 के लिए ईआरपी तरंगों के विस्तारित दृश्य। (ग) सीएच 10 के लिए ईआरपी तरंगों के विस्तारित दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसी तरह, दाएं हीन कोलिकुलस के पास के क्षेत्र के लघु चुंबकीय उत्तेजना (वी इन = 60 वीपीपी) के जवाब में ईईजी रिकॉर्डिंग के औसत तरंगों को चित्र 5 ए में समान उत्तेजनाओं के साथ 60 परीक्षणों के लिए दिखाया गया है। रिकॉर्डिंग चैनल मैपिंग का एक योजनाबद्ध चित्र 5 ए के बीच में भी प्रस्तुत किया गया है। क्योंकि उत्तेजना कुंडल सीएच 14 के क्षेत्र के पास स्थित था, उत्तेजना विरूपण साक्ष्य उस चैनल पर सबसे बड़ा था। हालांकि, उत्तेजना की शुरुआत के तुरंत बाद अधिकांश चैनलों के लिए अपेक्षाकृत बड़ी उत्तेजना कलाकृतियों को देखा गया, यह दर्शाता है कि चुंबकीय उत्तेजना ने सभी रिकॉर्डिंग साइटों को प्रभावित किया। चूंकि सीएच 5, 7, 10, और 12 से प्रतिक्रियाएं दोनों टेम्पोरल लोब में श्रवण कॉर्टेक्स के पास के क्षेत्रों से दर्ज की गई थीं, उत्तेजना कलाकृतियों को छोड़कर व्यक्तिगत ईईजी वेवफॉर्म पहले नकारात्मक थे और फिर चैनल की स्थिति (चित्रा 5 ए-सी) के आधार पर कुछ हद तक सकारात्मक थे। श्रवण क्षेत्रों के पास, चुंबकीय उत्तेजना द्वारा प्रेरित प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम ध्वनि उत्तेजना से प्रेरित लोगों से अलग थे। उदाहरण के लिए, Chs 3 और 10 के लिए, ध्वनि उत्तेजना की शुरुआत के तुरंत बाद प्रतिक्रियाएं नकारात्मक थीं, हालांकि चरम आयाम क्रमशः 58.8 ± 4.0 μV और 28.2 ± 2.0 μV थे। इसके अलावा, बढ़ती चुंबकीय उत्तेजना तीव्रता के साथ, सीएच 10 के लिए संचालित प्रतिक्रियाओं के चरम आयामों में वृद्धि हुई थी (चित्रा 5 डी), यह सुझाव देते हुए कि चुंबकीय उत्तेजना प्रभावित तंत्रिका प्रतिक्रियाओं को जन्म देती है।

Figure 5
चित्रा 5: माउस मस्तिष्क में 16 साइटों पर ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना (टीएमएस) संचालित घटना-संबंधी क्षमता (ईआरपी) तरंगें। (ए) एनेस्थेटाइज्ड माउस पर लागू टीएमएस (वी इन = 60 वीपीपी) के जवाब में 16-चैनल ईआरपी वेवफॉर्म सचित्र हैं। माउस मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध केंद्र में दिखाया गया है, और माउस मस्तिष्क की सतह पर 16 रिकॉर्डिंग साइटों (लाल घेरे) को चैनल संख्याओं द्वारा इंगित किया गया है। (बी) सीएच 3 के लिए ईआरपी तरंगों के विस्तारित दृश्य। (ग) सीएच 10 के लिए ईआरपी तरंगों के विस्तारित दृश्य। (डी) विभिन्न चुंबकीय तीव्रता (इनपुट वोल्टेज) द्वारा उत्पन्न सीएच 10 ईआरपी के आयामों के लिए सारांश। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कई तुलनाओं के लिए एक एनोवा का उपयोग किया जाता है, जिसके बाद एक पोस्ट-हॉक ट्यूकी-क्रेमर परीक्षण होता है। * और *** क्रमशः p < 0.05 और p < 0.001 का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक सत्र के लिए परीक्षण संख्या व्यक्तिगत जानवरों की प्रत्येक स्थिति के लिए 60 गुना है। आंकड़ों की गणना दो जानवरों से प्राप्त नमूनों के लिए की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस विधि को आसानी से एक जागृत छोटे जानवर तक भी बढ़ाया जा सकता है जो एक सामान्य एडाप्टर के माध्यम से टेथर्ड केबल से जुड़ा होता है और रिकॉर्डिंग के दौरान सिर पर टीएमएस डिवाइस के साथ तय किया जाता है (पूरक चित्र 1 और पूरक चित्रा 2)।

पूरक चित्र 1: माउस खोपड़ी से जुड़े उत्तेजना कुंडल का फिक्स्चर। (ए) एक जागृत माउस के लिए, माउस खोपड़ी से जुड़े फिक्स्चर के साथ तय एक उत्तेजना कुंडल दिखाया गया है। (बी) जागृत माउस की घटना-संबंधी क्षमता (ईआरपी) को एक एक्रिल बॉक्स में दर्ज किया गया था, जहां माउस बॉक्स के अंदर जा सकता था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 2: एक जागृत माउस के मस्तिष्क से 16 साइटों पर ध्वनि-चालित और ट्रांसक्रैनियल चुंबकीय उत्तेजना (टीएमएस) संचालित ईआरपी के तरंगें। (ए) ध्वनि उत्तेजना (8 किलोहर्ट्ज टोन-बर्स्ट, 80 डीबी एसपीएल) के जवाब में एक एक्रिल केस (पूरक चित्रा 1 बी) में एक जागृत माउस पर लागू किया जाता है, 16-चैनल ईआरपी तरंगों को चित्रित किया जाता है। माउस मस्तिष्क का योजनाबद्ध केंद्र में दिखाया गया है, और माउस मस्तिष्क की सतह पर 16 रिकॉर्डिंग साइटों (लाल घेरे) को चैनल संख्याओं द्वारा इंगित किया गया है। इस मामले में, 16 रिकॉर्डिंग चैनलों का उपयोग किया जाता है; अन्य 16 गैर-रिकॉर्डिंग चैनलों को हरे घेरे के रूप में दिखाया गया है। (बी) इसी तरह, एक ही जागृत माउस पर लागू टीएमएस (वीइन = 60 वीपीपी) के जवाब में 16-चैनल ईआरपी तरंगों को चित्रित किया गया है। माउस मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध केंद्र में दिखाया गया है, और माउस मस्तिष्क की सतह पर 16 रिकॉर्डिंग साइटों (लाल घेरे) को चैनल संख्याओं द्वारा इंगित किया गया है। उत्तेजना कुंडल सीएच 14 के क्षेत्र के पास स्थित है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: कॉइल निर्माण के लिए आवश्यक डोनट के आकार की डिस्क के लिए सीएडी डेटा फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह अध्ययन चूहों सहित छोटे जानवरों के लिए डिज़ाइन किए गए चुंबकीय उत्तेजना प्रणाली के साथ संयुक्त एक बहु-साइट ईईजी रिकॉर्डिंग सिस्टम को संबोधित करता है। निर्मित प्रणाली कम लागत वाली है और शारीरिक प्रयोगशालाओं में आसानी से निर्मित है, और उनके मौजूदा माप सेटअप का विस्तार कर सकती है। माउस रिकॉर्डिंग सिस्टम से डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया गहराई से सरल है यदि ऐसी प्रयोगशालाओं के पास मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के साथ पिछला अनुभव है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करने का एक लाभ एक व्यक्तिगत जानवर के सिर और खोपड़ी पर इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट की अच्छी प्रजनन क्षमता है। मस्तिष्क लक्ष्य साइटों को स्क्रू इलेक्ट्रोड असाइन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले लचीले सब्सट्रेट को मानक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करके आसानी से दोहराया जाता है, और वही सब्सट्रेट प्रत्येक जानवर की खोपड़ी से रिकॉर्डिंग साइटों को निर्धारित करने के लिए भी सुविधाजनक होते हैं। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड सरणी के आकार को विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को अनुकूलित करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है; अनुकूलित इलेक्ट्रोड व्यवस्था विशिष्ट प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए बेहतर रूप से बनाई जा सकती है। यदि प्रोटोकॉल में बताई गई विधि का पालन किया जाता है, तो पेंच इलेक्ट्रोड, कनेक्टर, केबल और सर्जिकल प्रक्रियाओं को आसानी से संशोधित किया जा सकता है और बड़ी संख्या में रिकॉर्डिंग साइटों के साथ माप प्रणाली तक बढ़ाया जा सकता है। इस रिकॉर्डिंग सिस्टम का दूसरा लाभ इसकी कम लागत है जब प्रयोगशालाएं मल्टीचैनल एम्पलीफायर से लैस होती हैं। वर्तमान रिकॉर्डिंग सिस्टम 32 इनपुट चैनलों और चार अलग-अलग केबलों से तंत्रिका संकेत प्राप्त कर सकता है। इसलिए, एक विस्तारित 32-चैनल रिकॉर्डिंग सिस्टम को अतिरिक्त केबल, स्क्रू इलेक्ट्रोड और संशोधित लचीले सब्सट्रेट की आवश्यकता होगी, और इस विस्तारित प्रणाली की लागत बहुत कम होगी।

हालांकि, इस पद्धति का एक दोष आरोपण के दौरान पेंच इलेक्ट्रोड की गहराई का सटीक नियंत्रण है। हालांकि, यह दोष हमेशा विशिष्ट स्क्रू ईईजी इलेक्ट्रोड के लिए मौजूद होता है, और कॉर्टिकल सतह के सापेक्ष स्क्रू प्रीमॉर्टम की सटीक गहराई अज्ञात है। इसके अलावा, इस प्रणाली में, ईईजी संकेतों की रिकॉर्डिंग गुणवत्ता और शोर स्तर को कम करने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु एपिड्यूरल परत के साथ उचित इलेक्ट्रोड संपर्क है। हम हमेशा प्रतिबाधा माप के माध्यम से सभी स्क्रू इलेक्ट्रोड के उचित इलेक्ट्रोड संपर्क की पुष्टि करते हैं। आमतौर पर, 1 kHz पर 5-10 kHz की प्रतिबाधा उचित एपिड्यूरल प्लेसमेंट का सुझाव देती है, और तंत्रिका संकेत माप से पहले प्रतिबाधा मूल्यों की पुष्टि की जानी चाहिए।

इसके अतिरिक्त, वर्तमान प्रोटोकॉल में, इलेक्ट्रोड आरोपण से पहले खोपड़ी पर दंत सीमेंट लगाया जाता है। दंत सीमेंट की उचित मात्रा ईईजी सिग्नल रिकॉर्डिंग की सफलता को प्रभावित कर सकती है। यही है, खोपड़ी पर दंत सीमेंट की एक पतली परत प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का समर्थन नहीं करती है या इलेक्ट्रोड की स्थिति को ठीक नहीं करती है, जबकि एक मोटी परत ड्यूरा पदार्थ से संपर्क करने के लिए इलेक्ट्रोड (ओं) की उचित स्थिति को रोकती है। परत की उचित मोटाई निर्धारित करने के लिए, हमने सफल ईईजी रिकॉर्डिंग के बाद डिजिटल कैलिपर का उपयोग करके दंत सीमेंट की मोटाई को मापा। एक उपयुक्त सीमेंट परत की औसत मोटाई 0.7 मिमी थी, यह सुझाव देते हुए कि दंत सीमेंट परत को 0.7 मिमी मोटाई और पेंच इलेक्ट्रोड के लिए छोटे छेद के साथ "खोपड़ी टोपी" के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

चुंबकीय उत्तेजना मस्तिष्क के न्यूनतम इनवेसिव या नॉनइनवेसिव न्यूरोस्टिम्यूलेशन के लिए मानव और पशु अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण है। एक कुंडल में धाराओं को तेजी से बदलने से कुंडल के चारों ओर एक चुंबकीय क्षेत्र बनता है और जब धाराएं जानवरों और मानव खोपड़ी से गुजरती हैं तो न्यूरॉन झिल्ली के हाइपरपोलराइजेशन या विध्रुवण का कारण बनता है। पशु मॉडल के लिए, कार्रवाई संभावित प्रतिक्रियाओं को सीधे विद्युत क्षेत्र परिवर्तन के सुप्राथ्रेशोल्ड परिमाण द्वारा प्रेरित किया जाता है, जबकि तंत्रिका झिल्ली में सबथ्रेशोल्ड परिवर्तन तंत्रिका आबादी10 की नेटवर्क गतिविधि को अनुकूलित करने के लिए उत्पन्न होते हैं। इस कुंडल को एक विद्युत क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए अनुकरण किया जाता है जो मस्तिष्क की सतह से 1.8 मिमी (खोपड़ी से 2.4 मिमी) की गहराई तक 10 वी / मीटर से अधिक है, जो एक विशिष्ट (जैसे, सी 57बीएल / 6 जे) माउस10 में कॉर्टिकल परत 5/6 या गहरे क्षेत्रों के अनुरूप है। ये मिलीमीटर आकार के कॉइल सुप्राथ्रेशोल्ड तंत्रिका गतिविधि को प्रेरित करने में सक्षम हैं और यहां तक कि पहले रिपोर्ट किए गए कॉइल11 द्वारा प्रेरित लोगों की तुलना में मस्तिष्क की सतह पर अधिक स्थानीय विद्युत क्षेत्र उत्पन्न कर सकते हैं। यद्यपि कथित ध्वनि, खोपड़ी कंपन और थर्मल प्रभाव सहित कई कारकों से युक्त अतिरिक्त प्रभावों को पूरी तरह से बाहर नहीं रखा जा सकता है, इन व्यक्तिगत प्रभावों का तंत्रिका गतिविधि पर थोड़ा प्रभाव पड़ा। इसके अलावा, एक चुंबकीय कोर के रूप में, हम पर्मलॉय का उपयोग करते हैं, जिसके चुंबकीय गुण आमतौर पर एनीलिंग प्रक्रिया की स्थितियों पर निर्भर करते हैं, जिसमें शीतलन दर, एनीलिंग तापमान और होल्डिंग टाइम12 शामिल हैं। हालांकि, इसकी एनीलिंग स्थितियों को नियंत्रित नहीं किया जा सका क्योंकि यह एक वाणिज्यिक पर्मलॉय था।

हाल ही में, मल्टी-साइट ईईजी रिकॉर्डिंग और टीएमएस से युक्त संयुक्त माप प्रणालियों का उपयोग चिकित्सा अध्ययनों में किया गया है, और उनके नैदानिक अनुप्रयोग 4,6 बढ़ रहे हैं। हमारा प्रस्तावित दृष्टिकोण मानव न्यूरोफिज़ियोलॉजी के छोटे पशु मॉडल (विशेष रूप से माउस मॉडल) में सुधार करेगा, जो पशु मॉडल की पेशकश करके मानव नैदानिक समकक्षों के लिए प्रयोगात्मक कृंतक मॉडल परिणामों का बहुत आसान अनुवाद प्रदान कर सकता है जो बेहतर समानांतर मानव प्रणालियों की पेशकश करते हैं। अंत में, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में बहु-साइट रिकॉर्डिंग तकनीकों का उपयोग करते हुए, संवेदी श्रवण हानि वाले जानवरों में संयुक्त चुंबकीय और औषधीय हस्तक्षेप विशिष्ट श्रवण विकार और टिनिटस उत्पन्न करने वाले तंत्र को प्रकट करने में मदद कर सकते हैं, जो हमारे भविष्य के शोध लक्ष्य हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को मुराटा साइंस फाउंडेशन, सुज़ुकेन मेमोरियल फाउंडेशन, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग में मापने वाली प्रौद्योगिकियों की उन्नति के लिए नाकातानी फाउंडेशन और खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (अनुदान संख्या 21 के 19755, जापान) और वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (अनुदान संख्या 23 एच 03416, जापान) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd FFD-101 The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks
ATROPINE SULFATE  0.5 mg NIPRO ES PHARMA CO., LTD. - Atropine sulfate
Bipolar amplifier NF Corp. KIT61380 For amplifying waveforms for coil input
Butorphanol Meiji Seika Pharma
Co., Ltd., Tokyo, Japan		 - For anathesis of animals
Commercial manufacturer of flexible 2D array p-ban.com Corp. - URL: https://www.p-ban.com/
Computer prograom to analyze output signals Natinal Instruments NI-DAQ and  NI-DAQmx Python To analyze output signals from the hall-effect sensor
Connector Harwin Inc. G125-FV12005L0P For connector to conect to the measuring system
Copper pad p-ban.com Corp. copper Copper pad on each substrate
Copper wire Kyowa Harmonet Ltd. P644432 The windings of the coil
DAQ board National Instruments Corp. USB-6343 For measuring the magnitic flux density of the coil
Dental cement SHOFU INC. Quick Resin Self-Curing Orthodontic Resin
ECoG electrode NeuroNexus Inc. HC32 For reference to design of the flexible 2D array
Epoxy resin Konishi Co. Ltd. #16123 For coil construction
Ethyl Carbamate FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 050-05821 For urethan anesthesia
Flat ribbon cable Oki Electric Cable Co., Ltd. FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem
flexible substrate p-ban.com Corp. polyimide Baseplate of flexible substrate
Function generator NF Corp. WF1947 For generating waveforms for coil input
Hall-effect sensor Honeywell International Inc. SS94A2D For measuring the magnitic flux density of the coil
IDC crimping tool Pro'sKit Industries Co. 6PK-214 To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool
Instant glue Konishi Co. Ltd. #04612 For coil construction
Insulation-displacement connector (IDC ) Uxcell Japan B07GDDG3XG 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch 
LCR meter NF Corp. ZM2376 For measuring the AC properties of the coil
Manipulator NARISHIGE Group. SM-15L For manipulating the coil
Medetomidine Kobayashi Kako, Fukui, Japan - For anathesis of animals
Midazolam Astellas Pharma, Tokyo, Japan - For anathesis of animals
Miniature screw KOFUSEIBYO Co., Ltd. S0.6*1.5 For EEG-senseing and reference electrode
Mouse Japan SLC, Inc. C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) Experimental animal
Permalloy-45 rod The Nilaco Corp. 780544 The core of the coil
Recording system Plexon Inc. OmniPlex For EEG data acquisition
Stainless wire Wakisangyo Co., Ltd. HW-136 For grasp by manipulator
Stereotaxic apparatus NARISHIGE Group. SR-5M-HT To fix a mouse head
Surface-mount connector Useconn Electronics Ltd. PH127-2x10MG For connector to mount on the flexible 2D array
Testing equipment (LCR meter) NF Corp. ZM2372 Contact check and impedance measurements
White PLA filament Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd PLA-F13 The material used for 3D-printing the donut-shaped disks
Xylocaine Jelly 2% Sandoz Pharma Co., Ltd. - lidocaine hydrochloride

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 195
<em>विवो में</em> माउस मस्तिष्क को ट्रांसक्रैनियल रूप से उत्तेजित करने के लिए मिलीमीटर आकार के कॉइल के साथ संयुक्त कम लागत वाली इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राफिक रिकॉर्डिंग सिस्टम
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Yoshikawa, T., Sato, H., Kawakatsu,… More

Yoshikawa, T., Sato, H., Kawakatsu, K., Tateno, T. Low-Cost Electroencephalographic Recording System Combined with a Millimeter-Sized Coil to Transcranially Stimulate the Mouse Brain In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e65302, doi:10.3791/65302 (2023).

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