Summary
in vivoでマウス脳の経頭蓋磁気刺激を駆動するために、ミリメートルサイズのコイルと組み合わせた低コストの脳波記録システムが提案されています。カスタムメイドの柔軟な多電極アレイ基板を備えた従来のスクリュー電極を使用して、経頭蓋磁気刺激に応答してマウス脳からマルチサイト記録を行うことができます。
Abstract
ここでは、ミリサイズのコイルを利用して、マウス脳の経頭蓋磁気刺激(TMS)を in vivoで 駆動するための低コストの脳波(EEG)記録システムが提案されています。従来のスクリュー電極とカスタムメイドの柔軟な多電極アレイ基板を組み合わせて、マウスの脳からマルチサイト記録を行うことができます。また、実験室でよく見かける低コストの装置でミリサイズのコイルを製造する方法についても説明します。また、低ノイズの脳波信号を生成するために必要な、フレキシブル多電極アレイ基板の実用的な製造手順とスクリュー電極の外科的移植技術も紹介します。この方法論はあらゆる小動物の脳からの記録に有用であるが、本報告では麻酔をかけたマウス頭蓋骨における電極の実装に焦点を当てている。さらに、この方法は、共通のアダプタ を介して テザーケーブルで接続され、記録中にTMS装置で頭部に固定される覚醒中の小動物に容易に拡張することができる。最大32個のEEGチャネル(16個のチャネルを有する装置がより少ないチャネルを有する例として提示される)および1つのTMSチャネル装置を含むことができるEEG−TMSシステムの本バージョンが説明される。さらに、EEG-TMSシステムを麻酔マウスに適用することによって得られた典型的な結果が簡単に報告されています。
Introduction
経頭蓋磁気刺激法(TMS)は、非侵襲性/低侵襲性のため、ヒトの脳科学、臨床応用、動物モデル研究に有望なツールです。TMSアプリケーションの初期段階では、ヒトおよび動物におけるシングルパルスおよびペアパルスTMSに応答する皮質効果の測定は、運動皮質に限定されていました。容易に測定可能な出力は、運動誘発電位および運動皮質1,2を含む誘導筋電位に限定されていた。TMS変調で測定できる脳領域を拡大するために、脳波記録(EEG)記録をシングルパルスTMSおよびペアパルスTMSと統合し、脳全体の領域の興奮性、接続性、および時空間ダイナミクスを直接調べる有用な方法として3,4,5。したがって、TMSと脳波記録(TMS-EEG)の脳への同時適用は、皮質内神経回路を調べるためにヒトおよび動物の様々な表在皮質脳領域を調査するために使用されてきた(Tremblayら6を参照)。さらに、TMS-EEGシステムを使用して、他の皮質領域への信号の伝播や振動活動の生成など、追加の皮質時空間特性を調べることができます7,8。
しかし、TMSの非侵襲性のために、脳におけるTMSの作用機序は推測のままであり、TMSの適用中に脳がどのように機能するかについての知識が制限されています。したがって、げっ歯類からヒトまでの動物を対象とした侵襲的なトランスレーショナル研究は、神経回路とその活動に対するTMSの影響のメカニズムを理解するために非常に重要です。特に、動物におけるTMS-EEG複合実験では、小動物用の同時刺激および測定システムが集中的に開発されていません。したがって、実験家は、特定の実験要件に応じて試行錯誤によってそのようなシステムを構築する必要があります。また、マウスモデルは、多くのトランスジェニックマウス系統や系統分離マウス系統が生物資源として利用可能であるため、他の in vivo 動物種モデルの中でも有用です。したがって、マウス用のTMS-EEG複合測定システムを構築するための便利な方法は、多くの神経科学研究者にとって望ましいでしょう。
本研究では、研究で用いられるトランスジェニック動物の主な種類であるマウス脳の同時刺激と記録に適用でき、一般的な神経科学研究室で容易に構築できるTMS-EEG併用法を提案します。まず、従来のスクリュー電極とフレキシブル基板を使用して、各実験で電極アレイ位置を再現性よく割り当てる低コストのEEG記録システムについて説明します。第二に、磁気刺激システムは、一般的な実験室で簡単にカスタムメイドできるミリメートルサイズのコイルを使用して構築されます。第三に、TMS-EEG複合システムは、音と磁気刺激に応答した神経活動を記録します。この研究で提示された方法は、小動物に特定の障害を引き起こすメカニズムを明らかにすることができ、動物モデルで得られた結果は、対応する人間の障害を理解するために翻訳することができます。
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Protocol
本研究では、すべての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従い、北海道大学動物実験委員会の承認を得て行った。C57BL/6Jマウス(雄2匹、雌3匹、8〜10週齢)を本研究に用いた。これはターミナルプロシージャです。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。
1.柔軟な2次元アレイの設計と構築
- 脳波記録電極および参照電極として使用するために、公称直径、ネック長、ヘッド直径0.6 mm、1.5 mm、および1.1 mmの構造特性を備えたミニチュアスクリュー電極(ステンレス、SUS XM7、 材料表を参照)を必要数用意します(図1A)。
注:本研究では、16個のミニチュアスクリュー電極を使用しました。 - 以下の手順に従って、フレキシブル基板上にプリント回路図の設計図を準備します。
- フレキシブル基板(全体サイズ、41.2 mm×19.9 mm、材料 表参照)上に2次元(2D)電極パッドパターンを作成し、ネジ電極を読み出します。2D電極配置を設計します。 図1B は、この研究で使用された特定の配置と、ベースラインポイントからの相対座標(原点[0、0]でマークされた十字)を示しています。
注:本研究では、側頭葉内の聴覚野の神経活動を記録するために、側頭葉から外側(水平)方向の電極配置は、吻側から尾側(垂直)方向の電極配置よりも長かった(図1B)。 - EEG記録電極の場合、フレキシブル基板上の各銅パッド( 材料表を参照)が、外径1.3 mm、内径0.8 mmのリング形状になっていることを確認します(図1C、左)。各ネジ電極が基板を通過するように、中央に小さな穴(直径0.8mm)を開けます。参照電極の場合、各銅パッドは一辺の長さが1.4 mmの正方形である必要があります。同様に、各ネジが基板上の正方形のパッドを通すように中央に小さな穴(直径0.8 mm)を作ります(図1C、右)。
- 次に、表面実装コネクタをはんだ付けし(図1D、左)、コネクタにつながる読み出しパッド(2Dアレイ)を設計します(図1D、右)。たとえば、2ピン×10ピンで、隣接するピン間に1.27mmピッチのコネクタを使用します(図1D、右)。
- 表面層と背面層の両方を使用して、線幅0.03 mm、線間隔0.03 mm( 図1Eの細い線)を使用して、ネジ電極パッドとコネクタパッドを配線します。
- さらに、リファレンス・チャンネルとグランド・チャンネルをアンプに接続するには、リファレンス電極とグランド電極用の電極パッドをフレキシブル2Dアレイの外側の絶縁部品に接続します( 図1Eの下部にある「G」と「HR」で示される2つの縦の長方形)。基準チャネルとグランドチャネルを決定したら、電極パッドを対応するコネクタにはんだ付けすることを忘れないでください(手順2.1を参照)。
- 保護層(ポリイミド層)で覆われていない露光部を適切に設計してください。表面層と背面層の両方でネジ電極パッドを露出させながら、表面層のコネクタパッドを露出させます。電極全体の設計、サイズ、および製造されたフレキシブル2Dアレイを図 1Eに示し、製造された基板の画像を 図1Fに示します。
- フレキシブル2Dアレイの上部電極部(ヘッド部)では、上から下の3層構造(総厚49.0μm)が、上部銅層(12.0μm厚)、中間層コアポリイミド層(25.0μm)、下部銅層(12.0μm)で構成されていることを確認します(図1G上)。
- 基板の上面および下面の銅層をエッチングするには、例えば、ウェットエッチングおよび標準作製技術9を使用する。
- フレキシブル2Dアレイの底部四角いパッド部(コネクタ部)は、上部銅層(厚さ12.0μm)、中間コアポリイミド層(25.0μm)、下部銅層(12.0μm)の3層で構成され、上下(いずれも12.5μm)の保護ポリイミド層で挟まれています。補強材として下から2mmのポリイミドボードを取り付けます(図1G、下)。
注:柔軟性を維持するために、補強ポリイミドボードは、ヘッドとコネクタ部分の間のフレキシブル2Dアレイのネック部分に取り付けられていません。 - 同様に、コネクタ部では、ウェットエッチングと標準的な製造技術を使用して、上部の銅および保護ポリイミド層をエッチングします。
メモ: 製造されたフレキシブルな 2D アレイデバイス(コネクタを含む)の総重量は 0.84 g です。柔軟な2Dアレイのレイアウトを設計した後、便宜上、商業メーカーの基板( 材料表を参照)が推奨される場合があります。
- フレキシブル基板(全体サイズ、41.2 mm×19.9 mm、材料 表参照)上に2次元(2D)電極パッドパターンを作成し、ネジ電極を読み出します。2D電極配置を設計します。 図1B は、この研究で使用された特定の配置と、ベースラインポイントからの相対座標(原点[0、0]でマークされた十字)を示しています。
図1:脳波(EEG)記録用のフレキシブル2次元(2D)アレイの構成部品と、このアレイを含む作製されたデバイス 。 (A)マウスの頭蓋骨に埋め込まれた小型スクリュー電極。(B)脳活動を測定するために設計された電極パッド(緑色の円)と基準チャネル(右下の四角形)。原点(0, 0)の基準点(十字マーク)からの電極パッドの相対座標が表示されます。ミリメートル単位のサイズは、括弧内に示されています。電極パッドの中心座標は、十字マークを通る垂直軸に対して対称である。(C)記録電極(左)と参照電極(右)用の電極パッドとドリル穴が図示されています。(D)フレキシブル2Dアレイに使用される表面実装コネクタ(2ピン×10ピン)(左)と、基板上に設計されたパッドのパターンとサイズ(右)。(E)各部品のサイズをミリメートル単位で設計しました。(F) Eの設計図で示した作製基板の画像。(G)フレキシブル2Dアレイの層構造(ヘッドおよびコネクタ部品)。スクリュー電極パッド(上)と読み出しパッド(下)の上面図と側面図が示されています。ヘッドとコネクタ部は、それぞれ3層構造(上)と6層構造(下)で構成されています。さらに、首の部分は5層構造で構成されています。上面と裏面に保護ポリイミド層が実装されており、ネック部には補強ポリイミドボードは実装されていません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. アダプターの構築とチャンネルマッピング
- 以下の手順でアダプターの施工を行います。
- フレキシブル基板上の2ピン×10ピンの表面実装コネクタ(図1D、左)と2Dアレイのコネクタパッド(図1D、右)( 材料表を参照)にはんだ付けフラックスを広げます。
- 2ピン×10ピンの表面実装コネクタをコネクタパッドにはんだ付けします。特に、2Dアレイの下部にある2つのパッドと、基準チャネルとグランドチャネルとして使用される2つのコネクタピンの間の接続を確認します(図2A)。
- 2つのパッドのそれぞれを個々のリード線に接続して、ベースライン信号を外部ポイント(たとえば、測定システムのグランドチャネルに接続されたグランドポイント。 図2A)。
注:ただし、この研究では、コネクタ部の正方形電極の代わりに、ネジ電極を備えた円形電極パッドの1つを参照電極として使用しました。 - はんだ付け後、露出した部分を保護し、短絡を防ぐために、エポキシ樹脂( 材料表を参照)を使用してはんだ付けポイントを覆います。
- コネクタケーブルとヘッドを固定します amp以下の手順に従ってリファイア。
- 2 × 10ピン、1.27 mmピッチの絶縁変位コネクタ(IDC)(図2B、左上)と、0.635 mmピッチのフラット20ピンリボンケーブル( 材料表を参照)を準備します(図2B、左下)。フラットリボンケーブルを必要な長さ(40cmなど)に切断します。
- IDC圧着工具を使用して、IDCとフラットリボンケーブルの一方の端を圧着します(図2B、右上)( 材料表を参照)。
- ケーブルのもう一方の端の各ラインをカッターを使用して先端端から約15mmまで離します。先端から3mmの断熱材を剥がします。
- 圧着したIDCをフラットリボンケーブルに接続し、フレキシブル基板にはんだ付けされた2×10ピンコネクタを接続します(図2C)。
- 記録電極とケーブルの分離ラインの対応関係を確認してください。使用する各回線によって誤った接続エラーが発生しないことを確認します。
- 各電極の出力に対応する個々のラインの露出銅線を、メインアンプを含む測定システムの20ピンコネクタ(1.25 mmピッチ)にはんだ付けします(図2B、右下)。
- はんだ付け後、試験装置(LCRメーターなど、 材料表を参照)を使用して、ネジ電極パッドとコネクタピン間の導通を確認します。
- はんだ付け箇所をエポキシ樹脂とシールドテープで覆い、損傷から保護し、他の信号線との接触を防ぎます。
- エポキシ樹脂を用い、フレキシブル基板上の2Dアレイのコネクタ部の裏面に細いステンレス棒(直径1.1-1.2mm、長さ100mm)を接着します。
注:このステンレス鋼棒は、実験中にマイクロマニピュレーターホルダーでつかむことができます(図2C)。 - 最後に、スクリュー電極と信号出力チャンネル間のマッピングを確認します(図2D)。
図2:フレキシブル基板上に2次元(2D)電極アレイ用のアダプターを構築し、チャネルマッピングを記録する。 (A)コネクタ部では、基準チャネルと接地チャネルがリード線で下部電極パッドに接続されています。基準チャンネルとグランドチャンネルが事前に決定されている場合は、設計段階でチャンネルを対応する下部電極パッドに接続する必要があります。このような場合、リード線をチャネルや電極パッドにはんだ付けする必要はありません。(B)フラットケーブル(左下)の一端に圧着して、測定アンプコネクタ(右上)をリンクします。使用するチャネルに対応するすべてのラインは、緑色のコネクタ(右下)にはんだ付けされています。この場合、ヘッドアンプに接続された各緑色のコネクタは8チャンネルの測定に割り当てられているため、16チャンネルの脳活動信号を記録するには少なくとも2つのコネクタが必要です。はんだ付け箇所はエポキシ樹脂とシールドテープで覆い、他の信号線との接触を防ぎます。(C)コネクタと作製したケーブルをフレキシブル2Dアレイ基板の表面に配置。細いステンレス鋼棒は、フレキシブル基板の裏側に取り付けられています。(D)マウス脳表面上の記録チャンネルの空間位置と、計測系における各ポイントのチャンネルマップを示す。この場合、ネジ電極(赤い丸)を備えた16の記録チャネルがありますが、可能な記録サイトの総数は32です。他の16の非記録チャネルも、脳表面に緑色の円として表示されます。マッピングプロットでは、「G」と「R」はそれぞれグランド電極と参照電極用に設計されたチャネルを示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.動物の手術
- 無菌手術環境を準備します。
- 動物が関与する実験手順全体を通して、ラテックス手袋などの保護具を着用してください。
- 定位固定装置と手術器具を滅菌します( 材料表を参照)。
- 手術器具を滅菌した後、滅菌生理食塩水を使用して洗浄します。
- 動物に麻酔をかけます。
- 手術前にマウスの体重を測定します。腹腔内注射を介して硫酸アトロピン(0.04 mg / kg;材料の表を参照)を投与します。.
- メデトミジン(0.3 mg / kg)、ミダゾラム(4.0 mg / kg)、およびブトルファノール(5.0 mg / kg)の混合物の腹腔内注射 を介して マウスに麻酔をかけます。.
- つま先をつまむ ことによる 反応のレベルによって麻酔の深さを確認します。
注:麻酔は約40分後に消えます。マウスがつま先のつまみに反応する場合は、腹腔内注射 を介して 同じ用量の麻酔薬混合物を投与します。.
- 電極移植手術の準備をします。
- 触覚を防ぐためにマウスのひげをカットします。
- 乾燥を防ぐために眼科用軟膏で両目を滑らかにします。まぶたを閉じて視覚を遮り、上下まぶたを補修テープで接着して閉鎖を維持します。
- 電動バリカンでマウスの頭の毛を剃ります。直腸に体温計を挿入し、加熱パッドを使用して体温を37°Cに維持します。
- 局所局所麻酔薬として塩酸リドカインをマウスの頭皮の切開部位に投与します。
- メスまたは外科用ハサミを用いてマウスの頭皮を吻側から尾側に切開する(面積サイズ:7×10mm2)。
- 切開した部分の近くの頭皮をピンセットでつまんで持ち上げます。メスまたは外科用ハサミを使用して頭蓋骨の目に見える膜を取り除きます。手術中に目の周りの血管を壊さないでください。
- 頭皮の切開線の両中心付近の皮膚を鉗子でつかみ、切開部を広げて頭蓋骨の上部を大きく露出させます。
- 外科用ハサミで頭蓋骨の表面とラムダ周辺の組織のすべての膜が完全に除去されていることを確認します。
- 頭蓋骨の表面を生理食塩水で濡らして、頭蓋骨の下の脳表面の視認性を高め、横洞を見つけます。
注意: ネジ電極を頭蓋骨に埋め込むときは、横洞の上や横洞に埋め込まないように注意してください。
4. 電極注入
- フレキシブル基板裏面の2D電極アレイに取り付けたステンレス棒をマイクロマニピュレーターに取り付けます。柔軟な基板を頭蓋骨に置きます。
- アレイ上のチャネル(Chs)3および14(図2D)の位置を、下コリキュラス内に収まるように調整します。
注:下丘は横洞に沿って位置しています。下丘の位置は、事前にマウス脳アトラスで確認することをお勧めします。 - 頭蓋骨のChs 3、8、9、および14(図2D)の位置に、ターゲットランドマークとして使用する永久マーカーを使用して小さな円を描きます。
- 頭蓋骨の表面を乾燥させて、歯科用セメントへの接着性を高め、フレキシブル基板上の2D電極アレイをマウスの頭蓋骨から電気的に分離します。
- 歯科用セメント(厚さ約1 mm、 材料表を参照)を頭蓋骨の表面に塗布します。歯科用セメントを塗布した後、硬化するまで約30分待ちます。
- 頭蓋骨の表面にある小さな円形のマークに従ってフレキシブル基板を揃えます。
- 歯科用ドリルの先端をフレキシブル基板の各電極パッドの穴に合わせます。各電極パッドの穴から頭蓋骨に注意深くドリルで穴を開けます。
- ミニチュアネジ専用のドライバーを使用して、頭蓋骨に開けられた穴に各ミニチュアスクリュー電極をねじ込みます。
- ネジ電極と電極パッドのヘッドをしっかりと圧着します。最後に、各スクリュー電極とコネクタ間のコンダクタンスを試験装置(LCRメーターなど)で測定し、電気伝導率を確認します。
5.小型コイルの設計と構造
- コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェア(材料表を参照)を使用して、中央に穴(内径:2 mm、外径:7 mm、厚さ:1 mm)のあるドーナツ型のディスク(補足コーディングファイル1を参照)を設計します。
- 3Dプリンターを使用して、非耐熱性材料(ポリ乳酸フィラメントなど)で作られた2枚のディスク(図3A、左)を印刷します。非耐熱材料は必ずしも必要ではありません(下記参照)。
- パーマロイ45ロッド(直径:2 mm、 材料表を参照)をトリミングして、短いシャフト(長さ:60 mm)を形成します。
- 2つの3Dプリントディスクの各穴にシャフトを挿入します(図3A、右)。一方のディスクをシャフトの端に配置し、もう一方のディスクを端から11 mm離して、2つのディスク間の距離を10 mmにします。ディスクを瞬間接着剤で接着します( 材料表を参照)。
- ディスクなしでシャフトの端をインパクトドライバーに取り付けます(図3B)。パーマロイ-45シャフトに小さな磁石を取り付けます。シャフトから5mmの磁石の近くにホール効果センサーを配置します。ホール効果センサをデータ集録(DAQ、 材料表を参照)システムに接続します。
- 巻数をカウントするには、DAQシステムを介してホール効果センサからの出力信号を分析するコンピュータプログラム( 材料表を参照)を準備します。
- 細い銅線(直径0.16mm)をシャフトに接続し、ワイヤーの上端に瞬間接着剤で接着します。
- インパクトドライバーを使用して、2つのディスク間で銅線を1,000回転巻きます。回転速度は任意ですが、通常は毎秒約5回転が使用されます。次に、巻き線に瞬間接着剤で接着します。
- 2 つのディスクをシャフトから取り外します。ディスクがシャフトに強く接着している場合は、ヒートガンを使用してディスクを溶かします。
- コイルをエポキシ樹脂で覆い、表面を絶縁して固定します。その後、巻き出された軸部を余分に切り取る。
- 得られたコイルの高さが10 mm、直径が6 mmであることを確認します(図3B、左)。コイルを操作するには、コイルホルダーを構築するか(図3C、右)、ステンレス鋼棒をコイルに接着します(ここには示されていません)。
- LCRメーターを使用してコイルの抵抗とインダクタンスを測定します( 材料表を参照)。たとえば、ここで使用したコイルの直流(DC)抵抗は18.3 Ωで、1 kHzの交流(AC)入力でのインダクタンスは7.9 mHでした。AC特性(抵抗とインダクタンス)を 図3Dに示します。
- 関数発生器を使用して、バイポーラ矩形波をコイルに印加します。入力電圧の標準振幅は、2Vのジェネレータ出力に続いて、10倍のゲインを持つバイポーラ電源を介して20Vです。結果として得られる波形は、約20Vの振幅(つまり、40Vのピークtoピーク電圧)のバイポーラ方形波です(図3E)。
- ホール効果センサとDAQシステムを使用して磁束密度を測定します。この場合、例えば、コイル底部がホール効果センサに接触したときのコイルの磁束密度(B)は113.6±2.5mT(SEM±平均値)であった(図3F)。
図3:磁気刺激用の小さなコイル。 (A)3次元(3D)プリントされたディスク(左)。2つの同一のディスクがパーマロイ-45シャフトに接着されています。1つはシャフトの端にあり、もう1つは10 mm離れています(右)。(B)コイルを巻くためのセットアップ。2つのディスクを備えた60 mmシャフトは、インパクトドライバーに取り付けられています。ホール効果センサーは、シャフトに取り付けられた小さな磁石の近くに配置されています。銅線は2つのディスクの間に巻かれています。(C)構築されたコイル。コイルは高さ10mm、直径6mmで、1,000巻の銅線があります。図の右側は、3Dプリントされたコイルホルダーによって操作されたコイルを示しています。(D)LCRメーターによって記録されたコイルのAC特性:(上)正弦波入力の周波数に対する抵抗。(下)インダクタンス対入力周波数標準的なコイルの抵抗とインダクタンスは、1kHzのAC入力でそれぞれ21.6mHと7.9mHです。(E)オシロスコープによって記録されるコイル入力として使用される二相方形波形。(F)磁束密度と構成コイルとホール効果センサの距離の関係。磁束密度は、5つの異なるホール効果センサーによって、各センサーに1つずつ記録されました。5つの測定値の平均がプロットされ、エラーバーは平均の標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
6.信号記録システムと手順
- フレキシブル2Dアレイをフラットリボンケーブルで記録システム( 材料表を参照)に接続します。
- コイルに取り付けられたステンレス鋼棒をマイクロマニピュレーターに取り付けます( 材料表を参照)。
- コイルをブレグマの上に置き、尾方向の位置を調整して、焦点を下コリキュラスの上に配置します。放射電界の焦点は、コイルの底面(すなわち、端から中心まで1mm)の巻線領域の正中線である。
- バイポーラ電源とファンクションジェネレータで構成される刺激システムを準備し( 材料表を参照)、コイルをシステムに接続します。
- 関数発生器の入力端子とDAQシステムの出力端子の間にケーブルを接続して、DAQシステムから関数発生器にトリガ信号を適用します。刺激を開始するためのトリガー信号用の適切なコンピュータプログラムを準備します。さらに、DAQシステムを記録システムに接続して、刺激時間をタイムスタンプとして保存します。
- 記録システムの集録プロセスを開始します。
注意: 録音システムがノイズを拾っている場合は、ノイズの原因を見つけて低減します。 - 刺激システムをトリガーして磁気刺激をテストします。
注意: 磁気刺激によって発生するノイズが測定範囲を飽和させる場合は、範囲を適切に調整してください。さらに、記録システムが刺激タイムスタンプを適切に保存することを確認します。 - 応答データの記録を開始し、刺激セッションを開始します。各刺激セッションが完了したら、記録を停止します。記録されたすべてのデータを後続の分析のために保存します。
注:たとえば、5つの異なる磁気強度ですべての実験条件を実行するには、すべてのセッションに必要な合計時間は約75分でした。エンドポイントは通常、すべての記録セッションが終了した後に決定されました。しかし、動物が咳、呼吸困難、あえぎなどの臨床的兆候を示したとき、実験セッションは直ちに終了しました。安楽死の場合、動物が麻酔下にある間、鋭くてきれいなハサミを使用して斬首が行われました。
7.データ分析
- カットオフ周波数が200Hzのローパスフィルタを使用して広帯域(生)信号をフィルタリングします。
- 各刺激タイムスタンプの前後の時間枠でフィルタリングされた波形を収集します。波形を平均して、事象関連電位(ERP)波形を求めます(図4 および 図5)。
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Representative Results
スクリュー電極と組み合わせたフレキシブル基板を使用して麻酔したC57BL / 6Jマウスで記録されたサンプルEEGデータを以下に示します。
典型的な例として、同一の刺激を用いた60回の試行について、音刺激(8kHzトーンバースト、80dB音圧レベル[SPL])に応答して生成される平均EEG波形が示されています(図4A)。記録チャンネルマッピングの概略図も 図4Aの中央に示されています。Chs 5、7、10、および12からの応答は、両方の側頭葉の聴覚皮質近くの領域から記録されます。聴覚領域(下丘および聴覚皮質)の周囲に位置するチャネルの個々のEEG波形では、刺激アーチファクトを除いた応答は、音刺激開始直後に最初に否定的であった(例えば、Chs 3および10)。ピーク振幅はそれぞれ45.6 ± 4.0 μVと25.6 ± 1.5 μVでした。その後、応答はベースラインをある程度上回り(図4B、C)、減衰しながら振動しました。対照的に、他のチャネルからの応答は刺激の開始とほぼ無関係でしたが、一部のチャネル波形は同様の応答を示しました。
図4:マウス脳の16部位における音事象関連電位(ERP)波形 。 (A)麻酔をかけたマウスに印加した音(8kHzトーンバースト、80dBSPL)刺激に応答して、16チャンネルのERP波形を図示した。中央にマウス脳の模式図を示し、マウス脳表面上の16の記録部位(赤丸)をチャンネル番号で示しています。この場合、16の記録チャネルが使用されます。他の 16 個の非録画チャンネルは緑色の円で表示されます。(B) 第3章のERP波形の拡大図。(C) Ch 10のERP波形の拡大図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
同様に、右下丘付近の領域の短い磁気刺激(V in = 60 Vpp)に応答したEEG記録の平均波形を、同一の刺激を用いた60回の試行について図5Aに示す。記録チャネルマッピングの概略図も図5Aの中央に示されています。刺激コイルはCh 14の領域の近くに位置していたため、刺激アーチファクトはそのチャネルで最大でした。しかし、刺激開始直後のほとんどのチャネルで比較的大きな刺激アーチファクトが観察され、磁気刺激がすべての記録部位に影響を与えたことを示しています。Chs 5, 7, 10, 12の応答は両側頭葉の聴覚皮質近傍から記録されたため,刺激アーチファクトを除いた個々の脳波波形は,チャネル位置に応じて,まず負方向,次にある程度正方向であった(図5A-C)。聴覚領域付近では,磁気刺激による応答時間経過と音刺激による応答時間経過が異なっていた。例えば、Chs 3と10では、ピーク振幅はそれぞれ58.8 ± 4.0 μVと28.2 ± 2.0 μVでしたが、応答は否定的でした。さらに、磁気刺激強度の増加に伴い、Ch 10の駆動応答のピーク振幅が増加し(図5D)、磁気刺激が誘発神経応答に影響を与えたことが示唆されました。
図5:マウス脳の16部位における経頭蓋磁気刺激(TMS)駆動事象関連電位(ERP)波形。 (A)麻酔をかけたマウスに適用したTMS(V in = 60 Vpp)に応答した16チャンネルERP波形を図示する。中央にマウス脳の模式図を示し、マウス脳表面の16の記録部位(赤丸)をチャンネル番号で示しています。(B) 第3章のERP波形の拡大図。(C) Ch 10のERP波形の拡大図。(D)異なる磁気強度(入力電圧)によって誘発されるCh.10ERPの振幅の要約。統計分析には、多重比較のANOVAとそれに続く事後テューキー-クレイマー検定が使用されます。* および *** は、それぞれ p < 0.05 および p < 0.001 を表す。セッションの試行回数は、個々の動物の状態ごとに60回です。統計は、2匹の動物から得られたサンプルについて計算されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この方法は、共通のアダプターを介してテザーケーブルで接続され、記録中にTMSデバイスで頭部に固定されている覚醒中の小動物にも簡単に拡張できます(補足図1および補足図2)。
補足図1:マウスの頭蓋骨に取り付けられた刺激コイルの固定具。 (A)覚醒中のマウスの場合、マウスの頭蓋骨に取り付けられた固定具で固定された刺激コイルが示されています。(B)覚醒中のマウスの事象関連電位(ERP)は、マウスが箱の中を移動できるアクリルの箱に記録されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:覚醒マウスの脳からの16部位における音駆動および経頭蓋磁気刺激(TMS)駆動ERPの波形。 (A)アクリルケースで覚醒マウスに加えた音刺激(8kHzトーンバースト、80dBSPL)に応答して(補足図1B)、16チャンネルのERP波形を示します。中央にマウス脳の模式図を示し、マウス脳表面の16の記録部位(赤丸)をチャンネル番号で示しています。この場合、16の記録チャネルが使用されます。他の 16 個の非録音チャンネルは緑色の円で表示されます。(b)同様に、同じ覚醒マウスに適用されたTMS(Vin=60Vpp)に応答した16チャンネルERP波形が図示されている。中央にマウス脳の模式図を示し、マウス脳表面の16の記録部位(赤丸)をチャンネル番号で示しています。刺激コイルはCh 14の領域の近くにあります。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:コイル構造に必要なドーナツ型ディスクのCADデータファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究は、マウスを含む小動物用に設計された磁気刺激システムと組み合わせたマルチサイトEEG記録システムに取り組んでいます。構築されたシステムは低コストで、生理学的実験室で簡単に構築でき、既存の測定セットアップを拡張できます。マウス記録システムからデータを取得するために必要な外科的手順は、そのような実験室が標準的な電気生理学的実験の経験がある場合、非常に簡単です。
このアプローチを使用する利点の1つは、個々の動物の頭と頭皮への電極配置の再現性が高いことです。スクリュー電極を脳の標的部位に割り当てるために使用される柔軟な基板は、標準的な微細加工技術を使用して簡単に複製でき、同じ基板は、各動物の頭皮から記録部位を決定するのにも便利です。さらに、電極アレイの形状は、さまざまな実験ニーズを最適化するために簡単に変更できます。カスタマイズされた電極配置は、特定の実験目的のために最適に作成できます。プロトコルに記載されている方法に従えば、ネジ電極、コネクタ、ケーブル、および外科的処置を簡単に変更し、より多くの記録部位を持つ測定システムに拡張することができます。この記録システムの2番目の利点は、ラボにマルチチャンネルアンプが装備されている場合の低コストです。現在の記録システムは、32の入力チャネルと最大4本の別々のケーブルから神経信号を得ることができます。したがって、拡張された32チャンネル記録システムは、追加のケーブル、スクリュー電極、および変更されたフレキシブル基板を必要とし、この拡張システムは非常に低コストになります。
しかしながら、この方法論の1つの欠点は、注入中のスクリュー電極の深さの正確な制御である。しかしながら、この欠点は典型的なスクリューEEG電極に常に存在し、皮質表面に対するスクリュー生前の正確な深さは不明である。さらに、このシステムでは、脳波信号の品質を記録し、ノイズレベルを低減するための別の重要なポイントは、硬膜外層との適切な電極接触です。すべてのねじ電極の適切な電極接触をインピーダンス測定により常に確認しています。通常、1kHzで5〜10kΩのインピーダンスは、適切な硬膜外配置を示唆しており、神経信号測定の前にインピーダンス値を確認する必要があります。
さらに、現在のプロトコルでは、電極移植前に歯科用セメントが頭蓋骨に塗布されます。適切な量の歯科用セメントは、EEG信号記録の成功に影響を与える可能性があります。つまり、頭蓋骨上の歯科用セメントの薄い層は、移植された電極を支えたり、電極の位置を固定したりしませんが、厚い層は、硬膜物質に接触するための電極の適切な配置を妨げます。層の適切な厚さを決定するために、脳波記録が成功した後、デジタルノギスを使用して歯科用セメントの厚さを測定しました。適切なセメント層の平均厚さは0.7 mmであり、歯科用セメント層は、厚さ0.7 mmでネジ電極用の小さな穴を備えた「頭蓋骨キャップ」に置き換えることができることが示唆されました。
磁気刺激は、脳の低侵襲または非侵襲的神経刺激のためのヒトおよび動物の研究において有用なツールである。コイル内の電流を急速に変化させると、コイルの周りに磁場が発生し、電流が動物や人間の頭蓋骨を通過するときにニューロン膜の過分極または脱分極を引き起こします。動物モデルの場合、活動電位応答は電場変化の閾値を超える大きさによって直接発火しますが、神経膜の閾値以下の変化は、神経集団のネットワーク活動を同調させるために生成されます10。このコイルは、典型的な(例えば、C57BL/6J)マウス10の皮質層の5/6またはより深い領域に対応する、脳の表面から1.8mmの深さ(頭蓋骨から2.4mm)の10V/mを超える電界を生成するようにシミュレートされる。これらのミリメートルサイズのコイルは、閾値を超える神経活動を誘導することができ、以前に報告されたコイルによって誘発されたものと比較して、脳の表面により局在化した電場を生成することさえできます11。知覚される音、頭蓋骨の振動、熱効果など、いくつかの要因からなる追加効果を完全に排除することはできませんが、これらの個々の効果は神経活動にほとんど影響を与えませんでした。さらに、磁気コアとして、その磁気特性は通常、冷却速度、焼鈍温度、保持時間12などの焼鈍プロセスの条件に依存するパーマロイを使用しています。しかし、その焼鈍条件は市販のパーマロイであるため制御できませんでした。
近年、マルチサイト脳波記録とTMSを組み合わせた測定システムが医学研究に使用され、その臨床応用が増加しています4,6。我々の提案するアプローチは、ヒトの神経生理学の小動物モデル(特にマウスモデル)を改善し、ヒトのシステムをよりよく平行する動物モデルを提供することにより、実験的なげっ歯類モデルの結果をヒトの臨床対応物にはるかに容易に変換することができる。最後に、遺伝子改変マウスのマルチサイト記録技術を用いて、感覚難聴の動物に磁気的介入と薬理学的介入を組み合わせることで、今後の研究対象である特定の聴覚障害や耳鳴りを引き起こすメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究は、村田科学振興財団、スズケン記念財団、中谷医工学計測技術振興財団、T.萌芽研究(課題番号21K19755)および基盤研究(B)(課題番号23H03416)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | FFD-101 | The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| ATROPINE SULFATE 0.5 mg | NIPRO ES PHARMA CO., LTD. | - | Atropine sulfate |
| Bipolar amplifier | NF Corp. | KIT61380 | For amplifying waveforms for coil input |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan |
- | For anathesis of animals |
| Commercial manufacturer of flexible 2D array | p-ban.com Corp. | - | URL: https://www.p-ban.com/ |
| Computer prograom to analyze output signals | Natinal Instruments | NI-DAQ and NI-DAQmx Python | To analyze output signals from the hall-effect sensor |
| Connector | Harwin Inc. | G125-FV12005L0P | For connector to conect to the measuring system |
| Copper pad | p-ban.com Corp. | copper | Copper pad on each substrate |
| Copper wire | Kyowa Harmonet Ltd. | P644432 | The windings of the coil |
| DAQ board | National Instruments Corp. | USB-6343 | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| Dental cement | SHOFU INC. | Quick Resin | Self-Curing Orthodontic Resin |
| ECoG electrode | NeuroNexus Inc. | HC32 | For reference to design of the flexible 2D array |
| Epoxy resin | Konishi Co. Ltd. | #16123 | For coil construction |
| Ethyl Carbamate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 050-05821 | For urethan anesthesia |
| Flat ribbon cable | Oki Electric Cable Co., Ltd. | FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m | For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem |
| flexible substrate | p-ban.com Corp. | polyimide | Baseplate of flexible substrate |
| Function generator | NF Corp. | WF1947 | For generating waveforms for coil input |
| Hall-effect sensor | Honeywell International Inc. | SS94A2D | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| IDC crimping tool | Pro'sKit Industries Co. | 6PK-214 | To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool |
| Instant glue | Konishi Co. Ltd. | #04612 | For coil construction |
| Insulation-displacement connector (IDC ) | Uxcell Japan | B07GDDG3XG | 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch |
| LCR meter | NF Corp. | ZM2376 | For measuring the AC properties of the coil |
| Manipulator | NARISHIGE Group. | SM-15L | For manipulating the coil |
| Medetomidine | Kobayashi Kako, Fukui, Japan | - | For anathesis of animals |
| Midazolam | Astellas Pharma, Tokyo, Japan | - | For anathesis of animals |
| Miniature screw | KOFUSEIBYO Co., Ltd. | S0.6*1.5 | For EEG-senseing and reference electrode |
| Mouse | Japan SLC, Inc. | C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) | Experimental animal |
| Permalloy-45 rod | The Nilaco Corp. | 780544 | The core of the coil |
| Recording system | Plexon Inc. | OmniPlex | For EEG data acquisition |
| Stainless wire | Wakisangyo Co., Ltd. | HW-136 | For grasp by manipulator |
| Stereotaxic apparatus | NARISHIGE Group. | SR-5M-HT | To fix a mouse head |
| Surface-mount connector | Useconn Electronics Ltd. | PH127-2x10MG | For connector to mount on the flexible 2D array |
| Testing equipment (LCR meter) | NF Corp. | ZM2372 | Contact check and impedance measurements |
| White PLA filament | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | PLA-F13 | The material used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| Xylocaine Jelly 2% | Sandoz Pharma Co., Ltd. | - | lidocaine hydrochloride |
References
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