Summary
Et billig elektroencefalografisk opptakssystem kombinert med en millimeterstor spole foreslås for å drive transkraniell magnetisk stimulering av musehjernen in vivo. Ved hjelp av konvensjonelle skrueelektroder med et skreddersydd, fleksibelt, multielektrode array-substrat, kan multi-site opptak utføres fra musehjernen som respons på transkraniell magnetisk stimulering.
Abstract
Et billig elektroencefalografisk (EEG) opptakssystem foreslås her for å drive transkraniell magnetisk stimulering (TMS) av musehjernen in vivo, ved hjelp av en millimeterstor spole. Ved hjelp av konvensjonelle skrueelektroder kombinert med et spesiallaget, fleksibelt, multielektrode array-substrat, kan multi-site opptak utføres fra musehjernen. I tillegg forklarer vi hvordan en millimeterstor spole produseres ved hjelp av billig utstyr som vanligvis finnes i laboratorier. Praktiske prosedyrer for fremstilling av det fleksible multielektrode-array-substratet og den kirurgiske implantasjonsteknikken for skrueelektroder blir også presentert, som er nødvendige for å produsere støysvake EEG-signaler. Selv om metodikken er nyttig for opptak fra hjernen til ethvert lite dyr, fokuserer denne rapporten på elektrodeimplementering i en bedøvet museskalle. Videre kan denne metoden enkelt utvides til et våkent lite dyr som er koblet til bundet kabler via en vanlig adapter og festet med en TMS-enhet til hodet under opptak. Den nåværende versjonen av EEG-TMS-systemet, som kan inkludere maksimalt 32 EEG-kanaler (en enhet med 16 kanaler presenteres som et eksempel med færre kanaler) og en TMS-kanalenhet, er beskrevet. I tillegg rapporteres typiske resultater oppnådd ved anvendelse av EEG-TMS-systemet på bedøvede mus.
Introduction
Transcranial magnetisk stimulering (TMS) er et lovende verktøy for menneskelig hjernevitenskap, klinisk anvendelse og dyremodellforskning på grunn av sin ikke-/ lave invasivitet. I det tidlige stadiet av TMS-applikasjoner var måling av den kortikale effekten som respons på enkelt- og parpuls TMS hos mennesker og dyr begrenset til motorbarken; Lett målbar output var begrenset til motoriske fremkalte potensialer og induserte myoelektriske potensialer som involverte den motoriske cortex 1,2. For å utvide hjernegruppene som kan måles ved TMS-modulasjon, ble elektroencefalografisk (EEG) opptak integrert med enkelt- og parpuls TMS som en nyttig metode for direkte å undersøke eksitabilitet, tilkobling og spatiotemporal dynamikk av områder gjennom hele hjernen 3,4,5. Dermed har samtidig anvendelse av TMS og EEG-opptak (TMS-EEG) til hjernen blitt brukt til å undersøke ulike overfladiske kortikale hjerneområder hos mennesker og dyr for å undersøke intrakortikale nevrale kretser (se Tremblay et al.6). Videre kan TMS-EEG-systemer brukes til å undersøke ytterligere kortikale spatiotemporale egenskaper, inkludert forplantning av signaler til andre kortikale områder og generering av oscillatorisk aktivitet 7,8.
Imidlertid forblir virkningsmekanismen for TMS i hjernen spekulativ på grunn av den ikke-invasive effekten av TMS, noe som begrenser vår kunnskap om hvordan hjernen fungerer under TMS-applikasjoner. Derfor er invasive translasjonsstudier hos dyr som spenner fra gnagere til mennesker av avgjørende betydning for å forstå mekanismen for effekten av TMS på nevrale kretser og deres aktivitet. Spesielt for kombinerte TMS-EEG-eksperimenter på dyr er det ikke utviklet et samtidig stimulerings- og målesystem for små dyr. Derfor er eksperimentalister pålagt å konstruere et slikt system ved prøving og feiling i henhold til deres spesifikke eksperimentelle krav. I tillegg er musemodeller nyttige blant andre in vivo dyreartsmodeller fordi mange transgene og stammeisolerte musestammer er tilgjengelige som biologiske ressurser. Dermed vil en praktisk metode for å bygge et TMS-EEG-kombinert målesystem for mus være ønskelig for mange nevrovitenskapsforskere.
Denne studien foreslår en TMS-EEG-kombinert metode som kan brukes til samtidig stimulering og registrering av musehjernen, som er den viktigste typen transgene dyr som brukes i forskning, og som lett kan konstrueres i typiske nevrovitenskapslaboratorier. Først beskrives et billig EEG-opptakssystem ved hjelp av konvensjonelle skrueelektroder og et fleksibelt substrat for reproduserbart å tildele en elektrode-array-posisjon i hvert eksperiment. For det andre konstrueres et magnetisk stimuleringssystem ved hjelp av en millimeterstor spole, som lett kan skreddersys i typiske laboratorier. For det tredje registrerer TMS-EEG-kombinert system nevral aktivitet som respons på lyd og magnetisk stimulering. Metoden som presenteres i denne studien kan avsløre mekanismene som genererer spesifikke lidelser hos små dyr, og resultatene oppnådd i dyremodellene kan oversettes for å forstå de tilsvarende menneskelige lidelsene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne studien ble alle dyreforsøk utført etter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals og med godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee of Hokkaido University. C57BL/6J-mus, to hannmus og tre hunner, 8 til 10 uker gamle, ble brukt i denne studien. Dette er en terminal prosedyre. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se materialtabell).
1. Fleksibel todimensjonal array-design og konstruksjon
- Forbered det nødvendige antall miniatyrskrueelektroder (rustfritt, SUS XM7; se materialfortegnelse) med følgende strukturelle egenskaper for bruk som EEG-opptaks- og referanseelektroder: nominell diameter, halslengde og hodediameter på henholdsvis 0,6 mm, 1,5 mm og 1,1 mm (figur 1A).
MERK: I denne studien ble 16 miniatyrskrueelektroder brukt. - Forbered en blåkopi av et trykt kretsdiagram på et fleksibelt underlag ved å følge trinnene nedenfor.
- Lag et todimensjonalt (2D) elektrodeputemønster på et fleksibelt underlag (hele størrelsen, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialfortegnelse) for skrueelektrodene som skal leses ut. Design 2D-elektrodearrangementet. Figur 1B viser de spesifikke arrangementene som ble brukt i denne studien og de relative koordinatene fra et utgangspunkt (kryssmerket ved origo [0, 0]).
MERK: I denne studien, for å registrere nevral aktivitet i hørselsbarken i tinninglappene, var elektrodeplasseringen i lateral til medial (horisontal) retning lengre enn i rostral-til-kaudal (vertikal) retning (figur 1B). - Sørg for at for EEG-opptakselektrodene har hver kobberpute (se materialfortegnelse) på det fleksible substratet en ringform med en ytre diameter på 1,3 mm og en indre diameter på 0,8 mm (figur 1C, venstre). Lag et lite hull (0,8 mm diameter) i midten for hver skrueelektrode som skal passere gjennom underlaget. For referanseelektrodene skal hver kobberpute ha en firkantet form med en sidelengde på 1,4 mm; På samme måte lager du et lite hull (0,8 mm diameter) i midten for hver skrue som skal passere gjennom den firkantede puten på underlaget (figur 1C, høyre).
- Hvis du deretter vil lodde en overflatemontert kontakt (figur 1D, venstre), designer du avlesningsputer (2D-matrise) som fører til kontakten (figur 1D, høyre). Bruk for eksempel en kontakt med 2 × 10 pinner og 1,27 mm avstand mellom tilstøtende pinner (figur 1D, høyre).
- Koble skrueelektrodeputene og koblingsklossene med både overflate- og baklaget med en linjebredde på 0,03 mm og linjeintervall på 0,03 mm (tynne linjer i figur 1E).
- Videre, for å koble referanse- og jordkanalene til forsterkeren, kobler du elektrodeputene for referanse- og jordelektrodene til den isolerte delen på utsiden av den fleksible 2D-matrisen (to vertikale rektangler indikert med "G" og "HR" nederst i figur 1E). Etter å ha bestemt referanse- og jordkanaler, husk å lodde elektrodeputene til de tilsvarende kontaktene (se trinn 2.1).
- Riktig utforming av et eksponert område som ikke er dekket med et beskyttelseslag (polyimidlag). Utsett koblingsklossene i overflatelaget mens du eksponerer skrueelektrodeputene i både overflate- og baklagene. Hele elektrodedesignet, størrelsene og den fabrikkerte fleksible 2D-matrisen er illustrert i figur 1E, og bildet av et fabrikkert substrat er vist i figur 1F.
- I den øverste elektrodedelen (hodedelen) av den fleksible 2D-matrisen, sørg for at den trelags strukturen fra topp til bunn består av følgende (total tykkelse på 49,0 μm): et topp kobberlag (12,0 μm tykkelse), et mellomlag av kjernepolyimid (25,0 μm) og et bunnkobberlag (12,0 μm) (figur 1G, øverst).
- Ets kobberlagene på underlagets øverste og nederste overflate, for eksempel ved hjelp av våtetsing og standard fabrikasjonsteknikk9.
- I den nederste firkantede putedelen (koblingsdelen) av den fleksible 2D-matrisen, sørg for at den sekslags strukturen består av tre lag, inkludert et topp kobberlag (12,0 μm tykkelse), et mellomkjernepolyimidlag (25,0 μm) og et bunnkobberlag (12,0 μm), som er sandwichet av beskyttende polyimidlag, inkludert topp og bunn (begge 12,5 μm) lag. Fest en 2 mm polyimidplate fra bunnen som forsterkende materiale (figur 1G, nederst).
MERK: For å opprettholde fleksibiliteten er ikke det forsterkende polyimidkortet montert på nakkedelen av det fleksible 2D-arrayet mellom hodet og kontaktdelen. - På samme måte, i kontaktdelen, ets kobber- og beskyttende polyimidlagene på toppen ved hjelp av våtetsing og standard fabrikasjonsteknikk.
MERK: Den totale vekten til den fabrikkerte, fleksible 2D-array-enheten, inkludert kontakten, er 0,84 g. Etter å ha designet et oppsett for en fleksibel 2D-matrise, anbefales underlagene fra en kommersiell produsent (se Materialfortegnelse) noen ganger for enkelhets skyld.
- Lag et todimensjonalt (2D) elektrodeputemønster på et fleksibelt underlag (hele størrelsen, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialfortegnelse) for skrueelektrodene som skal leses ut. Design 2D-elektrodearrangementet. Figur 1B viser de spesifikke arrangementene som ble brukt i denne studien og de relative koordinatene fra et utgangspunkt (kryssmerket ved origo [0, 0]).
Figur 1: Komponentdeler i den fleksible todimensjonale (2D) matrisen for elektroencefalografisk (EEG) opptak og den fabrikkerte enheten inkludert matrisen. (A) Miniatyrskrueelektroden som er innebygd i museskallen. (B) De designede elektrodeputene for måling av hjerneaktivitet (grønne sirkler) og referansekanalen (firkantet nederst til høyre). De relative koordinatene til elektrodeputene fra et referansepunkt (kryssmerke) ved opprinnelsen (0, 0) vises; Størrelsen i millimeter er illustrert i parentes. Senterkoordinatene til elektrodeputene er symmetriske i forhold til den vertikale aksen som passerer gjennom kryssmerket. (C) Elektrodeputene og borehullene for en opptakselektrode (venstre) og en referanseelektrode (høyre) er illustrert. (D) En overflatemontert kontakt (2 × 10 pinner) som brukes til den fleksible 2D-matrisen (venstre) og mønsteret og størrelsen på de designede putene på underlaget (høyre). (E) Designet tegning med størrelsen på hver del i millimeter. (F) Bilde av et fabrikkert substrat angitt med tegningen i E. (G) Lagstrukturen til den fleksible 2D-matrisen (hode- og kontaktdeler). Topp- og sidevisningen av skrueelektrodeputene (øverst) og avlesningsputene (nederst) er illustrert. Hodet og kontaktdelene består av henholdsvis en trelags struktur (øverst) og en sekslags struktur (nederst). I tillegg består nakkedelen av en femlags struktur; Et beskyttende polyimidlag er montert på toppen og baksiden, og det forsterkende polyimidplaten er ikke montert på nakkedelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Adapterkonstruksjon og kanalkartlegging
- Utfør adapterkonstruksjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Spre loddefluxen på 2 × 10-pinnen, den overflatemonterte kontakten (figur 1D, venstre) og koblingsputene til 2D-matrisen (figur 1D, høyre) (se materialfortegnelsen) på det fleksible underlaget.
- Lodd den overflatemonterte kontakten på 2 × 10 pinner til koblingsklossene. Bekreft spesielt tilkoblingen mellom de to putene på den nedre delen av 2D-matrisen og de to kontaktpinnene som brukes som referanse- og jordkanaler (figur 2A).
- Koble hver av de to putene til individuelle ledninger for å mate grunnlinjesignaler til et eksternt punkt (f.eks. et jordpunkt koblet til målesystemets bakkekanal; Figur 2A).
MERK: I denne studien ble imidlertid en av de sirkulære elektrodeputene med skrueelektroder brukt som referanseelektrode i stedet for en firkantet elektrode i kontaktdelen. - Etter lodding, dekk loddepunktene med epoksyharpiks (se materialfortegnelse) for å beskytte de eksponerte punktene og forhindre kortslutning.
- Fest kontaktkabelen og hodeforsterkeren ved å følge trinnene nedenfor.
- Klargjør en isolasjonsfortrengningskontakt (IDC) med 2 × 10 pinner og en 1,27 mm dybde (figur 2B, øverst til venstre) og en flat båndkabel på 20 pinners (se Materialfortegnelse) med 0,635 mm stigning (figur 2B, nederst til venstre). Klipp den flate båndkabelen til ønsket lengde (f.eks. 40 cm).
- Krymp IDC-en og den ene enden av den flate båndkabelen ved hjelp av et IDC-krympeverktøy (figur 2B, øverst til høyre) (se Materialfortegnelse).
- Separer hver linje i den andre enden av kabelen opptil ca. 15 mm fra spissenden ved hjelp av en kutter. Strip isolasjonen 3 mm fra spissenden.
- Koble den krympede IDC-en til den flate båndkabelen og den 2 × 10-pinners kontakten loddet til det fleksible underlaget (figur 2C).
- Bekreft korrespondansen mellom opptakselektroden og den separerte linjen på kabelen. Kontroller at hver linje som brukes, ikke gir feil tilkoblingsfeil.
- Lodd de eksponerte kobbertrådene til de enkelte linjene som tilsvarer utgangen fra hver elektrode til målesystemets 20-pinners kontakt (1,25 mm stigning), inkludert hovedforsterkeren (figur 2B, nederst til høyre).
- Etter lodding, bekreft ledningen mellom skrueelektrodeputene og koblingspinnene ved hjelp av et testutstyr (f.eks. en LCR-måler, se materialfortegnelse).
- Dekk loddepunktene med epoksyharpiks og skjermtape for å beskytte dem mot skade og forhindre kontakt med andre signallinjer.
- Bruk epoksyharpiks til å feste en tynn stang i rustfritt stål (diameter: 1,1-1,2 mm; lengde: 100 mm) på baksiden av kontaktdelen av 2D-arrayet på det fleksible underlaget.
MERK: Denne stangen i rustfritt stål kan gripes av en mikromanipulatorholder under eksperimenter (figur 2C). - Til slutt bekrefter du kartleggingen mellom skrueelektrodene og signalutgangskanalene (figur 2D).
Figur 2: Konstruksjon av adapteren for en todimensjonal (2D) elektrodematrise på det fleksible substratet og kartlegging av opptakskanaler. (A) I kontaktdelen er referanse- og jordkanalene koblet til de nederste elektrodeputene med ledninger. Hvis referanse- og jordkanalene bestemmes på forhånd, skal kanalene kobles til de tilsvarende bunnelektrodeputene i designfasen. I slike tilfeller er lodding av ledninger til kanalene og elektrodeputene unødvendig. (B) Isolasjonsfortrengningskontakter (øverst til venstre) krympes til den ene enden av flatkabelen (nederst til venstre) for å koble til måleforsterkerkontakten (øverst til høyre). Alle linjer som tilsvarer kanalene som skal brukes, er loddet til de grønne kontaktene (nederst til høyre). I dette tilfellet, fordi hver grønn kontakt koblet til hodeforsterkeren er tildelt for en åttekanalsmåling, er det nødvendig med minst to kontakter for å registrere 16-kanals hjerneaktivitetssignaler. De loddede punktene er dekket med epoksyharpiks og skjermingstape for å forhindre kontakt med andre signallinjer. (C) Kontakten og den fabrikkerte kabelen er plassert på overflaten av det fleksible 2D-array-underlaget. Den tynne stangen i rustfritt stål er festet på baksiden av det fleksible underlaget. (D) De romlige plasseringene av opptakskanaler på musens hjerneoverflate og kanalkartene for hvert punkt for målesystemet vises. I dette tilfellet er det 16 opptakskanaler med skrueelektroder (røde sirkler), selv om det totale antallet mulige opptakssteder er 32. De andre 16 ikke-opptakskanalene vises også som grønne sirkler på hjerneoverflaten. I kartleggingsplottet angir "G" og "R" kanalene designet for henholdsvis jord- og referanseelektroder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Dyrekirurgi
- Forbered det sterile kirurgiske miljøet.
- Bruk verneutstyr, for eksempel latekshansker, under hele forsøksprosedyren som involverer dyr.
- Steriliser det stereotaksiske apparatet og kirurgiske instrumenter (se materialfortegnelse).
- Etter sterilisering av kirurgiske instrumenter, vask dem med sterilt saltvann.
- Bedøv dyrene.
- Mål vekten av musen før operasjonen. Administrer atropinsulfat (0,04 mg/kg; se materialfortegnelse) via intraperitoneal injeksjon.
- Bedøv musen via en intraperitoneal injeksjon av en blanding av medetomidin (0,3 mg/kg), midazolam (4,0 mg/kg) og butorfanol (5,0 mg/kg).
- Bekreft bedøvelsesdybden med responsnivået ved å klemme tåen.
MERK: Anestesien vil avta etter ca. 40 min. Hvis musen reagerer på en tåklemme, administrer samme dose av bedøvelsesblandingen via en intraperitoneal injeksjon.
- Forbered deg på elektrodeimplantasjonsoperasjonen.
- Klipp musen whiskers for å forhindre haptisk følelse.
- Smør begge øynene med en oftalmisk salve for å forhindre tørking. Lukk øyelokkene for å hindre synssansen og oppretthold lukking ved å feste øvre og nedre øyelokk med reparasjonstape.
- Barber håret på musens hode med elektriske klippere. Sett et termometer inn i endetarmen og hold kroppstemperaturen på 37 °C ved hjelp av en varmepute.
- Administrer lidokainhydroklorid som en aktuell lokalbedøvelse til den delen av musens hodebunn som vil bli snittet.
- Snitt musens hodebunn med en skalpell eller kirurgisk saks i rostral-til-kaudal retning (arealstørrelse: 7 × 10 mm2).
- Klem hodebunnen nær den snittede delen med pinsett og løft. Fjern den synlige membranen på skallen ved hjelp av en skalpell eller kirurgisk saks. Ikke bryt blodkarene rundt øynene under operasjonen.
- Ta tak i huden nær begge sentrene av snittlinjen i hodebunnen med tang og utvid den innskårne delen for å eksponere toppen av skallen bredt.
- Bekreft fullstendig fjerning av alle membraner på overflaten av skallen og vevet rundt lambda med kirurgisk saks.
- Våt skalleoverflaten med fysiologisk saltvann for å forbedre synligheten av hjerneoverflaten under skallen og lokalisere den tverrgående sinus.
MERK: Når du implanterer skrueelektroder i skallen, husk å ikke legge dem over og inn i tverrgående sinus.
4. Elektrode implantasjon
- Fest stangen i rustfritt stål montert på 2D-elektrodeoppstillingen på baksiden av det fleksible substratet til en mikromanipulator. Plasser det fleksible underlaget på skallen.
- Juster plasseringen av kanalene (Chs) 3 og 14 (figur 2D) på matrisen slik at de passer inn i den nedre colliculus.
MERK: Den nedre colliculus ligger langs tverrgående sinus. Vi anbefaler å bekrefte plasseringen av den dårligere colliculus ved hjelp av et musehjerneatlas på forhånd. - Tegn små sirkler på stedene i kapittel 3, 8, 9 og 14 (figur 2D) på hodeskallen med en permanent markør som skal brukes som målrettede landemerker.
- Tørk skalleoverflaten for å forbedre adherens til tannsementen og for å isolere 2D-elektrodegruppen elektrisk på det fleksible substratet fra museskallen.
- Påfør dental sement (ca. 1 mm tykkelse, se materialfortegnelse) på skalleoverflaten. Etter påføring av dental sement, vent ca. 30 minutter for at den skal herdes.
- Juster det fleksible substratet i henhold til de små sirkulære merkene på overflaten av skallen.
- Juster tuppen av en tannbor til hvert elektrodeputehull på det fleksible underlaget. Bor forsiktig inn i skallen gjennom hvert av elektrodeputehullene.
- Skru hver av miniatyrskrueelektrodene gjennom de borede hullene i skallen ved hjelp av en dedikert skrutrekker for miniatyrskruer.
- Krymp hodet på skrueelektroden og elektrodeputen tett. Til slutt måler du konduktansen mellom hver skrueelektrode og kontakten med testutstyr (f.eks. en LCR-måler) for å bekrefte elektrisk ledningsevne.
5. Design og konstruksjon av liten spole
- Design en smultringformet disk (se tilleggskodingsfil 1) med et hull i midten (indre diameter: 2 mm; ytre diameter: 7 mm; tykkelse: 1 mm) ved hjelp av programvare for dataassistert konstruksjon (CAD) (se materiallisten).
- Bruk en 3D-skriver til å skrive ut to disker (figur 3A, venstre) laget av ikke-varmebestandig materiale (f.eks. polymelkesyrefilament); Ikke-varmebestandig materiale er ikke alltid nødvendig (se nedenfor).
- Trim en permalloy-45 stang (diameter: 2 mm; se materialfortegnelse) for å danne en kort aksel (lengde: 60 mm).
- Sett akselen inn i hvert hull på de to 3D-printede diskene (figur 3A, høyre). Plasser en disk på enden av skaftet og den andre 11 mm fra enden, noe som resulterer i en 10 mm avstand mellom de to diskene. Fest diskene med øyeblikkelig lim (se Materialfortegnelse).
- Fest enden av akselen uten skive til en slagdriver (figur 3B). Fest en liten magnet til permalloy-45-akselen. Plasser en hall-effekt sensor nær magneten 5 mm fra akselen. Koble hall-effekt sensoren til en datainnsamling (DAQ; se Tabell over materialer) system.
- For å telle antall svinger, utarbeide et dataprogram (se Materialfortegnelse) som analyserer utgangssignaler fra hall-effektsensoren gjennom DAQ-systemet.
- Koble en tynn kobbertråd (diameter: 0,16 mm) til akselen og fest den øverste enden av ledningen med øyeblikkelig lim.
- Ved hjelp av slagdriveren vikler du kobbertråden i 1000 omdreininger mellom de to skivene. Selv om rotasjonshastigheten er vilkårlig, brukes vanligvis omtrent 5 rotasjoner per sekund. Fest deretter til sårtråden med øyeblikkelig lim.
- Løsne de to diskene fra akselen. Hvis diskene festes sterkt til akselen, smelter du diskene ved hjelp av en varmepistol.
- Dekk spolen med epoksyharpiks for å isolere og sikre overflaten. Klipp deretter av den viklede akseldelen som overflødig.
- Forsikre deg om at den oppnådde spolen har høyde på 10 mm og en diameter på 6 mm (figur 3B, venstre). For spiralmanipulering, konstruer enten en spiralholder (figur 3C, høyre) eller fest en rustfritt stålstang til spolen (ikke vist her).
- Mål motstanden og induktansen til spolen ved hjelp av en LCR-måler (se materialfortegnelse). For eksempel hadde spolen som ble brukt her en likestrømsmotstand (DC) på 18,3 Ω og en induktans på 7,9 mH ved 1 kHz vekselstrøm (AC) inngang. AC-egenskapene (motstand og induktans) er vist i figur 3D.
- Bruk en funksjonsgenerator for å påføre en bipolar firkantbølge på spolen. Den typiske amplituden til inngangsspenningen er 20 V gjennom en bipolar strømforsyning med en 10x forsterkning, etter en 2 V generatorutgang. Den resulterende bølgeformen er en bipolar firkantbølge med en omtrentlig amplitude på 20 V (dvs. en topp-til-toppspenning på 40 V) (figur 3E).
- Mål den magnetiske flukstettheten ved hjelp av hall-effektsensoren og DAQ-systemet. I dette tilfellet var for eksempel spolens magnetiske flukstetthet (B) 113,6 ±2,5 mT (gjennomsnittlig ± SEM) når spolebunnen var i kontakt med hall-effektsensoren (figur 3F).
Figur 3: Liten spole for magnetisk stimulering. (A) Tredimensjonal (3D)-trykt disk (venstre). To identiske disker er festet til permalloy-45-akselen; Den ene er på enden av skaftet, og den andre er 10 mm unna (høyre). (B) Oppsett for vikling av spolen. 60 mm-akselen med de to skivene er festet til en slagdriver. En hall-effekt sensor er plassert i nærheten av den lille magneten festet til akselen. Kobbertråden er viklet mellom de to diskene. (C) Konstruert spole. Spolen er 10 mm høy, 6 mm i diameter, og har 1000 omdreininger av kobbertråd. Høyre side av figuren viser spolen manipulert av en 3D-printet spoleholder. (D) AC-egenskapene til spolen registrert av en LCR-måler: (øverst) motstand mot frekvensen av sinusformet inngang; (nederst) induktans versus inngangsfrekvens. En typisk spole har en motstand og induktans på henholdsvis 21,6 og 7,9 mH ved 1 kHz vekselstrøminngang. (E) Bifasisk rektangulær bølgeform brukt som spoleinngang registrert av et oscilloskop. (F) Forholdet mellom magnetisk flukstetthet og avstanden mellom en konstruert spole og hall-effektsensoren. Den magnetiske flukstettheten ble registrert av fem forskjellige hall-effekt sensorer, en gang for hver sensor. Gjennomsnittet av fem målinger er plottet, og feilfelt representerer standardfeilene i gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Signalopptakssystem og prosedyre
- Koble den fleksible 2D-matrisen til opptakssystemet (se Materialfortegnelse) med den flate båndkabelen.
- Fest stangen i rustfritt stål montert på spolen til en mikromanipulator (se materialfortegnelse).
- Plasser spolen over bregma og juster posisjonen i kaudal retning for å finne fokuspunktet over den nedre colliculus. Fokuspunktet til det emitterende elektriske feltet er midtlinjen til sårområdet på spolens underside (dvs. 1 mm fra kanten til midten).
- Forbered et stimuleringssystem bestående av en bipolar strømforsyning og en funksjonsgenerator (se materialtabell) og koble spolen til systemet.
- Koble en kabel mellom inngangsterminalen til funksjonsgeneratoren og utgangsterminalen til DAQ-systemet for å påføre utløsersignaler til funksjonsgeneratoren fra DAQ-systemet. Forbered et passende dataprogram for triggersignaler for å initiere stimuli. I tillegg kobler du DAQ-systemet til opptakssystemet for å lagre stimuleringstidene som tidsstempler.
- Start anskaffelsesprosessen for opptakssystemet.
MERK: Hvis opptakssystemet fanger opp støy, finn kilden til støyen og reduser den. - Test magnetisk stimulering ved å utløse stimuleringssystemet.
MERK: Hvis støyen som produseres av magnetisk stimulering metter måleområdet, må du justere området riktig. Bekreft i tillegg at registreringssystemet lagrer stimuleringstidsstemplene riktig. - Begynn å registrere svardataene og begynn stimuleringsøktene. Stopp opptaket når hver stimuleringsøkt er fullført. Lagre alle registrerte data for senere analyse.
MERK: For å utføre alle eksperimentelle forhold med fem forskjellige magnetiske intensiteter, for eksempel, var den totale tiden som kreves for alle økter ca. 75 minutter. Endepunktet ble vanligvis bestemt etter at alle innspillingsøktene var over. Men da dyrene viste kliniske tegn, inkludert hoste, anstrengt pust og gisping, ble eksperimentell økt umiddelbart avsluttet. Ved avlivning ble halshogging utført med skarp, ren saks mens dyrene lå i narkose.
7. Dataanalyse
- Filtrer bredbåndssignalet (rått) ved hjelp av et lavpassfilter med en avskjæringsfrekvens på 200 Hz.
- Samle filtrerte bølgeformer i løpet av et tidsvindu rundt hvert stimuleringstidsstempel. Gjennomsnitt bølgeformene for å oppnå hendelsesrelatert potensial (ERP) bølgeformer (figur 4 og figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksempler på EEG-data registrert i bedøvede C57BL/6J-mus med det fleksible substratet kombinert med skrueelektrodene er presentert nedenfor.
Som et typisk eksempel er de gjennomsnittlige EEG-bølgeformene generert som respons på lydstimulering (8 kHz tone-burst, 80 dB lydtrykknivå [SPL]) vist for 60 studier med identiske stimuli (figur 4A). Et skjema over registrering av kanalkartlegging er også presentert midt i figur 4A. Svarene fra kapittel 5, 7, 10 og 12 registreres fra områder nær hørselsbarken i begge tinninglappene. I de individuelle EEG-bølgeformene til kanalene som ligger rundt hørselsområdene (inferior colliculus og auditiv cortex), ble responsene unntatt stimuleringsartefaktene først negativt umiddelbart etter lydstimuleringsstart (f.eks. kap 3 og 10); maksimal amplituder var henholdsvis 45,6 ± 4,0 μV og 25,6 ± 1,5 μV. Svarene var deretter til en viss grad positive over utgangslinjen (figur 4B,C) og svingte under dempingen. I motsetning til dette var responser fra andre kanaler nesten uavhengige av stimuleringsstarten, selv om noen kanalbølgeformer viste lignende responser.
Figur 4: Lydhendelsesrelaterte potensielle ( ERP) bølgeformer på 16 steder i musehjernen. (A) Som respons på lydstimulering (8 kHz tone-burst, 80 dB SPL) påført en bedøvet mus, illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer. Skjemaet til en musehjerne er vist i midten, og de 16 opptaksstedene (røde sirkler) på musens hjerneoverflate er angitt med kanalnumre. I dette tilfellet brukes 16 opptakskanaler; De andre 16 ikke-opptakskanalene vises som grønne sirkler. (B) Utvidede visninger av ERP-bølgeformer for Ch 3. (C) Utvidede visninger av ERP-bølgeformer for Ch 10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilsvarende er de gjennomsnittlige bølgeformene av EEG-opptak som respons på kort magnetisk stimulering (V i = 60 Vpp) av området nær høyre nedre colliculus vist for 60 studier med identiske stimuli i figur 5A. Et skjema over registrering av kanalkartlegging er også presentert midt i figur 5A. Fordi stimuleringsspolen befant seg nær området Ch 14, var stimuleringsartefakten størst på den kanalen. Imidlertid ble det observert relativt store stimuleringsartefakter for de fleste kanalene umiddelbart etter stimuleringsstart, noe som indikerer at den magnetiske stimuleringen påvirket alle opptaksstedene. Fordi svarene fra kap 5, 7, 10 og 12 ble registrert fra områder nær hørselsbarken i begge temporallappene, var de individuelle EEG-bølgeformene unntatt stimuleringsartefaktene først negative og deretter positive til en viss grad, avhengig av kanalposisjonene (figur 5A-C). I nærheten av hørselsområdene var responstidsforløp indusert av magnetisk stimulering forskjellig fra de som ble indusert av lydstimulering. For Chs 3 og 10 var responsene for eksempel negativt umiddelbart etter lydstimuleringsstart, selv om toppamplitudene var henholdsvis 58,8 ± 4,0 μV og 28,2 ± 2,0 μV. Videre, med økende magnetiske stimuleringsintensiteter, ble toppamplitudene for drevne responser for Ch 10 økt (figur 5D), noe som tyder på at den magnetiske stimuleringen påvirket fremkalte nevrale responser.
Figur 5: Transkraniell magnetisk stimulering (TMS)-drevet hendelsesrelatert potensial (ERP) bølgeformer på 16 steder i musehjernen. (A) De 16-kanals ERP-bølgeformene som svar på TMS (V i = 60 Vpp) påført en bedøvet mus er illustrert. Et skjema over en musehjerne vises i midten, og de 16 opptaksstedene (røde sirkler) på musens hjerneoverflate er angitt med kanalnumrene. (B) Utvidede visninger av ERP-bølgeformer for Ch 3. (C) Utvidede visninger av ERP-bølgeformer for Ch 10. (D) Sammendrag for amplitudene til kap. 10 ERP fremkalt av forskjellige magnetiske intensiteter (inngangsspenning). For statistisk analyse brukes en ANOVA for flere sammenligninger etterfulgt av en post-hoc Tukey-Kramer-test. * og *** representerer henholdsvis p < 0,05 og p < 0,001. Forsøksnummeret for en økt er 60 ganger for hver tilstand hos enkeltdyr. Statistikken er beregnet for utvalg fra to dyr. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne metoden kan også enkelt utvides til et våkent lite dyr som er koblet til bundet kabler via en vanlig adapter og festet med en TMS-enhet til hodet under opptak (tilleggsfigur 1 og tilleggsfigur 2).
Tilleggsfigur 1: Festeanordning av stimuleringsspolen festet til en museskalle. (A) For en våken mus vises en stimuleringsspole festet med armaturen festet til museskallen. (B) Hendelsesrelaterte potensialer (ERP) til den våkne musen ble registrert i en akrylboks, hvor musen kunne bevege seg inne i boksen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Bølgeformer av lyddrevet og transkraniell magnetisk stimulering (TMS)-drevet ERP på 16 steder fra hjernen til en våken mus. (A) Som respons på lydstimulering (8 kHz tone-burst, 80 dB SPL) påført en våken mus i et akryltilfelle (tilleggsfigur 1B), illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer. Skjemaet til en musehjerne er vist i midten, og de 16 opptaksstedene (røde sirkler) på musens hjerneoverflate er indikertav kanalnumre. I dette tilfellet brukes 16 opptakskanaler; De andre 16 ikke-opptakskanalene vises som grønne sirkler. (B) På samme måte illustreres 16-kanals ERP-bølgeformer som svar på TMS (Vin = 60 Vpp) påført den samme våkne musen. Et skjema over en musehjerne vises i midten, og de 16 opptaksstedene (røde sirkler) på musens hjerneoverflate er angitt med kanalnumrene. Stimuleringsspolen ligger nær området Ch 14. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: CAD-datafil for den smultringformede disken som kreves for spolekonstruksjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien tar for seg et multi-site EEG-opptakssystem kombinert med et magnetisk stimuleringssystem designet for små dyr, inkludert mus. Det konstruerte systemet er billig og enkelt konstruert i fysiologiske laboratorier, og kan utvide sine eksisterende måleoppsett. Den kirurgiske prosedyren som er nødvendig for å skaffe data fra museopptakssystemet, er svært enkel hvis slike laboratorier har tidligere erfaring med standard elektrofysiologiske eksperimenter.
En fordel ved å bruke denne tilnærmingen er den gode reproduserbarheten av elektrodeplassering på et enkelt dyrs hode og hodebunn. Det fleksible substratet som brukes til å tildele skrueelektroder til hjernemålsteder, replikeres enkelt ved hjelp av standard mikrofabrikasjonsteknikker, og de samme substratene er også praktiske for å bestemme opptaksstedene fra hodebunnen til hvert dyr. I tillegg kan formen på elektrodegruppen enkelt modifiseres for å optimalisere ulike eksperimentelle behov; Tilpassede elektrodearrangementer kan opprettes optimalt for spesifikke eksperimentelle formål. Hvis metoden angitt i protokollen følges, kan skrueelektroder, kontakter, kabler og kirurgiske prosedyrer enkelt modifiseres og utvides til et målesystem med et større antall opptakssteder. En annen fordel med dette opptakssystemet er den lave prisen når laboratorier er utstyrt med en flerkanals forsterker. Det nåværende opptakssystemet kan hente nevrale signaler fra 32 inngangskanaler og opptil fire separate kabler. Derfor vil et utvidet 32-kanals opptakssystem kreve ekstra kabler, skrueelektroder og modifiserte fleksible underlag, og dette utvidede systemet vil ha en svært lav kostnad.
En ulempe med denne metoden er imidlertid den nøyaktige kontrollen av dybden av skrueelektroder under implantasjon. Denne ulempen er imidlertid alltid tilstede for typiske skrue EEG-elektroder, og den nøyaktige dybden av skruens premortem i forhold til den kortikale overflaten er ukjent. Videre, i dette systemet, er et annet kritisk punkt for opptakskvaliteten til EEG-signaler og reduksjon av støynivået passende elektrodekontakt med epidurallaget. Vi bekrefter alltid riktig elektrodekontakt av alle skrueelektroder gjennom impedansmåling. Vanligvis foreslår en impedans på 5-10 kΩ ved 1 kHz passende epiduralplassering, og impedansverdiene bør bekreftes før nevrale signalmålinger.
I tillegg, i den nåværende protokollen, påføres tannsement på skallen før elektrodeimplantasjon. Den riktige mengden dental sement kan påvirke suksessen til EEG-signalopptak. Det vil si at et tynt lag av dental sement på skallen ikke støtter de implanterte elektrodene eller fikser posisjonen til elektrodene, mens et tykkere lag forhindrer riktig posisjonering av elektroden (e) for å komme i kontakt med dura-saken. For å bestemme riktig tykkelse på laget, målte vi tykkelsen på tannsementen ved hjelp av en digital tykkelse etter vellykkede EEG-opptak. Den gjennomsnittlige tykkelsen på et passende sementlag var 0,7 mm, noe som tyder på at tannsementlaget kunne erstattes med en "skallehette" med en tykkelse på 0,7 mm og små hull for skrueelektroder.
Magnetisk stimulering er et nyttig verktøy i studier på mennesker og dyr for minimalt invasiv eller ikke-invasiv nevrostimulering av hjernen. Raskt skiftende strømmer i en spole skaper et magnetfelt rundt spolen og forårsaker hyperpolarisering eller depolarisering av nevronmembraner når strømmen passerer gjennom dyre- og menneskeskaller. For dyremodeller blir aksjonspotensielle responser direkte tent av supraterskelstørrelsen på den elektriske feltendringen, mens subterskelendringer i nevrale membraner produseres for å tilpasse nettverksaktiviteten til nevrale populasjoner10. Denne spolen er simulert for å produsere et elektrisk felt som er mer enn 10 V / m, opp en dybde på 1,8 mm fra overflaten av hjernen (2,4 mm fra skallen), tilsvarende kortikale lag 5/6 eller dypere regioner i en typisk (f.eks. C57BL/6J) mus10. Disse millimeterstore spolene er i stand til å indusere supraterskel nevral aktivitet og kan til og med generere et mer lokalisert elektrisk felt på overflaten av hjernen sammenlignet med de som er indusert av tidligere rapporterte spoler11. Selv om tilleggseffekter som består av flere faktorer, inkludert oppfattet lyd, hodeskallevibrasjon og den termiske effekten, ikke kan utelukkes helt, hadde disse individuelle effektene liten innflytelse på nevral aktivitet. Videre, som en magnetisk kjerne, bruker vi permalloy, hvis magnetiske egenskaper vanligvis avhenger av betingelsene for glødningsprosessen, inkludert kjølehastigheten, glødetemperaturen og holdetiden12. Imidlertid kunne dens glødende forhold ikke kontrolleres da det var en kommersiell permalloy.
Nylig har kombinerte målesystemer bestående av multi-site EEG-opptak og TMS blitt brukt i medisinske studier, og deres kliniske applikasjoner har økt 4,6. Vår foreslåtte tilnærming vil forbedre små dyremodeller (spesielt musemodeller) av human nevrofysiologi, noe som kan gi en mye enklere oversettelse av eksperimentelle gnagermodellresultater til menneskelige kliniske kolleger ved å tilby dyremodeller som bedre parallelle menneskelige systemer. Til slutt, ved hjelp av multi-site opptaksteknikker i genetisk modifiserte mus, kan kombinerte magnetiske og farmakologiske inngrep hos dyr med sensorisk hørselstap bidra til å avsløre mekanismene som genererer spesifikke hørselsforstyrrelser og tinnitus, som er våre fremtidige forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Murata Science Foundation, Suzuken Memorial Foundation, Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering, og et stipend i hjelp for utforskende forskning (stipendnummer 21K19755, Japan) og for vitenskapelig forskning (B) (stipendnummer 23H03416, Japan) til TT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | FFD-101 | The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| ATROPINE SULFATE 0.5 mg | NIPRO ES PHARMA CO., LTD. | - | Atropine sulfate |
| Bipolar amplifier | NF Corp. | KIT61380 | For amplifying waveforms for coil input |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan |
- | For anathesis of animals |
| Commercial manufacturer of flexible 2D array | p-ban.com Corp. | - | URL: https://www.p-ban.com/ |
| Computer prograom to analyze output signals | Natinal Instruments | NI-DAQ and NI-DAQmx Python | To analyze output signals from the hall-effect sensor |
| Connector | Harwin Inc. | G125-FV12005L0P | For connector to conect to the measuring system |
| Copper pad | p-ban.com Corp. | copper | Copper pad on each substrate |
| Copper wire | Kyowa Harmonet Ltd. | P644432 | The windings of the coil |
| DAQ board | National Instruments Corp. | USB-6343 | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| Dental cement | SHOFU INC. | Quick Resin | Self-Curing Orthodontic Resin |
| ECoG electrode | NeuroNexus Inc. | HC32 | For reference to design of the flexible 2D array |
| Epoxy resin | Konishi Co. Ltd. | #16123 | For coil construction |
| Ethyl Carbamate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 050-05821 | For urethan anesthesia |
| Flat ribbon cable | Oki Electric Cable Co., Ltd. | FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m | For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem |
| flexible substrate | p-ban.com Corp. | polyimide | Baseplate of flexible substrate |
| Function generator | NF Corp. | WF1947 | For generating waveforms for coil input |
| Hall-effect sensor | Honeywell International Inc. | SS94A2D | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| IDC crimping tool | Pro'sKit Industries Co. | 6PK-214 | To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool |
| Instant glue | Konishi Co. Ltd. | #04612 | For coil construction |
| Insulation-displacement connector (IDC ) | Uxcell Japan | B07GDDG3XG | 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch |
| LCR meter | NF Corp. | ZM2376 | For measuring the AC properties of the coil |
| Manipulator | NARISHIGE Group. | SM-15L | For manipulating the coil |
| Medetomidine | Kobayashi Kako, Fukui, Japan | - | For anathesis of animals |
| Midazolam | Astellas Pharma, Tokyo, Japan | - | For anathesis of animals |
| Miniature screw | KOFUSEIBYO Co., Ltd. | S0.6*1.5 | For EEG-senseing and reference electrode |
| Mouse | Japan SLC, Inc. | C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) | Experimental animal |
| Permalloy-45 rod | The Nilaco Corp. | 780544 | The core of the coil |
| Recording system | Plexon Inc. | OmniPlex | For EEG data acquisition |
| Stainless wire | Wakisangyo Co., Ltd. | HW-136 | For grasp by manipulator |
| Stereotaxic apparatus | NARISHIGE Group. | SR-5M-HT | To fix a mouse head |
| Surface-mount connector | Useconn Electronics Ltd. | PH127-2x10MG | For connector to mount on the flexible 2D array |
| Testing equipment (LCR meter) | NF Corp. | ZM2372 | Contact check and impedance measurements |
| White PLA filament | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | PLA-F13 | The material used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| Xylocaine Jelly 2% | Sandoz Pharma Co., Ltd. | - | lidocaine hydrochloride |
References
- Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
- Hallett, M. Transcranial magnetic stimulation: a primer. Neuron. 55 (2), 187-199 (2007).
- Thut, G., Pascual-Leone, A. Integrating TMS with EEG: How and what for. Brain Topography. 22 (4), 215-218 (2010).
- Ilmoniemi, R. J., Kicic, D. Methodology for combined TMS and EEG. Brain Topograpy. 22 (4), 233-248 (2010).
- Daskalakis, Z. J., Farzan, F., Radhu, N., Fitzgerald, P. B. Combined transcranial magnetic stimulation and electroencephalography: its past, present and future. Brain Research. 1463, 93-107 (2012).
- Tremblay, S., et al. Clinical utility and prospective of TMS-EEG. Clinical Neurophysiology. 130 (5), 802-844 (2019).
- Pellicciari, M. C., Veniero, D., Miniussi, C. Characterizing the cortical oscillatory response to TMS pulse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 38 (2017).
- Lin, Y. J., Shukla, L., Dugue, L., Valero-Cabre, A., Carrasco, M. Transcranial magnetic stimulation entrains alpha oscillatory activity in occipital cortex. Scientific Reports. 11 (1), 18562 (2021).
- Takahashi, S., et al. Laminar responses in the auditory cortex using a multielectrode array substrate for simultaneous stimulation and recording. IEEJ Transactions Electrical and Electronic Engineering. 14 (2), 303-311 (2019).
- Yoshikawa, T., Higuchi, H., Furukawa, R., Tateno, T. Temporal and spatial profiles of evoked activity induced by magnetic stimulation using millimeter-sized coils in the mouse auditory cortex in vivo. Brain Research. 1796, 148092 (2022).
- Tang, A. D., et al. Construction and evaluation of rodent-specific rTMS coils. Frontiers in Neural Circuits. 10, 47 (2016).
- Li, L. Controlling annealing and magnetic treatment parameters to achieve high permeabilities in 55 Ni-Fe toroid cores. IEEE Transactions on Magnetics. 37 (4), 2315-2317 (2001).
