Summary
Ett billigt elektroencefalografiskt registreringssystem kombinerat med en millimeterstor spole föreslås för att driva transkraniell magnetisk stimulering av mushjärnan in vivo. Med hjälp av konventionella skruvelektroder med ett skräddarsytt, flexibelt multielektrodmatrissubstrat kan inspelning på flera platser utföras från mushjärnan som svar på transkraniell magnetisk stimulering.
Abstract
Ett billigt elektroencefalografiskt (EEG) inspelningssystem föreslås här för att driva transkraniell magnetisk stimulering (TMS) av mushjärnan in vivo, med hjälp av en millimeterstor spole. Med hjälp av konventionella skruvelektroder i kombination med ett skräddarsytt, flexibelt multielektrodmatrissubstrat kan inspelning på flera platser utföras från mushjärnan. Dessutom förklarar vi hur en millimeterstor spole produceras med hjälp av billig utrustning som vanligtvis finns i laboratorier. Praktiska procedurer för tillverkning av det flexibla multielektrodmatrissubstratet och den kirurgiska implantationstekniken för skruvelektroder presenteras också, vilka är nödvändiga för att producera EEG-signaler med lågt brus. Även om metoden är användbar för inspelning från hjärnan hos alla små djur, fokuserar denna rapport på elektrodimplementering i en bedövad musskalle. Dessutom kan denna metod enkelt utvidgas till ett vaket litet djur som är anslutet med bundna kablar via en gemensam adapter och fixeras med en TMS-enhet till huvudet under inspelning. Den nuvarande versionen av EEG-TMS-systemet, som kan innehålla maximalt 32 EEG-kanaler (en enhet med 16 kanaler presenteras som ett exempel med färre kanaler) och en TMS-kanalenhet, beskrivs. Dessutom rapporteras kortfattat typiska resultat som erhållits genom applicering av EEG-TMS-systemet på bedövade möss.
Introduction
Transkraniell magnetisk stimulering (TMS) är ett lovande verktyg för mänsklig hjärnvetenskap, klinisk tillämpning och djurmodellforskning på grund av dess icke-/låga invasivitet. Under det tidiga stadiet av TMS-applikationer begränsades mätningen av den kortikala effekten som svar på TMS med en och parad puls hos människor och djur till motorcortex; Lätt mätbar effekt begränsades till motoriska framkallade potentialer och inducerade myoelektriska potentialer som involverade motorcortex 1,2. För att expandera hjärnregionerna som kan mätas med TMS-modulering integrerades elektroencefalografisk (EEG) inspelning med TMS med enkel- och parad puls som en användbar metod för att direkt undersöka excitabilitet, anslutning och spatiotemporal dynamik i områden i hela hjärnan 3,4,5. Således har samtidig applicering av TMS- och EEG-inspelning (TMS-EEG) på hjärnan använts för att undersöka olika ytliga kortikala hjärnområden hos människor och djur för att undersöka intrakortikala neurala kretsar (se Tremblay et al.6). Dessutom kan TMS-EEG-system användas för att undersöka ytterligare kortikala spatiotemporala egenskaper, inklusive utbredning av signaler till andra kortikala områden och generering av oscillerande aktivitet 7,8.
Verkningsmekanismen för TMS i hjärnan förblir dock spekulativ på grund av TMS icke-invasivitet, vilket begränsar vår kunskap om hur hjärnan fungerar under TMS-applikationer. Därför är invasiva translationella studier på djur som sträcker sig från gnagare till människor av avgörande betydelse för att förstå mekanismen för effekterna av TMS på neurala kretsar och deras aktivitet. I synnerhet för kombinerade TMS-EEG-experiment på djur har ett simultant stimulerings- och mätsystem inte utvecklats intensivt för små djur. Därför krävs experimentalister för att konstruera ett sådant system genom försök och fel enligt deras specifika experimentella krav. Dessutom är musmodeller användbara bland andra in vivo-djurartsmodeller eftersom många transgena och stamisolerade musstammar är tillgängliga som biologiska resurser. Således skulle en bekväm metod för att bygga ett TMS-EEG-kombinerat mätsystem för möss vara önskvärt för många neurovetenskapsforskare.
Denna studie föreslår en TMS-EEG-kombinerad metod som kan tillämpas för samtidig stimulering och inspelning av mushjärnan, som är den huvudsakliga typen av transgena djur som används i forskning, och som lätt kan konstrueras i typiska neurovetenskapliga laboratorier. Först beskrivs ett billigt EEG-inspelningssystem med konventionella skruvelektroder och ett flexibelt substrat för att reproducerbart tilldela en elektrodarrayposition i varje experiment. För det andra konstrueras ett magnetiskt stimuleringssystem med hjälp av en millimeterstor spole, som lätt kan skräddarsys i typiska laboratorier. För det tredje registrerar det TMS-EEG-kombinerade systemet neural aktivitet som svar på ljud och magnetisk stimulering. Metoden som presenteras i denna studie kan avslöja de mekanismer som genererar specifika störningar hos små djur, och resultaten som erhållits i djurmodellerna kan översättas för att förstå motsvarande mänskliga störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den aktuella studien utfördes alla djurförsök enligt National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och med godkännande från Institutional Animal Care and Use Committee of Hokkaido University. C57BL/6J möss, två hanar och tre honor, 8 till 10 veckor gamla, användes för den aktuella studien. Detta är ett terminalförfarande. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning).
1. Flexibel tvådimensionell arraydesign och konstruktion
- Förbered önskat antal miniatyrskruvelektroder (rostfritt, SUS XM7; se materialtabell) med följande strukturella egenskaper för användning som EEG-registrerings- och referenselektroder: nominell diameter, halslängd och huvuddiameter på 0,6 mm, 1,5 mm respektive 1,1 mm (figur 1A).
OBS: I den aktuella studien användes 16 miniatyrskruvelektroder. - Förbered en ritning av ett tryckt kretsschema på ett flexibelt substrat enligt stegen nedan.
- Skapa ett tvådimensionellt (2D) elektrodmönster på ett flexibelt substrat (hel storlek, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialtabell) för skruvelektroderna som ska läsas ut. Designa 2D-elektrodarrangemanget. Figur 1B visar de specifika arrangemang som används i denna studie och de relativa koordinaterna från en baslinjepunkt (korsmarkerad vid origo [0, 0]).
OBS: I den aktuella studien, för att registrera neural aktivitet i hörselbarken inom temporalloberna, var elektrodplaceringen i lateral-till-medial (horisontell) riktning längre än i rostral-till-caudal (vertikal) riktning (figur 1B). - Se till att för EEG-inspelningselektroderna har varje koppardyna (se materialtabell) på det flexibla substratet en ringform med en ytterdiameter på 1,3 mm och en innerdiameter på 0,8 mm (figur 1C, vänster). Gör ett litet hål (0,8 mm diameter) i mitten för varje skruvelektrod att passera genom underlaget. För referenselektroderna bör varje koppardyna ha en kvadratisk form med en sidolängd på 1,4 mm; Gör på samma sätt ett litet hål (0,8 mm diameter) i mitten för varje skruv att passera genom den fyrkantiga dynan på underlaget (figur 1C, höger).
- Därefter, för att löda en ytmonterad kontakt (bild 1D, vänster), designa avläsningsplattor (2D-matris) som leder till kontakten (bild 1D, höger). Använd till exempel en kontakt med 2 × 10 stift och en 1,27 mm stigning mellan intilliggande stift (bild 1D, höger).
- Koppla skruvelektroderna och anslutningsdynorna med både yt- och bakskiktet med en linjebredd på 0,03 mm och ett linjeintervall på 0,03 mm (tunna linjer i figur 1E).
- Dessutom, för att ansluta referens- och jordkanalerna till förstärkaren, anslut elektrodkuddarna för referens- och jordelektroderna till den isolerade delen på utsidan av den flexibla 2D-matrisen (två vertikala rektanglar indikerade med "G" och "HR" längst ner i figur 1E). Efter bestämning av referens- och jordkanalerna, kom ihåg att löda elektroddynorna till motsvarande kontakter (se steg 2.1).
- Korrekt utforma ett exponerat område som inte är täckt med ett skyddsskikt (polyimidskikt). Exponera kontaktdonen i ytskiktet medan du exponerar skruvelektroddynorna i både yt- och bakskikten. Hela elektroddesignen, storlekarna och den tillverkade flexibla 2D-matrisen illustreras i figur 1E, och bilden av ett tillverkat substrat visas i figur 1F.
- I den övre elektroddelen (huvuddelen) av den flexibla 2D-matrisen, se till att den treskiktade strukturen från topp till botten består av följande (total tjocklek 49,0 μm): ett övre kopparskikt (12,0 μm tjocklek), ett mellanlager av kärnpolyimid (25,0 μm) och ett nedre kopparskikt (12,0 μm) (figur 1G, överst).
- Etsa kopparskikten på substratets övre och nedre yta, till exempel med våtetsning och standardtillverkningstekniken9.
- I den nedre fyrkantiga dyndelen (anslutningsdelen) av den flexibla 2D-matrisen, se till att den sexskiktade strukturen består av tre lager, inklusive ett övre kopparskikt (12,0 μm tjocklek), ett mellersta kärnpolyimidskikt (25,0 μm) och ett nedre kopparskikt (12,0 μm), som är inklämda av skyddande polyimidskikt, inklusive övre och nedre (båda 12,5 μm) lager. Fäst en 2 mm polyimidskiva från botten som förstärkningsmaterial (figur 1G, botten).
OBS: För att bibehålla flexibiliteten är det förstärkande polyimidkortet inte monterat på halsdelen av den flexibla 2D-matrisen mellan huvudet och kontaktdelen. - På samma sätt, i anslutningsdelen, etsa koppar- och skyddspolyimidskikten på toppen med våtetsning och standardtillverkningstekniken.
OBS: Den totala vikten av den tillverkade, flexibla, 2D-arrayenheten, inklusive kontakten, är 0,84 g. Efter att ha utformat en layout för en flexibel 2D-matris rekommenderas substrat från en kommersiell tillverkare (se materialförteckning) ibland för enkelhets skull.
- Skapa ett tvådimensionellt (2D) elektrodmönster på ett flexibelt substrat (hel storlek, 41,2 mm × 19,9 mm; se materialtabell) för skruvelektroderna som ska läsas ut. Designa 2D-elektrodarrangemanget. Figur 1B visar de specifika arrangemang som används i denna studie och de relativa koordinaterna från en baslinjepunkt (korsmarkerad vid origo [0, 0]).
Figur 1: Komponentdelar i den flexibla tvådimensionella (2D) matrisen för elektroencefalografisk (EEG) inspelning och den tillverkade anordningen inklusive matrisen . (A) Miniatyrskruvelektroden som är inbäddad i musskallen. (B) De konstruerade elektrodkuddarna för mätning av hjärnaktivitet (gröna cirklar) och referenskanalen (kvadrat längst ner till höger). De relativa koordinaterna för elektrodkuddarna från en referenspunkt (korsmarkering) vid origo (0, 0) visas; Storleken i millimeter illustreras inom parentes. Elektroddynornas mittkoordinater är symmetriska med avseende på den vertikala axeln som passerar genom korsmärket. (C) Elektrodkuddarna och borrhålen för en inspelningselektrod (vänster) och en referenselektrod (höger) illustreras. (D) En ytmonterad kontakt (2 × 10 stift) som används för den flexibla 2D-matrisen (vänster) och mönstret och storleken på de designade dynorna på underlaget (höger). (E) Designad ritning med storleken på varje del i millimeter. (F) Bild av ett tillverkat substrat som indikeras av ritningen i E. (G) Skiktstrukturen för den flexibla 2D-matrisen (huvud- och anslutningsdelar). De övre och sidovyerna av skruvelektroddynorna (överst) och avläsningsdynorna (botten) illustreras. Huvudet och anslutningsdelarna består av en treskiktsstruktur (överst) respektive en sexskiktsstruktur (botten). Dessutom består halsdelen av en femskiktad struktur; Ett skyddande polyimidskikt är monterat på ovan- och baksidan, och förstärkningspolyimidskivan är inte monterad på nackdelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Adapterkonstruktion och kanalkartläggning
- Utför adapterkonstruktionen enligt stegen nedan.
- Sprid lödflödet på den 2 × 10-stifts, ytmonterade kontakten (bild 1D, vänster) och anslutningsdynorna i 2D-matrisen (figur 1D, höger) (se materialförteckningen) på det flexibla substratet.
- Löd den 2 × 10-stifts, ytmonterade kontakten till kontaktkuddarna. Bekräfta särskilt anslutningen mellan de två dynorna på den nedre delen av 2D-matrisen och de två anslutningsstiften som används som referens- och jordkanaler (figur 2A).
- Anslut var och en av de två dynorna till enskilda ledningstrådar för att mata baslinjesignaler till en extern punkt (t.ex. en jordpunkt ansluten till mätsystemets jordkanal; Figur 2A).
OBS: I denna studie användes dock en av de cirkulära elektroddynorna med skruvelektroder som referenselektrod istället för en fyrkantig elektrod i anslutningsdelen. - Efter lödning, täck lödpunkterna med epoxiharts (se materialtabell) för att skydda de utsatta punkterna och förhindra kortslutning.
- Fäst anslutningskabeln och huvudförstärkaren genom att följa stegen nedan.
- Förbered en isoleringsförskjutningskontakt (IDC) med 2 × 10 stift och 1,27 mm delning (figur 2B, uppe till vänster) och en platt 20-polig bandkabel (se materialtabell) med 0,635 mm delning (figur 2B, nere till vänster). Klipp av den platta bandkabeln till önskad längd (t.ex. 40 cm).
- Krymp IDC och ena änden av plattbandskabeln med ett IDC-pressverktyg (figur 2B, uppe till höger) (se materialförteckning).
- Separera varje linje i den andra änden av kabeln upp till cirka 15 mm från spetsänden med en skärare. Ta bort isoleringen 3 mm från spetsänden.
- Anslut den pressade IDC till den platta bandkabeln och 2 × 10-stiftskontakten lödd på det flexibla substratet (figur 2C).
- Bekräfta korrespondensen mellan inspelningselektroden och kabelns separerade linje. Se till att varje rad som används inte ger ett felaktigt anslutningsfel.
- Löd de exponerade koppartrådarna i de enskilda ledningarna som motsvarar utgången från varje elektrod till mätsystemets 20-poliga kontakt (1,25 mm stigning), inklusive huvudförstärkaren (figur 2B, nere till höger).
- Efter lödning, bekräfta ledningen mellan skruvelektroddynorna och kontaktstiften med hjälp av en testutrustning (t.ex. en LCR-mätare, se materialtabell).
- Täck lödpunkterna med epoxiharts och skyddstejp för att skydda dem från skador och förhindra kontakt med andra signalledningar.
- Använd epoxiharts och fäst en tunn stång av rostfritt stål (diameter: 1,1-1,2 mm; längd: 100 mm) på baksidan av anslutningsdelen av 2D-matrisen på det flexibla substratet.
OBS: Denna rostfria stålstång kan greppas av en mikromanipulatorhållare under experiment (figur 2C). - Slutligen bekräfta mappningen mellan skruvelektroderna och signalutgångskanalerna (figur 2D).
Figur 2: Konstruktion av adaptern för en tvådimensionell (2D) elektroduppsättning på det flexibla substratet och inspelning av kanalmappning. (A) I anslutningsdelen är referens- och jordkanalerna anslutna till de nedre elektrodkuddarna med ledningstrådar. Om referens- och jordkanalerna bestäms i förväg bör kanalerna anslutas till motsvarande bottenelektrodkuddar under konstruktionsfasen. I sådana fall är lödning av ledningstrådar till kanalerna och elektrodkuddarna onödig. (B) Isoleringsförskjutningskontakter (uppe till vänster) är pressade till ena änden av den platta kabeln (nere till vänster) för att länka mätförstärkarkontakten (uppe till höger). Alla linjer som motsvarar kanalerna som ska användas löds till de gröna kontakterna (längst ner till höger). I det här fallet, eftersom varje grön kontakt som är ansluten till huvudförstärkaren är tilldelad för en åttakanalsmätning, behövs minst två kontakter för att spela in 16-kanals hjärnaktivitetssignaler. De lödda punkterna är täckta med epoxiharts och skärmtejp för att förhindra kontakt med andra signallinjer. (C) Kontakten och den tillverkade kabeln placeras på ytan av det flexibla 2D-matrissubstratet. Den tunna stången i rostfritt stål är fäst på baksidan av det flexibla underlaget. (D) De rumsliga placeringarna av inspelningskanaler på musens hjärnyta och kanalkartorna för varje punkt för mätsystemet visas. I det här fallet finns det 16 inspelningskanaler med skruvelektroder (röda cirklar), även om det totala antalet möjliga inspelningsplatser är 32. De andra 16 icke-inspelningskanalerna visas också som gröna cirklar på hjärnytan. I kartläggningsdiagrammet anger "G" och "R" kanalerna avsedda för jord- respektive referenselektroder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Djurkirurgi
- Förbered den sterila kirurgiska miljön.
- Använd skyddsutrustning, t.ex. latexhandskar, under hela försöksförfarandet med djur.
- Sterilisera stereotaktiska apparater och kirurgiska instrument (se Materialförteckning).
- Efter sterilisering av de kirurgiska instrumenten, tvätta dem med steril saltlösning.
- Bedöva djuren.
- Mät musens vikt före operationen. Administrera atropinsulfat (0,04 mg/kg; se Materialförteckning) via intraperitoneal injektion.
- Bedöva musen via en intraperitoneal injektion av en blandning av medetomidin (0,3 mg/kg), midazolam (4,0 mg/kg) och butorfanol (5,0 mg/kg).
- Bekräfta anestesidjupet med responsnivån genom att nypa tån.
OBS: Bedövningen kommer att avta efter ca 40 min. Om musen svarar på en tånyp, administrera samma dos av bedövningsblandningen via en intraperitoneal injektion.
- Förbered dig för elektrodimplantationskirurgi.
- Skär musmorrhåren för att förhindra haptisk känsla.
- Smörj båda ögonen med en oftalmisk salva för att förhindra torkning. Stäng ögonlocken för att hindra synen och upprätthålla stängningen genom att fästa de övre och nedre ögonlocken med lagningstejp.
- Raka håret på musens huvud med elektriska klippare. Sätt in en termometer i ändtarmen och håll kroppstemperaturen vid 37 °C med en värmedyna.
- Administrera lidokainhydroklorid som lokalbedövning till den del av musens hårbotten som kommer att skäras.
- Skär musens hårbotten med en skalpell eller kirurgisk sax i en rostral-till-kaudal riktning (områdesstorlek: 7 × 10 mm2).
- Nyp hårbotten nära den snittade delen med pincett och lyft. Ta bort det synliga membranet på skallen med en skalpell eller kirurgisk sax. Bryt inte blodkärlen runt ögonen under operationen.
- Ta tag i huden nära båda centra av snittlinjen i hårbotten med pincett och vidga den snittade delen för att exponera toppen av skallen.
- Bekräfta fullständigt avlägsnande av alla membran på ytan av skallen och vävnaden runt lambda med kirurgisk sax.
- Våt skallytan med fysiologisk saltlösning för att förbättra synligheten av hjärnytan under skallen och lokalisera den tvärgående sinus.
OBS: När du implanterar skruvelektroder i skallen, kom ihåg att inte bädda in dem ovanför och i den tvärgående sinus.
4. Implantation av elektroder
- Fäst den rostfria stålstången monterad på 2D-elektrodmatrisen på baksidan av det flexibla substratet till en mikromanipulator. Placera det flexibla substratet på skallen.
- Justera placeringen av kanalerna (kap) 3 och 14 (bild 2D) på matrisen så att de passar in i den sämre kolliculusen.
OBS: Den sämre colliculus ligger längs den tvärgående sinus. Vi rekommenderar att du bekräftar platsen för den sämre colliculus med hjälp av en mushjärnatlas i förväg. - Rita små cirklar på platserna för kap 3, 8, 9 och 14 (figur 2D) på skallen med en permanent markör som ska användas som målmärken.
- Torka skallytan för att förbättra vidhäftningen till tandcementet och för att elektriskt isolera 2D-elektroduppsättningen på det flexibla substratet från musskallen.
- Applicera tandcement (ca 1 mm tjocklek; se Materialförteckning) på skallytan. Efter applicering av dentalcement, vänta cirka 30 minuter tills den härdar.
- Rikta in det flexibla substratet enligt de små cirkulära märkena på skallens yta.
- Rikta in spetsen på en tandborr mot varje elektrodhål på det flexibla substratet. Borra försiktigt in i skallen genom vart och ett av elektrodhålen.
- Skruva var och en av miniatyrskruvelektroderna genom de borrade hålen i skallen med en särskild skruvmejsel för miniatyrskruvar.
- Krymp skruvelektrodens och elektroddynans huvud tätt. Slutligen mät konduktansen mellan varje skruvelektrod och kontakten med testutrustning (t.ex. en LCR-mätare) för att bekräfta elektrisk ledningsförmåga.
5. Liten spole design och konstruktion
- Designa en munkformad skiva (se kompletterande kodningsfil 1) med ett hål i mitten (innerdiameter: 2 mm; ytterdiameter: 7 mm; tjocklek: 1 mm) med hjälp av CAD-programvara (computer-aided design) (se Materialförteckning).
- Använd en 3D-skrivare och skriv ut två skivor (bild 3A, vänster) av icke-värmebeständigt material (t.ex. polymjölksyrafilament). Icke-värmebeständigt material är inte alltid nödvändigt (se nedan).
- Trimma en permalloy-45-stång (diameter: 2 mm; se materialtabell) för att bilda en kort axel (längd: 60 mm).
- Sätt in axeln i varje hål på de två 3D-utskrivna skivorna (bild 3A till höger). Placera en skiva i slutet av axeln och den andra 11 mm från änden, vilket resulterar i ett avstånd på 10 mm mellan de två skivorna. Fäst skivorna med snabblim (se Materialförteckning).
- Fäst axelns ände utan skiva på en slagmejsel (bild 3B). Fäst en liten magnet på permalloy-45-axeln. Placera en halleffektsensor nära magneten 5 mm från axeln. Anslut halleffektsensorn till ett datainsamlingssystem (DAQ; se materialförteckning).
- För att räkna antalet varv, förbered ett datorprogram (se materialförteckning) som analyserar utsignaler från halleffektsensorn genom DAQ-systemet.
- Anslut en tunn koppartråd (diameter: 0,16 mm) till axeln och fäst vid trådens övre ände med omedelbart lim.
- Använd slagdrivrutinen och linda koppartråden i 1 000 varv mellan de två skivorna. Även om rotationshastigheten är godtycklig används vanligtvis cirka 5 varv per sekund. Håll sedan fast vid lindtråden med omedelbart lim.
- Lossa de två skivorna från axeln. Om skivorna fästs starkt på axeln, smälta skivorna med en värmepistol.
- Täck spolen med epoxiharts för att isolera och säkra ytan. Skär sedan av den olindade axeldelen som överskott.
- Se till att den erhållna spolen har en höjd av 10 mm och en diameter på 6 mm (figur 3B, vänster). För spolmanipulation, konstruera antingen en spolhållare (figur 3C, höger) eller fäst en rostfri stålstång på spolen (visas inte här).
- Mät spolens motstånd och induktans med en LCR-mätare (se materialtabell). Till exempel hade spolen som användes här ett likströmsmotstånd (DC) på 18,3 Ω och en induktans på 7,9 mH vid 1 kHz växelströmsingång. AC-egenskaperna (resistans och induktans) visas i figur 3D.
- Använd en funktionsgenerator för att applicera en bipolär fyrkantvåg på spolen. Den typiska amplituden för ingångsspänningen är 20 V genom en bipolär strömförsörjning med en 10x förstärkning, efter en 2 V generatorutgång. Den resulterande vågformen är en bipolär fyrkantvåg med en ungefärlig amplitud på 20 V (dvs en topp-till-toppspänning på 40 V) (figur 3E).
- Mät den magnetiska flödestätheten med hjälp av halleffektsensorn och DAQ-systemet. I detta fall var till exempel spolens magnetiska flödestäthet (B) 113,6 ±2,5 mT (medelvärde ± SEM) när spolens botten var i kontakt med halleffektsensorn (figur 3F).
Figur 3: Liten spole för magnetisk stimulering. (A) Tredimensionell (3D)-utskriven skiva (vänster). Två identiska skivor fästs vid permalloy-45-axeln; En är i slutet av axeln och den andra är 10 mm bort (höger). (B) Inställning för lindning av spolen. 60 mm-axeln med de två skivorna är ansluten till en slagmejsel. En halleffektsensor placeras nära den lilla magneten som är fäst vid axeln. Koppartråden lindas mellan de två skivorna. (C) Konstruerad spole. Spolen är 10 mm hög, 6 mm i diameter och har 1 000 varv koppartråd. Den högra sidan av figuren visar spolen manipulerad av en 3D-tryckt spolhållare. d) Växelströmsegenskaper hos spolen registrerade av en LCR-mätare: (överst) resistans kontra sinusformad ingångsfrekvens. (nederst) induktans kontra ingångsfrekvens. En typisk spole har en resistans och induktans på 21,6 respektive 7,9 mH vid 1 kHz AC-ingång. (E) Bifasisk rektangulär vågform som används som spolingång registrerad av ett oscilloskop. (F) Förhållandet mellan magnetisk flödestäthet och avståndet mellan en konstruerad spole och halleffektsensorn. Den magnetiska flödestätheten registrerades av fem olika halleffektsensorer, en gång för varje sensor. Medelvärdet av fem mätningar ritas och felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. System och förfarande för signalregistrering
- Anslut den flexibla 2D-matrisen till inspelningssystemet (se Materialförteckning) med plattbandskabeln.
- Fäst den rostfria stålstången monterad på spolen på en mikromanipulator (se Materialförteckning).
- Placera spolen ovanför bregma och justera positionen i kaudal riktning för att lokalisera fokuspunkten ovanför den nedre colliculus. Brännpunkten för det emitterande elektriska fältet är mittlinjen för sårområdet på spolens bottenyta (dvs 1 mm från kanten till mitten).
- Förbered ett stimuleringssystem bestående av en bipolär strömförsörjning och en funktionsgenerator (se materialförteckning) och anslut spolen till systemet.
- Anslut en kabel mellan funktionsgeneratorns ingångsterminal och DAQ-systemets utgångsterminal för att applicera triggersignaler på funktionsgeneratorn från DAQ-systemet. Förbered ett lämpligt datorprogram för triggersignaler för att initiera stimuli. Anslut dessutom DAQ-systemet till inspelningssystemet för att spara stimuleringstiderna som tidsstämplar.
- Starta förvärvsprocessen för inspelningssystemet.
OBS: Om inspelningssystemet tar upp brus, hitta källan till bruset och minska det. - Testa den magnetiska stimuleringen genom att utlösa stimuleringssystemet.
OBS: Om bruset som produceras av magnetisk stimulering mättar mätområdet, justera intervallet ordentligt. Kontrollera dessutom att inspelningssystemet sparar stimuleringstidsstämplarna korrekt. - Börja spela in svarsdata och börja stimuleringssessioner. Stoppa inspelningen när varje stimuleringssession är klar. Spara alla inspelade data för efterföljande analys.
OBS: För att utföra alla experimentella förhållanden med fem olika magnetiska intensiteter, till exempel, var den totala tiden som krävdes för alla sessioner cirka 75 minuter. Slutpunkten bestämdes vanligtvis efter att alla inspelningssessioner var över. Men när djuren visade kliniska tecken inklusive hosta, ansträngd andning och flämtning, avslutades experimentsessionen omedelbart. För eutanasi utfördes halshuggning med en skarp, ren sax medan djuren var under anestesi.
7. Analys av data
- Filtrera bredbandssignalen (rå) med ett lågpassfilter med en avstängningsfrekvens på 200 Hz.
- Samla in filtrerade vågformer under ett tidsfönster runt varje stimuleringstidsstämpel. Medelvärde av vågformerna för att erhålla de händelserelaterade potentialvågformerna (ERP) (figur 4 och figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EEG-provdata registrerade i bedövade C57BL / 6J-möss med det flexibla substratet kombinerat med skruvelektroderna presenteras nedan.
Som ett typiskt exempel visas de genomsnittliga EEG-vågformerna som genereras som svar på ljudstimulering (8 kHz tonburst, 80 dB ljudtrycksnivå [SPL]) för 60 försök med identiska stimuli (figur 4A). En schematisk bild av inspelning av kanalkartläggning presenteras också i mitten av figur 4A. Svaren från kap 5, 7, 10 och 12 registreras från områden nära hörselbarken i båda temporalloberna. I de enskilda EEG-vågformerna för kanalerna belägna runt hörselområdena (den nedre colliculus och hörselbarken) var svaren exklusive stimuleringsartefakterna först negativa omedelbart efter ljudstimuleringens början (t.ex. kap 3 och 10); toppamplituderna var 45,6 ± 4,0 μV respektive 25,6 ± 1,5 μV. Svaren var därefter positiva och gick i viss utsträckning över baslinjen (figur 4B,C) och oscillerade medan de dämpades. Däremot var svar från andra kanaler nästan oberoende av stimuleringens början, även om vissa kanalvågformer visade liknande svar.
Figur 4: Ljudhändelserelaterad potential (ERP) vågformer på 16 platser i mushjärnan. (A) Som svar på ljudstimulering (8 kHz tonburst, 80 dB SPL) applicerad på en sövd mus illustreras 16-kanals ERP-vågformer. Schemat för en mushjärna visas i mitten, och de 16 inspelningsplatserna (röda cirklar) på musens hjärnyta indikeras med kanalnummer. I detta fall används 16 inspelningskanaler; De övriga 16 icke-inspelningskanalerna visas som gröna cirklar. (B) Utökade vyer av ERP-vågformer för kap 3. (C) Utökade vyer av ERP-vågformer för kap 10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
På liknande sätt visas de genomsnittliga vågformerna av EEG-registreringar som svar på kort magnetisk stimulering (V in = 60 Vpp) i området nära höger nedre colliculus för 60 försök med identiska stimuli i figur 5A. En schematisk bild av inspelning av kanalmappning presenteras också i mitten av figur 5A. Eftersom stimuleringsspolen var belägen nära området för Ch 14 var stimuleringsartefakten störst vid den kanalen. Emellertid observerades relativt stora stimuleringsartefakter för de flesta kanaler omedelbart efter stimuleringens början, vilket indikerar att den magnetiska stimuleringen påverkade alla inspelningsplatser. Eftersom svaren från kap 5, 7, 10 och 12 registrerades från områden nära hörselbarken i båda temporalloberna, var de enskilda EEG-vågformerna exklusive stimuleringsartefakterna först negativa och sedan positiva i viss utsträckning, beroende på kanalpositionerna (figur 5A-C). Nära hörselområdena skilde sig svarstidskurser inducerade av magnetisk stimulering från de som inducerades av ljudstimulering. För Chs 3 och 10, till exempel, var svaren negativa omedelbart efter ljudstimuleringens början, även om toppamplituderna var 58,8 ± 4,0 μV respektive 28,2 ± 2,0 μV. Dessutom, med ökande magnetiska stimuleringsintensiteter, ökade toppamplituderna för drivna svar för Ch 10 (figur 5D), vilket tyder på att den magnetiska stimuleringen påverkade framkallade neurala svar.
Figur 5: Transkraniell magnetisk stimulering (TMS)-driven händelserelaterad potential (ERP) vågformer på 16 platser i mushjärnan. (A) De 16-kanaliga ERP-vågformerna som svar på TMS (V in = 60 Vpp) applicerade på en sövd mus illustreras. En schematisk bild av en mushjärna visas i mitten, och de 16 inspelningsplatserna (röda cirklar) på musens hjärnyta indikeras av kanalnumren. (B) Utökade vyer av ERP-vågformer för kap 3. (C) Utökade vyer av ERP-vågformer för kap 10. (D) Sammanfattning för amplituderna för kap. 10 ERP framkallade av olika magnetiska intensiteter (ingångsspänning). För statistisk analys används en ANOVA för flera jämförelser följt av ett post-hoc Tukey-Kramer-test. * och *** representerar p < 0,05 respektive p < 0,001. Försöksnumret för en session är 60 gånger för varje tillstånd hos enskilda djur. Statistiken beräknas för prover som erhållits från två djur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Denna metod kan också enkelt utvidgas till ett vaket litet djur som är anslutet med bundna kablar via en gemensam adapter och fäst med en TMS-enhet på huvudet under inspelning (kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2).
Kompletterande figur 1: Fixtur av stimuleringsspolen fäst vid en musskalle. (A) För en vaken mus visas en stimuleringsspole fixerad med fixturen fäst vid musskallen. (B) Händelserelaterade potentialer (ERP) hos den vakna musen registrerades i en akryllåda, där musen kunde röra sig inuti lådan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Vågformer av ljuddriven och transkraniell magnetisk stimulering (TMS)-drivna ERP på 16 platser från hjärnan hos en vaken mus. (A) Som svar på ljudstimulering (8 kHz tonskur, 80 dB SPL) applicerad på en vaken mus i ett akrylhölje (kompletterande figur 1B) illustreras 16-kanals ERP-vågformer. Schemat för en mushjärna visas i mitten, och de 16 inspelningsplatserna (röda cirklar) på mushjärnytan indikeras av kanalnummer. I detta fall används 16 inspelningskanaler; De övriga 16 icke-inspelningskanalerna visas som gröna cirklar. (B) På liknande sätt illustreras 16-kanaliga ERP-vågformer som svar på TMS (Vin = 60 Vpp) applicerade på samma vakna mus. En schematisk bild av en mushjärna visas i mitten, och de 16 inspelningsplatserna (röda cirklar) på musens hjärnyta indikeras av kanalnumren. Stimuleringsspolen är placerad nära området för Ch 14. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: CAD-datafil för den munkformade skivan som krävs för spolkonstruktionen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie behandlar ett EEG-registreringssystem med flera platser kombinerat med ett magnetiskt stimuleringssystem utformat för små djur, inklusive möss. Det konstruerade systemet är billigt och enkelt konstruerat i fysiologiska laboratorier och kan utöka sina befintliga mätinställningar. Det kirurgiska ingrepp som krävs för att erhålla data från musinspelningssystemet är mycket enkelt om sådana laboratorier har tidigare erfarenhet av vanliga elektrofysiologiska experiment.
En fördel med att använda detta tillvägagångssätt är den goda reproducerbarheten av elektrodplacering på ett enskilt djurs huvud och hårbotten. Det flexibla substratet som används för att tilldela skruvelektroder till hjärnans målställen replikeras enkelt med hjälp av standardmikrofabrikationstekniker, och samma substrat är också lämpliga för att bestämma inspelningsplatserna från hårbotten hos varje djur. Dessutom kan formen på elektroduppsättningen enkelt modifieras för att optimera olika experimentella behov; Anpassade elektrodarrangemang kan skapas optimalt för specifika experimentella ändamål. Om metoden som anges i protokollet följs kan skruvelektroder, kontakter, kablar och kirurgiska ingrepp enkelt modifieras och utvidgas till ett mätsystem med ett större antal inspelningsplatser. En andra fördel med detta inspelningssystem är dess låga kostnad när laboratorier är utrustade med en flerkanalig förstärkare. Det nuvarande inspelningssystemet kan ta emot neurala signaler från 32 ingångskanaler och upp till fyra separata kablar. Därför skulle ett utökat 32-kanals inspelningssystem kräva extra kablar, skruvelektroder och modifierade flexibla substrat, och detta utökade system skulle ha en mycket låg kostnad.
En nackdel med denna metod är emellertid den exakta kontrollen av skruvelektrodernas djup under implantation. Denna nackdel är emellertid alltid närvarande för typiska skruv-EEG-elektroder, och det exakta djupet av skruvarnas premortem i förhållande till den kortikala ytan är okänd. I detta system är en annan kritisk punkt för inspelningskvaliteten på EEG-signaler och minskning av brusnivån lämplig elektrodkontakt med epiduralskiktet. Vi bekräftar alltid lämplig elektrodkontakt för alla skruvelektroder genom impedansmätning. Vanligtvis föreslår en impedans på 5-10 kΩ vid 1 kHz lämplig epiduralplacering, och impedansvärdena bör bekräftas före neural signalmätning.
Dessutom, i det nuvarande protokollet, appliceras tandcement på skallen före elektrodimplantation. Lämplig mängd tandcement kan påverka framgången för EEG-signalinspelningar. Det vill säga ett tunt lager av tandcement på skallen stöder inte de implanterade elektroderna eller fixerar elektrodernas position, medan ett tjockare skikt förhindrar korrekt placering av elektroden (erna) för att komma i kontakt med dura-materien. För att bestämma lämplig tjocklek på skiktet mätte vi tjockleken på tandcementet med hjälp av en digital bromsok efter framgångsrika EEG-inspelningar. Den genomsnittliga tjockleken på ett lämpligt cementskikt var 0,7 mm, vilket tyder på att det dentala cementskiktet kunde ersättas med en "skallehatt" med en tjocklek på 0,7 mm och små hål för skruvelektroder.
Magnetisk stimulering är ett användbart verktyg i studier på människor och djur för minimalt invasiv eller icke-invasiv neurostimulering av hjärnan. Att snabbt ändra strömmarna i en spole skapar ett magnetfält runt spolen och orsakar hyperpolarisering eller depolarisering av neuronmembran när strömmarna passerar genom djur- och mänskliga skalle. För djurmodeller tänds åtgärdspotentialresponser direkt av den supratröskelstorleken på den elektriska fältförändringen, medan subtröskelförändringar i neurala membran produceras för att anpassa nätverksaktiviteten hos neurala populationer10. Denna spole simuleras för att producera ett elektriskt fält som är mer än 10 V / m, upp ett djup av 1,8 mm från hjärnans yta (2,4 mm från skallen), vilket motsvarar kortikalt lager 5/6 eller djupare regioner i en typisk (t.ex. C57BL / 6J) mus10. Dessa millimeterstora spolar kan inducera supratröskel neural aktivitet och kan till och med generera ett mer lokaliserat elektriskt fält på hjärnans yta jämfört med de som induceras av tidigare rapporterade spolar11. Även om tilläggseffekter som består av flera faktorer, inklusive uppfattat ljud, skallevibrationer och den termiska effekten, inte helt kan uteslutas, hade dessa individuella effekter lite inflytande på neural aktivitet. Dessutom använder vi som en magnetisk kärna permalloy, vars magnetiska egenskaper vanligtvis beror på glödgningsprocessens förhållanden, inklusive kylhastighet, glödgningstemperatur och hålltid12. Dess glödgningsförhållanden kunde dock inte kontrolleras eftersom det var en kommersiell permalloy.
Nyligen har kombinerade mätsystem bestående av EEG-registrering på flera platser och TMS använts i medicinska studier, och deras kliniska tillämpningar har ökat 4,6. Vårt föreslagna tillvägagångssätt kommer att förbättra små djurmodeller (särskilt musmodeller) av mänsklig neurofysiologi, vilket kan ge en mycket enklare översättning av experimentella gnagarmodellresultat till mänskliga kliniska motsvarigheter genom att erbjuda djurmodeller som bättre parallella mänskliga system. Slutligen, med hjälp av multi-site inspelningstekniker i genetiskt modifierade möss, kombinerade magnetiska och farmakologiska ingrepp hos djur med sensorisk hörselnedsättning kan bidra till att avslöja mekanismerna som genererar specifika hörselstörningar och tinnitus, som är våra framtida forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Murata Science Foundation, Suzuken Memorial Foundation, Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering och ett bidrag för undersökande forskning (bidragsnummer 21K19755, Japan) och för vetenskaplig forskning (B) (bidragsnummer 23H03416, Japan) till T.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | FFD-101 | The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| ATROPINE SULFATE 0.5 mg | NIPRO ES PHARMA CO., LTD. | - | Atropine sulfate |
| Bipolar amplifier | NF Corp. | KIT61380 | For amplifying waveforms for coil input |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokyo, Japan |
- | For anathesis of animals |
| Commercial manufacturer of flexible 2D array | p-ban.com Corp. | - | URL: https://www.p-ban.com/ |
| Computer prograom to analyze output signals | Natinal Instruments | NI-DAQ and NI-DAQmx Python | To analyze output signals from the hall-effect sensor |
| Connector | Harwin Inc. | G125-FV12005L0P | For connector to conect to the measuring system |
| Copper pad | p-ban.com Corp. | copper | Copper pad on each substrate |
| Copper wire | Kyowa Harmonet Ltd. | P644432 | The windings of the coil |
| DAQ board | National Instruments Corp. | USB-6343 | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| Dental cement | SHOFU INC. | Quick Resin | Self-Curing Orthodontic Resin |
| ECoG electrode | NeuroNexus Inc. | HC32 | For reference to design of the flexible 2D array |
| Epoxy resin | Konishi Co. Ltd. | #16123 | For coil construction |
| Ethyl Carbamate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. | 050-05821 | For urethan anesthesia |
| Flat ribbon cable | Oki Electric Cable Co., Ltd. | FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m | For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem |
| flexible substrate | p-ban.com Corp. | polyimide | Baseplate of flexible substrate |
| Function generator | NF Corp. | WF1947 | For generating waveforms for coil input |
| Hall-effect sensor | Honeywell International Inc. | SS94A2D | For measuring the magnitic flux density of the coil |
| IDC crimping tool | Pro'sKit Industries Co. | 6PK-214 | To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool |
| Instant glue | Konishi Co. Ltd. | #04612 | For coil construction |
| Insulation-displacement connector (IDC ) | Uxcell Japan | B07GDDG3XG | 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch |
| LCR meter | NF Corp. | ZM2376 | For measuring the AC properties of the coil |
| Manipulator | NARISHIGE Group. | SM-15L | For manipulating the coil |
| Medetomidine | Kobayashi Kako, Fukui, Japan | - | For anathesis of animals |
| Midazolam | Astellas Pharma, Tokyo, Japan | - | For anathesis of animals |
| Miniature screw | KOFUSEIBYO Co., Ltd. | S0.6*1.5 | For EEG-senseing and reference electrode |
| Mouse | Japan SLC, Inc. | C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) | Experimental animal |
| Permalloy-45 rod | The Nilaco Corp. | 780544 | The core of the coil |
| Recording system | Plexon Inc. | OmniPlex | For EEG data acquisition |
| Stainless wire | Wakisangyo Co., Ltd. | HW-136 | For grasp by manipulator |
| Stereotaxic apparatus | NARISHIGE Group. | SR-5M-HT | To fix a mouse head |
| Surface-mount connector | Useconn Electronics Ltd. | PH127-2x10MG | For connector to mount on the flexible 2D array |
| Testing equipment (LCR meter) | NF Corp. | ZM2372 | Contact check and impedance measurements |
| White PLA filament | Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd | PLA-F13 | The material used for 3D-printing the donut-shaped disks |
| Xylocaine Jelly 2% | Sandoz Pharma Co., Ltd. | - | lidocaine hydrochloride |
References
- Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
- Hallett, M. Transcranial magnetic stimulation: a primer. Neuron. 55 (2), 187-199 (2007).
- Thut, G., Pascual-Leone, A. Integrating TMS with EEG: How and what for. Brain Topography. 22 (4), 215-218 (2010).
- Ilmoniemi, R. J., Kicic, D. Methodology for combined TMS and EEG. Brain Topograpy. 22 (4), 233-248 (2010).
- Daskalakis, Z. J., Farzan, F., Radhu, N., Fitzgerald, P. B. Combined transcranial magnetic stimulation and electroencephalography: its past, present and future. Brain Research. 1463, 93-107 (2012).
- Tremblay, S., et al. Clinical utility and prospective of TMS-EEG. Clinical Neurophysiology. 130 (5), 802-844 (2019).
- Pellicciari, M. C., Veniero, D., Miniussi, C. Characterizing the cortical oscillatory response to TMS pulse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 38 (2017).
- Lin, Y. J., Shukla, L., Dugue, L., Valero-Cabre, A., Carrasco, M. Transcranial magnetic stimulation entrains alpha oscillatory activity in occipital cortex. Scientific Reports. 11 (1), 18562 (2021).
- Takahashi, S., et al. Laminar responses in the auditory cortex using a multielectrode array substrate for simultaneous stimulation and recording. IEEJ Transactions Electrical and Electronic Engineering. 14 (2), 303-311 (2019).
- Yoshikawa, T., Higuchi, H., Furukawa, R., Tateno, T. Temporal and spatial profiles of evoked activity induced by magnetic stimulation using millimeter-sized coils in the mouse auditory cortex in vivo. Brain Research. 1796, 148092 (2022).
- Tang, A. D., et al. Construction and evaluation of rodent-specific rTMS coils. Frontiers in Neural Circuits. 10, 47 (2016).
- Li, L. Controlling annealing and magnetic treatment parameters to achieve high permeabilities in 55 Ni-Fe toroid cores. IEEE Transactions on Magnetics. 37 (4), 2315-2317 (2001).
